JP7546485B2 - 改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質及びこれを含むＣＭＶワクチン - Google Patents

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Description

本発明は、改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質及びこれを含むＣＭＶワクチンに関する。
ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症には、主に大きく移植、ＡＩＤＳ、先天性免疫不全などの免疫抑制状態の患者において発症するＣＭＶ肺炎、腸炎、網膜炎などの臓器障害と、妊婦が初感染した場合に胎児が発症する先天性ＣＭＶ感染症との２つがある。このうち、先天性ＣＭＶ感染症は、ＴＯＲＣＨ症候群の１つを構成する重要な先天性感染症であり、胎児に奇形又は重篤な臨床症状を引き起こす。妊婦がＣＭＶに初感染した場合、およそ４０％で胎盤を通して胎児の先天性感染が発生する。また、死産の約１５％が先天性ＣＭＶ感染によるという報告もある。先天性感染児の年間発生件数は、日本で３０００人以上、米国で約４万人であり、症候性は日本で約１０００人、米国で約８０００人とも言われ、このうち約９割に中枢神経障害や難聴などの後障害が残る。
日本におけるＣＭＶ抗体保有率は欧米諸国に比して高く、日本人成人の８０％～９０％はＣＭＶ抗体陽性であり、乳幼児期にほとんどの人が感染を受けている。しかし、最近の傾向として、若年者のＣＭＶ抗体保有率は９０％台から６０％台に低下傾向を示しており、先天性ＣＭＶ感染症の予防対策の必要性はさらに高まっている（非特許文献１）。
ごく最近の研究によれば、これまで妊娠中に初感染した母体から多く生じると考えられていた先天性ＣＭＶ感染児が、妊娠中に初感染を起こした妊婦よりもむしろ慢性感染状態の妊婦から多く発生しているという報告も有る（非特許文献２）。
米国医学研究所（Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）は、先天性ＣＭＶ感染症が先進国における先天性の中枢神経障害の原因としてダウン症候群を凌ぐインパクトを持っており、障害が残った先天性感染児の生涯に及ぶＱＯＬの低下と社会経済的損失をＱＡＬＹｓ（Ｑｕａｌｉｔｙ－ａｄｊｕｓｔｅｄ ｌｉｆｅ ｙｅａｒｓ）として算出すると、ＣＭＶワクチンは、最も医療経済効果が高いカテゴリーに分類されると分析している（非特許文献３）。
感染症を引き起こす病原体は、従来型ワクチンで十分な効果を得ることができるＣｌａｓｓ Ｉ群病原体と、従来型ワクチン又は病原体感染歴では十分な防御免疫を獲得できないＣｌａｓｓ ＩＩ群病原体とに大別されるが、ＣＭＶは後者に分類される（非特許文献４）。Ｃｌａｓｓ ＩＩ群病原体の克服が難しい理由として、それらが有する巧妙な免疫逃避機構が指摘されている。人類はこれまでにＣｌａｓｓ Ｉ群病原体に対する数多くの有効なワクチンを開発し、それらの引き起こす感染症の脅威に打ち勝ってきた。そして今後のワクチン開発の焦点は、Ｃｌａｓｓ ＩＩ群病原体へと移りつつある。
ＣＭＶ関連疾患に取り組むために、弱毒生ワクチン及びサブユニットワクチンを含むワクチンの開発が行われている。特許文献１～３には、改変型ＣＭＶ エンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に関するワクチンが開示されている。
先天性ＣＭＶ感染症の被害を最小限に留めるために、妊婦スクリーニングで未感染妊婦を同定し、生活上の注意を啓発することも行われているが、十分ではない。さらに初感染妊婦を同定して、ＣＭＶ抗体高力価免疫グロブリンを妊婦に投与することで胎児への感染予防や重症化の軽減に有効であったとする報告もあるようであるが、現在のところ有効性に疑問が出てきている（非特許文献５）。
ＣＭＶの治療にはアシクロビルなどの抗ウイルス薬が用いられている。しかし、これらの抗ウイルス薬は、ウイルスを完全に除去することはできず、また服用を中止するとウイルスが再活性化する。低分子薬としてガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）も上市されているが、その効果は限定的であり、副作用の問題もある。そのため、ＣＭＶの感染そのものを防御する予防用ワクチン或いは再発症状を軽減緩和する治療用ワクチンの開発が望まれるが、現在、有効なワクチンは存在せず、そのアンメットニーズは高い。
ＣＭＶワクチン開発に関しては、これまで複数の製薬企業やアカデミアにおいて弱毒生ワクチンやアジュバント添加組換え蛋白ワクチン、ＤＮＡワクチンなどを用いた検討が試みられてきたが、何れもＴ細胞免疫、Ｂ細胞免疫共に応答が不十分であり、結果としてワクチンとして実用に耐え得る効果は得られていない。
臓器移植患者及び造血細胞移植患者におけるＣＭＶ感染症及びそれに伴う合併症の予防を目的としてアステラス製薬とＶｉｃａｌ社が共同開発中の二価ＤＮＡワクチンＡＳＰ０１１３（ｇＢ ｇｅｎｅ＋ｐｐ６５ ｇｅｎｅ／ポリキサマーＣＲＬ１００５）は、腎移植患者を対象とした第ＩＩ相試験においてプラセボ群に対する有意な効果を確認できなかった。また、造血細胞移植患者を対象とした第ＩＩＩ相試験においてもプラセボ群に対する有意な効果を確認できなかった。またサノフィパスツール社が先天性ＣＭＶ感染症予防を目的として開発を試みた組換え蛋白ワクチン（ｇＢ／ＭＦ５９）は、未感染成人女性を対象とした感染防御試験（第ＩＩ相試験）において約５０％の有効性を示したものの効果不十分により開発が中断された（非特許文献６）。
国際公開第２０１６／０９２４６０号 国際公開第２０１２／０４９３１７号 国際公開第２０１５／０８９３４０号
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上述のように、現在有効なＣＭＶワクチンが存在しない。したがって、本発明は、免疫誘導に際して、野生型ＣＭＶ ｇＢに比べて、ＣＭＶ感染に対する高い中和活性を示す中和抗体の含有割合が高い抗体を誘導でき、ＣＭＶ感染症の予防及び／又は治療に利用し得る、改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質及びこれを含むＣＭＶワクチンを提供することを課題とする。
本発明者らは、ＣＭＶの主要な抗原であり、感染防御の標的抗原の一つとして知られているｇＢタンパク質に関して、ＣＭＶ感染に対して高い中和活性を有する抗体を誘導する中和エピトープと、中和活性が低い又はない抗体を誘導する非中和エピトープとに分類することを試みた。そして、非中和エピトープを脱エピトープ化し、中和エピトープを免疫的に目立たせることによって、中和抗体誘導能及び感染防御能を増強させた改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質を見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の各発明に関する。
［１］ 野生型サイトメガロウイルスのエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ＣＭＶ ｇＢタンパク質）のヘッド領域が改変され、かつ、ボディ領域認識抗体の誘導能が向上した、改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
［２］ ヘッド領域における改変が糖鎖導入による改変を含む、［１］の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
［３］ ヘッド領域における改変が２つ以上の糖鎖導入による改変を含む、［１］又は［２］の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
［４］ ヘッド領域における改変が、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置７７、５４４、５８８、及び６０９の相当位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸残基への糖鎖導入による改変を含む、［１］～［３］のいずれかの改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
［５］ ヘッド領域における改変が、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置７７、５４４、５８８、及び６０９の相当位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも３つのアミノ酸残基への糖鎖導入による改変を含む、［１］～［４］のいずれかの改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
［６］ ヘッド領域における改変が、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置７７、５４４、及び５８８の相当位置のアミノ酸残基への糖鎖導入による改変を含む、［１］～［５］のいずれかの改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
［７］ ヘッド領域における改変が、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置７７、５４４、５８８、及び６０９の相当位置のアミノ酸残基への糖鎖導入による改変を含む、［１］～［６］のいずれかの改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
［８］ 糖鎖が、
配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置７７の相当位置のアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換及び位置７９の相当位置のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換と、
配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置５４４の相当位置のアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換及び位置５４６の相当位置のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換と、
配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置５８８の相当位置のアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換及び位置５８９の相当位置のアミノ酸残基のグリシン残基への置換と、
配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置６０９の相当位置のアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換、位置６１０の相当位置のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換及び位置６１１の相当位置のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換と
によって導入された、［７］の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
［９］ ヘッド領域における改変がヘッド領域の少なくとも一部の欠損を含む、［１］の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
［１０］ ヘッド領域における改変がヘッド領域の全領域の欠損である、［９］の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
［１１］ ＣＭＶ ｇＢタンパク質のヘッド領域における改変が、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置４３２及び４３４の相当位置のアミノ酸残基の置換を含み、さらに、上記改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質はボディ領域における改変を含み、該ボディ領域における改変が、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置１３２、１３３、及び２１６の相当位置のアミノ酸残基の置換を含む、［１］の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
［１２］ ボディ領域における改変が、さらに配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置２１５の相当位置のアミノ酸残基の置換を含む、［１１］の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
［１３］ ボディ領域における改変が、
配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置１３１から１３３、及び位置２１６から２１８の相当位置のアミノ酸残基の欠損を含む、［１１］又は［１２］の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
［１４］ ［１］～［１３］のいずれかの改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質を含む、ＣＭＶワクチン。
本発明の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質又はこれを含むワクチンによって免疫誘導した場合、野生型ＣＭＶ ｇＢで免疫誘導した場合に比べて、ＣＭＶ感染症に対して高い予防及び／又は治療効果が期待できる。
実施例６におけるヘッド領域からボディ領域への免疫リフォーカシングの結果（ＶＣ３１）を示す図である。 実施例６におけるヘッド領域からボディ領域への免疫リフォーカシングの結果（ＶＣ３３）を示す図である。 実施例６におけるヘッド領域からボディ領域への免疫リフォーカシングの結果（ＶＣ３７）を示す図である。 実施例６におけるヘッド領域からボディ領域への免疫リフォーカシングの結果（ＶＣ３９）を示す図である。 実施例６におけるヘッド領域からボディ領域への免疫リフォーカシングの結果（ＶＣ４０）を示す図である。 実施例６におけるヘッド領域からボディ領域への免疫リフォーカシングの結果（Ｄ１Ｄ２）を示す図である。 実施例６におけるヘッド領域からボディ領域への免疫リフォーカシングの結果（（Ｄ１Ｄ２）×２）を示す図である。 実施例７における各改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質免疫血清の線維芽細胞系中和試験の結果を示す図である。 実施例７における各改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質免疫血清の線維芽細胞系中和試験の結果を示す図である。 実施例７における各改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質免疫血清の上皮細胞系中和試験の結果を示す図である。 実施例７における各改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質免疫血清の上皮細胞系中和試験の結果を示す図である。
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本発明のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）の改変タンパク質は、野生型ＣＭＶ ｇＢタンパク質のヘッド領域が改変され、かつ、ｇＢタンパク質のボディ領域を認識する抗体の誘導能が向上した改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質である。
「野生型ＣＭＶ ｇＢ」とは、任意のＣＭＶ株に由来するｇＢタンパク質を意味し、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＣＭＶ ＡＤ１６９株由来のｇＢタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．： Ｘ１７４０３．１、配列番号１）が挙げられる。理解を容易にするために本明細書におけるアミノ酸残基位置に関して番号付けは、他に記載する場合を除いて、ＡＤ１６９株に由来し、かつリーダー配列を除いた配列番号１のｇＢタンパクのアミノ酸配列との関係で記載する。この場合は、配列アライメントに基づいて、ｇＢタンパク質におけるアミノ酸残基の位置を、配列番号１に記載のアミノ酸配列において相当する位置、すなわち、「相当位置」として記載する。
「改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質」（「ｇＢ改変体」又は「改変体」ともいう。）とは、野生型ＣＭＶ ｇＢに対して、少なくとも一つのアミノ酸残基又は連続したアミノ酸残基領域が、置換、欠損（欠失）又は付加されたタンパク質をいい、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されたタンパク質などの野生型に存在しないタンパク質修飾がされたタンパク質も含む。
ＣＭＶ ｇＢタンパク質の立体構造は解析されており（非特許文献８）、例えば、ＡＤ１６９株由来のｇＢにおいて、配列番号１における１０９－３１９番目のアミノ酸残基を有するドメインＩ、９７－１０８番目のアミノ酸残基と３２０－４１４番目のアミノ酸残基とを有するドメインＩＩ、７１－８７番目のアミノ酸残基と４５３－５２５番目のアミノ酸残基と６１４－６４３番目のアミノ酸残基とを有するドメインＩＩＩ、６５－７０番目のアミノ酸残基と５２６－６１３番目のアミノ酸残基とを有するドメインＩＶ、及び、６４４－６７５番目のアミノ酸残基を有するドメインＶを有することが知られている。
ＣＭＶ ｇＢのドメイン構造は非特許文献７によって報告されている。ＣＭＶ ｇＢタンパク質において、ドメインＩＶを含む領域をヘッド領域といい、例えば、ＡＤ１６９株由来のＣＭＶ ｇＢタンパク質において、１－８７番目と４１５－６４９番目のアミノ酸残基からなる領域である。ドメインＩとドメインＩＩを主に含む残りのエクトドメイン領域をボディ領域といい、例えば、ＡＤ１６９株由来のＣＭＶ ｇＢタンパク質において、８８―４１４番目のアミノ酸残基と６５０－６８２番目のアミノ酸残基からなる領域である。他のＣＭＶ ｇＢタンパク質のヘッド領域及びボディ領域は、ＡＤ１６９株由来のＣＭＶ ｇＢタンパク質に対応させた相当位置のアミノ酸残基で規定され得る。
ＣＭＶ ｇＢタンパク質の結晶構造においては、ボディ領域よりもヘッド領域の方が高い抗原提示性を有していること、すなわち、ヘッド領域は、ボディ領域と比較して抗体を多く誘導することが知られている。しかし、ドメインＩＶに存在するエピトープは、中和活性がない又は低い抗体を多く誘導する。その結果ｇＢタンパク質のドメインＩＶはＣＭＶの免疫回避機構として働いているという報告がされている（非特許文献７、８）。
実際に本発明者らが調べたところ、血液中の抗体においても、ヘッド領域に対する抗体の割合の方が、ボディ領域に対する抗体の割合よりも高い。しかし一方で、本発明者らの研究によれば、野生型ＣＭＶ ｇＢのヘッド領域は、中和活性が高い中和抗体よりも、中和活性がない又は低い非中和抗体の方を多く誘導していた。よって、ヘッド領域には、中和抗体を誘導する中和エピトープよりも非中和抗体を誘導する非中和エピトープの方が多く存在していると結論された。非中和抗体は、ウイルスと結合するものの、ウイルスの感染能を抑えることができない。よって、ワクチン抗原のデザインには、中和抗体の産生を誘導できることが重要とされている。
本発明の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質は、非中和エピトープが多く存在していると思われるｇＢタンパクのヘッド領域に改変を行うことにより、ヘッド領域よりも中和抗体の誘導能力が高いボディ領域であるドメインＩとドメインＩＩを目立たせた。その結果、ボディ領域認識抗体の誘導能が向上し、ボディ領域であるドメインＩとドメインＩＩに存在するエピトープが誘導する抗体量を増加させることができ、本発明の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質は、野生型ＣＭＶ ｇＢタンパク質と比較して多くの中和抗体を誘導することができる。
「ボディ領域認識抗体の誘導能」又は「ボディ領域認識抗体の誘導活性」とは、ボディ領域に存在するエピトープを認識する抗体の産生を誘導する能力又は活性をいう。「中和抗体誘導能」又は「中和抗体誘導活性」とは、抗原タンパク質に対する中和抗体を誘導できる能力をいい、抗原タンパク質を被検動物に接種することで得られる免疫血清中の中和抗体価（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ）で評価され得る。「中和抗体」とは、ウイルス粒子の感染性を失わせることができる抗体をいい、例えば被検ウイルスのプラーク数を５０％減少させるのに必要な抗体の濃度（ＮＴ５０）にてその抗体の中和活性の高さを評価することができる。
改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質の一例として、ヘッド領域に糖鎖導入（糖鎖修飾）をする改変を加えることでｇＢタンパク質のボディ領域を認識する抗体の誘導能を向上させてもよい。さらに、ヘッド領域への糖鎖修飾として、２か所に糖鎖修飾を行ってもよい。より好ましくは、ヘッド領域の３か所に糖鎖修飾を行ってもよい。さらに好ましくは、ヘッド領域の４か所に糖鎖修飾を行ってもよいし、５か所以上に糖鎖修飾を行ってもよい。
改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の位置７７、５４４、５８８、及び６０９の相当位置のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも２か所、又は少なくとも３箇所に糖鎖修飾を加える改変を行ってもよい。配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置７７、５４４、及び５８８の相当位置のアミノ酸残基に糖鎖導入修飾を加える改変、或いは、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置７７、５４４、５８８、及び６０９の相当位置のアミノ酸残基への糖鎖導入修飾を加える改変であることが好ましい。ここで、アミノ酸残基に糖鎖導入修飾を加えることは、糖鎖を導入する目的部位のアミノ酸残基を、糖鎖を導入できるように適切な他のアミノ酸残基へ変異させることを含む。
糖鎖修飾方法は、通常の方法であればよく、特に限定されないが、たとえば、Ｎ型糖鎖を導入する場合、野生型ｇＢタンパク質のｃＤＮＡをテンプレートとし、Ｎ型糖鎖を導入する目的部位の３つの連続したアミノ酸配列が、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）となるように、プライマーを設計し、ＰＣＲによって変異を導入する。糖鎖導入のための変異は、たとえば、配列番号１に記載のアミノ酸配列における以下の変異が挙げられる：（Ｄ７７Ｎ、Ｉ７９Ｔ）、（Ｅ５４４Ｎ、Ｐ５４６Ｔ）、（Ｌ５８８Ｎ、Ｐ５８９Ｇ）、及び（Ｋ６０９Ｎ、Ｒ６１０Ｔ、Ｍ６１１Ｔ）。目的の改変ｇＢタンパク質の核酸配列、さらに必要あれば６×Ｈｉｓなどのタグを連結した核酸配列を適切なベクターにクローニングし、発現させることによって改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質を得ることができる。そして、ｇＢ改変体の目的部位のアスパラギンに通常の方法によってＮ型糖鎖を付加する。
糖鎖導入は例えば、下記によって行われることが好ましい。これらの位置における糖鎖導入によって、ヘッド領域におけるエピトープが改変され（脱エピトープされ）、ボディ領域におけるエピトープを目立たせた改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質を得ることができる。このような改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質は、野生型ＣＭＶ ｇＢに比べて、中和活性の高い中和抗体をより多く誘導できると考えられる。
・配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置７７の相当位置のアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換及び位置７９の相当位置のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換、並びに／或いは
・配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置５４４の相当位置のアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換及び位置５４６の相当位置のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換、並びに／或いは
・配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置５８８の相当位置のアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換及び位置５８９の相当位置のアミノ酸残基のグリシン残基への置換、並びに／或いは
・配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置６０９の相当位置のアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換、位置６１０の相当位置のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換及び位置６１１の相当位置のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換。
改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質の一例として、ヘッド領域の少なくとも一部を欠損させる改変を加えることでｇＢタンパク質のボディ領域を認識する抗体の誘導能を向上させてもよい。ヘッド領域の全領域を欠損させてもよい。ヘッド領域の少なくとも一部の欠損によって、ヘッド領域におけるエピトープが脱エピトープされ、ボディ領域におけるエピトープが目立たせた改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質を得ることができる。このような改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質は、野生型ＣＭＶ ｇＢに比べて、中和活性の高い中和抗体をより多く誘導できると考えられる。
改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質の一例として、ボディ領域における改変として、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１３２番目のイソロイシン残基（Ｉ１３２）に相当するアミノ酸残基の置換を含んでいてもよい。好ましくは、１３２番目のイソロイシンのヒスチジンへの置換が挙げられる。
改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質の一例として、ボディ領域における改変として、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１３３番目のチロシン残基（Ｙ１３３）に相当するアミノ酸残基の置換を含んでいてもよい。好ましくは、１３３番目のチロシンのアルギニンへの置換が挙げられる。
改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質の一例として、ボディ領域における改変として、配列番号１に記載のアミノ酸配列における２１６番目のトリプトファン残基（Ｗ２１６）に相当するアミノ酸残基の置換を含んでいてもよい。好ましくは、２１６番目のトリプトファンのアラニンへの置換が挙げられる。
改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質の一例として、ヘッド領域における改変として、配列番号１に記載のアミノ酸配列における４３２番目のアルギニン残基（Ｒ４３２）に相当するアミノ酸残基の置換を含んでいてもよい。好ましくは、４３２番目のアルギニンのトレオニンへの置換が挙げられる。
改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質の一例として、ヘッド領域における改変として、配列番号１に記載のアミノ酸配列における４３４番目のアルギニン残基（Ｒ４３４）に相当するアミノ酸残基の置換を含んでいてもよい。好ましくは、４３４番目のアルギニンのグルタミンへの置換が挙げられる。
改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質の一例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＩ１３２、Ｙ１３３、Ｗ２１６、Ｒ４３２、及びＲ４３４に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸残基の置換を含んでいてもよい。好ましくは、ヘッド領域におけるＲ４３２、及びＲ４３４に相当する２箇所のアミノ酸残基の置換を含んでいてもよい。さらに好ましくは、Ｉ１３２、Ｙ１３３、Ｗ２１６、Ｒ４３２、及びＲ４３４の５か所に相当するアミノ酸残基すべての置換を含んでいてもよい。ここで、アミノ酸残基の置換は、他の任意のアミノ酸残基への置換であってよく、該置換によって得られた改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質は、野生型ＣＭＶ ｇＢに比べて、中和活性の高い中和抗体をより多く誘導できると考えられる。
改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質の一例として、ボディ領域における改変として、配列番号１に記載のアミノ酸配列における２１５番目のトレオニン残基（Ｔ２１５）に相当するアミノ酸残基の置換を含んでいてもよい。好ましくは、２１５番目のトレオニンのグルタミン酸への置換が挙げられる。Ｔ２１５に加えて、Ｉ１３２、Ｙ１３３、Ｗ２１６、Ｒ４３２、及びＲ４３４に相当するアミノ酸残基の５か所の置換をさらに含んでいてもよい。
改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質の一例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置１３１から１３３に相当する位置（相当位置）にあるアミノ酸Ｙ－Ｉ－Ｙによって定義される融合ループ１（ＦＬ１）ドメイン、又は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置２１６から２１８に相当する位置にあるアミノ酸Ｗ－Ｌ－Ｙによって定義される融合ループ２（ＦＬ２）ドメインのアミノ酸残基の改変を含んでいてもよい。
ここでアミノ酸残基への改変とは、アミノ酸残基の欠損、置換、若しくは付加、又は糖鎖導入であってもよい。また、ＦＬ１のアミノ酸残基を改変し、ＦＬ２のアミノ酸残基を改変しなくてもよい。また、ＦＬ２のアミノ酸残基を改変し、ＦＬ１のアミノ酸残基を改変しなくてもよい。好ましくは、ＦＬ１とＦＬ２両方のアミノ酸残基を改変することが挙げられる。
ＦＬ１とＦＬ２のアミノ酸残基の改変の一例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置１３１から１３３に相当するアミノ酸残基を全て欠損させてもよい。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置２１６から２１８に相当するアミノ酸残基を全て欠損させてもよい。さらに好ましくは、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置１２８から１３８に相当するアミノ酸残基を欠損させてもよい。
改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質の一例として、ＦＬ１を欠損させた改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質は、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列における欠損されたアミノ酸残基の位置にリンカーを挿入してもよい。好ましくは、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置１２８から１３８を欠損させて、その欠損された位置に、すなわち、欠損させたアミノ酸残基の前後のアミノ酸残基の間にリンカーを挿入してもよい。さらに好ましくはリンカーとしてグリシンリンカーを挿入してもよい。
本発明の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質は、遺伝子工学の手法によって作製することができる。作製方法は特に限定されないが、たとえば、野生型ｇＢタンパク質のｃＤＮＡをテンプレートとし、目的の変異を導入するためのプライマーを設計して、ＰＣＲによって変異が導入された核酸を得て、発現プロモータと機能的に連結し、場合によってタグも連結し、適切な発現ベクターに導入し、発現させることによって得ることができる。また、糖鎖導入による改変体の場合は、上述のとおりに得ることができる。
作製された改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質は、必要に応じて精製してもよい。精製方法は特に限定されないが、アフィニティクロマトグラフィーカラムなどによる精製が挙げられる。
本発明のＣＭＶワクチンは、本発明の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質を含む。
本実施形態のＣＭＶワクチンの剤形は、例えば、液状、粉末状（凍結乾燥粉末、乾燥粉末）、カプセル状、錠剤、凍結状態であってもよい。
本実施形態のＣＭＶワクチンは、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。上記担体としては、ワクチン製造に通常用いられる担体を制限なく使用することができ、具体的には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる。ワクチンは、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、不活化剤（例えば、ホルマリン）などが、更に適宜配合されてもよい。
本実施形態のＣＭＶワクチンの免疫原性をさらに高めるために、アジュバントを更に含むことも可能である。アジュバントとしては、例えば、アルミニウムアジュバント又はスクアレンを含む水中油型乳濁アジュバント（ＡＳ０３、ＭＦ５９など）、ＣｐＧ及び３－Ｏ－脱アシル化－４’－モノホスホリル ｌｉｐｉｄ Ａ（ＭＰＬ）などのＴｏｌｌ様受容体のリガンド、サポニン系アジュバント、ポリγ－グルタミン酸などのポリマー系アジュバント、キトサン及びイヌリンなどの多糖類が挙げられる。
本実施形態のＣＭＶワクチンは、本発明の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質と、必要に応じて、担体、アジュバントなどとを混合することにより得ることができる。アジュバントは、用時に混合するものであってもよい。
本実施形態のＣＭＶワクチンの投与経路は、例えば、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与であってもよい。
本実施形態のＣＭＶワクチンの投与方法は、例えば、シリンジ、経皮的パッチ、マイクロニードル、移植可能な徐放性デバイス、マイクロニードルを付けたシリンジ、無針装置、スプレーによって投与する方法であってもよい。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１ ＣＭＶ ｇＢタンパク質及びその改変体の調製
ＡＤ１６９株に由来するＣＭＶ ｇＢのエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）（配列番号１における位置１－６８２のアミノ酸残基、本明細書において場合によって「ｇＢ１－６８２」という））を国際公開第０３/００４６４７号に開示されているｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。ｇＢのＣ末端にはＨｉｓ ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ ｔａｇＩＩ又はＦＬＡＧ ｔａｇが付加されるようにデザインした。これをベースに表１に示す改変体と表２に示す改変体を作製した。
Figure 0007546485000001
表１に示す「ｇＢ１－６８２－ｆｍ」は、ｇＢ１－６８２においてＲ４３４Ａ及びＲ４３５Ａのアミノ酸残基の置換が行われた改変体であり、「ｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍｖ９」は、非特許文献８を参考にｇＢ１－６８２においてＩ１３２Ｈ、Ｙ１３３Ｒ、Ｔ２１５Ｅ、Ｗ２１６Ａ、Ｒ４３２Ｔ、及びＲ４３４Ｑのアミノ酸残基の置換が行われた改変体である。
Figure 0007546485000002
表２に示す改変体（１）「ｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ」は、ｇＢ１－６８２においてＩ１３２Ｈ、Ｙ１３３Ｒ、Ｗ２１６Ａ、Ｒ４３２Ｔ、Ｒ４３４Ｑのアミノ酸残基の置換が行われた改変体であり、改変体（２）「ｇＢ－Ｄ１」はｇＢ１－６８２における位置１－１０８及び３２０－６８２欠損させ、かつ、Ｉ１３２Ａ、Ｙ１３３Ａ及びＷ２１６Ａのアミノ酸残基の置換が行われた改変体であり、改変体（３）「ｇＢ－Ｄ２」はｇＢ１－６８２における位置１－８７及び１０９－６８２を欠損させた欠損体とｇＢ１－６８２における位置１－３１９及び４１５－６８２を欠損させた欠損体とをＩＡＧＳＧの５アミノ酸残基でつないだ改変体であり、改変体（４）「ｇＢ－Δｄ１」はｇＢ１－６８２における位置１０９－６８２を欠損させた欠損体とｇＢ１－６８２における位置１－３１９及び６５０－６８２を欠損させた欠損体とをＩＡＧＳＧの５アミノ酸残基でつないだ改変体である。
各改変体の発現には、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３又はＥｘｐｉ２９３発現システム（ライフテクノロジー社）を用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４～６日で培養上清を回収した。Ｈｉｓ ｔａｇを付加したｇＢ改変体を含む培養上清は、Ｎｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社 Ｃａｔ．３０２３０）を使った精製を行い、精製ｇＢ改変体を取得した。Ｓｔｒｅｐ ＴａｇＩＩを付加したｇＢ改変体を含む培養上清は、培地中に含まれるＢｉｏｔｉｎを除くためにＵＦ膜（Ｕｌｔｒａｃｅｌ ＹＭ－３／ミリポア社 Ｃａｔ．４３０３又はＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ－１０Ｋ／ミリポア社 Ｃａｔ．４３０５）でＰＢＳへのｂｕｆｆｅｒ置換及び濃縮を行った。濃縮した培養上清は、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎカラムを使った精製を行い、精製ｇＢ改変体を取得した。ＦＬＡＧ ｔａｇを付加したｇＢ改変体を含む培養上清は、Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｇａｒｏｓｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社 Ｃａｔ．Ａ２２２０）を使った精製を行い、精製ｇＢ改変体を取得した。
実施例２ 抗ｇＢ抗体の作製
ヒトＢ細胞（例えばリンパ節や脾臓）由来のｍＲＮＡからヒトＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを使用して調製された１０１１種以上の多様なｓｃＦｖ分子を含むファージディスプレイライブラリ（ＸＯＭＡ０２０）をスクリーニングすることによって、改変体に対する抗体を単離した。スクリーニング方法としては、抗原固相化パンニングの標準的な手法を用いた（Antibody Phage Display Methods and Protocols, Edited by Philippa M. O’Brien and Robert Aitken）。
具体的には、９６ウェルプレートにｇＢ抗原を固相化し、ｓｃＦｖ分子を含むファージディスプレイライブラリを反応させ、洗浄後、アルカリ溶液で溶出を行った。大腸菌ＴＧ１株とＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いてｓｃＦｖ分子を含むファージをレスキューした。このサイクルを２～３回繰り返し、ｇＢ抗原特異的なファージクローンを濃縮し単離した。
パンニングの際にサブトラクションを行う場合には、以下の手法で行った。９６ウェルプレートにｇＢ抗原を固相化し、ｓｃＦｖ分子を含むファージディスプレイライブラリを反応させる際に、下記の１－３－１３、６－２－８、８－２－２のｓｃＦｖ－ｈＦｃを共存させた。洗浄工程以降は上記のパンニングと同様の方法にて行った。
スクリーニングの結果、６５種のクローンを取得した。取得したクローン名を「Ｊ９」、「Ｊ１９」、「Ｊ２５」、「Ｊ４７」、「Ｊ５８」、「Ｊ６１」、「Ｊ８２」、「Ｊ９２」、「Ｋ１２」、「Ｋ１７」、「Ｋ２９」、「Ｋ４２」、「Ｋ６１」、「Ｋ７４」、「Ｋ９０」、「Ｋ９１」、「Ｍ３３」、「Ｎ６６」、「Ｎ７９」、「Ｎ８０」、「Ｎ９３」、「Ｐ１２」、「Ｐ３０」、「Ｐ４０」、「Ｐ８６」、「Ｑ５」、「Ｑ１２」、「Ｑ２５」、「Ｑ３８」、「Ｑ４１」、「Ｑ４４」、「Ｑ６２」、「Ｑ９２」、「Ｒ１８」、「Ｒ２３」、「Ｒ４０」、「Ｒ４７」、「Ｒ５７」、「Ｒ８７」、「Ｓ６８」、「Ｓ８０」、「１－３－１３」、「２－３－４」、「２－３－４２」、「２－３－７７」、「３－３－１５」、「３－３－８８」、「６－２－５」、「６－２－８」、「６－２－１８」、「６－２－９８」、「６－２－１４６」、「６－３－１０６」、「７－２－２５」、「７－２－３６」、「７－２－５８」、「７－２－６４」、「７－２－６６」、「７－３－３８」、「７－３－４５」、「８－２－２」、「８－２－１２」、「８－２－１６」、「８－２－７２」及び「８－２－８２」とした。
＜ｓｃＦｖ－Ｆｃの作製方法＞
単離したｓｃＦｖ遺伝子の可変領域をヒトＩｇＧ１に由来するＦｃ遺伝子（ＣＨ２－ＣＨ３）と連結し、国際公開第２０１５／１１５３３１号を参考に作製したｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ－ｈＦｃ発現プラスミドを構築した。発現には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３又はＥｘｐｉ２９３発現システム（ライフテクノロジー社）を用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４～６日で培養上清を回収した。培養上清をＡｂ－Ｒａｐｉｄ ＰｕＲｅ １０（ＰｒｏｔｅＮｏｖａ社 Ｃａｔ．Ｐ－０１２－１０）又はＡｂ－Ｒａｐｉｄ ＰｕＲｅ Ｅｘ（ＰｒｏｔｅＮｏｖａ社 Ｃａｔ．Ｐ－０１５－１０）を用いて精製し、ｓｃＦｖ－ｈＦｃを得た。
＜ヒトＩｇＧの作製方法＞
次に、単離したｓｃＦｖ遺伝子のＶＨ領域をヒトＩｇＧ１に由来するＨ鎖定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）と連結し、国際公開第２０１５／１１５３３１号を参考に作製したｐＫＭＡ０１０－ｈＣｇ１ベクターにクローニングし、Ｈ鎖発現プラスミドを構築した。また、ＶＬ領域をヒトＣＬ遺伝子と連結し、国際公開第２０１５／１１５３３１号を参考に作製したｐＫＭＡ００９－ｈＣＬベクターにクローニングし、Ｌ鎖発現プラスミドを構築した。発現には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３又はＥｘｐｉ２９３発現システム（ライフテクロノジー社）を用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４～６日で培養上清を回収した。培養上清をＨｉ－Ｔｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア社 Ｃａｔ．１７０４０３０３）を用いて精製し、ヒトＩｇＧを得た。
＜ｓｃＦｖファージの作製方法＞
単離したｓｃＦｖ遺伝子がクローニングされているファージミドベクターを有する大腸菌ＴＧ１株を２×ＹＴＣＧ培地（３７℃）で培養し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージをｍｏｉ＝２０で感染させた後、２×ＹＴＣＫ培地（２５℃）、オーバーナイトでファージの発現を行った。得られたｓｃＦｖファージは２０％－ＰＥＧ－２．５Ｍ ＮａＣｌによる濃縮を行った。
実施例３ ｇＢ抗体の反応性解析とグループ化
＜ｓｃＦｖファージの各改変体への結合活性によるグループ化＞
実施例２で取得したｓｃＦｖファージの結合活性を実施例１の表２に示した改変体を用いてＥＬＩＳＡによって評価した。各改変体をＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｃｏｒｐ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に１００μＬ入れ、４℃でオーバーナイト又は室温で１～２時間インキュベートすることによって、各改変体を固相化した。
固相化後、プレートをＰＢＳで洗浄し、取得したｓｃＦｖファージをプレートのウェルに１００μＬ加え、室温で１時間インキュベートした。その後ＰＢＳ－０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄後、検出抗体Ａｎｔｉ－Ｍ１３／ＨＲＰ（ＧＥヘルスケア社 Ｃａｔ．２７－９４２１－０１）をプレートのウェルに１００μＬ加え、室温で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ社 Ｃａｔ．Ｔ－４４４４）をプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。
取得した６５クローンの抗体と、実施例１で作製した改変体との反応性の差異により各抗体の認識領域を決定した。改変体として、実施例１の表２に示す改変体（１）ｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ、改変体（２）ｇＢ－Ｄ１、改変体（３）ｇＢ－Ｄ２、改変体（４）ｇＢ－Δｄ１を使用した。
各改変体との反応性により、取得した６５クローン抗体を改変体（２）又は（３）との反応性を有するもの、及び、改変体（１）との反応性を有し改変体（４）との反応性を有さないものをボディ領域認識抗体、改変体（１）との反応性を有し、上記ボディ領域認識抗体でないものをヘッド領域認識抗体として分類した。
その結果、６５クローンをボディ領域認識抗体２１クローンと、ヘッド領域認識抗体４４クローンとに分類できた。この結果から、取得した６５クローンの抗体のエピトープは、ヘッド領域に集中していたことが分かった。
＜ｓｃＦｖファージとｓｃＦｖ－Ｆｃの競合ＥＬＩＳＡによるグループ化＞
実施例２で取得したｓｃＦｖファージとｓｃＦｖ－Ｆｃ間の競合ＥＬＩＳＡによって６５クローンの抗体の分類を行った。表１に示す改変体ｇＢ１－６８２ ｆｍ３Ｍｖ９をＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に１００μＬ入れ、４℃でオーバーナイトでインキュベートすることによって改変体を固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳで洗浄し、取得したｓｃＦｖ－Ｆｃをプレートのウェルに５０μＬ加え、室温で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ａｎｔｉ－Ｍ１３／ＨＲＰ（ＧＥヘルスケア社 Ｃａｔ／２７－９４２１－０１）をプレートのウェルに１００μＬ加え、室温で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴで洗浄後、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ Ｃａｔ．Ｔ－４４４４）をプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。
各抗体の反応性の傾向から、表３に示すように、ボディ領域は７グループ、ヘッド領域は１３グループに細分化された。
Figure 0007546485000003
実施例４ 各抗体の中和試験
［細胞とウイルスの調製］
＜線維芽細胞系の細胞とウイルスの調製＞
線維芽細胞系のウイルスの培養、中和試験、及び中和抗体誘導能解析にはＡＴＣＣから購入したＭＲＣ－５細胞(ＣＣＬ．１７１)を使用した。細胞培養用培地はＭＥＭ培地に２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、及び、非必須アミノ酸（Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｌ－Ａｌａｎｉｎｅ、Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ、Ｌ－Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ、Ｌ－Ｐｒｏｌｉｎｅ及びＬ－Ｓｅｒｉｎｅ各１０ｍＭ）を添加して調製した。拡張、維持、及び解析プレート作製時は１０％ＦＢＳ含有培地を使用し、中和抗体誘導能評価時は２％ＦＢＳ含有培地を使用し、いずれも３７℃、５％のＣＯ２濃度の条件下で培養した。
線維芽細胞系の中和試験、及び中和抗体誘導能解析に用いるウイルスは、ＡＴＣＣから購入した、Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ５（ＣＭＶ） ＡＤ１６９株（ＶＲ－５３８）を使用した。フルシートのＭＲＣ－５細胞にｍｏｉ＝０．１～１でウイルスを接種後、４～１１日間２％ＦＢＳ含有培地で培養し、３回凍結融解後、室温で２１５０ｇの遠心を１０分間行い、その上清を線維芽細胞を用いた中和抗体価解析用のウイルスバンクとした。
＜上皮細胞系の細胞とウイルスの調製＞
上皮細胞系のウイルスの培養、中和試験、及び中和抗体誘導能解析には、ＡＴＣＣから購入したＡＰＲＥ－１９細胞（ＣＲＬ２３０２）を使用した。ヒト上皮細胞ＡＲＰＥ－１９は、１０％ＦＢＳ含有Ｆ１２／ＤＭＥＭ培地（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１：５で継代培養を行った。
上皮細胞系の中和試験、及び中和抗体誘導能解析に用いるウイルスは、ＡＤ１６９株（ＶＲ－５３８）をＡＰＲＥ－１９細胞に感染させ、感染細胞を非感染細胞と１：４から１：１０の比で長期継代することにより、ＡＰＲＥ－１９細胞で増殖可能なＡＤ１６９ｒｅｖ株を樹立した。５０％ＣＰＥを呈したＣＭＶ ＡＤ１６９ｒｅｖ株感染細胞を０．１ｍｏｉになるように１０％ＦＢＳ含有培地にて調整し、それを約８０％フルシートのＡＲＰＥ－１９細胞に接種した。接種後１週間培養し、培養液を回収し、室温で１８００ｇの遠心を１０分間行い、その上清を上皮細胞での中和抗体価解析用のウイルスバンク（５－１０×１０４ＰＦＵ／ｍＬ）とした。なお、線維芽細胞で継代培養されているＡＤ１６９株は、ＵＬ１３１Ａにフレームシフト変異がありペンタマーが形成されないことが報告されているが、ＡＤ１６９ｒｅｖ株では、この変異が野生型に戻っていることを塩基配列解析で確認した。
［中和試験］
＜各抗体の線維芽細胞系における中和試験＞
線維芽細胞を用いた中和抗体価解析は、フォーカス数減少活性（フォーカスリダクション活性）を用いて行った。解析には、ＣｅｌｌＢＩＮＤ加工されたｂｌａｃｋ ｗａｌｌ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３３４０）又はｓｅｌｌ ｃａｒｒｉｅｒ－９６ Ｕｌｔｒａ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ６０５５７００）に２×１０４細胞／ウェルで播種したＭＲＣ－５細胞を一晩培養したプレートを使用した。
各モノクローナル抗体を段階希釈して所定の濃度になるように調整し約１００～１０００ＰＦＵのＣＭＶ ＡＤ１６９株と混合後、３７℃で１時間反応させた。反応液を解析プレートの細胞に３０μＬ／ウェルで接種後、室温で４００ｇの遠心を３０分行いウイルスを細胞に吸着させた。反応液を除去し、ＦＢＳ不含培地で１回洗浄後、２％ＦＢＳ含有培地で１６～２０時間培養した。培養後、細胞を５０％アセトン／ＰＢＳによる不活化及び固定を室温で２０分間行った。その後、室温で１０分間０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で処理し、洗浄後抗ＣＭＶ ＩＥ１－ＩＥ２モノクローナル抗体（ＣＨ１６０：Ａｂｃａｍ ａｂ５３４９５、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ ｓｃ－６９７４８）１μｇ／ｍＬを３７℃で１時間反応させた。洗浄後にＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ （Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８）（Ａｂｃａｍ ａｂ１５００７７）１μｇ／ｍＬを３７℃で１時間反応させ、さらに洗浄後－Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ（登録商標）－Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｄｏｊｉｎｄｏ ３４６－０７９５１）１μｇ／ｍＬを室温で１０分間反応させ洗浄したプレートに１００μＬ／ウェルで０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加して、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ ｍｉｃｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で各ウェルの画像を取り込み、解析ソフトＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＣＭＶ ＩＥ１－ＩＥ２モノクローナル抗体反応細胞数及び総細胞数をカウントし、総細胞数におけるＣＭＶ ＩＥ１－ＩＥ２モノクローナル抗体反応細胞数の割合を算出した。ウイルスのみを添加した場合のＣＭＶ ＩＥ１－ＩＥ２モノクローナル抗体反応細胞数の割合を基準に、各免疫血清による細胞数の割合の抑制率から、中和活性を判定した。
＜各ｇＢ抗体の上皮細胞系における中和試験＞
上皮細胞を用いた各抗体の中和抗体価解析は、フォーカス数減少活性（フォーカスリダクション活性）を用いて行った。解析には、２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５２６）に７×１０４細胞／ウェルで播種したＡＲＰＥ－１９細胞を一晩培養したプレートを使用した。被験物質を段階希釈して所定の濃度になるように調整し、約２００ＰＦＵのＡＤ１６９ｒｅｖ株と混合し、全量２５μＬを３７℃で３０分間反応させた。反応液２０μＬを解析プレートの細胞に接種後、３７℃で２時間静置しウイルスを細胞に吸着させた。反応液を除去し、１０％ＦＢＳ含有培地で５日間培養した。培養後、細胞を３．７％フォルマリン／ＰＢＳによる不活化及び固定を室温で５分間行った。室温で５分ごとに３回ＰＢＳで洗浄後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００／ＰＢＳで１０分間処理し、ＰＢＳで洗浄後、抗ＣＭＶ ＩＥ１／ＩＥ２モノクローナル抗体（ＭＡｂ８１０、 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）２μｇ／ｍＬを３７℃で１時間反応させた。洗浄後にペルオキシダーゼ標識Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｎ－Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｉｎ ＭＡＸＰＯ、 Ｎｉｃｈｉｒｅｉ）１００μＬ／ウェル３７℃で１時間反応させ、最終的にＤＡＢ基質（Ｒｏｃｈｅ）を用いて発色反応を行い、水洗、乾燥後、実体顕微鏡下で免疫染色されたフォーカス数をカウントした。被験物質の代わりに培地のみを添加した場合のフォーカス数を基準に被験物質によるフォーカス数の抑制率から、中和活性を判定した。判定した結果を表４（ボディ領域認識抗体の中和活性）及び表５（ヘッド領域認識抗体の中和活性）に示す。
Figure 0007546485000004
Figure 0007546485000005
ＭＲＣ－５（線維芽細胞）感染系、ＡＲＰＥ（上皮細胞）感染系におけるウイルス中和活性は、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬの３点の濃度で解析し、５０％プラーク減少濃度（ＩＣ５０）でみたウイルス中和活性強度が１μｇ／ｍＬ以下であった強い中和抗体を「＋＋＋」、１～１０μｇ／ｍＬであった中程度の中和抗体を「＋＋」、１０～１００μｇ／ｍＬであった弱い中和抗体を「＋」、１００μｇ／ｍＬで５０％未満のプラーク減少率であるがわずかに中和傾向を示したものを「±」、全く中和活性を示さない非中和抗体を「－」、として評価した。なお、「ＮＴ」は試験しなかったことを意味する。
ＭＲＣ－５感染系においては、ボディ領域認識抗体２１クローンのうち５０％プラーク数減少濃度（ＩＣ５０）でみたウイルス中和活性強度が１μｇ／ｍＬ以下であった強い中和抗体（＋＋＋）が１４クローン、１～１０μｇ／ｍＬであった中程度の中和抗体（＋＋）が１クローン、１０～１００μｇ／ｍＬであった弱い中和抗体（＋）が３クローン、１００μｇ／ｍＬでは全く中和活性を示さない非中和抗体（－）が３クローンであった。
一方、ヘッド領域認識抗体４４クローンのうち強い中和抗体（＋＋＋）は無く、中程度の中和抗体（＋＋）が２クローン、弱い中和抗体（＋）が４クローン、また１００μｇ／ｍＬで５０％未満のプラーク数減少率ではあるが僅かに中和傾向を示したもの（±）が６クローン、全く中和活性を示さない非中和抗体（－）が３２クローンであった。
ＡＲＰＥ感染系において検討した２８クローンのウイルス中和活性（５０％フォーカス数減少濃度）の結果に関しては、概ねＭＲＣ－５感染系において中和活性を示すクローンはＡＲＰＥ感染系でも中和活性を示す傾向がみられたが、一部、どちらか一方の系のみで中和活性を示すもの、両系で中和活性を示すものの活性強度が大きく異なるものなどが存在していた。
以上から、ヘッド領域を認識する抗体の大半は非中和抗体であり、ボディ領域であるドメインＩ及びＩＩを認識する抗体の多くは強い中和抗体であることが確認された。
実施例５ 改変体と各ｇＢ抗体との反応性解析
＜改変体の作製＞
本発明者らは、中和抗体を誘導する中和エピトープを有益なエピトープ、非中和抗体を誘導する非中和エピトープを有害・無益なエピトープと考えた。そこで、ヘッド領域に存在する非中和エピトープを脱エピトープ化するため、大きく２つの方策を立て、改変ｇＢ抗原をデザインした。
１つ目の方策は、Ｎ型糖鎖付加によるｇＢの改変である。Ｎ型糖鎖はＯ型糖鎖と異なり、コンセンサス配列であるＮＸＴ又はＮＸＳの配列に付与される。糖ペプチドに対しては一般的に抗体ができにくく、糖鎖の嵩高さによって、その周辺にも抗体ができにくくなる(The Journal of Immunology, 1997,159 279-289.)。ＣＭＶ ｇＢのヘッド領域は、レセプターとの結合に重要な領域と考えられているが、ウイルス膜表面から最も遠い位置にあり、表面に露呈しているため抗体が結合しやすい。実際、ヒト血清中には、ヘッド領域の一部であるドメインＩＶを認識する抗体が多く含まれていることが報告されている。（非特許文献７）そこでヘッド領域の中でドメインＩＶとドメインＩＩＩの非中和エピトープにＮ型糖鎖を導入することとした。
一方、ボディ領域の一部であるドメインＩは、ｇＢの根元に位置しており、宿主細胞との融合に重要な領域であるが、ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎのみを発現させた場合には、本来ウイルス膜表面と接触していた領域が表面に露呈する可能性がある。それを回避するために、その露呈領域（Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｏｏｐ部分）を欠失する改変を行った。
二つ目の方策は、ヘッド領域の一部の欠失である。この方策の改変体を作製した。作製した改変体とその発現量を表６に示す。作製方法としては実施例１の改変体の作製方法と同様に、ＣＭＶのＡＤ１６９株に由来するｇＢのｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ（１－６８２ａａ）を国際公開第０３/００４６４７号に開示されているｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。ｇＢのＣ末端にはＨｉｓ ｔａｇが付加されるようにデザインした。
発現には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３又はＥｘｐｉ２９３発現システム（ライフテクノロジー社）を用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４～６日で培養上清を回収した。改変ＣＭＶ ｇＢを含む培養上清は、Ｎｉ－ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社 Ｃａｔ．３０２３０）を使った精製を行い、精製改変ＣＭＶ ｇＢを取得した。培養上清１ｍＬあたりのタンパク収量を発現量として表６にまとめた。精製改変ＣＭＶ ｇＢの結合活性はＥＬＩＳＡによって評価した。
作製した改変ＣＭＶ ｇＢのうち、ＶＣ５、ＶＣ６、ＶＣ１１、ＶＣ１５の４種類の改変体においては変異導入していない改変体と比較し、発現量が低下し、分解物又は凝集物が増加していた。これは糖鎖を一つ導入することにより本来のｇＢ立体構造（３量体）を保てなくなり発現量が減少し、さらに発現・調製時にプロテアーゼによる分解を受けたためだと考えられる。その為、ＶＣ５、ＶＣ６、ＶＣ１１、ＶＣ１５についてはＥＬＩＳＡの評価を行わなかった。
Figure 0007546485000006
＜改変体と抗体との競合ＥＬＩＳＡ＞
各精製改変体をＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ ｐｌａｔｅ （Ｎｕｎｃ）に５０μＬ入れ、４℃でオーバーナイトインキュベートすることによって精製改変体を固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳで洗浄し、実施例４で評価した抗体をプレートのウェルに１００μＬ加え室温でインキュベートした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ／ＨＲＰ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社 Ｃａｔ．７０９－１３１７）をプレートのウェルに１００μＬ加え、室温でインキュベートした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ社 Ｃａｔ．Ｔ－４４４４）をプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。測定した結果を表７、及び表８に示す。
Figure 0007546485000007
Figure 0007546485000008
作製した改変体ＶＣ７、ＶＣ９、ＶＣ１０、ＶＣ１２、ＶＣ１３、ＶＣ１４、ＶＣ１６の反応性解析を実施した。コントロールとして、ｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ ｖ９を用いた。その結果、ＶＣ７は、Ｋ６０９Ｎ、Ｒ６１０Ｔ、Ｍ６１１Ｔの変異を導入することによりヘッド領域認識抗体であるＫ２９、Ｓ８０、Ｊ９２、Ｋ７４、１－３－１３、Ｒ１８、Ｒ４７、Ｊ８２との反応性がなくなり、同様にＶＣ９はＫ５４３Ｎの変異を導入することによりＪ４７との反応性がなくなり、ＶＣ１０はＥ５４４Ｎ、Ｐ５４６Ｔの変異を導入することにより、Ｊ４７、Ｊ８２、Ｊ６１、Ｋ６１、Ｊ５８との反応性がなくなっていた。
改変体ＶＣ１１とＶＣ１２は、改変アミノ酸部位は同じである。しかし、糖鎖の付加による立体障害と構造のゆがみを考慮しＶＣ１１はＧ５７９Ｎ、Ｈ５８１Ｔの変異を導入し、ＶＣ１２はＧ５７９Ｎ、Ｈ５８１Ｓの変異を導入したところ、ＶＣ１１では発現量の低下と凝集物の増加が見られたが、ＶＣ１２は３量体構造を保っており、Ｊ４７、Ｑ９２、Ｋ１７、Ｊ８２、Ｎ６６、Ｎ９３の抗体との反応性がなくなっていた。
改変体ＶＣ１３とＶＣ１４は、改変アミノ酸部位は同じである。しかし、角度の付きやすいＰ５８９を自由度の高いＧｌｙに変えることによる構造の維持を目的とし、ＶＣ１３はＬ５８８Ｎ、Ｐ５８９Ａの変異を導入し、ＶＣ１４はＬ５８８Ｎ、Ｐ５８９Ｇの変異を導入した。その結果、発現量及び性状には殆ど差はなく、共にＫ１７、Ｊ８２、Ｎ６６、Ｊ６１、Ｊ５８、Ｎ９３の抗体との反応性がなくなっていた。
改変体ＶＣ１５とＶＣ１６は糖鎖付加部位による構造変化を考慮し近傍のアミノ酸に糖鎖を導入し比較した。ＶＣ１５はＶ６０４Ｎ、Ｙ６０６Ｔの変異を導入し、ＶＣ１６はＤ６０５Ｎ、Ｌ６０７Ｔの変異を導入したところ、ＶＣ１５では発現量の低下と凝集物の増加が見られた。ＶＣ１６では３量体構造を保っており、Ｋ１７、Ｊ８２、Ｎ６６抗体との反応性がなくなっていた。
改変体ＶＣ２２は、Ｑ７４Ｎの変異を導入することによりＫ２９、Ｓ８０抗体との反応性がなくなり、ＶＣ２３はＤ７７Ｎ、Ｉ７９Ｔの変異を導入することによりＪ９、Ｋ２９、Ｓ８０、Ｊ１９との反応性がなくなっていた。
改変体ＶＣ３３は、ＶＣ１０の変異（Ｅ５４４Ｎ、Ｐ５４６Ｔ）とＶＣ１４の変異（Ｌ５８８Ｎ、Ｐ５８９Ｇ）を導入することにより、Ｊ４７、Ｋ１７、Ｊ８２、Ｎ６６、Ｊ６１、Ｋ６１、Ｊ５８、Ｎ９３抗体との反応性がなくなっていた。これはＶＣ１０とＶＣ１４の一つずつ糖鎖を導入した場合にマスキングされる抗体と一致しており、糖鎖を複数導入しても構造を維持した上で、糖鎖によるエピトープのマスキングができていることを表している。
改変体ＶＣ２４は、ＶＣ７の変異（Ｋ６０９Ｎ、Ｒ６１０Ｔ、Ｍ６１１Ｔ）とＶＣ１０の変異（Ｅ５４４Ｎ、Ｐ５４６Ｔ）とＶＣ１４の変異（Ｌ５８８Ｎ、Ｐ５８９Ｇ）を導入することにより、Ｋ２９、Ｓ８０、Ｊ９２、Ｋ７４、１－３－１３、Ｒ１８、Ｒ４７、Ｊ４７、Ｋ１７、Ｊ８２、Ｎ６６、Ｊ６１、Ｋ６１、Ｊ５８、Ｎ９３抗体との反応性がなくなっていた。
改変体ＶＣ３１は、ＶＣ７の変異（Ｋ６０９Ｎ、Ｒ６１０Ｔ、Ｍ６１１Ｔ）とＶＣ１０の変異（Ｅ５４４Ｎ、Ｐ５４６Ｔ）とＶＣ１４の変異（Ｌ５８８Ｎ、Ｐ５８９Ｇ）とＶＣ２３の変異（Ｄ７７Ｎ、Ｉ７９Ｔ）を導入することにより、Ｊ９、Ｋ２９、Ｓ８０、Ｊ９２、Ｋ７４、１－３－１３、Ｒ１８、Ｒ４７、Ｊ４７、Ｐ４０、Ｑ９２、Ｋ１７、Ｊ８２、Ｎ６６、Ｊ６１、Ｋ６１、Ｊ５８、Ｎ９３抗体との反応性がなくなっていた。ＶＣ３１では、ＶＣ７、ＶＣ１０、ＶＣ１４、ＶＣ２３の一つずつの糖鎖を導入した場合にマスキングされる抗体のうちＪ１９抗体の反応性低下の度合いが弱くなっていた。また、それぞれ単独では反応性が低下していなかったＰ４０、Ｑ９２の反応性が低下しており、導入する糖鎖の数が増える事により、わずかな構造変化によるエピトープの露出や糖鎖の嵩高さによるさらなるエピトープの消失がおこっていると考えられる。
改変体ＶＣ３９は、Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｏｏｐ１、２を欠損させたｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ Ｄｅｌ２１をベースに、ＶＣ１０の変異（Ｅ５４４Ｎ、Ｐ５４６Ｔ）とＶＣ１４の変異（Ｌ５８８Ｎ、Ｐ５８９Ｇ）を導入することにより、Ｊ４７、Ｋ１７、Ｊ８２、Ｎ６６、Ｊ６１、Ｋ６１、Ｊ５８、Ｎ９３抗体との反応性がなくなっていた。これはＶＣ１０とＶＣ１４の一つずつ糖鎖を導入した場合と一致していた。また、ｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ ｖ９をベースとしてＶＣ１０の変異とＶＣ１４の変異を２つ導入したＶＣ３１で反応性の低下した抗体とも一致していた。このことから、Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｏｏｐ部分を欠失させ、さらに糖鎖を複数導入しても、構造を維持したまま糖鎖によるエピトープのマスキングができていることがわかった。
改変体ＶＣ４０は、ｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ Ｄｅｌ２１をベースにＶＣ１０の変異（Ｅ５４４Ｎ、Ｐ５４６Ｔ）とＶＣ１４の変異（Ｌ５８８Ｎ、Ｐ５８９Ｇ）とＶＣ２３の変異（Ｄ７７Ｎ、Ｉ７９Ｔ）を導入することにより、Ｊ９、Ｋ２９、Ｓ８０、Ｊ４７、Ｑ９２、Ｋ１７、Ｊ８２、Ｎ６６、Ｊ６１、Ｋ６１、Ｊ５８、Ｎ９３抗体との反応性がなくなっていた。ＶＣ１０、ＶＣ１４、ＶＣ２３の糖鎖を一つずつ導入したものと比較し、抗体との反応性はほぼ一致していたが、ＶＣ２３の糖鎖単独では反応性が消失していたＪ１９との反応性がＶＣ４０では保っていた。また、ＶＣ１０、ＶＣ１４、ＶＣ２３では反応性を保っていたＱ９２の反応性がＶＣ４０では消失していた。これもＶＣ３１と同様、導入する糖鎖の数が増えることにより、わずかな構造変化によるエピトープの露出や糖鎖の嵩高さによるさらなるエピトープの消失がおこっていると考えられる。
改変体ＶＣ３７は、ｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ Ｄｅｌ２１をベースにＶＣ７の変異（Ｋ６０９Ｎ、Ｒ６１０Ｔ、Ｍ６１１Ｔ）とＶＣ１０の変異（Ｅ５４４Ｎ、Ｐ５４６Ｔ）とＶＣ１４の変異（Ｌ５８８Ｎ、Ｐ５８９Ｇ）とＶＣ２３の変異（Ｄ７７Ｎ、Ｉ７９Ｔ）を導入することによって、Ｊ９、Ｋ２９、Ｓ８０、Ｊ９２、Ｋ７４、１－３－１３、Ｒ１８、Ｒ４７、Ｊ４７、Ｐ４０、Ｑ９２、Ｋ１７、Ｊ８２、Ｎ６６、Ｊ６１、Ｋ６１、Ｊ５８、Ｎ９３抗体との反応性がなくなっていた。これは、ｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ ｖ９をベースとしてＶＣ７、ＶＣ１０、ＶＣ１４、ＶＣ２３の変異を導入したＶＣ３１で反応性の低下した抗体とも一致していた。
改変体Ｄ１Ｄ２は、立体構造を加味しながらドメインＩＶを含むヘッド領域の一部を除き、ｇＢ９７から４６８とｇＢ６３１から６８２をＧＧＧＳＧＳＧＧＧリンカー（配列番号２）で結合させ、さらにＦｕｓｉｏｎ Ｌｏｏｐ部分のＹ１３１Ａ、 Ｉ１３２Ａ、 Ｙ１３３Ａ、 Ｗ２１６Ａのアミノ酸改変とＦｕｒｉｎ切断サイトのＲ４３２Ｔ、Ｒ４３４Ｑのアミノ酸改変を導入して作出した。ボディ領域であるドメインＩ、ドメインＩＩを結合するだけでなく３量体の中心となるドメインＶを残し、さらにＦｕｓｉｏｎ Ｌｏｏｐ部分のアミノ酸を改変することにより、３量体構造を維持しつつｇＢ１－６８２と同等の発現量を保っていた。また、既取得抗体との反応性解析ＥＬＩＳＡを実施したところ、ボディ領域認識抗体８種類との反応性は維持しつつ、ヘッド領域認識抗体との反応性は消失していた。
改変体（Ｄ１Ｄ２）×２は、二つのＤ１Ｄ２をＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカー（配列番号３）で連結して作出し、（Ｄ１’Ｄ２）×２は、（Ｄ１Ｄ２）×２のＦｕｓｉｏｎ Ｌｏｏｐ１、２を欠失させて作出した。（Ｄ１Ｄ２）×２と（Ｄ１’Ｄ２）×２を既取得抗体との反応性解析ＥＬＩＳＡを実施したところ、ボディ領域認識抗体８種類との反応性は維持しつつ、ヘッド領域認識抗体との反応性は完全に消失していた。
実施例６ 改変体抗原のモルモット免疫原性試験及び免疫リフォーカシングの解析
実施例５で作製した改変体ＶＣ３１、ＶＣ３３、ＶＣ３７、ＶＣ３９、ＶＣ４０、Ｄ１Ｄ２及び（Ｄ１Ｄ２）×２のヘッド領域とボディ領域の抗体誘導能の評価をＥＬＩＳＡにより行った。
＜免疫血清の作製＞
実施例５で作製した改変体ｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ ｖ９、ＶＣ３１、ＶＣ３３、ＶＣ３７、ＶＣ３９、ＶＣ４０、Ｄ１Ｄ２及び（Ｄ１Ｄ２）×２を抗原としてモルモットに免疫した。対照としてｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ ｖ９を野生型ｇＢ抗原の代替抗原とした。各抗原は０．２、１、５μｇ／匹になるように、生理食塩水(大塚製薬)で調整し、アジュバントとして１０ｖ／ｖ％のＡｌｕｍ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）及び５０μｇ／匹のＣｐＧ ＯＤＮ１８２６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用した。調整した抗原液を２週間間隔で３回、Ｈａｒｔｌｅｙモルモット(メス ３匹/群)に筋肉内接種（１００μＬ／後肢両足）にし、最終免疫の２週間後にイソフルラン吸入麻酔下での心臓採血により全採血した。得られた血液は凝固促進剤入り分離管で血清分離した。本血清を用いて、ｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ ｖ９に対する結合抗体価誘導活性（ａｎｔｉ－ｇＢ ＥＬＩＳＡ）を評価した。
＜ＥＬＩＳＡによる結合抗体価誘導活性測定＞
ｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ ｖ９又はＤ１Ｄ２抗原をＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ ｐｌａｔｅ （Ｎｕｎｃ）に５０μＬ入れ、４℃でオーバーナイトインキュベートすることによって抗原を固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳで洗浄し、取得したｇＢ抗原免疫血清をＰＢＳで段階希釈し、プレートのウェルに１００μＬ加え室温でインキュベートした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ／ＨＲＰ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社 Ｃａｔ．７０９－１３１７）をプレートのウェルに１００μＬ加え、室温でインキュベートした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ社 Ｃａｔ．Ｔ－４４４４）をプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。
改変体抗原ＶＣ３１、ＶＣ３３、ＶＣ３７、ＶＣ３９、ＶＣ４０、Ｄ１Ｄ２及び（Ｄ１Ｄ２）×２の免疫血清について、免疫リフォーカシングが誘導されているか否かをそれぞれｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ ｖ９及びドメインＩＶを欠損させたＤ１Ｄ２を固相化したＥＬＩＳＡにより解析した。
結果を図１～７に示し、図１～７における（ａ）はｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ ｖ９を固相化したＥＬＩＳＡの結果を示し、（ｂ）はＤ１Ｄ２を固相化したＥＬＩＳＡの結果を示す。ｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ ｖ９の免疫血清と比較して、ＶＣ３１、ＶＣ３３、ＶＣ３７、ＶＣ３９、ＶＣ４０、Ｄ１Ｄ２及び（Ｄ１Ｄ２）×２の免疫血清は何れもｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ ｖ９に対する結合抗体活性は同等又はむしろ少ない値を示したのに対して、Ｄ１Ｄ２に対する結合抗体活性は上昇しており、ボディ領域に対する抗体ポピュレーション（抗体群比率）が上昇していることが確認された。
本結果は、ＣＭＶ ｇＢ抗原のヘッド領域の一部であるドメインＩＩＩ又はドメインＩＶに対するＮ型糖鎖導入或いはドメインＩＶを含むヘッド領域の欠損変異により非中和エピトープ（有害・無益なエピトープ）の脱エピトープ化を図ることによって、重要領域であるボディ領域上に残存している中和エピトープ（有益なエピトープ）に対する免疫応答をより効率的・効果的に誘導することができた結果であると考えられる。言い換えれば、ＣＭＶ ｇＢ抗原上のデコイ領域に対する偏った免疫応答（免疫偏向）を、免疫リフォーカシング戦略によって理想的な形に矯正（免疫矯正）することができたものと考えられる。
実施例７ 改変体抗原のモルモット抗血清を用いた中和試験
実施例６で作製したＶＣ３１、ＶＣ３７、ＶＣ４０及び（Ｄ１Ｄ２）×２の免疫血清に加え、（Ｄ１’Ｄ２）×２の免疫血清を使用して、線維芽細胞系及び上皮細胞系における中和抗体誘導活性（プラーク数減少率）を評価した。
＜ＣＭＶ ＡＤ１６９株／線維芽細胞中和試験＞
線維芽細胞を用いた中和抗体価解析は、フォーカス数減少活性（フォーカスリダクション活性）を用いて行った。解析には、ＣｅｌｌＢＩＮＤ加工されたｂｌａｃｋ ｗａｌｌ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３３４０）又はｓｅｌｌ ｃａｒｒｉｅｒ－９６ Ｕｌｔｒａ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ６０５５７００）に２×１０４細胞／ウェルで播種したＭＲＣ－５細胞を一晩培養したプレートを使用した。各免疫血清を段階希釈して所定の濃度になるように調整し約１００～１０００ＰＦＵのＣＭＶ ＡＤ１６９株と混合後、３７℃で１時間反応させた。反応液を解析プレートの細胞に３０μＬ／ウェルで接種後、室温で４００×ｇの遠心を３０分行いウイルスを細胞に吸着させた。反応液を除去し、ＦＢＳ不含培地で１回洗浄後、２％ＦＢＳ含有培地で１６～２０時間培養した。培養後、細胞を５０％アセトン／ＰＢＳによる不活化及び固定を室温で２０分間行った。その後、室温で１０分間０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で処理し、洗浄後抗ＣＭＶ ＩＥ１－ＩＥ２モノクローナル抗体（ＣＨ１６０：Ａｂｃａｍ ａｂ５３４９５、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ ｓｃ－６９７４８）１μｇ／ｍＬを３７℃で１時間反応させた。洗浄後にＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ （Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８）（Ａｂｃａｍ ａｂ１５００７７）１μｇ／ｍＬを３７℃で１時間反応させ、さらに洗浄後－Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ（登録商標）－ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｄｏｊｉｎｄｏ ３４６－０７９５１）１μｇ／ｍＬを室温で１０分間反応させ洗浄したプレートに１００μＬ／ウェルで０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加して、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ ｍｉｃｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で各ウェルの画像を取り込み、解析ソフトＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＣＭＶ ＩＥ１－ＩＥ２モノクローナル抗体反応細胞数及び総細胞数をカウントし、総細胞数におけるＣＭＶ ＩＥ１－ＩＥ２モノクローナル抗体反応細胞数の割合を算出した。ウイルスのみを添加した場合のＣＭＶ ＩＥ１－ＩＥ２モノクローナル抗体反応細胞数の割合を基準に、各免疫血清による細胞数の割合の抑制率（阻害率）から、中和活性を判定した。
線維芽細胞系中和試験の結果を図８及び９に示す。図８及び９のグラフ中にはｎ＝３の平均値をプロットし±ＳＥエラーバーを付記している。ＶＣ３１、ＶＣ３７、ＶＣ４０、（Ｄ１Ｄ２）×２及び（Ｄ１’Ｄ２）×２の免疫血清は、ｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ ｖ９より高い中和抗体活性を誘導していることが確認された。
＜ＣＭＶ ＡＤ１６９ｒｅｖ／上皮細胞中和試験＞
上皮細胞を用いた中和抗体価解析は、フォーカス数減少活性（フォーカスリダクション活性）を用いて行った。解析には、ｃｅｌｌ ｃａｒｒｉｅｒ－９６ Ｕｌｔｒａ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ６０５５７００）に２×１０４細胞／ウェルで播種したＡＰＲＥ－１９細胞を一晩培養したプレートを使用した。ウイルスは、実施例４で調製したＡＤ１６９ｒｅｖ株を用いた。各免疫血清を段階希釈して所定の濃度になるように調整し約１０００ＰＦＵのＣＭＶ ＡＤ１６９ｒｅｖ株と混合後、３７℃で１時間反応させた。反応液を解析プレートの細胞に３０μＬ／ウェルで接種後、室温で４００×ｇの遠心を３０分行いウイルスを細胞に吸着させた。反応液を除去し、ＦＢＳ不含培地で１回洗浄後、２％ＦＢＳ含有培地で１６～２０時間培養した。培養後、細胞を５０％アセトン／ＰＢＳによる不活化及び固定を室温で２０分間行った。その後、室温で１０分間０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で処理し、洗浄後抗ＣＭＶ ＩＥ１－ＩＥ２モノクローナル抗体（ＣＨ１６０：Ｓａｎｔａｃｒｕｚ ｓｃ－６９７４８）１μｇ／ｍＬを３７℃で１時間反応させた。洗浄後にＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８）（Ａｂｃａｍ ａｂ１５００７７）１μｇ／ｍＬを３７℃で１時間反応させ、さらに洗浄後－Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ（登録商標）－ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｄｏｊｉｎｄｏ ３４６－０７９５１）１μｇ／ｍＬを室温で１０分間反応させ洗浄したプレートに１００μＬ／ウェルで０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加して、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ ｍｉｃｒｏ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で各ウェルの画像を取り込み、解析ソフトＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＣＭＶ ＩＥ１－ＩＥ２モノクローナル抗体反応細胞数及び総細胞数をカウントし、総細胞数におけるＣＭＶ ＩＥ１－ＩＥ２モノクローナル抗体反応細胞数の割合を算出した。ウイルスのみを添加した場合のＣＭＶ ＩＥ１－ＩＥ２モノクローナル抗体反応細胞数の割合を基準に、被験物質による細胞数の割合の抑制率から、中和活性を判定した。
上皮細胞系中和試験の結果を図１０及び１１に示す。図１０及び１１のグラフ中にはｎ＝３の平均値をプロットし±ＳＥエラーバーを付記している。ＶＣ３１、ＶＣ３７、ＶＣ４０、（Ｄ１Ｄ２）×２及び（Ｄ１′Ｄ２）×２の免疫血清は、ｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍ ｖ９より高い中和抗体活性を誘導していることが確認された。
以上の結果は、ＣＭＶ ｇＢ抗原のヘッド領域であるドメインＩＩＩまたはドメインＩＶに対するＮ型糖鎖導入或いはヘッド領域の一部であるドメインＩＶの欠損変異により非中和エピトープ（有害・無益なエピトープ）の脱エピトープ化を図ることによって、重要領域であるボディ領域上に残存している中和エピトープ（有益なエピトープ）に対する免疫応答をより効率的・効果的に誘導することができた結果であると考えられる。言い換えれば、ＣＭＶ ｇＢ抗原に対する偏った免疫応答（免疫偏向）を、免疫リフォーカシング戦略によって理想的な形に矯正（免疫矯正）することができたものと言える。
本発明の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質は、ＣＭＶ感染症の予防及び治療に効果的なワクチンの作製に使用できる。

Claims (9)

  1. 野生型サイトメガロウイルスのエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ＣＭＶ ｇＢタンパク質）のヘッド領域が改変され、かつ、ボディ領域認識抗体の誘導能が向上した、改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質であって、ヘッド領域における改変が、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置５４４及び５８８の相当位置のアミノ酸残基への糖鎖導入による改変を含む、改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
  2. ヘッド領域における改変が、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置５４４、５８８、及び６０９の相当位置のアミノ酸残基への糖鎖導入による改変を含む、請求項１に記載の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
  3. ヘッド領域における改変が、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置７７、５４４、及び５８８の相当位置のアミノ酸残基への糖鎖導入による改変を含む、請求項１に記載の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
  4. ヘッド領域における改変が、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置７７、５４４、５８８、及び６０９の相当位置のアミノ酸残基への糖鎖導入による改変を含む、請求項１に記載の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
  5. 糖鎖が、
    配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置７７の相当位置のアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換及び位置７９の相当位置のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換と、
    配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置５４４の相当位置のアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換及び位置５４６の相当位置のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換と、
    配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置５８８の相当位置のアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換及び位置５８９の相当位置のアミノ酸残基のグリシン残基への置換と、
    配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置６０９の相当位置のアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換、位置６１０の相当位置のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換及び位置６１１の相当位置のアミノ酸残基のトレオニン残基への置換と
    によって導入された、請求項４に記載の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
  6. 前記改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質はボディ領域における改変を含み、該ボディ領域における改変が、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置２１５の相当位置のアミノ酸残基の置換を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
  7. 前記改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質はボディ領域における改変を含み、該ボディ領域における改変が、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置１３２、１３３、２１５及び２１６の相当位置のアミノ酸残基の置換を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
  8. ヘッド領域における改変が、さらに配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置４３２及び４３４の相当位置のアミノ酸残基の置換を含み、さらに、前記改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質はボディ領域における改変を含み、該ボディ領域における改変が、配列番号１に記載のアミノ酸配列における位置１３２、１３３、２１５及び２１６の相当位置のアミノ酸残基の置換を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質を含む、ＣＭＶワクチン。
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