发明内容
本发明的第一方面是提供一系列重组融合蛋白,该系列重组融合蛋白对结核病有预防和/或治疗作用。
本发明所涉及的重组融合蛋白,其特征在于该系列重组融合蛋白至少包含乙肝核心蛋白和结核抗原或抗原片段两个部分,其中所述乙肝核心蛋白的特征在于:对应于如SEQ ID NO:1所示序列或该序列N端的144个氨基酸。
本发明所述的重组融合蛋白所包含的结核抗原或抗原片段,其特征在于至少为下列一种结核抗原或抗原片段序列:
ESAT-6、TB10.4、Ag85A、Ag85B、PPE18、MTB32C;
本发明所述的重组融合蛋白可能包含的免疫辅助因子,其特征在于至少为下列一种免疫辅助因子序列:
IL-2、IL-10、IL-12、GM-CSF、IFN-γ、IL-4和/或IL-6;
本发明所述的重组融合蛋白中包含结核抗原或抗原片段序列,以及所述的免疫辅助因子之间有/无连接序列。
本发明所述的重组融合蛋白,当其结核抗原或抗原片段部分包括两种或两种以上结核抗原或抗原片段序列时,所述的两抗原或抗原片段序列之间可以存在或不存在连接序列;当其免疫辅助因子部分包括两种或两种以上免疫辅助因子时,所述的两免疫辅助因子之间可以存在或不存在连接序列。
在本发明的一个实施方式中,所述的乙肝核心蛋白的长度为氨基端144个氨基酸,所述的结核抗原或抗原片段序列为全长的结核抗原ESAT-6,免疫辅助因子不存在。
本发明的第二方面是提供制备乙肝核心蛋白、结核抗原或抗原片段、免疫辅助因子重组融合蛋白的方法。
制备乙肝核心蛋白、结核抗原或抗原片段、免疫辅助因子重组融合蛋白的方法包括以下几个部分:
首先利用化学合成和重叠延伸PCR的方法得到乙肝核心蛋白分子的基因序列,再通过重叠延伸PCR,或者通过引入常用的酶切位点的方法将结核抗原或抗原片段和免疫辅助因子以一定的插入方式,分别插入到乙肝核心蛋白的相同或不同的许可位点,成为一个人工基因,并将该基因在表达载体系统中表达后纯化,得到乙肝核心蛋白、结核抗原或抗原片段、免疫辅助因子的重组融合蛋白。
其中所述的结核抗原或抗原片段的插入方式为:单抗原或抗原片段插入,单抗原或抗原片段重复插入,单抗原或抗原片段经连接序列间隔后重复插入,不同抗原或抗原片段串联插入,不同抗原或抗原片段串联重复插入,不同抗原或抗原片段经连接序列间隔后串联插入,不同抗原或抗原片段经连接序列间隔后串联重复插入。
其中所述的免疫辅助因子的插入方式为:一种免疫辅助因子单独插入,单种免疫辅助因子经连接序列间隔后重复插入,不同免疫辅助因子经连接序列间隔后串联插入,不同免疫辅助因子经连接序列间隔后串联重复插入。
其中所述的结核抗原或抗原片段在乙肝核心蛋白中的许可位点为以下任何位点之一:
(1)78-79位氨基酸之间;
(2)替换76-81位氨基酸之间的任意n个氨基酸(1≤n≤6);
(3)羧基端最后一位氨基酸之后。
其中所述的免疫辅助因子在乙肝核心蛋白中的许可位点为以下任何位点之一:
(1)78-79位氨基酸之间;
(2)替换76-81位氨基酸之间的任意n个氨基酸(1≤n≤6);
(3)羧基端最后一位氨基酸之后;
附加条件是免疫辅助因子必须在结核抗原或抗原片段存在的前提下出现,两者之间有/无连接序列。
本发明的实施方式中,为单独的结核抗原ESAT-6直接插入到乙肝核心蛋白的位点(1)中。
本发明的第三方面是提供编码上述融合蛋白的核酸序列和氨基酸序列。由于基因的简并性,编码相同肽段的核酸序列不是唯一的,但均应属本发明的保护范围。
本发明的第四方面是提供了一种以本发明重组融合蛋白作为有效成分的疫苗或药物,所以本发明还可以包括或不包括医学上可接受的药用辅料,如铝佐剂等。
本发明在设计上将结核抗原或抗原片段,可能还包括免疫辅助因子插入到乙肝核心蛋白的相同或不同位点,得到了能够激发机体产生针对结核分枝杆菌感染的免疫反应的重组融合蛋白,初步评价了融合蛋白的免疫原性,为新型结核疫苗的研究做出了尝试。
实施例2:以HE6为例在动物模型上进行重组融合蛋白的免疫学评价。
1.动物实验
30只4-5周龄的无菌雌性BALB/c小鼠被随机分为5组,分别经皮下注射免疫载体HBc-N144、HE6、rESAT-6,各蛋白的免疫剂量均为20μg抗原/200μl/只,前三次免疫分别间隔两周,第四次免疫10天后处死小鼠取脾脏,开展细胞免疫的检测。由于免疫载体HBc还被报道自身可能具有免疫佐剂的效应,所以在本实施例中还设置一组HE6不加佐剂的对照,另外HBc-N144或空白组(blank)均被作为阴性对照,各组均使用氢氧化铝佐剂(其中铝的终浓度为1.0mg/ml)。取小鼠三免后血清同时检测体液免疫的情况。
2.ELISA检测体液免疫
虽然结核的免疫以细胞免疫为主,体液免疫对保护性可能影响不大,但对疫苗的免疫程序、安全性等有一定意义,因此本研究检测了小鼠对重组融合蛋白HE6产生抗体的水平,具体方法如下:
①ELISA板条(96孔)分别用200ng/孔的rESAT-6包被4℃过夜;
②用PBS-0.05%(v/v)Tween20溶液洗板三次,每次5min,于吸水纸上拍打干净;
③将ELISA板用封闭液(PBS-2%(w/v)BSA)于37℃封闭1h;
④将小鼠血清按1/100起的浓度加入到ELISA板条中,之后按倍比稀释的方法系列稀释,ELISA板的最后一列留空,作为阴性对照孔,于37℃孵育1h;
⑤将孵育好的ELISA板条用PBS-0.05%(v/v)Tween20溶液洗板四次,每次5min,于吸水纸上拍打干净后加入1/8000稀释的HRP-小鼠IgG或IgG1或IgG2a,再次于37℃孵育1h;
⑥将孵育好的ELISA板条用PBS-0.05%(v/v)Tween20溶液洗板四次,每次5min,于吸水纸上拍打干净后加入TMB溶液于暗处显色;
⑦5min后用2M的H2SO4终止反应,并用酶连仪(Bio-Rad)于OD450读值;
⑧以大于2倍阴性孔OD450值的孔为阳性孔。
3.检测细胞免疫
(1)小鼠脾脏单细胞悬液的制备
具体步骤如下:
①将小鼠断颈处死,浸泡于75%的乙醇中5min;
②无菌,取5ml完全RPIM1640培养基于培养皿中,在培养皿中放置一个200目的细胞筛,取脾脏(解剖位置位于小鼠的左上腹腔),置于平皿内200目的细胞筛上,用注射器针芯研磨,使其分散为单个细胞,再加入15ml完全RPIM1640培养液冲洗细胞筛,使终体积为20ml;
③将上述细胞悬液转移至50ml的尖底离心瓶中,10℃,400g(转头:4180),5min,离心脾细胞悬液,吸出上清;
④用3ml ACK裂解缓冲液重悬细胞沉淀,在室温下孵育3-5min以裂解红细胞;
⑤再加入27ml完全RPMI1640培养液至细胞悬液中混匀,10℃,400g(转头:4180),5min,离心脾细胞悬液;
⑥吸出上清,用30ml完全RPMI1640重悬细胞沉淀,10℃,400-500g,5min,弃上清,细胞沉淀备用;
⑦用10ml完全RPI1640培养基充分重悬细胞沉淀;
⑧对细胞进行计数,并将其用完全RPMI1640调整至浓度为5.0×106cells/ml。
(2)ELISPOT法检测IFN-γ
具体方法如下:
第一天
①预湿:每孔加入15μLMagiTM Coating Buffer(达科为公司)润湿各孔内的PVDF膜;
②包被:润湿之后,无须洗涤,每孔加入50μL PBS稀释好的包被抗体,4℃包被过夜;
③封闭:(第二天)倾倒包被液,用PBS洗涤3次,最后一次,在灭菌的吸水纸上扣干。200μL/孔加入用1×PBS稀释好的封闭液,37℃封闭1h;
④倾倒封闭液,无须洗涤,直接加入检测细胞进行ELISPOT检测。
第二天
①将计数好的细胞悬液调整为5×106ml,按100μL/孔的量分别加入到96孔板中,每个处理做3个复孔;
②在细胞种到96孔板时同时加入刺激物,并于37℃孵箱孵育,其中特异性刺激物:rESAT-6和HBc-N144终浓度为10μg/ml,非特异刺激物的终浓度为PMA:50ng/ml,ionomycin:1μg/ml;
③裂解细胞:培养约20h后,倾倒孔内的细胞及培养基,200μL/孔加入冰冷的去离子水,4℃冰浴10min(低渗法裂解细胞);
④洗涤:每孔加入200μL wash buffer,浸泡3-5mins后扣出洗涤液,重复5次,最后一次,在吸水纸上扣干;
⑤加入检测抗体:每孔加入100μL稀释好的生物素标记检测抗体,37℃孵育1h;⑥洗涤:每孔加入200μLwash buffer,浸泡3-5mins后扣出洗涤液,重复5次。最后一次,在吸水纸上扣干;
⑦加入酶标亲和素:每孔加入100μL稀释好的酶标亲和素,37℃1小时;
⑧洗涤:每孔加入200μL wash buffer,浸泡3-5mins后扣出洗涤液,重复5次,最后一次,在吸水纸上扣干;
⑨显色:解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100μL的显色液,室温静置30min(在20-25℃,显色25min较合适),注意避光;
⑩待斑点生长到适合的大小之后,以去离子水洗涤2遍,终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上,拍干细小的水珠,之后取下保护层,放在通风的地方,室温静置10-30min,让膜自然晾干。将晾干的ELISPOT提交达科为公司读板。
(3)流式细胞术检测IFN-γ
1)将计数好的脾细胞悬液按5×106cells/ml的浓度转移到6孔板中,同时设置加非特异性刺激物的阳性对照孔和不刺激的阴性对照孔,以及同型对照孔,每孔2.5ml;
2)各孔加入特异性刺激物rESAT-6后于37℃孵箱培养,每孔中特异性刺激物rESAT-6的终浓度为10μg/ml;
3)4-6h后各孔加入终浓度为10μg/ml BFA,同时在所设置的阳性对照孔中加入终浓度为500ng/ml的Ionomycin和终浓度为5ng/ml的PMA;
4)6h后收集细胞,将细胞转移到流式管中,2管,10℃,400g,5min;
5)吸弃上清,用2ml的RPMI1640重悬细胞,10℃,400g,5min;
6)弃上清,每管各加入2ml stain Buffer(FBS)重悬细胞沉淀,10℃,400g,5min;
7)弃上清后,估计剩余液体体积,并在每管中分别加入5μl小鼠APC-anti CD3ε,PerCP-antiCD4,FITC-antiCD8a抗体,补齐至50μL,使抗体的终浓度为1μg/106cells,10℃避光孵育30min;
8)向原有孔中再加入0.5mL stain buffer,洗细胞1次,10℃,400g,5min;
9)弃上清,用100μL Cytofix/CytopermTM充分重悬细胞,室温,孵育20min;
10)加400μL的Perm/washTMsolution使终体积为500μL,将6孔板分出的管分别分为两管,wash细胞一次,10℃,400g,5min;
11)用含有PE-antiIFN-γ的50μL的Perm/WashTMsolution重悬细胞沉淀,同型对照管加入等量的PE-Rat IgG1,κIsotype Control,10℃,避光孵育30min;
12)向原有孔中再加入150μL Perm/WashTMsolution,使终体积为200μL,洗细胞1次,10℃,400g,5min;
13)加200μL的Perm/wash TMsolution,再wash细胞一次,10℃,400g,5min;将上述离心后的细胞沉淀用200μL的stain buffer重悬;
14)进行流式分析。
小结:
本部分实施例的结果表明,单纯用重组ESAT-6免疫时,ESAT-6特异的IgG约为3.63×103;当用HE6不加佐剂或使用铝佐剂免疫时,ESAT-6特异的IgG滴度大于104或105,这提示HBc的加入显著地增加了针对ESAT-6的抗体反应。我们同样也检测了相关的抗体亚类,检测的结果表明,HE6不加佐剂组和使用铝佐剂组激发的IgG1和IgG2a的水平均显著高于rESAT-6单独加铝佐剂免疫组,然而分析特异性抗体IgG2a和IgG1比值,组与组之间比较没有统计学差异(p均大于0.05)。
本部分实施例中,细胞免疫反应的检测结果表明在rESAT-6刺激下,HE6不加佐剂组或使用铝佐剂组较rESAT-6组,载体组和空白组,分泌IFN-γ的T细胞数目均有显著增加,这主要是rESAT-6特异的T细胞数目的增加。这提示HBc的使用有助于刺激Th1型细胞反应。另外,流式的结果表明经rESAT-6刺激后的所检测到的HE6不加佐剂组对应的脾IFN-γ+CD4+T细胞频率和IFN-γ+CD8+T细胞频率,均显著高于单独用rESAT-6加铝佐剂免疫组小鼠和空白组小鼠。我们也发现HE6不加佐剂组和使用氢氧化铝佐剂组经刺激后产生的ESAT-6特异的T细胞频率的增加在数值上没有显著性差异,这提示我们佐剂效应可能依然存在。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所
<120>乙肝核心蛋白与结核抗原或抗原片段的重组融合蛋白及用途
<210>1
<211>149
<212>PRT
<213>乙肝核心蛋白
<400>2
Gly Ser Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val
1 5 10 15
Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg
16 20 25 30
Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu
31 35 40 45
Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala
46 50 55 60
Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly
61 65 70 75
Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr
76 80 85 90
Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe
91 95 100 105
His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr
106 110 115 120
Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg
121 125 130 135
Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
136 140 145 149
<210>2
<211>717
<212>DNA
<213>HE6
<400>1
atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 60
tctgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag 120
gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg 180
tgttggggtg agttgatgaa tttggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacacagag 240
cagcagtgga atttcgcggg tatcgaggcc gcggcaagcg caatccaggg aaatgtcacg 300
tccattcatt ccctccttga cgaggggaag cagtccctga ccaagctcgc agcggcctgg 360
ggcggtagcg gttcggaggc gtaccagggt gtccagcaaa aatgggacgc cacggctacc 420
gagctgaaca acgcgctgca gaacctggcg cggacgatca gcgaagccgg tcaggcaatg 480
gcttcgaccg aaggcaacgt cactgggatg ttcgcaccag catccaggga attagtagtc 540
agctatgtca atgttaatat gggcctaaaa atcagacaac tattgtggtt tcatatttcc 600
tgtcttactt ttggaagaga aactgttctt gagtatttgg tgtcttttgg agtgtggatt 660
cgcactcctc ccgcttacag accaccaaat gcccctatct tatcaacact tccgtaa 717
<210>3
<211>239
<212>PRT
<213>HE6
<400>2
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu
16 20 25 30
Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro
31 35 40 45
Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu
46 50 55 60
Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn
61 65 70 75
Leu Glu Asp Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala
76 80 85 90
Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu
91 95 100 105
Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp
106 110 115 120
Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp
121 125 130 135
Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala
136 140 145 150
Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Glu Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly
151 155 160 165
Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val
166 170 175 180
Ser Tyr Val Asn Val Asn Val Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu
181 185 190 195
Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
196 200 205 210
Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro
211 215 220 225
Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
226 230 235 239