CN102988976B - 乙型肝炎病毒核心抗原-dna复合疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗及其制备方法，该复合疫苗由乙型肝炎病毒核心抗原和质粒DNA组成，所述质粒DNA为含小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组载体，利用了乙型肝炎病毒核心抗原C端有效结合核酸及其自聚成病毒样颗粒的特性，克服了蛋白疫苗免疫原性较弱，不易诱导细胞毒性T细胞应答；DNA疫苗的转染具有非特异性，对体细胞的转染可导致T细胞对该抗原的耐受，长期免疫效果差的缺陷，制备的复合疫苗可于治疗乙型肝炎病毒感染的疫苗，具有广泛的应用前景。

Description

乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗，还涉及该复合疫苗的制备方法。

背景技术

蛋白疫苗和DNA疫苗是目前最常用的两种疫苗形式，二者均有各自的优势和劣势。蛋白疫苗可反复免疫，可有效激发机体体液免疫应答，但不易诱导细胞毒性T细胞（CTL）应答。DNA疫苗则具有较强的诱导机体细胞免疫应答的能力，而诱导体液免疫应答能力较弱；若单独使用，易被机体降解，且其转染具有非特异性，对体细胞的转染可导致T细胞对该抗原的耐受，长期免疫效果差。因此，如何实现二者的优势互补，一直是疫苗研究领域的热点。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗，即能有效激发机体的体液免疫，还能激发机体的体细胞免疫；本发明的目的之二在于提供乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗的制备方法。

1.乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗，由乙型肝炎病毒核心抗原和质粒DNA组成，所述质粒DNA为含小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组载体。

优选的，所述乙型肝炎病毒核心抗原与质粒DNA的摩尔比为1:1。

优选的，所述重组载体为pGM载体，制备方法如下：克隆小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，用BglII和EcoRI酶切后连接经同样酶切的pTCAE载体而得。。

2.所述乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗的制备方法，包括以下步骤：

将乙型肝炎病毒核心抗原加入变性剂，变性，然后加入质粒DNA，混合，经透析后，去变性，最后通过梯度离心得到乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗。

优选的，将HBcAg蛋白在变性条件下处理30分钟，使HBcAg蛋白裂暴露出C-末端核酸结合序列，然后加入质粒pGM，然后在含有500 mM NaCl，pH 7.0、50 mM Tris–HCl、0.5 mM EDTA的透析液中、4℃透析过夜；经10-50%氯化铯密度梯度离心，收集14-19处离心液；将离心液过10 kDa孔径的柱，然后10000转/分离心30分钟，去除含氯化铯液体，用pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于磷酸盐缓冲液中，得乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗；

所述变性剂中各物质的浓度为：2 M尿素，200 mM NaCl，pH值为 9.5的50mM碳酸钠，10 mM β-巯基乙醇和200mM咪唑。

本发明有益效果在于：本发明公开了乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗，巧妙利用乙型肝炎病毒核心抗原C端有效结合核酸及其自聚成病毒样颗粒的特性，克服了蛋白疫苗免疫原性较弱，不易诱导细胞毒性T细胞应答；DNA疫苗的转染具有非特异性，对体细胞的转染可导致T细胞对该抗原的耐受，长期免疫效果差的缺陷，实现了蛋白疫苗和DNA疫苗的优势互补，即能有效激发机体的体液免疫，还能激发机体的体细胞免疫；本发明还公开了复合疫苗的制备方法，制备方法简单，便于大批量生产。

附图说明

图1为HBcAg蛋白纯化前后的SDS-PAGE电泳图。

图2为DNA阻滞实验（A）和DNase I保护实验（B）（图A中，1： DNA marker DL2000， 2. HBcAg-pGM复合疫苗，3. 质粒pGM；图B中，1：DNA marker DL2000，2. HBcAg-pGM复合疫苗，3为经蛋白酶处理后的HBcAg-pGM复合疫苗）。

图3为HBcAg-DNA复合疫苗透视电镜照片。

图4 为HBcAg-DNA复合疫苗转染实验ELISA检测293T细胞上清GM-CSF的浓度（pg/mL）。

图5为⁵¹Cr杀伤实验结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

一、实验材料：

乙肝病毒核心抗原（HBcAg）表达质粒为pTrcHBcshHIS质粒，由Drvon Brunn惠赠（参考文献见：H. Wizemann，A.von Brunn. Purification of E. coli-expressed HIS-tagged hepatitis B core antigen by Ni²⁺ -chelate affinity chromatography. J Virol Methods. 1999；77(2)：189-97.）。

His蛋白纯化镍柱（Ni-NTA Agarose，购自Qiagen公司，货号30210）；表达小鼠巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）的质粒为pGM；对照质粒pTCAE：由M. Reff (IDEC Corp., San Diego, Calif.)惠赠；293T细胞，购自ATCC公司。

二、步骤

1. HBcAg蛋白的表达、纯化，参照已建立的方法（H. Wizemann，A.von Brunn. Purification of E. coli-expressed HIS-tagged hepatitis B core antigen by Ni²⁺ -chelate affinity chromatography. J Virol Methods. 1999；77(2)：189-97.）：

（1）pTrcHBcshHIS质粒转染DH5α感受态细胞，用含100 μg/mL的TY培养液230转37℃过夜培养；

（2） 取5 mL新鲜菌液至2000 mL TY培养液，230转37℃培养至OD₆₀₀为0.7；再加入IPTG至终浓度为0.1 mM，继续培养3小时。

（3）细菌沉淀加入裂解液(100 mM NaCl，50 mM Tris-HCl (pH 8.0)，5 mM EDTA，10 mM β-巯基乙醇，0.2% Trition-X-100，1 mg/mL溶菌酶，10 mg/mL DNaseⅠ和10 mg/mL RNAse A），配合超声，破碎细菌；然后10000 g、4℃离心20分钟，收集上清。

（4）HBcAg蛋白收集：将步骤（3）所得上清在25000 rpm条件下，用20%蔗糖进行密度梯度离心；然后溶解于解离溶液（2 M尿素，200 mM NaCl，50 mM 碳酸钠(pH 9.5)，10 mM β-巯基乙醇，5 mM咪唑，0.5%十二烷基肌氨酸钠），冰浴过夜后，再加入不含十二烷基肌酸钠的解离溶液，继续冰浴放置2 小时。

（5）HBcAg蛋白纯化、浓缩：用镍柱纯化HBcAg蛋白，去除细菌蛋白（具体操作步骤见Qiagen镍柱说明书）；测定蛋白浓度，如浓度过低可用10 kDa孔径Macrosep:Microsep柱(Pall Filtron, Karlstein, Germany)浓缩至合适浓度。

将纯化前和纯化后的HBcAg蛋白用SDS-PAGE检测，结果如图1所示。结果表明，处理HBcAg蛋白后，得到分子量约为17 kD的单体和分子量为34 kD的二聚体形式存在的；纯化后能得到纯度较高的HBcAg蛋白。

2. GM-CSF质粒大量制备

表达小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的质粒pGM由刘宏利博士惠赠（上海贺普生物科技有限公司），该质粒构建方法如下：用RT-RCR扩增编码小鼠GM-CSF基因，利用BglII/EcoRI克隆至真核表达质粒pTCAE（由Dr.M.Reff惠赠），测序验证后用碱裂解法大量制备质粒pGM。紫外分光度测定及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒质量及浓度。紫外分光光度测定显示A260/A280=1.95，质粒浓度为11.5 mg/mL，能够满足实验所需纯度及浓度。

3. HBcAg-DNA复合疫苗的制备与鉴定

（1）复合疫苗制备：将步骤1中纯化所得的HBcAg蛋白在变性条件（2 M 尿素，200 mM NaCl，50 mM碳酸钠(pH 9.5)，10 mMβ-巯基乙醇，200 mM 咪唑）下处理30分钟，使HBcAg蛋白裂暴露出C-末端核酸结合序列；然后加入质粒pGM使HBcAg蛋白与质粒pGM的按摩尔比为1:1；然后将结合产物，以含有500 mM NaCl，50 mM Tris–HCl (pH 7.0)、0.5 mM EDTA的液体为透析液，4℃透析过夜去除变性条件，使HBcAg蛋白重新聚合病毒样颗粒并包裹质粒pGM；经10-50%氯化铯密度梯度离心（4℃，SW41转子36000 转/分钟，18小时），收集14-19处离心液；将收集液置于10 kDa孔径Macrosep:Microsep柱(Pall Filtron，Karlstein，Germany)，10000转/分离心30分钟，去除含氯化铯液体，用pH7.0的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次后，重悬于合适体积的PBS中，得到HBcAg-DNA复合疫苗。HBcAg-DNA复合疫苗主要通过HBcAg蛋白C端带正电荷，质粒DNA带负电荷将HBcAg蛋白与质粒DNA连接，经HBcAg蛋白的自组装从而形成HBcAg-DNA复合疫苗。

重组乙肝核心抗原氨基酸序列：

M D I D P Y K E F G A S V E L L S F L P S D F F P S V R D L L D T A S A L Y R D A L E S P E H C T N H T A L R Q A I L C W G E L M T L A S W V G N N L E D P A A R D L V V N Y V N T N M G L K I R Q L L W F H I S C L T F G R E T V L E Y L V S F G V W I R T P P A Y R P P N A P I L S T L P E T T V V R R R G R S P H H H H H H

（2）复合疫苗鉴定：

① 通过凝胶延迟实验证实HBcAg与质粒pGM结合：取10 μL HBcAg-DNA复合物疫苗，使用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳；

② 通过DNase I保护试验证实质粒被包裹于HBcAg蛋白内部而不是存在于表面：一组用45 μL复合疫苗中加入5 μL含10 mM MgCl₂和10 mM CaCl₂的溶液，再加入5 μL 0.5 μg/mL的DNase I，37℃水浴30分钟；加入4 μL 0.5 M的EDTA 并65℃加热10分钟终止反应，如果质粒DNA位于颗粒的表面，则被降解；如果质粒被包裹于内部，则受到保护，需要将蛋白裂解后释放出来。另一组加入1μL 10% SDS，5 μL 10 mg/mL的蛋白酶K，55℃水浴30分钟，消化HBcAg颗粒；然后进行DNA琼脂糖凝胶电泳，检测有无DNA存在；如检测到DNA的存在，则证实质粒DNA被包裹在HBcAg病毒样颗粒内部，结果如图2所示。由图2可知，经蛋白酶K处理后的HBcAg-DNA复合疫苗能够检测到DNA存在，表明制得的HBcAg-DNA复合疫苗，HBcAg蛋白与pGM质粒结合，并将其包裹在蛋白内部。

另外通过透射电镜检测，分析HBcAg-DNA复合疫苗的结构，结果如图3所示。由图3可知，HBcAg-DNA复合疫苗包裹pGM质粒，形成直径约30 nm的颗粒。

4. HBcAg-DNA复合疫苗体外转染实验：

将制备的HBcAg-DNA复合疫苗转染293T细胞，以用HBcAg蛋白包裹pTCAE空白质粒及质粒pGM作为对照。转染48小时后，收集上清，ELISA试剂盒检测GM-CSF，结果如图4所示。由图4可知， HBcAg-pGM复合疫苗，能较好的介导pGM转染293T细胞。HBcAg与pGM的混合物只能介导低水平的GM-CSF表达，而HBcAg包裹空质粒pTCAE（由M. Reff博士惠赠，(IDEC Corp.，San Diego，California，美国)）则不能介导GM-CSF的表达。

5. HBcAg-DNA复合疫苗免疫原性分析：

免疫正常Balb/c小鼠：6~8周龄的Balb/c小鼠20只（雌雄各半），分为5组，每组4只。一组用HBcAg-pGM复合疫苗免疫接种；其余4组分别用HBcAg蛋白、pGM表达质粒、HBcAg蛋白包裹pTCAE质粒、HBcAg蛋白与pGM质粒混合免疫，作为对照。免疫部位均为尾根部皮下。然后去其脾细胞作为效应细胞、以P815-C为靶细胞进行⁵¹Cr杀伤实验，结果如图5所示。由图5可知，HbcAg-pGM复合疫苗在体内能较好地激发CTL反应，具有较好的免疫原性。

因此，根据HBcAg蛋白自聚成病毒样颗粒及其C末端能结合核酸的特性，HBcAg成功包裹质粒DNA，形成复合疫苗。这种新的疫苗形式能够实现蛋白疫苗和DNA疫苗的优势互补，在体内激发有效的细胞免疫及体液免疫应答。根据此思路用，不仅可制备用于HBV感染的疫苗，也可制备感染其他疾病及肿瘤等多种疾病。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明。

Claims (3)

1.乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗，其特征在于：由乙型肝炎病毒核心抗原和质粒DNA组成，所述质粒DNA为含小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组载体；

其制备方法为：将乙型肝炎病毒核心抗原在变性剂中处理30分钟，使乙型肝炎病毒核心抗原暴露出C-末端核酸结合序列，然后加入质粒pGM，然后在含有500 mM NaCl，pH 7.0、50 mM Tris–HCl、0.5 mM EDTA的透析液中、4℃透析过夜；经10-50%氯化铯密度梯度离心，收集14-19处离心液；将离心液过10 kDa孔径的柱，然后10000转/分离心30分钟，去除含氯化铯液体，用pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于磷酸盐缓冲液中，得乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗；

所述质粒pGM的制备方法如下：克隆小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，用BglII和EcoRI酶切后连接经同样酶切的pTCAE载体而得；

所述变性剂中各物质的浓度为：2 M尿素，200 mM NaCl，pH值为 9.5的50mM碳酸钠，10 mM β-巯基乙醇和200mM咪唑。

2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗，其特征在于：所述乙型肝炎病毒核心抗原与质粒DNA的摩尔比为1:1。

3.权利要求1所述乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

将乙型肝炎病毒核心抗原在变性剂中处理30分钟，使乙型肝炎病毒核心抗原暴露出C-末端核酸结合序列，然后加入质粒pGM，然后在含有500 mM NaCl，pH 7.0、50 mM Tris–HCl、0.5 mM EDTA的透析液中、4℃透析过夜；经10-50%氯化铯密度梯度离心，收集14-19处离心液；将离心液过10 kDa孔径的柱，然后10000转/分离心30分钟，去除含氯化铯液体，用pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3次后，重悬于磷酸盐缓冲液中，得乙型肝炎病毒核心抗原-DNA复合疫苗；

所述变性剂中各物质的浓度为：2 M尿素，200 mM NaCl，pH值为 9.5的50mM碳酸钠，10 mM β-巯基乙醇和200mM咪唑。

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