CN101678095A - 新型鼻病毒中和免疫原(nimiv)及其在疫苗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防或治疗人类鼻病毒感染的方法和组合物。

Description

新型鼻病毒中和免疫原(NIMIV)及其在疫苗中的应用
发明领域
本发明涉及预防或治疗人鼻病毒感染的方法和组合物。
发明背景
人鼻病毒(HRV)是普通感冒唯一最重要的病原体(Arruda等，J.Clin.Microbiol.35：2864-2868(1997)；Couch，“Rhinoviruses.”In：Fields，B.N.，Knipe，D.M.(主编)，Virology.Raven Press，New York，607-629(1990)；Turner，Antivir.Res.49(1)：1-14(2001)。导致约1/3普通感冒爆发的HRV约有100种血清型，来自被HRV感染患者恢复期血清不完全交叉中和。尽管HRV引起的上呼吸道疾病通常轻微并且具有自限性，然而工作和学习停顿所造成的社会经济影响以及不恰当使用抗生素的程度是显著的。据估计，每年在美国上呼吸道疾病导致至少2500万次请假和2300万次缺课(Anzueto等，Chest 123(5)：1664-1672(2003)；Rotbart，Antivir.Res.53：83-98(2002))。
越来越多的证据表明HRV感染和更严重的医学并发症之间的联系。例如HRV引起的感冒是急性中耳炎和鼻窦炎重要的易感因素，并且是引起成人和小孩哮喘恶化的主要因素。HRV感染也与患有囊性纤维病、支气管炎和其他潜在的呼吸系统病症的个体的下呼吸道综合症相关(Gern，Pediatr.Infect.Dis.J.23：S78-S86(2004)；Anzueto等，Chest 123(5)：1664-1672(2003)；Gern等，Clin.Microbiol.Rev.12(1)：9-18(1999)；Pitkaranta等，J.Clin.Microbiol.35：1791-1793(1997)；Pitkaranta等，Pediatrics 102：291-295(1998)；Rotbart，Antivir.Res.53：83-98(2002))。
迄今为止，预防或治疗HRV感染引起的疾病还没有经批准的有效抗病毒疗法。因此，存在寻找可以起以下作用药剂的显著未满足的医药需求：预防HRV感染、缩短HRV引起的疾病的持续时间、减轻症状的严重性、减少继发细菌感染和减轻潜在疾病(underlyingdisease)的恶化、减少病毒传播。预防性HRV疫苗应针对多种血清型起保护作用，以减少HRV感染数量并缩小其临床影响。
制备基于对应单独结构蛋白的保守区(McCray等，Nature329：736-738(1987))或作为生物融合体的一部分(Brown等，Vaccine9：595-601(1991)；Francis等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：2545-2549(1990))的合成多肽HRV疫苗的尝试仅取得有限成功，因为所选肽免疫原性低，这可部分通过它们较少接触病毒表面(有限接触抗体)或构象局限性来解释。
本发明克服了这些限制，并展示了诱发保护血清型交叉反应的中和抗体应答从而预防和治疗HRV感染的疫苗。
发明概述
本发明提供分离的鼻病毒中和免疫原IV(NimIV)肽。这些肽可以来自鼻病毒的任何血清型，例如人鼻病毒(例如HRV14)。这些肽可以包括例如人鼻病毒的病毒结构蛋白1(VP1)的羧基末端区域的第277-283位氨基酸(例如第275-285位氨基酸)。例示性的序列包括以下序列：PVIKKR、PVIKKRK(HRV14)、PVIKKRE(HRV6和HRV72)、PVIKKRS(HRV92)、PVIEKRT(HRV83)、PKIIKKR(HRV86)、PVIKRRE(HRV35)、PIIAKRE(HRV79)、TIIKKRT(HRV3)、NTEPVIKKRKGDIKSY(HRV14)和A-X1-X2-I-X3-X4-R-X5-B，其中X1＝P或T；X2＝V、K或I；X3＝K、E、I或A；X4＝K或R；X5＝S、E、D、T、R、T或K；A＝0-10个附加氨基酸；和B＝0-10个附加氨基酸。
本发明还包括分离的编码NimIV肽的核酸分子或其互补核酸分子(complement)。此外，本发明包括含有本发明的肽和核酸分子的载体(例如HRV14载体)。该载体可以是例如人鼻病毒载体，例如与可NimIV肽所获自的人鼻病毒血清型不同的人鼻病毒载体。在一个实施方案中，NimIV肽分子或核酸分子存在于上述人鼻病毒载体，代替了最初存在于上述载体的NimIV序列。在另一个实施方案中，NimIV肽所获自的人鼻病毒是人鼻病毒6(HRV6)或者人鼻病毒72(HRV72)。HRV72的NimIV肽可包含在例如人鼻病毒14(HRV14)载体中。在另一个实施方案中，NimIV肽所获自的人鼻病毒的VP1蛋白或者核酸取代了载体中的VP1蛋白或者核酸分子。在另外的实施方案中，该载体包括与NimIV肽交联的灭活人鼻病毒或者与NimIV序列融合的乙型肝炎核心序列(参见例如Fiers等，Virus Res.103：173-176，2004；WO 2005/055957；US 2003/0138769 A1；US2004/0146524 A1；US 2007/0036826 A1)。
本发明还包括药物组合物，其包含本文描述的肽、核酸分子和载体。该药物组合物还任选包括一种或多种可药用稀释剂、赋形剂、载体和/或佐剂。例示性的佐剂包括几丁质微粒和铝化合物。此外，该组合物可以任选包括一种或多种附加人鼻病毒中和免疫原。
本发明还包括在被试者中诱导鼻病毒免疫应答的方法。这些方法包括给予被试者分离的NimIV肽或核酸分子。在一些实施方案中，所述被试者没有受感染但存在发生鼻病毒感染的风险。在其他实施方案中，被试者已经感染鼻病毒。
定义
“给药”或“给予”是指给予哺乳动物(例如人)一定剂量本发明组合物的方法，所述方法是：例如鼻内给药、表面(topical)给药、全身给药、吸入给药、口服给药、静脉内给药、皮下给药、血管内给药、动脉内给药、瘤内给药、腹膜内给药、心室内给药、硬脑膜内(intraepidural)给药、鼻腔给药、直肠给药、巩膜内(intrascleral)给药、眼部给药、眼内给药或肌肉给药。根据不同的因素，例如药物组合物的组分、潜在和实际疾病位点(例如待治疗的肿瘤或血管病症的位置)和疾病的严重程度，优选的给药方法可以不同。
“人鼻病毒(human rhinovirus)”(HRV)是指小RNA病毒科(Picornaviridae)鼻病毒属(Rhinovirus)的任何成员。HRV可以根据血清型进行分类，已知其存在的血清型约有100种。例如，HRV14、HRV6、HRV37和HRV92分别是指血清型编号为14、6、37和92的人鼻病毒。
“可药用载体”是指被治疗的哺乳动物生理学上可接受、同时保留了与其一起给予的化合物预防或治疗特性的载体。一种例示性的可药用载体是生理盐水。其他生理上可接受的载体和其制剂已为本领域技术人员所熟知，实例参见例如Remington’s PharmaceuticalSciences，(第18版)，A.Gennaro主编，1990，Mack Publishing Company，Easton，PA，通过引用结合到本文中。
“中和免疫原(neutralizing immunogen)”(Nim)是指在引入人体之后诱发抗-HRV中和抗体的人鼻病毒(HRV)序列。对于本文描述的重组HRV疫苗，NimIV血清型置于上标处，以明确说明Nim的来源(例如NimIVHRV6是指来源于HRV6血清型的NimIV序列)。
“中和免疫原IV肽”或“NimIV肽”为具有鼻病毒结构蛋白1(VP1)羧基末端区域序列的肽(例如第274-289位氨基酸，使用HRV14(NTEPVIKKRKGDIKSY)作为参考；见图12B)。NimIV肽可以包括下述的特定序列、附加侧翼序列、或者仅核心、保守序列。此外，该肽可不经修饰，因此与天然存在的NimIV序列相同，或者可包括一个或多个置换、缺失、插入或其他修饰(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个置换、缺失或插入)，前提是基本维持该肽的免疫原性。此外，NimIV肽可包含L型或D型氨基酸，或其混合物。
可以用于本发明的NimIV肽序列的实例列举如下。例如，肽可以具有5-30、8-25、10-20、14-19、15-18或16-17个氨基酸的长度。该肽可包含核心NimIV序列，并任选在侧翼具有附加NimIV序列或连接序列(例如在氨基末端和/或羧基末端有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)。核心NimIV序列的实例包括：PVIKKR、PVIKKRK(HRV14)、PVIKKRE(HRV6和HRV72)、PVIKKRS(HRV92)、PVIEKRT(HRV83)、PKIIKKR(HRV86)、PVIKRRE(HRV35)、PIIAKRE(HRV79)、TIIKKRT(HRV3)、TIVKKRT(HRV3)、TAIVTRP(HRV2)、VAIRPRT(HRV16)、TAIVRRN(HRV1A)、NTEPVIKKRKGDIKSY(HRV14)，和其他与这些序列比对的HRV序列(例如，参见图11)。核心序列可定义为例如式A-X1-X2-I-X3-X4-R-X5-B，其中X1＝P或T；X2＝V、K或I；X3＝K、E、I或A；X4＝K或R；X5＝S、E、D、T、R、T或K；A＝0-10个附加氨基酸；B＝0-10个附加氨基酸。A和/或B的序列可以为天然存在的NimIV/VP1序列、人工合成序列(例如连接序列)、或其混合物。
“中和免疫原IV核酸分子”或“NimIV核酸分子”为本文定义的编码NimIV肽的核酸分子或其互补核酸分子。
如果NimIV肽或核酸分子不包括与其在天然存在病毒上邻接的侧翼序列，则它是“分离的(isolated)”。此肽或核酸分子可限定为：例如VP1全长序列、VP1羧基末端的一半、VP1羧基末端的四分之一、或VP1的羧基末端15-30个氨基酸、或核酸序列的相应区域(参见例如Laine等，J.Gen.Virol.87：129-138，2006)。
在以下情况中NimIV肽“基本由特定序列组成”：其只包含此序列，并在氨基和/或羧基端可能包含最少量侧翼序列(例如1-10、2-9、3-8、4-7或5-6个氨基酸)，所述侧翼序列可为天然存在的序列、人工序列(例如连接序列)、或其组合。这样的序列可以存在于更大序列(例如异源病毒或其他载体序列)中。
在以下情况中NimIV核酸分子“基本由特定序列组成”：其只包含此序列，并在5’和/或3’端可能包含最少量侧翼序列(例如3-30、6-27、9-24、12-21或15-18个核苷酸)，所述侧翼序列可为天然存在的序列、人工序列(例如连接序列)、或其组合。这样的序列可以存在于更大序列(例如异源病毒或其他载体序列)中。
本发明其他特征和优点将在以下发明详述、附图和权利要求中显而易见。
附图简述
图1是CR6基因组的结构区(下图)和HRV6与HRV14的NimIV序列的氨基酸比对(上图)的图。
图2A和2B是显示用豚鼠多克隆抗体抗-HRV14(图2A)和抗-HRV6(图2B)进行的CR6(NimIV序列为HRV6序列的嵌合体，其包含除NimIV序列以外的HRV14序列，；本文还称之为CR6；每对柱中的右柱(绿色))和HRV14(每对柱中的左柱(棕色))的蚀斑减少中和试验结果的图。20K、40K、60K、80K对应的抗体效价分别为2×104、4×104、6×104和8×104。上面(绿色)和下面(棕色)的虚线分别表示HRV14和HRV650％减少的蚀斑数。
图3A-3D是HRV14和CR6的三维模型。图3A和3B是基于已知晶体结构(Che等，J.Virol.72：4610-4622(1998))使用嵌合体软件(Chimera software)(http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/)设计的HRV14病毒颗粒的3D模型。VP1、Vp2和VP2分别用深蓝色、红紫色和灰色表示。HRV14颗粒用空间填充模型表示，其中Nim在其范德华表面(Van-der-Vaals surface)用颜色标明。分别用绿线、蓝线和红紫色线围起的面分别表示NimIII、NimIV和NimII。图中显示NimIV与NimIII的接触通过K287来提供。注意到在此模型的NimI被用深绿色表示的NimI-特异性Fab17所覆盖。
图3C和3D是使用Accelrys Discovery Studio v1.5.1(AccelrysSoftware，Inc.)制作的3D模型。图3C-HRV14颗粒的NimI、NimII、NimIII和NimIV的空间填充模型。通过范德华立体表面(Van-der-Vaals solid surface)展示Nim的氨基酸残基。分别用蓝色和红色表示正电荷表面和负电荷表面。图3D-HRV14和CR6病毒的空间填充模型的比较(仅显示NimIII和NimIV)。基于已知的晶体结构(见上文)和蛋白质序列CR6的信息(见图1)预测了CR6的结构。注意：HRV14的NimIV的正电荷K287与NimIII的负电残基紧密接触，然而在CR6中因为K287T置换这种联系被废止。
图4显示CR6与鼠抗-HRV37、鼠抗-HRV92和鼠抗-HRV6血清中和的结果。图4A是HRV14、HRV37、HRV6和HRV92的NimIV比对。氨基酸按照HRV14模板(下面)进行编号。相同的区域用矩形(蓝色)表示。图4B是显示用由相应纯化病毒产生的抗-HRV37、抗-HRV92和抗-HRV6小鼠抗体进行的HRV14(每对柱中的左柱，棕色)和CR6(每对柱中的右柱，绿色)的蚀斑减少中和试验(PRNT)研究结果的一组图表。50％中和效价用图中的虚线或相应图表下的图中方框内数字(50％NUT)表示。
图5显示基于NimIVHRV6和NimIVHRV14特异性合成肽的实验数据。图5A是用豚鼠抗-HRV14(GP14)和抗-HRV6(GP6)多克隆抗体检测KLH-连接肽H6(NimIVHRV6)和H14(NimIVHRV14)的蛋白质印迹。图5B是用相同抗体检测的游离H6和H14肽的蛋白质印迹，泳道(1)-蛋白质分子量标记，泳道(2)-H6-KLH(A)或H6(B)，泳道(3)-H14-KLH(A)或H14(B)。图5C是显示用GP6和GP14进行H6和H14的ELISA分析结果的图。
图6是显示用鼠抗-HRV14-NimIVHRV6血清进行的HRV14和HRV6的蚀斑减少中和试验(PRNT)研究结果的图。这些数据显示NimIVHRV6在HRV14壳体(capsid)本底下的免疫优势。
图7是显示HRV14和CR6的蚀斑减少中和试验(PRNT)研究结果的图，该图显示了被NimIII单克隆抗体(Mab5)中和的CR6比HRV14少约十倍。
图8是显示HRV14和CR6的蚀斑减少中和试验(PRNT)研究结果的图，该图显示了被NimII单克隆抗体(Mab16)中和的CR6比HRV14多约五倍。
图9是显示HRV14和CR6的蚀斑减少中和试验(PRNT)研究结果的图，该图显示了被NimI单克隆抗体(Mab17)中和的CR6比HRV14少约1.5倍。
图10是显示Nim IV影响NimI、NimII和NimIII(50％中和效价)的表。
图11显示NimIII和NimIV序列的比对，以及这些序列在HRV结构蛋白中的位置。
图12A是CR6和CR72嵌合体的VP1序列的比对。图12B是表示HRV基因组的简图，对HRV6、HRV72和HRV14的NimIV进行了比对。
图13是一对显示NimIV赋予嵌合重组体的供体血清型中和特性图。图13A显示用GP72抗体中和CR72(空柱)和HRV14(黑柱)的效价。图13B显示用GP6抗体中和CR6(空柱)和HRV14(黑柱)的效价。注意：GP6和GP72＝分别针对HRV6和HRV72的豚鼠多克隆抗体(ATCC)。
图14是显示NimIV置换对HRV14主链(backbone)其他Nim(针对HRV14、CR6和CR72的NimI、II、III Mab(中和作用))影响的表格。
图15是显示的抗-CR6和抗-CR72鼠抗血清针对HRV14、HRV6、HRV72、CR6和CR72的50％中和效价的表格。
发明详述
总的来讲，本发明涉及人鼻病毒(HRV)的新型免疫原性基因座，以及其在预防和治疗HRV感染的疫苗中的应用。本发明基于我们对新型HRV中和免疫原(Nim)NimIV发现，其可作为疫苗使用。如下文所述，此疫苗包括几种实施方案。这些实施方案包括：展示异源NimIV抗原的一种或多种重组HRV、单独的合成NimIV肽或在病毒、蛋白或化学连接载体中的合成NimIV肽、以及在生物载体中的血清型不同的NimIV肽的生物或化学融合物的混合物。这样的HRV疫苗诱发对多种HRV血清型产生NimIV-特异性免疫反应，可用于预防性和治疗性治疗HRV感染。NimIV抗原、包含NimIV的疫苗组合物以及此组合物的使用方法在下文中进一步描述。
中和免疫原IV(NimIV)
鼻病毒(HRV)的三种主要表面中和免疫原(NeutralizingImmunogen)(NimI、NimII和NimIII)诱发高特异性中和免疫应答。Nim特异性抗体阻断病毒吸附于细胞受体(ICAM-1)。本发明基于新型Nim(NimIV)的发现，其包括在结构蛋白VP1 C末端的一段约17-25个氨基酸序列并经过分子进化实验鉴定。我们证实了NimIV可在不同HRV血清型之间交换。例如，当供体血清型HRV(例如HRV6或HRV72)的NimIV被引入另一种血清型宿主病毒(例如HRV14)中时，其将供体血清型的中和特征赋予得到的嵌合重组体，从而显著改变宿主病毒的中和特性。将NimIV掺入重组HRV疫苗会导致定向针对(directed against)多种HRV血清型的血清交叉反应免疫应答的产生。
利用嵌合型NimIV抗体的重组HRV疫苗
理想HRV疫苗的一个特征是保护人类免受广范围HRV血清型的HRV感染风险的能力。本发明疫苗的特征在于能够诱发针对引起人类疾病的众多HRV血清型(例如大部分或更理想的是所有HRV血清型)的保护性和治疗性免疫应答。这可以通过在疫苗中使用多种NimIV序列来实现，包括例如将供体血清型的NimIV抗原添加(addition)到一小群宿主血清型HRV中。如我们在下文所述，转移的NimIV抗原引起血清型特异性的强烈中和抗体反应。在嵌合型疫苗或重组疫苗中，第一血清型NimIV抗原与第二血清型宿主HRV结合(combination)会诱发定向针对这两种HRV血清型的中和抗体，因而与不是在NimIV基因座嵌入的疫苗相比，得到更广泛的保护性或治疗性益处。例如，用NimIVHRV6置换HRV14的NimIVHRV14(即在HRV血清型14中的NimIV抗原)得到HRV疫苗CR6(下文进一步讨论)。此疫苗诱导产生同时定向针对HRV14和HRV6血清型的中和抗体。在另一个实施方案中，用NimIVHRV72置换HRV14的NimIVHRV14得到HRV疫苗CR72(下文进一步讨论)。此疫苗产生同时定向针对HRV14和HRV72血清型的中和抗体。由此构建的重组HRV混合物(其包含众多供体血清型NimIV抗原和有限宿主血清型HRV组合)代表用于预防或治疗HRV感染的理想疫苗。
NimIV肽
本发明第二个实施方案是人工合成或天然来源的NimIV肽的应用，此NimIV肽与NimIV基因座的氨基酸序列相对应。本文其他地方提供了此肽的实例(见例如发明概述和实验性实施例)。给予由许多HRV血清型合并的肽混合物，诱发对预防或治疗HRV感染的广泛保护性中和抗体应答。NimIV肽混合物可以单独给药或与可药用佐药或免疫系统刺激剂联合给药(见下文)。
NimIV融合分子
本发明另一方面是NimIV抗原与生物载体的化学或生物融合用作HRV疫苗。在上下文中，来源于一种或多种血清型的NimIV肽与合适的生物载体(例如乙型肝炎核心抗原)结合(bond)，以延长NimIV肽降解半衰期，提高其组织渗透率(penetrance)和特异性、可探测性或免疫原性。此NimIV融合分子的混合物(取自(drawn from)许多HRV血清型)可用于接种人以预防或治疗HRV感染。在其他实施方案中，NimIV肽(其可来源于许多不同血清型)与HRV载体交联。
给药和剂量
本发明还提供组合物，该组合物包含本文描述的预防上或治疗上有效量的一种或多种人鼻病毒疫苗。HRV疫苗的混合物可在相同的药物组合物(单一剂型)或分开的药物组合物(分开剂型)中存在，其可伴随(concomitantly)给药或分不同次数给药。该组合物可经配制用于多种递药系统。组合物还可以包含一种或多种生理上可接受的赋形剂或载体用作合适的制剂。病毒可以冻干形式或溶解在生理上可容的溶液或缓冲液(例如盐水或水)中。制备和配制的标准方法可以应用在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版)，A.Gennaro(主编)，1990，Mack Publishing Company，Easton，PA中所描述的方法。
该组合物预期用于鼻内给药、胃肠外给药、表面(topical)给药、口服给药或局部给药用以预防性和/或治疗性治疗。一般而言，该组合物是鼻内给药(例如通过喷雾法或滴鼻剂)、胃肠外给药(例如通过肌肉、皮下或静脉注射)、或口服法、或通过表面施用或关节内注射。另外的给药途径包括血管内给药、动脉内给药、瘤内给药、腹腔内给药、心室内给药、硬脑膜内给药，以及眼部给药、巩膜内给药、眼眶内给药、直肠给药或表面给药。本发明还特别地包括缓释给药，通过如长效注射(depot injection)或可蚀性植入物(erodibleimplant)或可蚀性成分的方法。因此，本发明提供用于粘膜给药或胃肠外给药的组合物，其包含溶解或悬浮在可接受载体、优选含水的载体(例如水、缓冲水、盐水、PBS等等)中的上述作用剂。该组合物可含有根据接近生理条件所需的可药用辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂、湿润剂和去污剂等等。本发明还提供用于经口递送的组合物，其可含有惰性成分，例如用于配制片剂和胶囊等等的粘合剂或充填剂。另外，本发明提供局部给药的组合物，其可含有惰性成分，例如用于配制霜剂和软膏剂等等的溶剂或乳化剂。
这些组合物可通过常规灭菌技术灭菌或过滤除菌。所得到的水溶液可包装待使用或进行冻干，冻干制剂与无菌水载体结合后再给药。制剂的pH通常在3-11之间，例如5-9、6-8或7-8，如7-7.5。得到的固体组合物以多个单剂量单元包装，每单元含有固定量的上述药剂(agent或agents)，例如以密封包装的片剂或胶囊的形式。该组合物还可以包括冻干形式的有效成分，其在给药时重新溶解(reconstitute)。
包含有效量疫苗的该组合物可经给药用以预防性和/或治疗性治疗。在预防性应用中，组合物可以以对HRV感染敏感性增加的量给予对象(例如人类对象)。本发明的组合物以足够量给予对象(例如人)以延缓、减少或防止临床或亚临床疾病的发病。在治疗性应用中，组合物以足够量给予受HRV感染的患者(例如人)，以治愈或至少部分阻止此病症的症状及其并发症。足以达到此目的的量被定义为“治疗有效量”。适宜的剂量和服法可容易由本领域技术人员确定。此应用的有效量可取决于疾病的严重性或患者的病况、体重和一般状况，而通常每名患者每剂量在约0.5mg-约3000mg药剂的范围。疫苗只能一次性给药或按初次/加强服法给药。用于初次给药和加强给药的适宜服法是指在初次给药后，随后以一个或多个小时、一天或多天、一周或多周或者一个或多个月的间隔给予重复剂量。存在于本发明组合物中的有效总量的药剂可以作为单剂量给予哺乳动物(以弹丸注射(bolus)或在相对短的时间内注入)，或者可以使用分段治疗(fractionated treatment)方案给药，即在更长时期内分多剂给药(例如每4-6、8-12、14-16或18-24小时一剂，或每2-4天、1-2周、每月一剂)。
存在于本发明组合物中并在应用于哺乳动物(例如人)的本发明方法中使用的治疗有效量的一种或多种药剂，可以通过本领域技术人员考虑了哺乳动物的年龄、体重、免疫系统完整性和病况的个体差异后确定。本发明的药剂以有效量给予对象(例如哺乳动物，如人类、小鼠、家畜(例如牛、羊或猪)、家庭宠物(例如猫或狗)，此有效量为在治疗患者时达到所期望的结果的量(例如预防易感个体的HRV感染或减轻感染个体的症状)。此治疗有效量可以由本领域技术人员通过经验来确定。
本发明疫苗可以与其他接种方法和其他治疗方法(例如基于小分子的方法)联用。例如，病毒可以联合包括相同或不同抗原的其他重组疫苗给药。本发明的联合方法包括本发明疫苗与其他抗原形式共给药。或者，本发明的疫苗可与其他方法(如亚单位法或HBc法(HBc-M2e；Fiers等，Virus Res.103：173-176，2004；WO 2005/055957；US 2003/0138769 A1；US 2004/0146524 A1；US 2007/0036826 A1))以初次-加强策略联用，本发明的疫苗或另一种方法用作初次，然后另一种方法用作加强，或相反。另外，本发明包括将本发明疫苗同时用作初次剂和加强剂的初次-加强策略。
本发明的疫苗可以使用标准方法给予对象，例如哺乳动物(例如人类对象)。对于鼻内给药，载体可以以滴鼻剂形式给药或通过吸入雾化或喷雾制剂给药。
本发明的载体可以作为活疫苗或灭活疫苗给予对象(例如人类)。活疫苗可以使用本领域技术人员所熟悉的方法鼻内给药(见例如Grünberg等，Am.J.Respir.Crit.Car.Med.156：609-616，1997)。适宜的剂量和服法可容易通过本领域技术人员确定。作为实例，剂量范围可以为每剂103-108pfu。该疫苗以单剂量给药会有利，然而如果本领域技术人员认为有需要，还可给予加强剂量。至于灭活疫苗，可以用例如福尔马林或UV处理杀死病毒，以每剂约108pfu任选与合适佐剂(例如几丁质或突变LT，见上文)进行鼻内给药。在此方法中，不止一剂(例如2-3剂)给药会是有利的。
包含在本发明疫苗的肽或蛋白质的大小可以在例如3-3000个氨基酸(例如5-500、10-100、20-55、25-45或35-40个氨基酸)的长度范围内，其可以由本领域技术人员适当地确定。因此，本发明可以应用长度在7-25、12-22和15-20个氨基酸范围内的肽。另外，本文所述的肽可以包括附加序列或可以减少长度，还可以由本领域技术人员适当地确定。本文列出的肽可以在本文所示的本发明的载体中存在，或可以通过例如置换或缺失一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸)来进行修饰。另外，该肽可以位于较大的肽内而存在于疫苗中。任选地，诸如上文和本文其他地方描述的肽在氨基端和/或羧基端包括附加序列，而不管这些序列与肽序列天然连接(例如，在流感病毒基因组中该序列与所述肽邻接)或否(例如合成连接序列)。因此，所述肽可以包括例如在一端或两端的1-25、2-20、3-15、4-10或4-8个氨基酸序列。作为具体实例，所述肽可在氨基端和/或羧基端包括1-3个连接序列。
佐剂
在疫苗应用中，可以任选使用本领域技术人员所熟知的佐剂。佐剂是根据给药途径来选择的。对于鼻内给药，可以使用几丁质微粒(CMP)(Asahi-Ozaki等，Microbes and Infection 8：2706-2714，2006；Ozdemir等，Clinical and Experimental Allergy 36：960-968，2006；Strong等，Clinical and Experimental Allergy 32：1794-1800，2002)。适用于粘膜途径给药(例如鼻内或口服途径)的其他佐剂包括大肠杆菌(E.coli)的不耐热毒素(LT)或其突变衍生物。对于灭活病毒，可以使用胃肠外佐剂，包括例如铝化合物(例如氢氧化铝、磷酸铝或羟基磷酸铝化合物)、脂质体制剂、合成佐剂例如(如QS21)、胞壁酰二肽、单磷酰脂质A或聚磷嗪(polyphosphazine)。另外，可以将编码具有佐剂活性的细胞因子的基因插入载体。因此，可以将编码细胞因子例如GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13或IL-5的基因与外源性抗原基因共同插入，以产生起以下作用的疫苗：增强免疫应答，或调整对细胞、体液或粘膜应答特异性更强的免疫性。或者，可以通过熟悉的方法(例如直接接种、裸DNA、在病毒的载体中等等)使细胞因子与重组疫苗病毒同时、序贯、分开递送。
实验性实施例
NimIV的鉴定
我们发现了中和免疫原NimIV，其包含长度为17-25个氨基酸的非保守病毒结构蛋白1(VP1)C末端序列。此表位可以在HRV血清型之间交换。如果NimIV被置换，它会将其中和特性赋予异源HRV。研究表明，NimIV的相应合成肽在ELISA和蛋白质印迹实验中能被病毒特异性抗体识别。
在下述进行的分子进化实验(VP1基因改组(gene shuffling))中，分离得到两个活性嵌合体HRV14-NimIVHRV6(CR6)和HRV14-NimIVHRV72(CR72)。如图12A给出的比对所示，CR6和CR72的VP1序列包含几个个别的氨基酸取代，并且在CR6和CR72中NimIVHRV6和NimIVHRV72分别置换了NimIVHRV14。NimIV的比对(图12B)显示：所有NimIV病毒都含有保守中心域(PVIKKRK/E)，而侧翼区是变化的。有趣的是，在所有HRV血清型(RM2506)中，第279-282位的氨基酸都显示出十分保守或相似。CR6和CR72的嵌合体显示出与多克隆豚鼠抗体GP6和GP72(ATCC)的强中和性，而这些抗体不中和主链病毒(backbone virus)(HRV14；图13)。结果显示，与GP6或GP72相比针对HRV6和HRV72得到的小鼠多克隆抗体中和CR6和CR72的效价低10倍，其证实CR6和CR72的NimIV决定子是表面外露的，并以有利的构象用以与中和抗体结合。嵌合体中这些表位的构象很可能与野生型病毒的一致。
作为分离NimIV置换方法的DNA改组
在产生HRV嵌合体CR6之后发现NimIV是可能的，该嵌合体具有(carry)以下置换：VP1C末端部分的18个氨基酸被HRV6相应的17个氨基酸区域置换(见图1)。此序列通过DNA改组，随后将此片段重新克隆到HRV14感染性克隆中来得到(DNA改组方法综述参见Patten等人，DNA改组在药物和疫苗中的应用(“Applications ofDNA shuffling to pharmaceuticals and vaccines”)，Curr Opin Biotechnol8：724-733(1997)；使用的实例包括：Zhang等，由DNA改组和通过噬菌体展示文库得到的病肝病毒高变区1的广泛交叉反应模拟位(“Broadly cross-reactive mimotope of hypervariable region 1 of hepatitisC virus derived from DNA shuffling and screened by phage displaylibrary”)，J Med Virol 71：511-517(2003)；Castle等，草甘膦耐受基因的发现及定向进化(“Discovery and directed evolution of a glyphosatetolerance gene”)，Science 304：1151-1154(2004)；Pekrun等，通过DNA改组在猪尾恒河猴细胞中复制增强的1型人免疫缺陷病毒的进化(“Evolution of a human immunodeficiency virus type 1 variant withenhanced replication in pig-tailed macaque cells by DNA shuffling”)，JVirol 76：2924-2935(2002)；Toth等，通过DNA改组提高植物病毒载体移动及宿主范围得特性(“Improvement of the movement and hostrange properties of a plant virus vector through DNA shuffling”)，Plant J30：593-600(2002)；Kaper等，超热稳定的β糖苷酶的DNA家族改组(“DNA family shuffling of hyperthermostable beta-glycosidases”)，Biochem J 368：461-470(2002).；Wang等，底物最佳化GroEL/S陪伴蛋白的定向进化(“Directed evolution of substrate-optimized GroEL/Schaperonins”)，Cell 111：1027-1039(2002)；和Hurt等，通过定向结构域改组和基于细胞选择获得的高特异性锌指蛋白(“Highly specificzinc finger proteins obtained by directed domain shuffling and cell-basedselection”)，Proc Natl Acad Sci U.S.A 100：12271-12276(2003))。DNA改组实验包含了约100个VP1序列(Ledgord等，所有人鼻病毒血清型的VP1测序：了解种系发育和对抗病毒壳体结合化合物的敏感性(“VP1 sequencing of all human rhinovirus serotypes：insights into genusphylogeny and susceptibility to antiviral capsid-binding compounds”)，JVirol 78：3663-3674(2004))。
CR6同时被GP6和GP14中和
CR6嵌合体的中和特异性显示出与亲代(parental)HRV14载体(pWR3.26感染性克隆)不同。除了检测到CR6与HRV14-特异性多克隆豚鼠抗体的中和作用之外(GP14；图2A)，我们还发现其与豚鼠HRV6-特异性抗体的中和作用(GP6；图2B)，然而亲代HRV14不被GP6中和(图2)。这表明HRV6的C末端结构域具有免疫原性和中和性。
CR6被NimI和NimII特异性单克隆抗体强烈中和，但不能被NimIII特异性单克隆抗体强烈中和
在HRV14本底中存在的NimIVHRV6(CR6)改变了其他Nim(HRV14)的中和作用(NA)。用NimHRV14特异性单克隆抗体(mAb)进行的PRNT显示：CR6 NimIII特异性中和作用降低(约10倍；图7)，而NimII特异性NA提高(5倍；图8)；NimI特异性中和作用仅受轻微影响(1.5倍；图9和16)。图10概述了这些发现。
NimIVHRV6和NimIVHRV72对主链Nim的中和效能的影响
为了研究NimIV置换对主链Nim中和特性的影响，针对CR6和CR72使用一组HRV14 Nim特异性小鼠单克隆抗体(图14)。两种嵌合体的NimI中和能力受轻微影响，但CR6对NimII和NimIII分别表现出中和率(neutralization rate)提高5倍和降低10倍。相反，CR72的NimIII依赖性中和作用则不受影响。遗憾的是，因为受到抗体供应的限制，没有研究NimII-特异性抗体对CR72的中和作用。这些数据证明了NimIV和NimIII结构域间存在强相互作用，这与结晶学和以往得到的诱变数据一致。
CR6和HRV14中NimIV与其他Nim相互作用的建模
这些结果显示NimIV HRV6对于CR6构象完整性的重要性。3D建模是在已知晶体结构的基础上完成的，所述晶体结构显示在HRV14中(但不在CR6颗粒中)NimIII与NimIV紧密接触(图3B、D)(Che等，通过病毒-Fab复合体的冷冻电子显微镜术和X衍射晶体学研究人鼻病毒14的抗体介导中和作用(“Antibody-mediatedneutralization of human rhinovirus 14 explored by means of cryoelectronmicroscopy and X-ray crystallography of virus-Fab complexes”)，J Virol72：4610-4622(1998))。在HRV14中，这种接触与VP1的正电荷K287有关，通过K287 NimIV与NimIII的负电荷残基相互作用(图3B、D)。在CR6中，T287突变废止了这种联系(图3D)。有趣的是，K287突变对NimIII特异性中和用作的负面作用先前已有文献记载(Sherry等，利用单克隆抗体鉴定普通感冒小RNA病毒：人鼻病毒的四种中和免疫原(“Use of monoclonal antibodies to identify fourneutralization immunogens on a common cold picornavirus，humanrhinovirus”)，J Virol 57：246-2571986))，但作者认为VP1的C末端区域不是中和免疫原(Nim)，因为没有逃逸突变体与对此区域特异的单克隆抗体起中和作用。CR6的NimIVHRV6仅轻微影响NimI特异性中和作用，这可以部分通过此表位与NimIV的距离较远来解释(图3C)。
CR6的唯一特征是其对NimII特异性中和作用的敏感性提高5倍(图14)。这种提高不能通过NimIVHRV6与NimIIHRV14的直接物理接触解释。3D建模显示在病毒颗粒中这两个Nim的位置相距较远(图3A-C)。此现象最可能通过VP2构象变化来解释，VP2构象的变化可能更利于单克隆抗体结合接触病毒颗粒表面的NimII。
CR6的交互中和作用概况
NimIVHRV6与所有100种血清型的NimIV的比对确定出其两种最接近的匹配：HRV37与HRV92的C末端(见图4A)。分析显示NimIV存在三个区域：由6个氨基酸(AA)(P-V-I-K-K-R)组成的保守(核心)区，以及核心区上游和下游的两个区。7种紧密相关的病毒(HRV14、HRV72、HRV83、HRV86、HRV35、HRV79和HRV3；见图11)的NimIV中也检测到核心。这里值得关注的是，在所有100种HRV血清型中，发现R282是保守的。如图4A所示，NimIVHRV6和NimIVHRV37的6个AA下游区域几乎相同(D/E-N-I-T-T-Y)，而HRV92的对应序列(S-L-I-T-N-Y)与它们差异较大。NimIVHRV6与NimIVHRV92的上游域具有两个相同的氨基酸，而NimIVHRV37的相应区域与NimIVHRV6则没有明显的相似性。NimIV之间的这种差异提供了机会评估表位的哪些部分对CR6病毒中和作用具有重要性。为了研究这一方面，我们制备了针对这三种血清型的鼠恢复期血清，并测试它们对CR6病毒的中和作用(图4B)。虽然NimIVHRV6和NimIVHRV37抗HRV37的下游区具有广泛同源性，但血清不显示中和作用，证明下游区对于中和作用无重要性。相反，与抗-HRV 6相比抗-HRV92血清的NA仅稍微降低。这三个血清样品都不能中和HRV14。这些结果表明了NimIV的功能性分析，并提供证据证明了上游区的交叉中和活性比核心区和下游区高。为了回答这些病毒被小鼠抗体识别的差异性是否反映了它们与NimIV特异性序列的实际相互作用的问题，我们合成了NimIVHRV14和NimIVHRV6-特异性肽，并用同一套抗体进行了蛋白质印迹和ELISA实验。
NimIV特异性肽与GP14和GP6的免疫反应性在血清型特异性肽之间的差异
在蛋白质印迹(图5A-B)和ELISA(图5C)实验中，GP6和GP14特异性识别同源性NimIV特异性肽。图5A和5B分别表示用KLH-连接材料和游离肽得到的蛋白质印迹结果。因为KLH的分子量很大(约3×105kDa)，所以图5A的蛋白质条带呈成片条带。给定肽的免疫反应性特异性很高，因用肽/抗体异源组合(GP6/NimIVHRV14或GP14/NimIVHRV6)没有检测到任何信号。KLH-连接材料中的异源组合有微弱信号归因于KLH特征。这些结果是HRV6和HRV14表面的NimIV表位为线性和具有高特异性的证据，HRV6和HRV14的纯化样品分别用于生产GP6和GP14。这些肽之间没有显著交叉反应性，证明了这些Nim的核心部分免疫原性低。若此表述不正确，则在本实验中应该观察到高交叉免疫反应性。
这些肽与GP6和GP14的高识别特异性还通过ELISA得以证实(图5C)。H14与GP14的反应性比H6与GP6的反应性低表明病毒颗粒表面的NimIV表位呈递差异。这些结果与图2所描述的PRNT数据相反。这两个实验中均无鉴定到HRV14和HRV6之间或它们的NimIV特异性肽之间有显著交叉反应性。
体内试验：抗-CR6血清中和HRV6
用100μl与佐剂(氢氧化铝)混合的病毒悬浮液(105pfu/ml)或模拟品(稀释剂)腹膜内免疫接种11-12周龄雌性B1b/c小鼠3次(在第1、14和28天)。最后小鼠在第49天采血。为了测试血清抗体水平，在接种之前(基线)，以及在异氟醚吸入麻醉下经眼后途经或不经麻醉经下颌骨途经免疫接种后第30-40天对小鼠采血(体积不超过7.7μl/g体重)。PPNT实验证实了HRV6与2只小鼠的血清库的特异性中和作用(图6)。这也显示了HRV14病毒中和作用降低，这提供了证据表明NimIVHRV6在CR6中是优势免疫表位。
方法
肽和缀合物
通过Biosynthesis，Inc(Lewisville，TX)用标准固相合成法制备寡肽NimIVHRV6、NimIVHRV72和NimIVHRV14，这些寡肽分别与HRV6(CKNIVPVIKKRENITTY)、HRV14(CNTEPVIKKRKGDIKSY)和HRV72(CNPKPVIKKREGDIKTY)结构区的C-末端对应。通过使用交联剂4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸琥珀酰亚胺酯(sMBS)和还原剂TCEP·HCl盐酸三(2-羧基乙基)膦(TCEP HCL)，使肽材料的部分与Concholepas concholepas的血蓝蛋白(KLH)缀合。
细胞培养、病毒繁殖和试剂
通过连续感染靶H1海拉细胞(HeLa cell)，将HRV血清型6、14、35、37、72、83、86、92原种(ATCC)扩增至高滴度。将海拉细胞(ATCC)维持在含有5％胎牛血清(JRH Biosciences，KS)的最低基础培养基(Minimum Essential Medium)(Invitrogen)中以进行常规繁殖。在传代过程中，使细胞维持在分会合生长状态。于34℃下48小时后，经过3次在-80和37℃下的冻融循环，使病毒从细胞中释放。弃去细胞碎片，同时将含有扩增病毒的上清液分成等份并在-80℃冷冻。从ATCC获得用于HRV血清型6、14、72、92和37的豚鼠抗血清。
VP1基因改组病毒文库
通过RT-PCR从HRV血清型6、14、35、37、72、79、83、86和92的RNA扩增VP1的DNA片段。为了作进一步克隆，通过重组PCR去除HRV血清型83、86、92的VP1基因中存在的固有AvrII位点。将所有PCR片段合并在一起并进行改组，随后克隆到改良的HRV14 cDNA载体pWR3.26(ATCC)。简而言之，用DNase I(Amersham Pharmacia Biotech，Inc)处理2微克合并的PCR片段，胶纯化出50-100bpDNA片段部分，然后不需引物进行15-25个循环的PCR(94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min)，接着用克隆引物进行25个循环的PCR(94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min)。将扩增改组VP1序列文库克隆到改良的pWR3.26质粒的XhoI和AvrII位点。为此目的，通过插入在VP1序列5’位的XhoI位点来改良HRV14 cDNA克隆pWR3.26(图12)。将XhoI和AvrII位点分别掺入到VP1正向和反向克隆引物。
VP1改组质粒DNA文库通过MluI消化进行线性化和并通过T7转录试剂盒(Epicentere，Inc)进行体外转录。RNA用lipofectine(Invitrogen，Inc)转染到H1-海拉细胞(ATCC)中。于34℃培养2-4天后收集细胞。细胞样品经过三个冻融循环，上清液用于感染单层H1-海拉细胞。病毒文库保藏在-80℃。
HRV14-NimIV重组病毒的分离
从上述病毒文库蚀斑纯化HRV14-NimIVHRV6(CR6)嵌合体。为了分离其他HRV14-NimIVHRVX重组体，用病毒文库的总RNA作模板，通过8条退火至VP1基因3’-末端的血清型-特异性反向引物进行8个不同的RT-PCR反应。所有这些反应都使用相同的正向引物，该引物与VP1基因的上游保守区互补。将得到的PCR片段重新克隆到上述用于VP1改组体(shuffliant)的pWR3.26质粒中。转录并转染到H1-海拉细胞后，将各别的病毒进行蚀斑纯化并测序。
动物实验方案
取8周龄的雌性Balb/c小鼠(10只/组)，通过腹膜内给予500μL与100μg佐剂(氢氧化铝)混合的过滤细胞培养基，在第0天对小鼠进行初次接种，然后在第14和28天进行加强接种，该细胞培养基每剂含有约1.0×106pfu的(1)HRV14-NimIVHRV6、(2)HRV14-NimIVHRV72、(3)亲本HRV14或模拟物(培养上清液)作为阴性对照。
使用与(或不与)KLH肽偶联的NimIVHRV6和NimIVHRV6免疫接种8周龄雌性Balb/c小鼠。小鼠在第0天用100μl含15μg KLH-连接肽的Titermax Gold(1∶1乳化剂)经皮下途径进行初次接种，(在第36天和第49天)通过腹膜内给予15μg溶解在100μl PBS的“游离”肽来进行两次加强接种。
通过在包被了相应合成NimIV肽的微量滴定板中进行的确立ELISA，测定血清中NimIV特异性抗体效价。
蚀斑减少中和试验(PRNT)
将约50pfu研究的HRV(在完全MEM+5％FBS培养基中)与样品血清的各级稀释液混合，总体积为300μL，于4℃下孵育过夜。在12孔组织培养板中，用100微升每种混合物感染1孔H1-海拉细胞(每孔接种6×105 H1-海拉细胞，于37℃下培养箱中孵育过夜)。于34℃下孵育1小时后，用1mL MEM中的0.4％琼脂糖和含有青霉素/链霉素的10％FBS覆盖细胞，并于34℃下孵育约3天。然后用甲醛(终浓度为3.7％)固定单细胞层，并用含1％结晶紫的70％甲醇染色。
ELISA
用5μg/ml NimIV特异性肽或纯化的HRV14病毒包被96孔板，于4℃下过夜。于37℃下用不同稀释度的抗血清孵育微孔板1小时，然后用1∶1000羊抗鼠IgG-AP(Southern Biotech，Inc)于37℃下缀合合小时。如厂家(Sigma，Inc)所述，微孔板在碱性磷酸酶底物中显影。
蛋白质印迹
将20μg肽在10％tris-甘氨酸SDS胶(Novex，Invitrogen，Inc)上点样，电泳运行一小段时间后，将肽转移到硝基纤维素膜(Bio-Rad，Inc)上。在室温下用封闭液(含5％脱脂乳的PBS/0.05％吐温)将膜浸泡1小时，实现膜的非特异性结合。将膜用含豚鼠抗-HRV6或抗-HRV14多克隆抗体(ATCC)(1∶1000)的封闭液于4℃下孵育过夜。将膜用PBS/0.05％吐温洗涤3次，每次15分钟，然后用含羊抗鼠IgG-AP缀合抗体(Southern Biotech)的封闭液在室温下孵育1小时。膜在AP底物(Sigma SIGMA FASTTM BCIP/NBT)中显影10分钟。
其他实施方案
所有出版物、专利申请和本说明书提及的专利通过引用结合于本文中。
在不背离本发明的范围和精神下，本发明描述的方法和系统的多种修改和变更对本领域技术人员都是显而易见的。虽然已结合具体所需的实施方案描述了本发明，但应该理解的是，所要求保护的本发明不应过分限于这些具体实施方案。用于实施本发明所描述的各种修改，无疑对医学、药物学或相关领域的技术人员是显而易见的，并意欲落入本发明的范围内。本文使用的单数形式，例如“一个(种)”和“所述”，不排除相应的复数形式，除非上下文表明具有相反意思。

Claims (24)

1.一种分离的鼻病毒中和免疫原IV(NimIV)肽。
2.权利要求1的肽，其中所述NimIV肽是人鼻病毒14(HRV14)NimIV肽。
3.权利要求1的肽，其中所述NimIV肽包含人鼻病毒的病毒结构蛋白1(VP1)羧基末端区域的第277-283位氨基酸。
4.权利要求3的肽，其中所述肽包含人鼻病毒的VP1羧基末端区域的第275-285位氨基酸。
5.权利要求1的肽，其中所述肽的序列包含选自以下的序列：PVIKKR、PVIKKRK(HRV14)、PVIKKRE(HRV6和HRV72)、PVIKKRS(HRV92)、PVIEKRT(HRV83)、PKIIKKR(HRV86)、PVIKRRE(HRV35)、PIIAKRE(HRV79)、TIIKKRT(HRV3)、NTEPVIKKRKGDIKSY(HRV14)和A-X1-X2-I-X3-X4-R-X5-B，其中X1＝P或T；X2＝V、K或I；X3＝K、E、I或A；X4＝K或R；X5＝S、E、D、T、R、T或K；A＝0-10个附加氨基酸；和B＝0-10个附加氨基酸。
6.编码NimIV肽的分离的核酸分子或其互补核酸分子。
7.包含分离的NimIV肽或核酸分子的载体。
8.权利要求7的载体，其中所述载体是人鼻病毒载体。
9.权利要求8的载体，其中所述人鼻病毒载体的血清型与NimIV肽所获自的人鼻病毒的血清型不同。
10.权利要求9的载体，其中所述NimIV肽或核酸分子取代了初始存在于所述载体中的NimIV序列存在于所述人鼻病毒载体中。
11.权利要求8的载体，其中所述人鼻病毒载体是人鼻病毒14(HRV14)载体。
12.权利要求7的载体，其中所述NimIV肽所获自的人鼻病毒是人鼻病毒6(HRV6)或人鼻病毒72(HRV72)。
13.权利要求8的载体，其中所述人鼻病毒载体是人鼻病毒14(HRV14)载体，而所述NimIV肽所获自的人鼻病毒是人鼻病毒6(HRV6)或人鼻病毒72(HRV72)。
14.权利要求10的载体，其中所述NimIV肽所获自的人鼻病毒的VP1蛋白或核酸取代了所述载体的VP1蛋白或核酸分子。
15.权利要求7的载体，其中所述载体包含与NimIV肽交联的灭活人鼻病毒。
16.权利要求7的载体，其中所述载体包含与NimIV序列融合的乙型肝炎核心序列。
17.包含权利要求1的肽或权利要求6的核酸分子的药物组合物。
18.权利要求17的药物组合物，其中所述肽包含在载体内。
19.权利要求17的药物组合物，所述药物组合物还包括一种或多种可药用稀释剂、赋形剂、载体或佐剂。
20.权利要求19的药物组合物，其中所述佐剂选自几丁质微粒和铝化合物。
21.权利要求17的药物组合物，所述药物组合物还包含一种或多种另外的人鼻病毒中和免疫原。
22.在对象中诱导针对鼻病毒免疫应答的方法，所述方法包括给予对象分离的NimIV肽或核酸分子。
23.权利要求22的方法，其中所述对象没有受到鼻病毒感染，但具有被鼻病毒感染的风险。
24.权利要求22的方法，其中所述对象已被鼻病毒感染。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090096414A (ko) * 2006-09-29 2009-09-10 사노피 파스테르 바이오로직스 씨오 재조합 리노바이러스 벡터
CA2718731A1 (en) * 2008-03-27 2009-10-01 Sanofi Pasteur Biologics Co. Recombinant rhinovirus vectors
EP2316481A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-04 Biomay Ag Pharmaceutical composition for the treatment and prevention of a rhinovirus infection
GB201115910D0 (en) 2011-09-14 2011-10-26 Univ Manchester Peptides
BE1022174B1 (fr) * 2013-03-15 2016-02-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccin
EP2970396B1 (en) * 2013-03-15 2022-02-23 Biological Mimetics, Inc. Immunogenic human rhinovirus (hrv) compositions
US11160857B2 (en) * 2015-06-15 2021-11-02 Emory University Multivalent enterovirus vaccine compositions and uses related thereto
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6147191A (ja) * 1984-07-20 1986-03-07 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド ヒト・ライノウイルスｒｎａおよびたんぱく
EP0169146A3 (en) 1984-07-20 1988-07-20 Merck & Co. Inc. Monoclonal antibodies directed against the cellular receptor of human rhinovirus
US5541100A (en) * 1990-09-12 1996-07-30 Rutgers University Chimeric rhinoviruses
US20030138769A1 (en) 2000-08-16 2003-07-24 Birkett Ashley J. Immunogenic HBc chimer particles having enhanced stability
US7361352B2 (en) 2001-08-15 2008-04-22 Acambis, Inc. Influenza immunogen and vaccine
US20040146524A1 (en) * 2002-02-21 2004-07-29 Katelynne Lyons Stabilized immunogenic HBc chimer particles
US7429472B2 (en) * 2003-01-31 2008-09-30 Promega Corporation Method of immobilizing a protein or molecule via a mutant dehalogenase that is bound to an immobilized dehalogenase substrate and linked directly or indirectly to the protein or molecule
WO2006037070A2 (en) * 2004-09-28 2006-04-06 Alza Corporation Stabilization of alum-adjuvanted immunologically active agents
US8153760B2 (en) * 2005-01-19 2012-04-10 Donald Danforth Plant Science Center Rhinovirus vaccines

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