CN101134781A - 携带被插入到乙肝核心抗原蛋白或其片段内的炭疽保护性抗原表位的重组融合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包括携带炭疽保护性抗原的一种或数种表位的一种或数种多肽的重组融合蛋白，所述的表位多肽以单表位或组合在一起的多个表位的形式插入到乙肝核心抗原(HBcAg)蛋白或其片段的相同或不同的许可位点，形成了能够刺激机体对炭疽感染产生多种中和抗体的重组融合蛋白，建立了利用载体蛋白分析评价抗原表位的方法，初步评价了各种融合蛋白的免疫原性和保护性，为现有炭疽疫苗的使用和发展表位疫苗等新型疫苗提供依据。本发明还涉及编码相同多肽的多核苷酸，及本发明中重组融合蛋白的制备方法及其在制备用于预防和/或治疗炭疽感染制剂和/或药物中的应用。

Description

携带被插入到乙肝核心抗原蛋白或其片段内的炭疽保护性抗原表位的重组融合蛋白及其用途

技术领域

本说明涉及一系列基因工程重组融合蛋白，具体是涉及预防和/或治疗炭疽感染的重组融合蛋白。

本发明涉及重组融合蛋白，其乙肝核心抗原蛋白或其片段的作用为引发针对原自炭疽保护性抗原(PA)表位的免疫应答的蛋白载体。

本发明提供了该系列重组融合蛋白的氨基酸序列和编码该系列重组融合蛋白的核苷酸序列，以及相应重组融合蛋白的制备方法。

本发明还涉及该系列重组融合蛋白在制备用于预防和/或治疗炭疽感染的试剂和/或药物中的应用。

背景技术

炭疽是一种人畜共患的烈性传染病，病死率在我国法定报告的传染病中位居前十位。炭疽毒素是炭疽芽孢杆菌的主要致病因子之一，包括保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)三种蛋白质成分，在炭疽菌的致病与免疫中发挥重要作用。炭疽杆菌芽孢作为一种潜在的生物战剂和生物恐怖制剂，一直为各国所重视。近年来随着国际反恐斗争的发展，对炭疽的防护研究已成为国际生物医学界的研究热点之一。

炭疽分为肺炭疽，胃肠炭疽和皮肤炭疽三种类型，其中肺炭疽又称为吸入性炭疽，致死率在三者中是最高的，它通常由吸入炭疽芽孢所引起，在感染的最初几天呈现的是普通的流感样症状，所以早期的诊断非常困难，通常一旦症状出现，再想采取有效的措施就迟了。虽然抗生素能杀死细菌，但可能已经释放的毒素仍会导致患者的死亡(M.Mourez.Anthrax Toxins.Physiol Biochem Pharmacol，2004，152：135-164)。目前，对抗炭疽毒素最常用的措施就是暴露或未知暴露后的被动免疫(Sternbath G.The history of anthrax.Journalof Emergency Medicine，2003，24(4)：463-7)。然而虽然被动免疫是有效的(Sawada-Hirai R，Jiang I et al.Humananti-anthrax protective antigen neutralizing monoclonal antibodies derived from donors vaccinated with anthraxvaccine adsorbed.Journal of Immune Based Therapies and Vaccines，2004，2：5)，但免疫血清的有效性却非常有限，而且目前也没有能有效地对抗炭疽的治疗性抗体得到批准。另一方面，尽管目前有一些抗生素能有效地对抗炭疽杆菌，但基于炭疽所具有的战略意义，经过设计的，具有抗生素抗性的生物恐怖级别的炭疽症状很有可能在未来出现(Mary Ellen Smith，Martin Koser et al.Rabies Virus Glycoprotein as a Carrier forAnthrax Protective Antigen.Virology，2006，353(2)：344-356)。所以，疫苗接种是相对于暴露后治疗更具有消除感染风险意义的实用性的选择。

目前世界上人用炭疽疫苗主要有两类，一类是由炭疽减毒株制备的活芽孢苗，主要在我国和俄罗斯使用；另一类是由炭疽减毒株培养上清制备的PA吸附疫苗，主要在欧美国家使用。这两种疫苗虽然被长期使用，但都存在一些缺陷，如生产安全性要求高，免疫操作或免疫程序复杂，质控困难等，目前仅限于特殊人群，如畜牧业者、研究人员和军队等使用，不提倡对人群广泛接种。近年来，国内外都在加紧发展新型炭疽疫苗，主要是以重组PA为基础构建。这些包括编码PA的DNA疫苗(Ferrari ME，Hermanson G，Rolland A，Development of anthrax DNA vaccines.Current Opinion in Molecular Therapeutics，2004，6(5)：506-12)以及使用不同的微生物载体表达PA的方法，比如说流行性感冒病毒(Li ZN，Mueller SN，et al.Chimericinfluenza virus hemagglutinin proteins containing large domains of the Bacillus anthracis protective antigen：protein characterization，incorporation into infectious influenza viruses，and antigenicity.Journal ofVirology，2005，79(15)：10003-12)，痘苗病毒(Iacono-Connors LC，Welkos SL，et al.Protection against anthraxwith recombinant virus-expressed protective antigen in experimental animals.Infect Immun，1991，59(6)：1961-5)，腺病毒(TanY，Hackett NR，et al.Protective immunity evoked against anthrax lethal toxin after a singleintramuscular administration of anafenovirus-based vaccine encoding humanized protective antigen.HumanGene Therapy，2003，14(17)：1673-82)，基于委内瑞拉马脑炎病毒的复制子(Lee JS，Hadjipanayis AG，Welkos SL.Venezuelan equine encephalitis virus-vectored vaccines protect mice against anthrax spore challenge.InfectImmun，2003，71(3)：1491-6)所制得的疫苗。现在发展得最好的是吸附于氢氧化铝的重组PA疫苗(Keyserling，HL，Gorse，GJ，et al.The International Conference on Emerging Infectious Diseases(ICEID)，Atlanta，Georgia，2004)。

另一层面，随着表位生物学的兴起，人们逐渐认识到，绝大多数蛋白质抗原都有多个表位，这些表位中除了含有免疫识别所必须的结构外，同时还含有诸如：毒性或抑制性表位，优势非中和性表位，病理及自身抗原交叉反应性表位等。其次，在一个抗原分子中，即使同样都是参与某类免疫识别的表位，各表位对抗原的免疫原性和抗原性的贡献也不一样。就同一表位而言，表位内氨基酸残基的构成，连接顺序等也决定着抗原的特异性，不同氨基酸残基对抗原性作用大小也各异。再者，表位的性质，数目，排列方式，空间构型和侧翼序列等都与表位的功能密切相关。所以现在的免疫原研究越来越青睐于表位多肽水平。

对于炭疽的保护性抗原PA的表位研究，人们发现PA共有4个结构域(CarloPetosa，R.JohnCollier，etal.Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen.Nature，1997，385：833-838)，其中结构域1包含了一个Furin酶的切割位点并与配体(LF/EF)的结合有关；结构域2与孔道形成有关，它包含一个在易位过程中非常关键的胰凝乳蛋白酶的酶切位点(JunZhang，JunjieXu，et al.The2β₂2β₃loop of anthrax protective antigencontains a dominat neutralizing epitope.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，341：1164-1171)；结构域3与七聚体形成有关；结构域4则是PA与受体的结合部位。早期的研究认为其结构域4含有蛋白的主要中和性表位(Flick-Smith HC，Walker NJ，Gibson P，et al.A recombinantcarboxy-terminal domain of the protective antigen of Bacillus anthracis protects mice against anthrax infection.Infect Immun，2002，70(3)：1653-1656.)，但近年来发现结构域2(Brossier F，Levy M，Landier A，et al.Functional analysis of Bacillus anthracis protective antigen by using neutralizing monoclonal antibodies.Infectlmmun，2004，72(11)：6313-6317.)和结构域1(Johanna Rivera，Antonio Nakouzi，et al.A Monoclonal Antibodyto Bacillus anthracis Protective Antigen Defines a Neutralizing Epitope in Domain1.InfectImmun，2006，74(7)：4149-4156.)也存在PA的中和性表位。另一方面，国外有些研究发现，针对保护性抗原(PA)某些表位的单抗不仅不能中和毒素，相反在体外对毒素的毒性有加强作用(Belova EV，Dubilei SA，et al.Monoclonalantibodies to B.anthracis protective antigen are capable to neutralize and to enhance the anthrax lethal toxin actionin vitro.Mol Gen Mikrobiol Virusol，2004，(3)：21-22.(Abstrct))，这提示我们，在某些病毒感染中存在的抗体依赖性毒性增强作用(ADE)在炭疽杆菌感染中也可能出现。如果这种情况确实存在，那么基于完整PA的疫苗就可能有一定的风险性，而研究PA的中和性表位，在此基础上发展表位疫苗就可以避免这一问题。

对于表位疫苗的研究而言，最普遍的问题就是表位的分子量一般均较小，虽然所引发的免疫应答的针对性增强了并摆脱了抑制性或毒性表位的影响，但分子量在5KD以下的肽类一般无免疫原性，不能或者无法有效地激发满意的保护性免疫反应，而且易被破坏和清除。针对上述问题，本发明从两条途径入手制订了解决方案。一方面用优化表位的手段来增大表位的分子量，另一方面，采取了引入载体蛋白乙肝核心抗原蛋白或其片段的方法，不仅增大了分子量还改变了表位的存在形式(被展示到颗粒表面)，同时由于载体蛋白自身所具有的免疫佐剂的性质，进一步达到了增强免疫原性的目的。

乙肝核心抗原(HBcAg)是一种病毒样颗粒，由位于HBV基因组1901-2450位的C区基因编码而成，分子量为21000-22000，包括183或185个氨基酸，其中1-149位氨基酸为颗粒装配区域，150-183或185位氨基酸为核酸结合区。电镜下观察显示HBcAg分子可分别由240个、180个相同的亚单位组装成为大小分别为34nm、30nm的核心颗粒，这两种颗粒分别为T＝4、T＝3的正二十面体对称结构，在其表面分别有120和90个刺突。在颗粒表面形成的刺突中，78-83位氨基酸位于刺突的尖部，是HBcAg颗粒的主要免疫显性区域，126-135位在刺突侧面形成一个小的突出部位，这两个位点成为HBV核心颗粒表面主要的B细胞识别位点。另外，在颗粒的表面还有T辅助细胞识别位点1-20，28-47，50-69，72-105，108-165及CTL的识别位点18-27，88-96，141-151。另一方面，HBcAg病毒样粒子作为一种颗粒性抗原，易被抗原呈递细胞摄取，加工，处理及呈递，能激发机体较强的体液和细胞免疫作用。同时，由于重组HBcAg颗粒内部包含的少量的RNA能使机体免疫反应向Th1方向极化，故HBcAg颗粒本身还可以发挥免疫佐剂的作用。因此，HBcAg颗粒被认作是重组抗原较为理想的载体。乙肝核心抗原主要是通过交联和融合两种方式来发挥免疫载体的作用。融合主要有三种形式，国内外研究的经验表明，融合在羧基端和氨基端的外源性抗原，尽管有一定的免疫原性，但乙肝核心抗原自身的免疫原性依然存在，因而特异性较差。另一种方式即为刺突尖部插入。HBcAg的刺突尖部，目前已成为首选的插入位点，因为该区域位于颗粒表面；去除该区域某些特定氨基酸后，可以消除HBcAg本身的免疫原性；而且，该区域可以插入肽段的长度多达120个氨基酸。

因此，本发明将炭疽杆菌保护性抗原PA的中和性表位SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3所示序列与乙肝核心抗原蛋白或其片段融合在一起构成重组融合蛋白，利用乙肝核心抗原蛋白或其片段在插入外源片段后依然能形成颗粒状抗原，并将外源片段展示在颗粒表面，同时还能发挥免疫佐剂的性质，来增强所插入的外源片段的免疫原性，以达到建立利用载体蛋白分析评价抗原表位的方法，初步评价各种融合蛋白的免疫原性和保护性，为现有炭疽疫苗的使用和发展表位疫苗等新型疫苗提供依据。

发明内容

本发明的目的是提供一系列重组融合蛋白，该系列重组融合蛋白是将乙肝核心抗原蛋白或其片段和炭疽保护性抗原表位多肽融合在一起所构成的，该重组融合蛋白对炭疽感染有预防和/或治疗作用。

本发明所涉及的融合蛋白，基本上是包括乙肝核心抗原蛋白或其片段，以及由下列成员中的一个或多个连接而成的肽段：

1.n个炭疽杆菌保护性抗原的中和表位(n≥1)

2.i个柔性氨基酸组成的短肽序列(i≥0)

所述中和表位可以是下列成员及连续具有其所含n个氨基酸(n≥5)的衍生物之一：

SEQIDNO：1，

SEQIDNO：2，

SEQIDNO：3

所述的柔性氨基酸组成的短肽序列可以是下列成员之一：

SEQIDNO：4

SEQIDNO：5

SEQIDNO：6

所述的乙肝核心抗原蛋白或其片段序列可以是下列成员之一：

SEQIDNO：7

SEQIDNO：8

SEQ ID NO：9

本发明还提供了一种以本发明重组融合蛋白作为有效成分的疫苗制品，所以本发明还包括医学上可接受的药用佐剂，如铝佐剂等。

本发明的另一个目的是提供编码上述重组融合蛋白氨基酸序列的DNA序列。由于基因的简并性，编码相同肽段的DNA序列不是唯一的，但均应属本发明的保护范围。

本发明的又一目的是提供制备乙肝核心抗原或其片段-炭疽保护性抗原表位重组融合蛋白的方法

制备乙肝核心抗原蛋白或其片段-炭疽保护性抗原表位重组融合蛋白的方法包括以下几个部分：首先通过化学合成和重叠延伸PCR的方法分别拼接出乙肝核心抗原全长蛋白(HBcAg，183AA)，氨基端144个氨基酸(HBcAg-N144)及氨基端149个氨基酸(HBcAg-N149)所对应的基因序列，再通过同样的方法将炭疽杆菌保护性抗原的中和性表位(如序列SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3所示)分别以如下的方式：单表位插入，单表位重复插入，单表位经柔性氨基酸组成的短肽间隔后重复插入，不同单表位组合串联插入，不同单表位组合串联重复插入，不同单表位经柔性氨基酸组成的短肽间隔后组合串联插入，不同单表位经柔性氨基酸组成的短肽间隔后组合串联重复的方式插入HBcAg的78-79位氨基酸之间，或替换HBcAg76-81位氨基酸之间的任意n个氨基酸(1≤n≤6)：或插入HBcAg-N144的78-79位氨基酸之间，或替换HBcAg-N144的76-81位氨基酸之间的任意n个氨基酸(1≤n≤6)，或是分别插入到HBcAg-N144的78-79之间及144之后；或插入HBcAg-N149的78-79位氨基酸之间，或替换HBcAg76-81位氨基酸之间的任意n个氨基酸(1≤n≤6)，成为一个人工基因，并将该基因在表达载体系统中表达后纯化，得到乙肝核心抗原蛋白或片段-炭疽保护性抗原表位重组融合蛋白。

编码乙肝核心抗原蛋白或其片段的寡核苷酸片段的两端包含一对常用的限制性内切酶的酶切位点，比如说HindIII和BamH I等

本发明在设计上将炭疽保护性抗原PA的单个表位或组合在一起的多个表位插入到乙肝核心抗原蛋白或其片段的不同位点，形成了能够刺激机体对炭疽感染产生多种中和抗体的重组融合蛋白，建立了利用载体蛋白分析评价抗原表位的方法，初步评价了各种融合蛋白的免疫原性和保护性，为现有炭疽疫苗的使用和发展表位疫苗等新型疫苗提供依据。

附图说明

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式

实施例1、以HBcAg-N144为例制备乙肝核心抗原蛋白或其片段

1.分十段化学合成与HBcAg-N144相对应核苷酸序列，同时合成一对末端分别包含HindIII和BamH I内切酶位点的引物。

Fragl：5-atggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgcc-3

Frag2：5-gcggtgtcgaggagatctcgaatagaaggaaagaagtcagaaggcaaaaaagagagtaa-3

Frag3：5-gatctcctcgacaccgcctctgctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattg-3

Frag4：5-caacacagaatagcttgcctgagtgctgtatggtgaggtgaacaatgttccggagactc-3

Frag5：5-caagctattctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaattt-3

Frag6：5-tgacatag tc gactactaattccctggatgctgggtcttccaaattacttcccacccag-3

Frag7：5-tagtagtcagctatgtcaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactattgtggttt-3

Frag8：5-ctcaagaacagtttctcttccaaaagtaagacaggaaatatgaaaccacaatagttgtc-3

Frag9：5-gagaaactgttcttgagtatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcccgct-3

Frag10：5-cggaagtgttgataagataggggcatttggtggtctgtaagcgggaggagtgcgaa-3

上游引物：5-cgcggatccatggacattgacccgtat-3

下游引物：5-cccaagcttcggaagtgttgataagat-3

2.利用重叠延伸PCR经三轮PCR扩增拼接上述十段片段，在第四轮PCR中利用上下游引物将HindIII和BamHI酶切位点引入到拼接好的HBcAg-N144核苷酸片段两端，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，最终得到一个长度为444bp的序列为：(黑框内的碱基序列为内切酶位点)

atggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctctgctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaatttggaagacccagcatccagggaattagtagtcagctatgtcaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactattgtggtttcatatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgagtatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcccgcttacagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccg

3.将第四轮PCR的产物经HindIII和BamH I双酶切后克隆入经同样酶切处理的载体pET21a中，热激转化入大肠杆菌DH5α，涂布于含氨苄的LB平板，37℃恒温箱培养16小时左右，挑选菌落鉴定为阳性的克隆提交测序。

4.将测序正确的菌株摇菌提质粒，将连接在载体pET21a上含正确的HBcAg-N144DNA序列的质粒转入到大肠杆菌BL21中，经1mM的IPTG28℃诱导5小时后得到大小为19.3K的目的蛋白片段HBcAg-N144。蛋白电泳结果如图2所示。

5.用抗His抗体来检测融合蛋白上的组氨酸标签，检测结果如图5所示。

实施例2、以SEQ ID NO：1所示表位插入HBcAg-N144的78-79位氨基酸之间为例制备单表位的乙肝核心抗原片段-炭疽保护性抗原表位重组融合蛋白。

1.分别合成携带有SEQ IDNO：1所示表位对应的核苷酸序列的5′端44个碱基，和3′端28个碱基的突变引物3和4，以含有正确的HBcAg-N144核酸序列的质粒为模板，分别用突变引物3与上游引物，突变引物4与下游引物，进行表位插入的第一轮扩增，得到两个长度分别为284bp和247bp的片段。

突变引物3：5-gtcgttctttgatattggtgggagtgtatctgcaggatttagtccagcatccagggaat-3

突变引物4：5-atatcaaagaacgacgcatgcacttctgcatttccatgtacttcgtcttccaaattact-3

2.将第一轮PCR产物的两个片段与上下游引物混在一个反应体系中，经扩增得到一个长度为516bp的片段，序列为：(加下划线者为插入表位的核苷酸序列)

atggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctctgctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaatttggaagacgaagtacatggaaatgcagaagtgcatgcgtcgttctttgatattggtgggagtgtatctgcaggatttagtccagcatccagggaattagtagtcagctatgtcaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactattgtggtttcatatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgagtatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcccgcttacagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccg

扩增结果如图3所示。

3.将第二轮PCR产物经HindIII和BamHI双酶切后克隆入经同样酶切处理的载体pET21a中，热激转化入大肠杆菌DH5α，涂布于含氨苄的LB平板，37℃恒温箱培养16小时左右，挑选菌落鉴定为阳性的克隆提交测序。

4.将测序正确的菌株摇菌提质粒，将连接在载体pET21a上含正确的HBcAg-N144-2βDNA序列的质粒转入到大肠杆菌BL21中，经1mM的IPTG28℃诱导5小时后得到大小为21.7K的目的蛋白片段HBcAg-N144-2β。蛋白序列如SEQNO：10所示。蛋白电泳结果如图4。

5.用抗His抗体来检测融合蛋白上的组氨酸标签，检测结果如图5所示。

实施例3、以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示表位组合串联插入HBcAg-N144的78-79位氨基酸之间为例制备多表位的乙肝核心抗原片段-炭疽保护性抗原表位重组融合蛋白。

1.分别合成携带有SEQ IDNO：3所示表位对应的核苷酸序列的5′端37个碱基，和3′端23个碱基的突变引物5和6，以含有正确的HBcAg-N144-2β核酸序列的质粒为模板，分别用突变引物5与上游引物，突变引物6与下游引物，进行表位插入的第一轮扩增，得到两个长度分别为349bp和257bp的片段。

突变引物5：5-ccgctaactgattcttgatattttgagatgtttgttgactaaatcctgcaga-3

突变引物6：5-agaatcagttagcggaattaaacgcaactaacatatatccagcatccagggaa-3

2.将第一轮PCR产物的两个片段与上下游引物混在一个反应体系中，经扩增得到一个长度为576bp的片段，序列为：

atggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctctgctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactcaggcaagctattctgtgttggggtgagttgatgaatttggccacctgggtgggaagtaatttggaagacgaagtacatggaaatgcagaagtgcatgcgtcg ttctttgatattggtgggagtgtatctgcaggatttagtcaacaaacatctcaaaatatcaagaatcagttagcggaattaaacgcaacta acatatatccagcatccagggaattagtagtcagctatgtcaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactattgtggtttcatatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttcttgagtatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcccgcttacagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccg

扩增结果如图6所示。

3.将第二轮PCR产物经HindIII和BamH I双酶切后克隆入经同样酶切处理的载体pET21a中，热激转化入大肠杆菌DH5α，涂布于含氨苄的LB平板，37℃恒温箱培养16小时左右，挑选菌落鉴定为阳性的克隆提交测序

4.将测序正确的菌株摇菌提质粒，将连接在载体pET21a上含正确的HBcAg-N144-2β-3βDNA序列的质粒转入到大肠杆菌BL21中，经1mM的IPTG28℃诱导5小时后得到大小为23.9K的目的蛋白片段HBcAg-N144-2β-3β。蛋白序列如SEQ NO：11所示。蛋白电泳结果如图7。

实施例4、以HBcAg-N144和重组融合蛋白HBcAg-N144-2β为例进行融合蛋白的小鼠免疫实验。

1.方法：设立PBS对照组，HBcAg-N144组，HBcAg-N144-2β组，每组5只体重为16克左右，雌性，Balb/c小鼠，免疫前随机抽取5只小鼠取血，于0，15，29，57天给小鼠进行免疫，注射部位为背腹部皮下，PBS对照组每只每次注射300μL pH7.4的PBS，HBcAg-N144组每只每次注射300μL50μg HBcAg-N144/佐剂，HBcAg-N144-2β组每只每次注射300μL50μg HBcAg-N144-2β/佐剂，佐剂首次为弗氏完全佐剂，之后为弗氏不完全佐剂。于首次免疫15，29，40，70天分别取血。

2.结果：同PBS组相比，HBcAg-N144组和HBcAg-N144-2β组第二次免疫后就已经激起了针对相应融合蛋白的抗体，第四次免疫后两组的免疫血清，在稀释到102400倍时均仍然能与融合蛋白结合。

实施例5、免疫血清与PA单抗的体外结合实验

1.方法：(1)用包被液稀释PA到终浓度为2μg/mL，以100μL/孔的量包被4块96孔酶联板，4℃过夜；

(2)用PBST(0.05％Tween-20，pH7.4)洗板两次，甩干；

(3)将封闭液(0.2％小牛血清)以100μL/孔的量加入到酶联板中，放于湿盒内，37℃作用1小时；

(4)用PBST(0.05％Tween-20，pH7.4)洗板两次，甩干；

(5)将稀释液(2％小牛血清)以100μL/孔的量加入到酶联板中，1/100起倍比稀释免疫血清，留每行的最后一孔作为空白对照，放于湿盒内，37℃作用1小时；

(6)用PBST(0.05％Tween-20，pH7.4)洗板四次，甩干；

(7)将小鼠二抗用稀释液1/1000稀释，按100μL/孔的量加入到酶联板中，放于湿盒内，37℃作用1小时；

(8)用PBST(0.05％Tween-20，pH7.4)洗板四次，甩干；

(9)加入酶作用底物A液和B液各50μL/孔，于室温下显色3-5分钟，用2M的硫酸溶液终止反应；

(10)将酶联板于450nm处读取OD值

2.结果：OD450的数值表明，PA与PBS对照组和HBcAg-N144组的四次取血的免疫血清的体外结合实验均为阴性结果，PA与HBcAg-N144-2β组免疫血清的体外结合实验在第二次免疫后已经开始激起了针对插入的PA表位的抗体，但效价非常低，PA稀释200倍后结果即为阴性，第三次免疫后的体外绪合实验结果PA稀释到12800倍时结果依然有意义。

实施例6、融合蛋白所激起的抗体的细胞保护实验

1.方法：(1)将小鼠的巨噬细胞J774A.1细胞铺于96孔细胞板中，24小时后长至10⁵个/mL；

(2)PA、LF用细胞培养基MEM稀释至100ng/mL，以120μL/孔的量加入新的洁净的96孔细胞板中；

(3)血清样品以1/200起倍比稀释于上述加有PA、LF的96孔板中，将作用液置于37℃温箱孵育1小时；

(4)1小时后将作用液以100μL/孔的量对应地转移到铺有细胞的96孔板中，同时设有阴性和阳性对照，37℃温箱孵育3小时；

(5)作用液小心吸干，弃掉，将MTT用细胞培养基稀释至终浓度为0.5mg/mL，以100μL/孔的量加入，37℃温箱孵育0.5小时；

(6)将MTT-培养基吸干，加入显色液100μL/孔，室温显色5分钟，于540nm读取OD值。

2.结果：结果表明PBS对照组和HBcAg-N144组四次取血的获得的免疫血清均无细胞保护活性，HBcAg-N144-2β组第三次的免疫血清稀释到3000倍时细胞已经全死了，第四次的免疫血清稀释到128000时细胞仍然存活。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所

<120>携带被插入到乙肝核心抗原蛋白或其片段内的炭疽保护性抗原表位的重组蛋白及其用途

<130>

<160>12

<210>1

<211>24

<212>PRT

<213>PA的二区表位

<400>2

Glu Val His Gly Asn Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile

 1               5                   10                  15

Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly Phe Ser

16              20

<210>2

<211>17

<212>PRT

<213>PA的四区表位

<400>2

Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro

 1               5                   10                  15

Asn Tyr

16

<210>3

<211>20

<212>PRT

<213>PA三区的表位

<400>2

Gln Gln Thr Ser Gln Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn

 1               5                   10                  15

Ala Thr Asn Ile Tyr

16                 20

<210>4

<211>4

<212>PRT

<213>柔性短肽1

<400>2

Gly Gly Gly Ser

 1

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>柔性短肽2

<400>2

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

 1               5

<210>6

<211>7

<212>PRT

<213>柔性短肽3

<400>2

Gly Ser Gly Asp Glu Gly Gly

 1               5

<210>7

<211>148

<212>PRT

<213>HBcAg-N144

<400>2

Gly Ser Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val

 1                5                  10                  15

Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg

 16              20                  25                  30

Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu

31               35                  40                  45

Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala

46               50                  55                  60

Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly

61               65                  70                  75

Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr

76               80                  85                  90

Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe

91               95                 100                 105

His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr

106             110                 115                 120

Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg

121             125                 130                 135

Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Lys Leu

136             140                 145

<210>8

<211>153

<212>PRT

<213>HBcAg-N149

<400>2

Gly Ser Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val

 1               5                   10                  15

Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg

 16              20                  25                  30

Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu

31               35                  40                  45

Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala

46               50                  55                  60

Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly

61               65                  70                  75

Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr

76               80                  85                  90

Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe

91               95                 100                 105

His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr

106             110                 115                 120

Leu ValSer Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg

121             125                 130                 135

Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu ThrThr Val

136             140                 145                 150

Val Lys Leu

151

<210>9

<211>187

<212>PRT

<213>HBcAg

<400>2

Gly Ser Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val

 1               5                   10                  15

Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg

 16              20                  25                  30

Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu

31               35                  40                  45

Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala

46               50                  55                  60

Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly

61               65                  70                  75

Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr

76               80                  85                  90

Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe

91               95                 100                 105

His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tr

106             110                 115                 120

Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg

121             125                 130                 135

Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val

136             140                 145                 150

Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro

151             155                 160                 165

Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser

166             170                 175                 180

Arg Glu Ser Gln Cys Lys Leu

181             185

<210>10

<211>172

<212>PRT

<213>HBcAg-N144-2β

<400>2

Gly Ser Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val

 1           5                       10                  15

Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg

 16          20                      25                  30

Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu

31           35                      40                  45

Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala

46           50                      55                  60

Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly

61               65                  70                  75

Ser Asn Leu Glu Asp Glu Val His Gly Asn Ala Glu Val His Ala

76              80                   85                  90

Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly Phe Ser Pro

91               95                 100                 105

Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly

106             110                 115                 120

Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr

121             125                 130                 135

Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val

136             140                 145                 150

Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile

151             155                 160                 165

Leu Ser Thr Leu Pro Lys Leu

166             170

<210>11

<211>426

<212>PRT

<213>HBcAg-N144-2β-3β

<400>2

Gly Ser Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val

 1                5                  10                  15

Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg

 16              20                  25                  30

Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu

31               35                  40                  45

Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala

46               50                  55                  60

Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly

61               65                  70                  75

Ser Asn Leu Glu Asp Glu Val His Gly Asn Ala Glu Val His Ala

76              80                  85                  90

Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Ser Ala Gly Phe Ser Gln

91              95                  100                 105

Gln Thr Ser Gln Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala

106             110                 115                 120

Thr Asn Ile Tyr Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val

121             125                 130                 135

Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His

136             140                 145                 150

Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu

151             155                 160                 165

Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro

166             170                 175                 180

Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Lys Leu

181             185                 190

Claims (12)

1.一种重组融合蛋白，该重组融合蛋白是由包括乙肝核心抗原蛋白或其片段，以及由下列成员中的一个或多个连接而成的肽段：

①n个炭疽杆菌保护性抗原的中和表位(n≥1)

②i个柔性氨基酸组成的短肽序列(i≥0)

2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于：所述的炭疽保护性抗原表位多肽是下列成员及连续具有其所含n个氨基酸(n≥5)的衍生物之一：

(1)SEQ ID NO：1所示氨基酸序列

(2)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列

(3)SEQ ID NO：3所示氨基酸序列

3.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于：所述的柔性氨基酸组成的短肽序列是下列成员之一：

(1)SEQ ID NO：4所示氨基酸序列

(2)SEQ ID NO：5所示氨基酸序列

(3)SEQ ID NO：6所示氨基酸序列

4.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于：所述的乙肝核心抗原蛋白或其片段是下列成员之一：

(1)SEQ ID NO：7所示氨基酸序列

(2)SEQ ID NO：8所示氨基酸序列

(3)SEQ ID NO：9所示氨基酸序列

5.编码权利要求1所述的乙肝核心抗原或其片段-炭疽保护性抗原表位重组融合蛋白的DNA序列。

6.制备乙肝核心抗原或其片段-炭疽保护性抗原表位重组融合蛋白的方法，是利用化学合成和重叠延伸PCR的方法分别拼接出乙肝核心抗原全长蛋白(HBcAg，183AA)，氨基端144个氨基酸(HBcAg-N144)及氨基端149个氨基酸(HBcAg-N149)所对应的基因序列，再通过同样的方法将炭疽杆菌保护性抗原(PA)的中和性表位(如序列SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3所示)以一定的插入方式，分别插入到上述乙肝核心抗原或其片段的相同或不同的许可位点。

7.根据权利6所述的插入优化方式，其特征在于：单表位插入，单表位重复插入，单表位经柔性氨基酸组成的短肽间隔后重复插入，不同单表位组合串联插入，不同单表位组合串联重复插入，不同单表位经柔性氨基酸组成的短肽间隔后组合串联插入，不同单表位经柔性氨基酸组成的短肽间隔后组合串联重复的方式插入。

8.根据权利6所述的乙肝核心抗原或其片段的相同或不同的许可位点，其特征在于HBcAg的78-79位氨基酸之间，或替换HBcAg76-81位氨基酸之间的任意n个氨基酸(1≤n≤6)：或插入HBcAg-N144的78-79位氨基酸之间，或替换HBcAg-N144的76-81位氨基酸之间的任意n个氨基酸(1≤n≤6)，或是分别插入到HBcAg-N144的78-79之间及144之后；或插入HBcAg-N149的78-79位氨基酸之间，或替换HBcAg76-81位氨基酸之间的任意n个氨基酸(1≤n≤6)，成为一个人工基因，并将该基因在表达载体系统中表达后纯化，得到乙肝核心抗原蛋白或片段-炭疽保护性抗原表位重组融合蛋白。

9.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于：编码乙肝核心抗原蛋白或其片段的寡核苷酸片段的两端包含一对常用的限制性内切酶的酶切位点。

10.一种以本发明重组融合蛋白作为有效成分的疫苗制品。

11.根据权利8所述的疫苗制品，其特征在于：所述疫苗中还包括医学上可以接受的药用佐剂。

12.根据权利1-4所述的重组融合蛋白，在制备用于预防和/或治疗炭疽感染制剂和/或药物中的应用。

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