CN102988976B - 乙型肝炎病毒核心抗原-dna复合疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗及其制备方法,该复合疫苗由乙型肝炎病毒核心抗原和质粒DNA组成,所述质粒DNA为含小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组载体,利用了乙型肝炎病毒核心抗原C端有效结合核酸及其自聚成病毒样颗粒的特性,克服了蛋白疫苗免疫原性较弱,不易诱导细胞毒性T细胞应答;DNA疫苗的转染具有非特异性,对体细胞的转染可导致T细胞对该抗原的耐受,长期免疫效果差的缺陷,制备的复合疫苗可于治疗乙型肝炎病毒感染的疫苗,具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,特别涉及乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗,还涉及该复合疫苗的制备方法。
背景技术
蛋白疫苗和DNA疫苗是目前最常用的两种疫苗形式,二者均有各自的优势和劣势。蛋白疫苗可反复免疫,可有效激发机体体液免疫应答,但不易诱导细胞毒性T细胞(CTL)应答。DNA疫苗则具有较强的诱导机体细胞免疫应答的能力,而诱导体液免疫应答能力较弱;若单独使用,易被机体降解,且其转染具有非特异性,对体细胞的转染可导致T细胞对该抗原的耐受,长期免疫效果差。因此,如何实现二者的优势互补,一直是疫苗研究领域的热点。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗,即能有效激发机体的体液免疫,还能激发机体的体细胞免疫;本发明的目的之二在于提供乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗的制备方法。
1.乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗,由乙型肝炎病毒核心抗原和质粒DNA组成,所述质粒DNA为含小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组载体。
优选的,所述乙型肝炎病毒核心抗原与质粒DNA的摩尔比为1:1。
优选的,所述重组载体为pGM载体,制备方法如下:克隆小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因,用BglII和EcoRI酶切后连接经同样酶切的pTCAE载体而得。。
2.所述乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗的制备方法,包括以下步骤:
将乙型肝炎病毒核心抗原加入变性剂,变性,然后加入质粒DNA,混合,经透析后,去变性,最后通过梯度离心得到乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗。
优选的,将HBcAg蛋白在变性条件下处理30分钟,使HBcAg蛋白裂暴露出C-末端核酸结合序列,然后加入质粒pGM,然后在含有500 mM NaCl,pH 7.0、50 mM Tris–HCl、0.5 mM EDTA的透析液中、4℃透析过夜;经10-50%氯化铯密度梯度离心,收集14-19处离心液;将离心液过10 kDa孔径的柱,然后10000转/分离心30分钟,去除含氯化铯液体,用pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3次后,重悬于磷酸盐缓冲液中,得乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗;
所述变性剂中各物质的浓度为:2 M尿素,200 mM NaCl,pH值为 9.5的50mM碳酸钠,10 mM β-巯基乙醇和200mM咪唑。
本发明有益效果在于:本发明公开了乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗,巧妙利用乙型肝炎病毒核心抗原C端有效结合核酸及其自聚成病毒样颗粒的特性,克服了蛋白疫苗免疫原性较弱,不易诱导细胞毒性T细胞应答;DNA疫苗的转染具有非特异性,对体细胞的转染可导致T细胞对该抗原的耐受,长期免疫效果差的缺陷,实现了蛋白疫苗和DNA疫苗的优势互补,即能有效激发机体的体液免疫,还能激发机体的体细胞免疫;本发明还公开了复合疫苗的制备方法,制备方法简单,便于大批量生产。
附图说明
图1为HBcAg蛋白纯化前后的SDS-PAGE电泳图。
图2为DNA阻滞实验(A)和DNase I保护实验(B)(图A中,1: DNA marker DL2000, 2. HBcAg-pGM复合疫苗,3. 质粒pGM;图B中,1:DNA marker DL2000,2. HBcAg-pGM复合疫苗,3为经蛋白酶处理后的HBcAg-pGM复合疫苗)。
图3为HBcAg-DNA复合疫苗透视电镜照片。
图4 为HBcAg-DNA复合疫苗转染实验ELISA检测293T细胞上清GM-CSF的浓度(pg/mL)。
图5为51Cr杀伤实验结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件进行。
一、实验材料:
乙肝病毒核心抗原(HBcAg)表达质粒为pTrcHBcshHIS质粒,由Drvon Brunn惠赠(参考文献见:H. Wizemann,A.von Brunn. Purification of E. coli-expressed HIS-tagged hepatitis B core antigen by Ni2+ -chelate affinity chromatography. J Virol Methods. 1999;77(2):189-97.)。
His蛋白纯化镍柱(Ni-NTA Agarose,购自Qiagen公司,货号30210);表达小鼠巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)的质粒为pGM;对照质粒pTCAE:由M. Reff (IDEC Corp., San Diego, Calif.)惠赠;293T细胞,购自ATCC公司。
二、步骤
1. HBcAg蛋白的表达、纯化,参照已建立的方法(H. Wizemann,A.von Brunn. Purification of E. coli-expressed HIS-tagged hepatitis B core antigen by Ni2+ -chelate affinity chromatography. J Virol Methods. 1999;77(2):189-97.):
(1)pTrcHBcshHIS质粒转染DH5α感受态细胞,用含100 μg/mL的TY培养液230转37℃过夜培养;
(2) 取5 mL新鲜菌液至2000 mL TY培养液,230转37℃培养至OD600为0.7;再加入IPTG至终浓度为0.1 mM,继续培养3小时。
(3)细菌沉淀加入裂解液(100 mM NaCl,50 mM Tris-HCl (pH 8.0),5 mM EDTA,10 mM β-巯基乙醇,0.2% Trition-X-100,1 mg/mL溶菌酶,10 mg/mL DNaseⅠ和10 mg/mL RNAse A),配合超声,破碎细菌;然后10000 g、4℃离心20分钟,收集上清。
(4)HBcAg蛋白收集:将步骤(3)所得上清在25000 rpm条件下,用20%蔗糖进行密度梯度离心;然后溶解于解离溶液(2 M尿素,200 mM NaCl,50 mM 碳酸钠(pH 9.5),10 mM β-巯基乙醇,5 mM咪唑,0.5%十二烷基肌氨酸钠),冰浴过夜后,再加入不含十二烷基肌酸钠的解离溶液,继续冰浴放置2 小时。
(5)HBcAg蛋白纯化、浓缩:用镍柱纯化HBcAg蛋白,去除细菌蛋白(具体操作步骤见Qiagen镍柱说明书);测定蛋白浓度,如浓度过低可用10 kDa孔径Macrosep:Microsep柱(Pall Filtron, Karlstein, Germany)浓缩至合适浓度。
将纯化前和纯化后的HBcAg蛋白用SDS-PAGE检测,结果如图1所示。结果表明,处理HBcAg蛋白后,得到分子量约为17 kD的单体和分子量为34 kD的二聚体形式存在的;纯化后能得到纯度较高的HBcAg蛋白。
2. GM-CSF质粒大量制备
表达小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的质粒pGM由刘宏利博士惠赠(上海贺普生物科技有限公司),该质粒构建方法如下:用RT-RCR扩增编码小鼠GM-CSF基因,利用BglII/EcoRI克隆至真核表达质粒pTCAE(由Dr.M.Reff惠赠),测序验证后用碱裂解法大量制备质粒pGM。紫外分光度测定及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒质量及浓度。紫外分光光度测定显示A260/A280=1.95,质粒浓度为11.5 mg/mL,能够满足实验所需纯度及浓度。
3. HBcAg-DNA复合疫苗的制备与鉴定
(1)复合疫苗制备:将步骤1中纯化所得的HBcAg蛋白在变性条件(2 M 尿素,200 mM NaCl,50 mM碳酸钠(pH 9.5),10 mMβ-巯基乙醇,200 mM 咪唑)下处理30分钟,使HBcAg蛋白裂暴露出C-末端核酸结合序列;然后加入质粒pGM使HBcAg蛋白与质粒pGM的按摩尔比为1:1;然后将结合产物,以含有500 mM NaCl,50 mM Tris–HCl (pH 7.0)、0.5 mM EDTA的液体为透析液,4℃透析过夜去除变性条件,使HBcAg蛋白重新聚合病毒样颗粒并包裹质粒pGM;经10-50%氯化铯密度梯度离心(4℃,SW41转子36000 转/分钟,18小时),收集14-19处离心液;将收集液置于10 kDa孔径Macrosep:Microsep柱(Pall Filtron,Karlstein,Germany),10000转/分离心30分钟,去除含氯化铯液体,用pH7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后,重悬于合适体积的PBS中,得到HBcAg-DNA复合疫苗。HBcAg-DNA复合疫苗主要通过HBcAg蛋白C端带正电荷,质粒DNA带负电荷将HBcAg蛋白与质粒DNA连接,经HBcAg蛋白的自组装从而形成HBcAg-DNA复合疫苗。
重组乙肝核心抗原氨基酸序列:
M D I D P Y K E F G A S V E L L S F L P S D F F P S V R D L L D T A S A L Y R D A L E S P E H C T N H T A L R Q A I L C W G E L M T L A S W V G N N L E D P A A R D L V V N Y V N T N M G L K I R Q L L W F H I S C L T F G R E T V L E Y L V S F G V W I R T P P A Y R P P N A P I L S T L P E T T V V R R R G R S P H H H H H H
(2)复合疫苗鉴定:
① 通过凝胶延迟实验证实HBcAg与质粒pGM结合:取10 μL HBcAg-DNA复合物疫苗,使用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳;
② 通过DNase I保护试验证实质粒被包裹于HBcAg蛋白内部而不是存在于表面:一组用45 μL复合疫苗中加入5 μL含10 mM MgCl2和10 mM CaCl2的溶液,再加入5 μL 0.5 μg/mL的DNase I,37℃水浴30分钟;加入4 μL 0.5 M的EDTA 并65℃加热10分钟终止反应,如果质粒DNA位于颗粒的表面,则被降解;如果质粒被包裹于内部,则受到保护,需要将蛋白裂解后释放出来。另一组加入1μL 10% SDS,5 μL 10 mg/mL的蛋白酶K,55℃水浴30分钟,消化HBcAg颗粒;然后进行DNA琼脂糖凝胶电泳,检测有无DNA存在;如检测到DNA的存在,则证实质粒DNA被包裹在HBcAg病毒样颗粒内部,结果如图2所示。由图2可知,经蛋白酶K处理后的HBcAg-DNA复合疫苗能够检测到DNA存在,表明制得的HBcAg-DNA复合疫苗,HBcAg蛋白与pGM质粒结合,并将其包裹在蛋白内部。
另外通过透射电镜检测,分析HBcAg-DNA复合疫苗的结构,结果如图3所示。由图3可知,HBcAg-DNA复合疫苗包裹pGM质粒,形成直径约30 nm的颗粒。
4. HBcAg-DNA复合疫苗体外转染实验:
将制备的HBcAg-DNA复合疫苗转染293T细胞,以用HBcAg蛋白包裹pTCAE空白质粒及质粒pGM作为对照。转染48小时后,收集上清,ELISA试剂盒检测GM-CSF,结果如图4所示。由图4可知, HBcAg-pGM复合疫苗,能较好的介导pGM转染293T细胞。HBcAg与pGM的混合物只能介导低水平的GM-CSF表达,而HBcAg包裹空质粒pTCAE(由M. Reff博士惠赠,(IDEC Corp.,San Diego,California,美国))则不能介导GM-CSF的表达。
5. HBcAg-DNA复合疫苗免疫原性分析:
免疫正常Balb/c小鼠:6~8周龄的Balb/c小鼠20只(雌雄各半),分为5组,每组4只。一组用HBcAg-pGM复合疫苗免疫接种;其余4组分别用HBcAg蛋白、pGM表达质粒、HBcAg蛋白包裹pTCAE质粒、HBcAg蛋白与pGM质粒混合免疫,作为对照。免疫部位均为尾根部皮下。然后去其脾细胞作为效应细胞、以P815-C为靶细胞进行51Cr杀伤实验,结果如图5所示。由图5可知,HbcAg-pGM复合疫苗在体内能较好地激发CTL反应,具有较好的免疫原性。
因此,根据HBcAg蛋白自聚成病毒样颗粒及其C末端能结合核酸的特性,HBcAg成功包裹质粒DNA,形成复合疫苗。这种新的疫苗形式能够实现蛋白疫苗和DNA疫苗的优势互补,在体内激发有效的细胞免疫及体液免疫应答。根据此思路用,不仅可制备用于HBV感染的疫苗,也可制备感染其他疾病及肿瘤等多种疾病。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明。
Claims (3)
1.乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗,其特征在于:由乙型肝炎病毒核心抗原和质粒DNA组成,所述质粒DNA为含小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组载体;
其制备方法为:将乙型肝炎病毒核心抗原在变性剂中处理30分钟,使乙型肝炎病毒核心抗原暴露出C-末端核酸结合序列,然后加入质粒pGM,然后在含有500 mM NaCl,pH 7.0、50 mM Tris–HCl、0.5 mM EDTA的透析液中、4℃透析过夜;经10-50%氯化铯密度梯度离心,收集14-19处离心液;将离心液过10 kDa孔径的柱,然后10000转/分离心30分钟,去除含氯化铯液体,用pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3次后,重悬于磷酸盐缓冲液中,得乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗;
所述质粒pGM的制备方法如下:克隆小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因,用BglII和EcoRI酶切后连接经同样酶切的pTCAE载体而得;
所述变性剂中各物质的浓度为:2 M尿素,200 mM NaCl,pH值为 9.5的50mM碳酸钠,10 mM β-巯基乙醇和200mM咪唑。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗,其特征在于:所述乙型肝炎病毒核心抗原与质粒DNA的摩尔比为1:1。
3.权利要求1所述乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗的制备方法,其特征在于:具体步骤如下:
将乙型肝炎病毒核心抗原在变性剂中处理30分钟,使乙型肝炎病毒核心抗原暴露出C-末端核酸结合序列,然后加入质粒pGM,然后在含有500 mM NaCl,pH 7.0、50 mM Tris–HCl、0.5 mM EDTA的透析液中、4℃透析过夜;经10-50%氯化铯密度梯度离心,收集14-19处离心液;将离心液过10 kDa孔径的柱,然后10000转/分离心30分钟,去除含氯化铯液体,用pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3次后,重悬于磷酸盐缓冲液中,得乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗;
所述变性剂中各物质的浓度为:2 M尿素,200 mM NaCl,pH值为 9.5的50mM碳酸钠,10 mM β-巯基乙醇和200mM咪唑。
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