CN111018997A - 一种基于fret的融合蛋白、荧光纳米颗粒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于FRET的融合蛋白、荧光纳米颗粒及其应用。该融合蛋白包括病毒结构蛋白，所述病毒结构蛋白能自组装成病毒样颗粒；和能实现荧光共振能量转移的供体‑受体对。本发明还提供一种病毒样荧光纳米颗粒由该融合蛋白组装得到，所述荧光纳米颗粒在提高FRET效率的同时，还极大提高了其作为荧光探针功能过程中的荧光信号输出量，在提高检测的灵敏度和稳定性的同时降低背景值提高信噪比；在应用时可直接与靶向性配体相连，可以保证荧光蛋白对的FRET效果，稳定性好，灵敏度高，使得实验结果误差减小，实验结果更贴近真实。

Description

一种基于FRET的融合蛋白、荧光纳米颗粒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于FRET的融合蛋白、荧光纳米颗粒及其应用。
背景技术
荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)是指两个不同的荧光发色基团，其中一个荧光发色基团(供体)的发射光谱与另一荧光发色基团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，当供体分子被激发后，受体与供体相距一定合适的距离，且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的供体将把一部分或全部能量通过偶极子的介导转移给受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重新吸收。这种无辐射方式的能量转移的效率与供体和受体之间的距离的六次方成反比，使得FRET对距离的微小变化极为敏感。
FRET发生的条件包括：供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱有一定的重叠；供体与受体之间的距离在10nm以内；供体的量子产率和受体的光吸收系数足够高；供体与受体的偶极具有合适的相对取向(Neha S et al.,Role of green fluorescentproteins and their variants in development of FRET-based sensors[J].Journalof Biosciences,2018)。
斯托克斯位移(Stokes shift)是荧光染料的一个重要的光物理参数，通常指一个荧光发色基团的最大激发光到最大发射光的波长差。在生物学研究中，斯托克斯位移小的荧光探针会导致探针荧光的严重自淬灭和瑞利散射，从而使检测的结果产生严重的误差，而斯托克斯位移较大则有利于消除背景激发光的影响，提高信噪比，增强检测灵敏性。因此，斯托克斯位移在荧光探针的设计和研究当中起着导向性的作用，而FRET效应带来的荧光探针的长斯托克斯位移具有明显的优势。
现在普遍使用的荧光探针是用单一的荧光染料修饰功能大分子(如蛋白质分子、核酸分子等)。但是，这种修饰的荧光染料个数有限，荧光信号背景值高，其稳定性、灵敏度，信噪比等都受到了较大的限制。例如，人的血清中含有多种荧光物质，在激发光的激发下正常人的血清荧光发射光谱基本覆盖整个可见光的范围(背景信号)(朱殿明,金万祥,骆晓森,et al.人血清血卟啉荧光光谱的双正交样条小波识别[J].光谱学与光谱分析,2008(08):185-188.)，这种背景荧光对于大多数临床血液或血清样本的荧光检测具有极大的干扰，严重影响受检者的检验数据判定。又如在活体动物成像当中，也存在着动物自发荧光的干扰及荧光穿透性差的问题(陈陵,高军,熊晓峰,et al.活体生物光学分子成像技术研究进展[J].医学综述,2010,16(24):3800-3802.)。因此，亟需一种能同时标记多个荧光基团，且荧光信号稳定性好、灵敏度高、信噪比高的荧光修饰体系。
发明内容
本发明旨在解决上述现有技术问题之中的至少一种。为此，本发明提供了一种基于FRET的融合蛋白、荧光纳米颗粒及其应用。
因此，本发明的目的之一在于提供一种融合蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种编码所述融合蛋白的核酸序列。
本发明的又一目的在于提供一种由所述融合蛋白组装得到的病毒样荧光纳米颗粒。
本发明所采用的技术方案如下文所述。
本发明的一个方面提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括：病毒结构蛋白，所述病毒结构蛋白能自组装成病毒样颗粒；能实现荧光共振能量转移的供体-受体对。
根据本发明的一些实施方式，所述病毒结构蛋白选自由乙肝核心抗原、乙肝表面抗原、丙肝核心抗原，丙肝包膜蛋白、人乳头瘤病毒、免疫缺陷症病毒壳体蛋白、猪细小病毒结构蛋白、流感病毒结构蛋白、流感病毒包膜蛋白、口蹄疫病毒结构蛋白、蓝舌病病毒结构蛋白、铁蛋白、链霉亲和素、饥饿诱导DNA结合蛋白、噬菌体衣壳蛋白、猿猴空泡病毒40、豇豆褪绿斑驳病毒组成的组中的一种或多种；优选地，所述病毒结构蛋白为乙肝核心抗原。
根据本发明的一些实施方式，所述供体-受体对为选自由ECFP-EYFP，mTurquoise2-sEYFP，mTurquoise2-mVenus，EGFP-mCherry，Clover-mRuby2，mClover3-mRuby3，mNeonGreen-mRuby3，eqFP650-iRFP，mAmetrine-tdTomato，LSSmOrange-mKate2，EGFP-sREACh，EGFP-ShadowG，EGFP-activated PA-GFP，EGFP-Phanta，mTagBFP-sfGFP，mVenus-mKO，CyOFP1-mCardinal，mClover3-mScarlet，mClover3-mScarlet-I组成的组中的至少一种；优选地，所述供体-受体对为mClover3与mScarlet-I。
根据本发明的一些实施方式，所述供体-受体对可以位于所述病毒结构蛋白的N或C端。
根据本发明的一些实施方式，所述供体-受体对插入在所述乙肝核心抗原的c/e1环处。
根据本发明的一些实施方式，所述供体-受体对可位于HBcAg的CoreN的3’端。根据本发明的一些实施方式，所述供体-受体对可位于HBcAg的core-C的5’端。
根据本发明的一些实施方式，所述供体-受体对中供体与受体之间通过柔性连接链相连。
本发明的另一方面还提供一种编码如上所述的融合蛋白的核酸序列。
本发明的另一方面提供了一种病毒样荧光纳米颗粒，所述病毒样荧光纳米颗粒由如上所述的融合蛋白组装得到，所述供体-受体对展示在病毒结构蛋白组装成的病毒样颗粒的外表面上。
病毒样颗粒(Virus-Like Particle，VLP)是由某种病毒的一种或多种结构蛋白自组装成的类似病毒粒子的结构。这种结构因不含病毒遗传物质，不能自主复制，而不具有感染能力。在本发明中，通过在构成VLP的结构蛋白上插入FRET荧光蛋白对来形成嵌合型VLP。插入有FRET荧光蛋白对的VLP结构蛋白在组装的过程中将FRET荧光蛋白对展示在病毒颗粒表面，形成功能性的纳米颗粒。
所述病毒样颗粒是由病毒的某种蛋白异源表达且自组装形成的具有3D纳米骨架结构的颗粒。
根据本发明的一些实施方式，所述病毒样颗粒可以由一种或多种病毒结构蛋白构成。所述病毒结构蛋白可以自组装形成病毒样颗粒，并且在特定位点融合外源蛋白后也不会影响其自组装形成病毒样颗粒，同时表达后的外源蛋白会暴露于病毒样颗粒的表面或者外部。
根据本发明的一些实施方式，所述病毒结构蛋白可为选自由乙肝核心抗原(HBcAg)、乙肝表面抗原、丙肝核心抗原，丙肝包膜蛋白、人乳头瘤病毒、免疫缺陷症病毒壳体蛋白、猪细小病毒结构蛋白、流感病毒结构蛋白、流感病毒包膜蛋白、口蹄疫病毒结构蛋白、蓝舌病病毒结构蛋白、铁蛋白、链霉亲和素蛋白、饥饿诱导DNA结合蛋白、噬菌体衣壳蛋白、猿猴空泡病毒40、豇豆褪绿斑驳病毒组成的组中的一种或多种。例如，所述病毒结构蛋白为乙肝核心抗原。
根据本发明的一些实施方式，所述病毒样颗粒可以为空壳样的二十面体或螺旋形结构。
根据本发明的一些实施方式，所述病毒样荧光纳米颗粒的直径为5nm～100nm。
根据本发明的一些实施方式，所述供体-受体对可以为选自由ECFP-EYFP、mTurquoise2-sEYFP、mTurquoise2-mVenus、EGFP-mCherry、Clover-mRuby2、mClover3-mRuby3、mNeonGreen-mRuby3、eqFP650-iRFP、mAmetrine-tdTomato、LSSmOrange-mKate2、EGFP-sREACh、EGFP-ShadowG、EGFP-activated PA-GFP、EGFP-Phanta、mTagBFP-sfGFP、mVenus-mKOK、CyOFP1-mCardinal、mClover3-mScarlet、mClover3-mScarlet-I组成的组中的至少一种。例如，所述供体-受体对可以为mClover3与mScarlet-I。
能实现荧光共振能量转移(FRET)的供体-受体对中供体和受体的光谱重叠积分较高，供体的量子产率较高。
根据本发明的一些实施方式，所述供体-受体对插入在所述病毒结构蛋白中，在所述病毒结构蛋白自组装成病毒样颗粒的过程中，展示在病毒样颗粒的表面。
根据本发明的一些实施方式，所述供体-受体对插入在乙肝核心抗原的c/e1环处。
根据本发明的一些实施方式，所述供体-受体对插入在乙肝核心抗原的core-N的3’端。根据本发明的一些实施方式，所述供体-受体对插入在乙肝核心抗原的core-C的5’端。
根据本发明的一些实施方式，所述供体-受体对中供体与受体通过柔性连接链(linker)相连。所述柔性连接链可以为本领域经常使用的任何连接氨基酸链。
柔性连接链自身不会影响被所连接蛋白各自的功能。柔性连接链可以有两种：螺旋形式的柔性连接链(如EAAAK)n；低疏水性、低电荷的氨基酸构成的柔性连接链，如(GGGGS)n。其中，n是任意整数。柔性连接链中应尽量避免过多的α螺旋和β转角结构，否则会限制被连接蛋白的伸缩性，从而影响其生物学活性。
图1中，以mScarlet-I-mClover3为例，示出了所述FRET供体-受体对的连接。本领域技术人员应理解，荧光蛋白对(供体-受体对)中的受体分子和供体分子的相对位置是可以互换的。
根据本发明的一些实施方式，所述供体-受体对与所述病毒结构蛋白的摩尔比为1:1至1:N，其中，N不大于420。
根据本发明的一些实施方式，所述供体-受体对的供体与受体之间的距离不超过10nm，例如可以为5、6.5、7、8.1、9、10nm等。
根据本发明的一些实施方式，展示在病毒样颗粒外表面的所述供体-受体对之间的距离可以为10nm以内。本发明的病毒样颗粒中，FRET供体-受体对即FRET荧光蛋白对展示在病毒样颗粒外表面，且不会影响病毒样颗粒的自组装。病毒样颗粒表面的FRET荧光蛋白对由于聚集临近效应，FRET效应不仅发生在分子内部，还会在分子间产生，从而进一步地提高病毒样颗粒表面的荧光蛋白对的FRET效率。
根据本发明的一些实施方式，所述病毒样荧光纳米颗粒可以进一步包括靶向配体。所述靶向配体可以为本领域技术人员已知的可以特异性结合细胞表面或细胞内靶点的配体。所述靶向性配体可以为抗原、抗体、核酸适配体等。所述荧光纳米颗粒可以通过基因融合或者通过化学交联，来连接一些靶向性的配体(如多肽，抗原，单链抗体等)。
根据本发明的一些实施方式，所述靶向配体位于所述病毒样荧光纳米颗粒的表面。
根据本发明的一些实施方式，所述靶向配体可以是靶向癌细胞。根据本发明的一些实施方式，所述靶向配体是RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)多肽。
本发明另一方面还提供一种病毒样荧光纳米颗粒的制备方法，包括：将能实现荧光共振能量转移的供体-受体对插入到病毒结构蛋白基因得到融合基因。
根据本发明的一些实施方式，所述方法还可包括将所述融合基因通过蛋白表达系统进行表达的步骤。
根据本发明的一些实施方式，所述方法还可包括将所述融合基因与载体连接并在原核表达系统中表达的步骤。
根据本发明的一些实施方式，所述病毒样荧光纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
1)通过柔性连接链连接所述供体-受体对中供体与受体；
2)将所述步骤1)得到的基因插入组成病毒样颗粒的结构蛋白基因中，得到重组表达载体；
3)将所述重组表达载体转化入宿主细胞；
4)培养所述步骤3)得到的细胞，分离纯化得到所述荧光纳米颗粒。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤2)中，将所述步骤1)得到的基因插入组成病毒样颗粒的结构蛋白基因的位点为可以使其表达后的荧光蛋白对展示在VLP表面的位点。
根据本发明的一些实施方式，所述宿主细胞可以是大肠杆菌、酵母、来源于昆虫及哺乳动物的真核细胞株。
根据本发明的一些实施方式，所述真核细胞株可以为BHK-21、CHO、293T、Vero、SF9、SF21或Hi-5细胞。
本发明另一方面还提供一种上述融合蛋白或上述病毒样荧光纳米颗粒在荧光成像或荧光检测中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种荧光探针，所述荧光探针包含上述病毒样荧光纳米颗粒。
本发明的另一目的在于提供一种如上所述的病毒样荧光纳米颗粒在制备用于免疫检测、荧光显微成像和/或活体成像的探针中的应用。
免疫检测一个难点在于背景荧光干扰，人的血清中含有多种荧光物质，在激发光的激发下正常人的血清荧光发射光谱基本覆盖整个可见光的范围。但是研究发现，血清的背景荧光在发射波长红移的过程中会明显地减弱，本发明的病毒样荧光纳米颗粒具有长的发射波长，能够在免疫检测中降低血清产生的背景干扰，提高信噪比。
荧光显微成像和/或活体成像也会存在背景荧光干扰或荧光穿透性低等问题，研究表明，发射荧光的红移能明显减低动物的自发荧光，600nm以上的波长的发射光能显著增加小鼠器官的透过率，本发明的病毒样荧光纳米颗粒在600nm附近存在高荧光信号，信噪比高，穿透性强，具有非常好的荧光显微成像和/或活体成像效果。
可以发生FRET效应的荧光发射供体-受体对可以看成一个整体发色团，它的斯托克斯位移为供体的激发光到受体激发光的位移长度，这种位移长度大于或远大于单一的发色团(供体或受体)的斯托克斯位移长度，称之为长斯托克斯位移发色团。
本发明通过将FRET供体-受体对插入到能够组成病毒样颗粒的结构蛋白中，得到在病毒样颗粒表面上展示FRET荧光蛋白对的病毒样颗粒。展示在病毒样纳米颗粒表面的FRET荧光蛋白对不但可以在分子内部发生FRET效应，而且在FRET蛋白分子对之间发生FRET效应，从而提高整体VLP上荧光蛋白对的FRET效率。因此本发明的荧光纳米颗粒具有斯托克斯位移长、荧光信号稳定、FRET效率高等优势；在生物成像和免疫荧光检测方面，可以起到降低背景值、提高信噪比的功能。
另外，FRET荧光蛋白对分子在病毒颗粒表面集中展示，在提高FRET效率的同时，还极大提高了此荧光纳米颗粒作为荧光探针功能过程中的荧光信号输出量。现有技术中一般采用对荧光蛋白基因序列进行突变的方法来提高荧光蛋白的斯托克斯位移，或者通过筛选不同的荧光蛋白对获得高FRET效率的荧光蛋白对。而本发明另辟蹊径，通过将荧光蛋白对展示在病毒样颗粒的外表面，在获得长斯托克斯位移的同时，使得荧光蛋白对在分子内部和分子间发生FRET效应，也大大提高其FRET效率。
现有技术中，荧光纳米颗粒的制备通常是将具有不同功能配体的亚基分别在不同的宿主细胞中表达形成各种病毒样颗粒，然后在将这些病毒样颗粒在体外各自分离纯化后，再混合在一起通过调节pH或者某些离子浓度使这些病毒样颗粒解组装形成不同的功能配体，再通过恢复pH或者某些离子浓度，使不同功能配体再自组装形成多种功能配体的病毒样颗粒(Li F et al.,Monofunctionalization of Protein Nanocages.Journal ofthe American Chemical Society,2011,133(50):20040-20043)。而本发明的荧光纳米颗粒，利用了病毒结构蛋白自组装的性质，在生物体内自动组装成带有荧光的病毒样颗粒，并通过纯化获得、荧光纳米颗粒。这种一步法合成，极大的简化了荧光纳米颗粒制备的步骤，避免了体外解组装再组装的过程。
现有技术中FRET荧光蛋白对可用于成像或检测，例如能量供体与蛋白A相连，能量受体与蛋白B相连，通过观察FRET效应，判断是否有抗原、抗体的特异性反应或实现靶向成像等。相比之下，本发明的荧光纳米颗粒在应用时直接将荧光蛋白对与靶向性配体相连，可以保证荧光蛋白对的FRET效果，稳定性好，灵敏度高，使得实验结果误差减小，实验结果更贴近真实。
附图说明
图1示出了根据本发明的一个实施方式的FRET供体-受体对基因结构示意图。
图2示出了根据本发明的一个实施方式的FRET供体-受体对基因插入HBcAg基因的结构示意图。
图3示出了根据本发明的一个实施方式的FRET供体-受体对基因与HBcAg基因连接过程示意图。
图4示出了根据本发明的一个实施方式的病毒样荧光纳米颗粒的透射电镜图以及该病毒样荧光纳米颗粒的结构示意图。
图5示出了根据本发明的一个实施方式的荧光纳米颗粒、仅FRET供体-受体对和仅供体的FRET效率图。
图6示出了根据本发明的一个实施方式通过两种连接方案得到的荧光纳米颗粒的FRET效率图。其中，方案1中，FRET荧光蛋白对的5’端融合在core-N的3’端；方案2中，FRET荧光蛋白对的3’端融合在core-C的5’端。
图7示出了根据本发明的一个实施方式的病毒样荧光纳米颗粒和人血清的发射光光谱图。
图8示出了根据本发明的一个实施方式的连接有RGD配体的病毒样颗粒。图8A示出了RGD-Scarlet-I-mClover3基因与HBcAg基因连接结构示意图；图8B示出了表面展示有RGD-Scarlet-I-mClover3的HBcAg病毒样颗粒的结构示意图。
图9示出了根据本发明的一个实施方式的表面展示有RGD-Scarlet-I mClover3的HBcAg病毒样颗粒靶向标记U87细胞的荧光图。
图10示出了根据本发明的一个实施方式的表面展示有RGD-Scarlet-I mClover3的HBcAg病毒样颗粒靶向肿瘤细胞的活体成像图及对应的热图。
具体实施方式
以下结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1.FRET供体-受体对的制备
绿色荧光蛋白mClover3：GenBank Accession No.:KX987298.1，717bp；
红色荧光蛋白mScarlet-I：GenBank Accession No.:KY021423，696bp；
柔性连接链氨基酸序列为：SGLRSRAQASNSAVDGT。
分别以绿色荧光蛋白mClover3和红色荧光蛋白mScarlet-I的基因为模板，进行PCR扩增。其中，绿色荧光蛋白PCR扩增引物为：
mClover3-F:GTGAGCAAGGGCGAGGAGC
mClover3-R:GGCATGGACGAGCTGTACAAG
红色荧光蛋白PCR扩增引物为：
mScarlet-I-F:GTGAGCAAGGGCGAGGCAG
mScarlet-I-R:GCATGGACGAGCTGTACAAG
将上述柔性连接链插入mScarlet-I与mClover3之间。同时在mScarlet-I的5’端加入Strep标签，便于后期蛋白纯化。构建得到mScarlet-I-连接链-mClover3，其结构示意图如图1所示。
将获得的mScarlet-I-连接链-mClover3克隆入pET32a原核表达载体的Nde I和Xho I内切酶位点之间。使用CaCl2转化方法，将得到的表达载体转化入感受态大肠杆菌Rosetta细胞中。将转化后的细胞培养在氨苄青霉素培养基上，筛选出带有外源DNA分子。经测序，验证了插入的mScarlet-I-连接链-mClover3序列正确。
实施例2.重组表达载体的构建
在本实施例中，通过基因改造，将实施例1中构建的mScarlet-I-连接链-mClover3结构插入HBcAg基因中。
以实施例1中的mScarlet-I-连接链-mClover3基因为模板，使用如下引物进行PCR扩增，得到mScarlet-I-连接链-mClover3的PCR产物。
mScarlet-I-F：GTGAGCAAGGGCGAGGCAG；
mClover3-R：GGCATGGACGAGCTGTACAAG。
本实施例中使用的HBcAg基因序列为GenBank Accession No:CAA24706。
将HBcAg基因在c/e1环处，拆分为N端(core-N)和C端(core-C)两部分。可以将FRET荧光蛋白对的5’端融合在core-N的3’端(方案1)，也可以将FRET荧光蛋白对的3’端融合在core-C的5’端(方案2)。图2示出了，按照方案2将FRET供体-受体对基因插入HBcAg的core-C5’端的结构示意图。
将HBcAg基因从c/e1环处将其拆分成core-N和core-C两部分，其中，拆分时所使用的引物对为：
HBcAg-F:TCTAGAGACCTGGTAGTCAG；
HBcAg-R:ATCCTCCAAGTTAACACCCAC。
如图3所示，FRET供体-受体对基因与HBcAg基因连接结构示意图。具体连接过程为：将HBcAg基因的core-N序列后加入TAA终止密码子，放在pETDuet表达载体的5’端，然后按照5’→3’的基因序列依次加入以下序列：RBS序列(核糖体结合序列)，ATG起始密码子，实施例1中带有标签序列的FRET荧光蛋白对序列，HBcAg基因的core-C序列，TAA终止密码子。
实施例3.大肠杆菌的诱导表达及检测
将实施例2制备得到的HBcAg中插入mScarlet-I-连接链-mClover3的基因序列克隆入pET32a的表达载体中，使用CaCl2转化方法转化入感受态大肠杆菌Rosetta细胞中，将转化后的细胞培养在氨苄青霉素培养基上，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。经测序，证明mScarlet-I-连接链-mClover3已正确插入HBcAg基因的c/e1环中。
将获得的正确阳性克隆，先使用LB培养基扩大化培养，随后加入终浓度为1M的IPTG的在25℃诱导表达。在Rosetta大肠杆菌中表达展示FRET供体受体对的HBcAg病毒样纳米颗粒。将展示有mScarlet-I-mClover3供体-受体对的HBcAg病毒样纳米颗粒的诱导菌体离心收集后，使用超声破碎仪破碎后，获取上清，先使用硫酸铵沉淀，再使用TN缓冲液(25mMTris-Cl[pH7.5],150mM NaCl)复溶，后使用蔗糖密度梯度超速离心，于30％～40％蔗糖浓度梯度区间获取展示FRET供体-受体对的HBcAg病毒样纳米颗粒。病毒样纳米颗粒使用100kD浓缩管(Millipore公司)浓缩后，取10μL蛋白溶液滴于干净平铺的封口膜上，使其形成一个球形的液滴，将投射电镜所用的吸附单边的铜网正面向下吸附于蛋白液滴上，吸附5min；然后将残留液体用滤纸吸去，再铜网正面向下吸附于预先滴于封口膜上的10μL 2％的磷钨酸或醋酸双氧铀负染液上面，吸附5min。再次用滤纸将铜网上残留的液体吸去，然后将铜网正面向上放置于滤纸上，室温过夜风干，第二天于透射电子显微镜(型号：HITACHIH-7000FA)上进行观察。
如图4所示，为病毒样荧光纳米颗粒的透射电镜图以及该病毒样荧光纳米颗粒的结构示意图。其中，图4A示出了病毒样荧光纳米颗粒的透射电镜图，通过大肠杆菌进行表达，HBcAg的core-N和core-C自动组装成病毒样颗粒，并且mScarlet-I-mClover3供体-受体对展示在病毒样颗粒的表面。图4B示出了该病毒样荧光纳米颗粒的结构示意图。
实施例4.检测HBcAg病毒样荧光纳米颗粒的FRET效率
将实施例1制备得到的纯化后的FRET供体受体对即mScarlet-I-mClover3，实施例3制备得到的展示有mScarlet-I-mClover3供体受体对的HBcAg病毒样纳米颗粒蛋白，和作为阴性对照的Scarlet-I(0.1mg/ml)各100μl置于黑色酶标板(PE公司)中，使用酶标仪(激发光为480nm，发射光为520nm和600nm，PE公司EnSpire 2300Multilabel Reader)检测两种蛋白在480nm激发光激发下，520nm和600nm处的发射光强度Ex值Ex520和Ex600，然后计算各自Ex600/Ex520的比值。结果如图5所示。
从图5的结果可以看出，mScarlet-I-mClover3供体-受体对展示于HBcAg表面(即HBc-Scarlet-I-mClover3)的FRET效率为112.8％；而没有展示在病毒样颗粒表面、处于自由状态的mScarlet-I-mClover3供体-受体对的FRET效率仅为34.7％。这表明FRET供体-受体对展示在病毒样颗粒表面，可以显著提高FRET效率。
由这一结果，可以知晓mClover3-mScarlet-I展示于HBcAg病毒样纳米颗粒表面，不影响HBcAg样病毒颗粒的自组装，也不影响mClover3-mScarlet-I发生FRET效率，而且还会显著提高FRET效率。这可能是由于聚集临近效应，FRET效应不仅发生在融合于同一HBcAg亚基上的mClover3-mScarlet-I的分子内部，还会在融合于不同HBcAg亚基上的mClover3-mScarlet-I和mClover3-mScarlet-I之间产生进一步的能量转移，从而使FRET效率显著提高。
另外，发明人还使用相同方式检测了按照实施例2的两种方案得到的荧光纳米颗粒的FRET率，结果如图6所示。从图6可以看出，方案2得到的荧光纳米颗粒的FRET率更高。
实施例5.病毒样荧光纳米颗粒的发射光光谱图
取实施例4制备得到的病毒样荧光纳米颗粒和人血清样品，分别在488nm激发光下进行荧光光谱扫描，结果如图7所示，其中，图7a为人血清荧光发射光谱，图7b为病毒样荧光纳米颗粒发射光光谱图。可以看出，在600nm左右时，人血清的荧光背景明显降低，病毒样荧光纳米颗粒的荧光信号明显增强。一般荧光成像滤光片的红色波长是600nm，因此，在用于荧光成像时，本发明制备的病毒样荧光纳米颗粒具有非常高的信噪比，尤其是相对于血清或含血清的样品。也就意味着，本发明的病毒样荧光纳米颗粒用于荧光显微成像、免疫检测或活体成像等方面具有非常好的优势。
实施例6.病毒样荧光纳米颗粒应用于荧光显微成像
已知配体RGD多肽在病毒样荧光纳米颗粒表面表达，能使病毒样荧光纳米颗粒靶向细胞表面的CD51分子(αvβ3整合素)(Danhier F et al.,RGD-Based Strategies ToTarget Alpha(v)Beta(3)Integrin in Cancer Therapy and Diagnosis.MolecularPharmaceutics,2012,9(11):2961-2973)。
为了研究本发明的病毒样荧光纳米颗粒在显微成像中的效果，本实施例构建了带有RGD配体的病毒样荧光纳米颗粒。
使用以下引物对扩增RGD配体：
RGD-F:
CGTGGTGACCGCGGCGACGGTGGAGGTGGATCGGTGAGCAAGGGCGAGG；
RGD-R:CTTGTACAGCTCGTCCATGC。
将RGD基因序列引入到Scarlet-I-mClover3基因的5’端，然后将带有RGD序列的Scarlet-I-mClover3基因按照实施例2的方法插入HBcAg序列的c/e1环处(如图8A所示)。按照实施例3的方法对上述基因进行表达和蛋白纯化，得到表面展示有RGD-Scarlet-ImClover3的HBcAg病毒样颗粒。图8B示出了表面展示有RGD-Scarlet-I mClover3的HBcAg病毒样颗粒的结构示意图。
使用制备得到的HBcAg病毒样颗粒进行靶向细胞实验，具体实验过程如下：
培养人脑胶质瘤细胞U87细胞，以2×105个细胞/每个培养皿的密度接种到25mm石英底培养皿中，培养基为MEM培养基+15％胎牛血清+1％双抗(青链霉素)，37℃，培养6小时。使用PBS清洗3遍。加入4％多聚甲醛，1ml/每个培养皿，室温下孵育15分钟。使用PBS清洗3遍。使用1％PBST+10％胎牛血清，室温下封闭30分钟，使用PBS清洗3遍。使用PBS(4％BSA)，将上述HBcAg病毒样颗粒稀释至50μg/ml，加入培养皿中，1ml/每个培养皿，置于4℃孵育过夜。次日使用PBS清洗3遍，然后使用双光子共聚焦荧光显微镜(Nikon A1 MP STORM)观察成像结果，激发光为488nm，结果如图9所示。其中，图9A为使用Hoechst染料对U87细胞核的染色图(原荧光彩图为蓝色)，图9B为U87表面CD51分子被上述HBcAg病毒样颗粒靶向标记后，使用488nm激光激发，在600nm滤光片下观察到的荧光图(原荧光彩图为红色)。图9B中可以看到明显的红色信号，且信噪比高。
实施例7.病毒样荧光纳米颗粒应用于活体动物成像
使用实施例5制备得到的表面展示有RGD-Scarlet-I mClover3的HBcAg病毒样颗粒进行小鼠体内肿瘤细胞靶向实验，具体实验过程如下：
培养人脑胶质瘤细胞U87细胞，取1×107个细胞/ml的密度(稀释液为PBS)等体积混合基质胶(Matrigel，美国康宁公司购买)，以皮下接种的方式接种100ul上述细胞混合物至6周龄雌性BALB/C-nu裸鼠腋下，持续培养裸鼠并每日观察，直至裸鼠皮下接种细胞处出现直径约5mm左右的肿瘤凸起，于肿瘤凸起的周围通过皮下注射，注射入100ul制备好的HBcAg病毒样颗粒溶液(PBS稀释)，注射的蛋白量为6mg/kg(病毒样颗粒质量/小鼠体重)，继续培养裸鼠直至48小时，使用小动物活体成像系统(型号：Maestro2，美国剑桥科研仪器公司，CRi)对裸鼠进行荧光成像观察病毒样荧光纳米颗粒对小鼠体内肿瘤细胞的成像效果。
如图10所示，为表面展示有RGD-Scarlet-I mClover3的HBcAg病毒样颗粒靶向肿瘤细胞的活体成像图及对应的热图。图10a(原荧光彩图为绿色)，10b(原彩图为蓝色)为488nm激发，520nm绿色滤光片获得的荧光成像图，其中图10b为图10a基础上使用软件处理的热图结果；图10c(原荧光彩图为红色)，图10d(原彩图为红色)为488nm激发，600nm红色滤光片获得的荧光成像图，其中图10d为图10c基础上使用软件处理的热图结果。图10a中红色箭头为肿瘤接种区，可看到明显的凸起，左侧裸鼠为注射无靶向肽RGD3的实施例3制备得到的表面展示有Scarlet-I mClover3的HBcAg病毒样颗粒，右侧裸鼠为注射含有靶向肽RGD3的实施例5制备得到的表面展示有RGD-Scarlet-I mClover3的HBcAg病毒样颗粒；可以看到接种具有肿瘤靶向性的病毒样颗粒裸鼠的肿瘤在绿色和红色发射区均有信号，而接种无靶向性纳米颗粒的裸鼠的肿瘤在绿色和红色发射区均无明显的信号，且由FRET效应获得的红色荧光信号，信号强度明显高于绿色荧光信号，且背景值显著降低。
本发明构建的带有FRET荧光对的病毒样颗粒，可靶向癌症细胞，从而为癌细胞的成像，示踪以及治疗提供了基础。可靶向患病部位，活体成像。可以看出，其具有显著的长斯托克斯位移，可以提高成像的信噪比。并且需要的激发光和发射光光谱均是常用的激发和发射长度，常用的仪器即可普适，无需特殊的仪器和设备。
本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

Claims (11)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括：
病毒结构蛋白，所述病毒结构蛋白能自组装成病毒样颗粒；
能实现荧光共振能量转移的供体-受体对。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述病毒结构蛋白为选自由乙肝核心抗原、乙肝表面抗原、丙肝核心抗原，丙肝包膜蛋白、人乳头瘤病毒、免疫缺陷症病毒壳体蛋白、猪细小病毒结构蛋白、流感病毒结构蛋白、流感病毒包膜蛋白、口蹄疫病毒结构蛋白、蓝舌病病毒结构蛋白、铁蛋白、链霉亲和素蛋白、饥饿诱导DNA结合蛋白、噬菌体衣壳蛋白、猿猴空泡病毒40、豇豆褪绿斑驳病毒组成的组中的一种或多种；优选地，所述病毒结构蛋白为乙肝核心抗原。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述供体-受体对为选自由ECFP-EYFP，mTurquoise2-sEYFP，mTurquoise2-mVenus，EGFP-mCherry，Clover-mRuby2，mClover3-mRuby3，mNeonGreen-mRuby3，eqFP650-iRFP，mAmetrine-tdTomato，LSSmOrange-mKate2，EGFP-sREACh，EGFP-ShadowG，EGFP-activated PA-GFP，EGFP-Phanta，mTagBFP-sfGFP，mVenus-mKO，CyOFP1-mCardinal，mClover3-mScarlet，mClover3-mScarlet-I组成的组中的至少一种；优选地，所述供体-受体对为mClover3与mScarlet-I。
4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述供体-受体对插入在所述乙肝核心抗原的c/e1环处。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述供体-受体对中供体与受体之间通过柔性连接链相连。
6.一种编码如权利要求1～5中任一项所述的融合蛋白的核酸序列。
7.一种病毒样荧光纳米颗粒，其特征在于，所述病毒样荧光纳米颗粒由权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白组装得到，所述供体-受体对展示在病毒结构蛋白组装成的病毒样颗粒的外表面上。
8.根据权利要求7所述的病毒样荧光纳米颗粒，其特征在于，所述供体-受体对与所述病毒结构蛋白的摩尔比为1:1至1:N，其中，N不大于420。
9.根据权利要求7所述的病毒样荧光纳米颗粒，其特征在于，所述病毒样荧光纳米颗粒进一步包括靶向性配体，所述靶向性配体选自抗原、抗体或核酸中的至少一种。
10.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针包括如权利要求7至9中任一项所述的病毒样荧光纳米颗粒。
11.一种如权利要求7～9中任一项所述的病毒样荧光纳米颗粒在制备用于免疫检测、荧光显微成像和/或活体成像的探针中的应用。
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