CN111548395A - 一种口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒及其应用 - Google Patents

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邵军军
常艳燕
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Abstract

本发明提供了一种口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒，涉及生物疫苗技术领域。本发明提供了口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒、表达所述重组病毒样颗粒的重组载体、包含所述重组载体的工程菌以及所述重组病毒样颗粒在制备疫苗中的应用。本发明将口蹄疫病毒A型和O型两种毒株的主要抗原表位分别进行合理串联后，分别插入到THBcAg二聚体的两个THBcAg分子中，构建得到所述重组病毒样颗粒(VLPs)。本发明利用所述VLPs进行免疫效力研究，表明所述VLPs免疫动物能够产生A型和O型FMDV特异性抗体滴度，而且能够诱发显著细胞免疫应答反应，可用于制备免疫疫苗，且与商品化灭活疫苗组相比无显着性差异。

Description

一种口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒及其应用
技术领域
本发明属于生物疫苗技术领域，具体涉及一种口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒及其应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus，FMDV)感染猪、牛、羊等偶蹄动物引起的一种具有高度传染性动物疫病。一旦发生口蹄疫疫情，将会造成严重的经济损失。目前口蹄疫灭活疫苗仍是预防和控制口蹄疫的主要手段，但是鉴于灭活疫苗在生产中存在的安全隐患，研制新型安全有效的口蹄疫亚单位疫苗刻不容缓。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒，利用所述重组病毒样颗粒免疫动物能够产生口蹄疫病毒特异性抗体滴度，而且能够诱发显著细胞免疫应答反应。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒，所述重组病毒样颗粒以乙肝核心抗原THBcAg二聚体为载体蛋白，分别在所述载体蛋白的每个乙肝核心抗原THBcAg分子的第78～82位氨基酸位置插入口蹄疫病毒抗原表位；
所述口蹄疫病毒抗原表位包括A型口蹄疫病毒的抗原表位和O型口蹄疫病毒的抗原表位；
所述乙肝核心抗原THBcAg二聚体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述载体蛋白的制备方法，包括将两个乙肝核心抗原THBcAg分子利用linker串联后，得所述载体蛋白；所述乙肝核心抗原THBcAg分子的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述A型口蹄疫病毒的抗原表位包括氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的A型口蹄疫病毒的重组B细胞表位；
所述O型口蹄疫病毒的抗原表位包括氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的O型口蹄疫病毒的B细胞表位。
优选的，所述A型口蹄疫病毒的重组B细胞表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述O型口蹄疫病毒的重组B细胞表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
优选的，所述重组病毒样颗粒的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种表达上述重组病毒样颗粒的重组载体，所述重组载体的序列中包括编码口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒的核苷酸序列；所述编码口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明还提供了一种重组工程菌，所述重组工程菌含有上述重组载体。
本发明还提供了上述重组病毒样颗粒在制备口蹄疫免疫疫苗中的应用。
本发明还提供了一种口蹄疫免疫疫苗，所述疫苗以上述重组病毒样颗粒为免疫原。
本发明还提供了所述口蹄疫免疫疫苗的制备方法，包括以下步骤：调整所述重组病毒样颗粒的浓度至200μg/mL，与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂等体积混合后，乳化得浓度为100μg/mL的口蹄疫免疫疫苗。
本发明提供了一种口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒，采用分子生物学技术以及先进的设计理念，将国内流行的口蹄疫病毒A型和O型两种毒株的主要抗原表位分别进行合理串联后，分别插入到THBcAg二聚体的两个THBcAg分子的第78～82位氨基酸位置，构建得到口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒(VLPs)。本发明利用所述VLPs进行免疫效力研究，表明所述VLPs免疫动物能够产生A型和O型FMDV特异性抗体滴度，而且能够诱发显著细胞免疫应答反应，可用于制备免疫疫苗，且与商品化灭活疫苗组相比无显着性差异。
附图说明
图1为本发明所述口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒的结构示意图；
图2为包含二价多表位THBcAg二聚体的表达与纯化结果分析图，其中泳道1表示THBcAg组装前蛋白，泳道2表示THBcAg组装后VLPs；
图3为重组装重组病毒样颗粒通过透射电镜的分析结果；
图4为A型FMDV特异性抗体的动态变化图；
图5为O型FMDV特异性抗体的动态变化图；
图6为各免疫组淋巴细胞经灭活FMDV抗原刺激后增殖水平；
图7为体外培养淋巴细胞经FMDV灭活抗原刺激后培养上清中细胞因子水平。
具体实施方式
本发明提供了一种口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒，所述重组病毒样颗粒以乙肝核心抗原THBcAg二聚体为载体蛋白，分别在所述载体蛋白的每个乙肝核心抗原THBcAg分子的第78～82位氨基酸位置插入口蹄疫病毒抗原表位；所述口蹄疫病毒抗原表位包括A型口蹄疫病毒的抗原表位和O型口蹄疫病毒的抗原表位；所述乙肝核心抗原THBcAg二聚体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述载体蛋白的制备方法，优选包括将两个乙肝核心抗原THBcAg分子利用linker串联后，得所述载体蛋白；所述乙肝核心抗原THBcAg分子的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明分别在所述载体蛋白的每个乙肝核心抗原THBcAg分子的第78～82位氨基酸位置插入口蹄疫病毒抗原表位，所述口蹄疫病毒抗原表位包括A型口蹄疫病毒的抗原表位和O型口蹄疫病毒的抗原表位，所述A型口蹄疫病毒的抗原表位优选包括A型口蹄疫病毒的重组B细胞表位，所述A型口蹄疫病毒的重组B细胞表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明所述O型口蹄疫病毒的抗原表位优选包括O型口蹄疫病毒的重组B细胞表位，所述O型口蹄疫病毒的重组B细胞表位的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.5所示。在本发明中，所述A型口蹄疫病毒的重组B细胞表位优选为将A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因序列上第134～161位氨基酸和第200～213位氨基酸进行特殊串联，在所述串联时，优选在不同的表位之间引入linker序列GGSSGG(SEQ ID NO.3)，从而避免新表位的形成。本发明所述O型口蹄疫病毒的重组B细胞表位的获得方法优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明所述重组病毒样颗粒的制备方法，优选包括将所述A型口蹄疫病毒的抗原表位和O型口蹄疫病毒的抗原表位分别插入到所述载体蛋白的每个乙肝核心抗原THBcAg分子的第78～82位氨基酸位置后，体外自组装成重组病毒样颗粒(VLPs)即可，更优选的为将每个所述乙肝核心抗原THBcAg分子的第78～82位氨基酸删除后，在删除的位置插入所述口蹄疫病毒抗原表位。本发明所述VLPs的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.6所示。本发明对所述体外自组装的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规重组病毒样颗粒的体外自组装方法即可。
本发明还提供了一种表达上述重组病毒样颗粒的重组载体，所述重组载体的序列中包括编码口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒的核苷酸序列；所述编码口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。本发明所述重组载体优选以pET-28a为基础载体，将所述编码口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒的核苷酸序列插入到所述基础载体中。本发明所述编码口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒的核苷酸序列中，编码乙肝核心抗原THBcAg二聚体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.8所示，且组成所述乙肝核心抗原THBcAg二聚体的THBcAg分子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.9所示，插入到所述THBcAg分子中的A型口蹄疫病毒的重组B细胞表位和O型口蹄疫病毒的重组B细胞表位的核苷酸序列优选分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。本发明对所述重组载体的构建方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法构建重组载体即可。
本发明还提供了一种重组工程菌，所述重组工程菌含有上述重组载体。本发明所述重组工程菌优选以原核表达菌感受态为宿主，所述原核表达菌感受态优选为大肠杆菌BL21感受态细胞。本发明在制备所述重组工程菌时，优选将所述重组载体转化所述宿主，本发明对所述转化的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规转化方法即可。
本发明还提供了上述重组病毒样颗粒在制备口蹄疫免疫疫苗中的应用。
本发明还提供了一种口蹄疫免疫疫苗，所述疫苗以上述重组病毒样颗粒为免疫原。
本发明还提供了所述口蹄疫免疫疫苗的制备方法，包括以下步骤：调整所述重组病毒样颗粒的浓度至200μg/mL，与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂等体积混合后，乳化得浓度为100μg/mL的口蹄疫免疫疫苗。本发明在验证所述口蹄疫免疫疫苗的作用时，在小鼠模型上的免疫剂量优选为10μg/只。
下面结合实施例对本发明提供的口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、A型、O型口蹄疫二价多表位重组蛋白的设计
根据NCBI上A型FMDV(AGDMM/CHA/2013)以及O型FMDV(O/MAY98/BY/2010)的基因序列，分别选取这两种血清型FMDV结构蛋白VP1基因序列上的两个B细胞表位，即将VP1上第134～161和200～213位的氨基酸序列进行特殊串联，在不同的表位之间引入linker序列GGSSGG，从而避免新表位的形成，形成A型FMDV的重组B细胞表位基因(SEQ ID NO.4)和O型FMDV的重组B细胞表位基因(SEQ ID NO.5)所示。
在NCBI上查找HBcAg分子的基因序列(GenBank登录号AEK93756)，选取串联的两分子HBcAg作为复合表位的载体蛋白(即二聚体，氨基酸序列SEQ ID NO.1，核苷酸序列SEQ IDNO.8)，分别插入到两个HBcAg分子的第78～82位氨基酸的位置，从而命名为THBc-AO，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。其中没有插入多表位序列的HBcAg二聚体分子作为分子内佐剂对照组，命名为THBc。
分别将THBc和THBc-AO的基因序列合成到克隆载体pUC57中，基因两端的酶切位点是BamH1和XhoI，从而得到重组质粒pUC57-THBc和pUC57-THBc-AO。这些重组质粒直接送至金斯瑞生物公司进行合成。
使用BamHI和XhoI两个限制性内切酶对pUC57-THBc、pUC57-THBc-AO以及pET-28a载体进行双酶切，37℃酶切3h之后进行琼脂糖凝胶电泳回收目的基因片段。将胶回收回来的THBc和THBc-AO的基因片段分别连接到胶回收回来的pET-28a载体上，16℃连接过夜，将连接产物转化DH5α感受态细胞。送西安擎科生物公司测序，对测序正确的菌液进行小提质粒，从而获得阳性重组表达质粒。提取质粒步骤参照试剂盒说明书。
2、重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及纯化
对测序正确的质粒pET-28a-THBc，pET-28a-THBc-AO进行诱导表达，过程如下：将这两种阳性质粒转化至BL21感受态细胞。挑取单克隆于5mL含卡那抗性的LB培养基中，37℃220rmp摇床培养过夜，将5mL菌液按1％的转接比例，转接到500mL的卡那LB培养基中，继续37℃220rmp摇床培养，等到菌液的OD600达到0.4～0.6时，加入IPTG进行诱导，使其终浓度0.5mM，接着37℃220rmp摇床培养8h，5000rmp离心收集菌体，收集的菌体用PBS洗一遍后，用binding buffer(组成：0.5M NaCl、50mM Tris、5mM咪唑，pH 8.0)将菌体重悬，超声裂解菌体，12000rmp离心，分为包涵体和上清两部分，并将两部分分别进行SDS-PAGE电泳分析，确定三种重组蛋白均为包涵体形式表达。
纯化步骤如下：将获得的包涵体首先用washing buffer(组成：0.5M NaCl、50mMTris、0.5mM EDTA、2M Urea、10％Triton X-100，pH 8.0)洗涤5遍，再用PBS洗涤1遍；在洗涤后的包涵体中加入solutionbuffer(组成：0.5M NaCl、50mM Tris、8M Urea、5mM咪唑、15mMβ-巯基乙醇，pH 8.0)，4℃溶解过夜；12000rmp离心，取上清。离心后的上清通过Ni-NTA亲和层析的方法进行纯化蛋白，纯化后的蛋白进行经SDS-PAGE以及Westernblot分析，结果如图2和图3所示，两种蛋白均能与anti-His单克隆抗体(mAb)发生反应，且只有THBc-AO能和感染A型和O型FMDV的阳性血清反应，说明纯化的蛋白具有生物活性。
实施例2
重组病毒样颗粒的制备
将实施例1中得到的三种重组蛋白采用尿素梯度透析的方法复性包涵体蛋白。将纯化后的蛋白装入透析袋中(透析袋截留分子量为15KD)，然后透析袋两端封闭好放入复性液中(组成：0.5M NaCl、50mM Tris、0.5mM EDTA、6M Urea、10％甘油、2mM GSH和0.2mMGSSG，pH 7.3)，并每隔8h换一次透析液，且同时依次降低尿素的浓度(6M、4M、2M、0M)，最后用PBS透析8h，获得复性后的重组蛋白。
同时采用负染色电镜技术检测重组蛋白THBc-AO。将样品稀释至0.8mg/mL，轻点至铜网并孵育5min，2％磷钨酸负染色，JEM2100HC透射电镜100kV下观察(JEOLL,Tokyo,Japan)。结果如图1所示，三种重组蛋白均成功自组装成完整的VLPs。
实施例3
疫苗制备及免疫效力实验
1、疫苗的制备
实施例2制备得到的纯化后的重组VLPs经Bio-Rad定量试剂盒定量后稀释成适当的浓度。用蛋白缓冲液调整浓度至200μg/mL，然后按照等比例加入完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂，(首免应用的是完全弗氏佐剂乳化的VLPs疫苗，在加强免疫阶段应用的是不完全弗氏佐剂乳化的疫苗)用乳化仪进行搅拌乳化，使蛋白完全乳化获得免疫原，得到浓度为100μg/mL的免疫疫苗。
2、免疫效力试验
将50只6～8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠随机分为3组(10只/每组)，包括：THBc-AO组，10μg/只；THBc，10μg/只；口蹄疫灭活疫苗组。
将制备好的免疫原，根据不同分组皮下注射免疫小鼠，分别于第0、2和4周接种小鼠3次，首次免疫注射弗氏完全佐剂乳化的疫苗，两次加强免疫注射不完全弗氏佐剂。
通过ELISA检测首次免疫后第0、14、21、28、35和42天采集的血清中FMDV特异性IgG的水平。在启动免疫后2周，结果如图4和图5所示，在血清样品中检测出A型和O型FMDV的特异性抗体。THBc-AO VLPs能够诱导产生A型和O型FMDV特异性中和抗体，且与灭活疫苗组没有显著差异；THBc-AO VLPs诱导的中和抗体效价显著高于THBc免疫组。表明重组的THBc-AOVLPs诱导了有效的体液免疫应答。
免疫后42d分离小鼠脾淋巴细胞，用灭活FMDV体外刺激小鼠脾淋巴细胞，用MTT淋巴细胞增殖试验检测T淋巴细胞增殖反应，结果如图6所示，THBc-AO和商品化疫苗组淋巴细胞的增殖能力均明显高于THBc组，THBc-AO组与商品化灭活疫苗组相比无显着性差异。
另外测定纯化的灭活口蹄疫病毒刺激脾淋巴细胞后培养液上清中Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4)细胞因子的浓度。结果如图7所示，与FMDV灭活疫苗相比，THBc-AO VLPs免疫组能显著产生Th1细胞因子(IFN-γ)。此外，THBc-AO免疫组Th2细胞因子应答(IL-4)和灭活疫苗组并无显著差异；表明THBc-AO VLPs本身具有较强的Th1型细胞免疫应答，同时能促进Th2型细胞因子。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Ser Ser Gly Gly Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met
85 90 95
Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr
100 105 110
Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp
115 120 125
Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
130 135 140
Thr Leu Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys
145 150 155 160
Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe
165 170 175
Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg
180 185 190
Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu
195 200 205
Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp
210 215 220
Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ser Gly Gly Arg Asp Leu
225 230 235 240
Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu
245 250 255
Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile
260 265 270
Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr
275 280 285
Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
290 295 300
<210> 2
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Ser Ser Gly Gly Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met
85 90 95
Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr
100 105 110
Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp
115 120 125
Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
130 135 140
Thr Leu Pro
145
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Gly Ser Ser Gly Gly
1 5
<210> 4
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Lys Tyr Ser Ala Pro Gln Asn Arg Arg Gly Asp Ser Gly Pro Leu Ala
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Gly Gly Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Lys Tyr Ser Ala Pro Ala Thr Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu
35 40 45
Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Gly Gly Ser Ser
50 55 60
Gly Gly Lys Tyr Ser Thr Gly Asn Ala Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly
65 70 75 80
Ser Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Gly Gly
85 90 95
Ser Ser Gly Gly Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln
100 105 110
Leu Leu
<210> 5
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val
1 5 10 15
Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly
20 25 30
Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val
35 40 45
Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly
50 55 60
Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val
65 70 75 80
Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly
85 90 95
Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val
100 105 110
Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Gly Gly Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Leu Leu
130 135 140
<210> 6
<211> 568
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Ser Ser Gly Gly Lys Tyr Ser Ala Pro Gln Asn Arg Arg Gly Asp Ser
85 90 95
Gly Pro Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Gly
100 105 110
Gly Ser Ser Gly Gly Lys Tyr Ser Ala Pro Ala Thr Arg Arg Gly Asp
115 120 125
Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe
130 135 140
Gly Gly Ser Ser Gly Gly Lys Tyr Ser Thr Gly Asn Ala Gly Arg Arg
145 150 155 160
Gly Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala
165 170 175
Ser Phe Gly Gly Ser Ser Gly Gly Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala
180 185 190
Pro Ala Lys Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gly Arg Asp Leu Val
195 200 205
Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu
210 215 220
Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu
225 230 235 240
Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg
245 250 255
Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Gly Gly Ser Ser Gly
260 265 270
Gly Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu
275 280 285
Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu
290 295 300
Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His
305 310 315 320
Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly
325 330 335
Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Gly
340 345 350
Gly Ser Ser Gly Gly Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg
355 360 365
Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Gly
370 375 380
Gly Ser Ser Gly Gly Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg
385 390 395 400
Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Gly
405 410 415
Gly Ser Ser Gly Gly Lys Tyr Gly Glu Ser Pro Val Thr Asn Val Arg
420 425 430
Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Gly
435 440 445
Gly Ser Ser Gly Gly Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val Arg
450 455 460
Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Gly
465 470 475 480
Gly Ser Ser Gly Gly Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys
485 490 495
Gln Leu Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gly Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr
500 505 510
Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His
515 520 525
Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val
530 535 540
Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn
545 550 555 560
Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
565
<210> 8
<211> 1704
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggacattg atccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60
tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120
gccttagagt ctcctgagca ttgttctcct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180
tgctgggggg aactaatgac tctagccacc tgggtgggtg gtaatttgga agatggtggt 240
tctagcggcg gtaagtactc cgcacctcaa aaccggcgag gtgactcggg tcctctcgcg 300
gcgagactcg ctgcacagct ccctgcctcc ttcggtggtt ctagcggcgg taagtactct 360
gcgcctgcaa cacggcgagg tgacttgggg tctctcgcgg cgaggctcgc cgcacagctt 420
cctgcctcct tcggtggttc tagcggcggt aagtactcca caggtaatgc aggcagacgg 480
ggtgatctag ggtctcttgc ggcgagggtc gccgcacagc ttcccgcttc tttcggtggt 540
tctagcggcg gtagacacaa gcagaaaatc attgcccctg caaaacaact cctgggtggt 600
tctagcggcg gtagggacct agtagtcagt tatgttaaca ctaatatggg cctaaagttc 660
aggcaactat tgtggtttca catttcttgt ctcacttttg gaagagaaac ggtcatagag 720
tatttggtgt ctttcggagt gtggattcgc actcctccag cttatagacc accaaatgcc 780
cctatcttat caacacttcc gggtggttct agcggcggta tggacattga tccttataaa 840
gaatttggag ctactgtgga gttactctcg tttttgcctt ctgacttctt tccttcagta 900
cgagatcttc tagataccgc ctcagctctg tatcgggaag ccttagagtc tcctgagcat 960
tgttctcctc accatactgc actcaggcaa gcaattcttt gctgggggga actaatgact 1020
ctagccacct gggtgggtgg taatttggaa gatggtggtt ctagcggcgg taagtatggc 1080
gagagccccg tgaccaatgt gagaggtgac ctgcaagtat tggcccagaa ggcggcaaga 1140
acgctgcctg gtggttctag cggcggtaaa tacgccgggg gctcactgcc caacgtgaga 1200
ggcgatctcc aagtgctggc tcagaaggca gcgaggccgc tgcctggtgg ttctagcggc 1260
ggtaagtatg gcgagagccc cgtgaccaat gtgagaggtg acctgcaagt attggcccag 1320
aaggcggcaa gaacgctgcc tggtggttct agcggcggta aatacgccgg gggctcactg 1380
cccaacgtga gaggcgatct ccaagtgctg gctcagaagg cagcgaggcc gctgcctggt 1440
ggttctagcg gcggtagaca caaacaaaag attgtggcgc ctgtgaaaca gcttttgggt 1500
ggttctagcg gcggtaggga cctagtagtc agttatgtta acactaatat gggcctaaag 1560
ttcaggcaac tattgtggtt tcacatttct tgtctcactt ttggaagaga aacggtcata 1620
gagtatttgg tgtctttcgg agtgtggatt cgcactcctc cagcttatag accaccaaat 1680
gcccctatct tatcaacact tccg 1704
<210> 8
<211> 900
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggacattg atccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60
tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120
gccttagagt ctcctgagca ttgttctcct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180
tgctgggggg aactaatgac tctagccacc tgggtgggtg gtaatttgga agatggtggt 240
tctagcggcg gtagggacct agtagtcagt tatgttaaca ctaatatggg cctaaagttc 300
aggcaactat tgtggtttca catttcttgt ctcacttttg gaagagaaac ggtcatagag 360
tatttggtgt ctttcggagt gtggattcgc actcctccag cttatagacc accaaatgcc 420
cctatcttat caacacttcc gggtggttct agcggcggta tggacattga tccttataaa 480
gaatttggag ctactgtgga gttactctcg tttttgcctt ctgacttctt tccttcagta 540
cgagatcttc tagataccgc ctcagctctg tatcgggaag ccttagagtc tcctgagcat 600
tgttctcctc accatactgc actcaggcaa gcaattcttt gctgggggga actaatgact 660
ctagccacct gggtgggtgg taatttggaa gatggtggtt ctagcggcgg tagggaccta 720
gtagtcagtt atgttaacac taatatgggc ctaaagttca ggcaactatt gtggtttcac 780
atttcttgtc tcacttttgg aagagaaacg gtcatagagt atttggtgtc tttcggagtg 840
tggattcgca ctcctccagc ttatagacca ccaaatgccc ctatcttatc aacacttccg 900
<210> 9
<211> 441
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggacattg atccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60
tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120
gccttagagt ctcctgagca ttgttctcct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180
tgctgggggg aactaatgac tctagccacc tgggtgggtg gtaatttgga agatggtggt 240
tctagcggcg gtagggacct agtagtcagt tatgttaaca ctaatatggg cctaaagttc 300
aggcaactat tgtggtttca catttcttgt ctcacttttg gaagagaaac ggtcatagag 360
tatttggtgt ctttcggagt gtggattcgc actcctccag cttatagacc accaaatgcc 420
cctatcttat caacacttcc g 441
<210> 10
<211> 342
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aagtactccg cacctcaaaa ccggcgaggt gactcgggtc ctctcgcggc gagactcgct 60
gcacagctcc ctgcctcctt cggtggttct agcggcggta agtactctgc gcctgcaaca 120
cggcgaggtg acttggggtc tctcgcggcg aggctcgccg cacagcttcc tgcctccttc 180
ggtggttcta gcggcggtaa gtactccaca ggtaatgcag gcagacgggg tgatctaggg 240
tctcttgcgg cgagggtcgc cgcacagctt cccgcttctt tcggtggttc tagcggcggt 300
agacacaagc agaaaatcat tgcccctgca aaacaactcc tg 342
<210> 11
<211> 426
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aagtatggcg agagccccgt gaccaatgtg agaggtgacc tgcaagtatt ggcccagaag 60
gcggcaagaa cgctgcctgg tggttctagc ggcggtaaat acgccggggg ctcactgccc 120
aacgtgagag gcgatctcca agtgctggct cagaaggcag cgaggccgct gcctggtggt 180
tctagcggcg gtaagtatgg cgagagcccc gtgaccaatg tgagaggtga cctgcaagta 240
ttggcccaga aggcggcaag aacgctgcct ggtggttcta gcggcggtaa atacgccggg 300
ggctcactgc ccaacgtgag aggcgatctc caagtgctgg ctcagaaggc agcgaggccg 360
ctgcctggtg gttctagcgg cggtagacac aaacaaaaga ttgtggcgcc tgtgaaacag 420
cttttg 426

Claims (10)

1.一种口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒，其特征在于，所述重组病毒样颗粒以乙肝核心抗原THBcAg二聚体为载体蛋白，分别在所述载体蛋白的每个乙肝核心抗原THBcAg分子的第78～82位氨基酸位置插入口蹄疫病毒抗原表位；
所述口蹄疫病毒抗原表位包括A型口蹄疫病毒的抗原表位和O型口蹄疫病毒的抗原表位；
所述乙肝核心抗原THBcAg二聚体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述重组病毒样颗粒，其特征在于，所述载体蛋白的制备方法，包括将两个乙肝核心抗原THBcAg分子利用linker串联后，得所述载体蛋白；所述乙肝核心抗原THBcAg分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述重组病毒样颗粒，其特征在于，所述A型口蹄疫病毒的抗原表位包括氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的A型口蹄疫病毒的重组B细胞表位；
所述O型口蹄疫病毒的抗原表位包括氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的O型口蹄疫病毒的重组B细胞表位。
4.根据权利要求3所述重组病毒样颗粒，其特征在于，所述A型口蹄疫病毒的重组B细胞表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述O型口蹄疫病毒的重组B细胞表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
5.根据权利要求1所述重组病毒样颗粒，其特征在于，所述重组病毒样颗粒的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.一种表达权利要求1～5任一项所述重组病毒样颗粒的重组载体，其特征在于，所述重组载体的序列中包括编码口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒的核苷酸序列；所述编码口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
7.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌含有权利要求6所述重组载体。
8.权利要求1～5任一项所述重组病毒样颗粒在制备口蹄疫免疫疫苗中的应用。
9.一种口蹄疫免疫疫苗，其特征在于，所述疫苗以权利要求1～5任一项所述重组病毒样颗粒为免疫原。
10.权利要求9所述口蹄疫免疫疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：调整所述重组病毒样颗粒的浓度至200μg/mL，与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂等体积混合后，乳化得浓度为100μg/mL的口蹄疫免疫疫苗。
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