CN114252622A - 一种体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法 - Google Patents

一种体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法，属于生物分析检测领域。该方法通过体外检测荧光能量共振转移(FRET)信号变化来筛选抑制剂分子。具体的方法是，首先通过基因工程方法分别在新型冠状病毒的受体结合蛋白(RBD)及其受体人源血管紧张素转化酶2(hACE2)融合上标签蛋白，分别用FRET给‑受体荧光小分子分别标记这两个蛋白。在溶液中，用给体分子激发光激发，由于hACE2和RBD蛋白相互作用，发射受体分子荧光。当加入新冠病毒抑制剂后，hACE2和RBD蛋白被解离，此时，分子受体的荧光减弱，而给体荧光增强。应用该方法，可以在体外筛选新冠病毒抑制剂分子，具有灵敏、快速的特点。

Description

一种体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法
技术领域
本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法。
背景技术
新型冠状病毒(COVID-19)是由核壳蛋白包裹单链RNA组成，其感染细胞的机制与SARS-CoV相似，都是通过病毒表面的刺突S蛋白与人细胞膜蛋白血管紧张素转化酶2(hACE2)结合，在蛋白酶的作用下，内呑进入细胞内而感染。目前，COVID-19感染已经成为全球性的流行疾病，严重威胁着人类的健康。然而，还没有治疗新冠病毒的特效药物，因此药物发现与筛选工作成为部分研究人员关注的重点。
COVID-19S蛋白由S1和S2两个亚基组成，其中，S2亚基包含疏水单元，用于侵染细胞膜。而S1亚基包含一个受体结合部位RBD(receptor-binding domain)，用于识别宿主细胞的ACE2蛋白。RBD与hACE2的强相互作用是病毒侵染细胞的关键，因此其活性中心部位成为疫苗与药物开发的重要靶点，研究人员认为筛选出靶向hACE2-RBD作用活性位点的药物，阻止病毒结合hACE2侵染细胞可能是其快速治疗方案。因此，一种快速、高效、灵敏的筛选方法是必不可少的。目前，已经有大量研究者应用计算机模拟的方法筛选hACE2或者RBD的抑制剂，但是计算机模拟法无法还原蛋白的真实环境，误差较大；而应用假病毒原位侵染过表达hACE2细胞的方法则耗时长，无法通量的筛选；目前，商业化的新冠病毒RBD抑制剂筛选试剂盒通常是在体外环境利用ELISA方法检测，存在操作复杂，耗时长，信号弱等缺点；
荧光检测技术具有信号灵敏，原位检测、筛选通量高、检测成本低、检测仪器成熟的突出优势，而被广泛应用于高通量药物筛选体系。它的原理是通过标记技术将带有对应配体的荧光团标记到受体蛋白上，加入药物分子后，通过分析荧光信号筛选出活性分子。目前这种光学标记技术灵活多样，常规的荧光强度变化已经不能满足高灵敏度实验的要求，因此，荧光猝灭检测、荧光偏振检测、荧光共振能量转移检测(FRET)和均相时间分辨荧光共振能量转移检测(HTRF)等多种荧光检测技术逐渐发展起来并均在高通量筛选中得到了应用。但是目前还没有荧光体系应用于hACE2-RBD相互作用活性位点抑制剂的筛选。
发明内容
本发明提供一种体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法，通过体外检测荧光能量共振转移(FRET)信号变化来筛选抑制剂分子。具体的方法是，首先通过基因工程方法分别在新型冠状病毒的受体结合蛋白(RBD)及其受体人源血管紧张素转化酶2(hACE2)融合上标签蛋白，分别用FRET给-受体荧光小分子分别标记这两个蛋白。在溶液中，用给体分子激发光激发，由于hACE2和RBD蛋白相互作用，发射受体分子荧光。当加入新冠病毒抑制剂后，hACE2和RBD蛋白被解离，此时，分子受体的荧光减弱，而给体荧光增强。应用该方法，可以在体外筛选新冠病毒抑制剂分子，具有灵敏、快速的特点。
一种基于RBD与人源ACE2相互作用体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法，其特征在于，该筛选步骤为：
(1)分别用FRET给-受体荧光团标记hACE2和新冠病毒RBD蛋白，并纯化；
(2)在溶液中加入荧光标记后的hACE2和RBD蛋白；用荧光给体的波长激发，采集荧光光谱；
(3)加入带筛选的分子，孵育5-30分钟，用荧光给体的波长激发，采集荧光光谱；
(4)分析光谱数据，得出筛选结果。
步骤(1)所述的hACE2蛋白为hACE2与标签蛋白的融合蛋白，是分别将SNAP、Halo或者CLIP标签蛋白融合在hACE2蛋白的N端或者C端。
步骤(1)所述的RBD蛋白为hACE2与标签蛋白的融合蛋白，是分别将SNAP、Halo或者CLIP标签蛋白融合在RBD蛋白的N端或者C端。
步骤(1)所述的FRET给-受体荧光团为带有标签蛋白专一底物的荧光分子。步骤(4)所述的光谱数据的分析，结果为加了待筛选分子的RBD-hACE2溶液荧光光谱中，如果受体荧光减弱，给体荧光增强，则说明该分子有抑制hACE2与RBD蛋白相互作用的能力。
一种基于RBD与人源ACE2相互作用体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法，其特征在于，能够在溶液里快速筛选新冠病毒RBD和hACE2蛋白相互作用的抑制剂。
一种基于RBD与人源ACE2相互作用体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法，其特征在于：筛选出的抑制剂能够抑制hACE2与新型冠状病毒的RBD蛋白的结合，该抑制剂可以是hACE2的抑制剂，也可以是RBD的抑制剂。
本发明的优点和有益效果为：
首先，本发明在体外通过采集FRET荧光信号进行筛选，具有灵敏、快速的特点；其次，通过基因工程方法将蛋白标签融合到目标蛋白上，其优点是根据所用的仪器或者荧光通道不同，可以选择不同的FRET给-受体荧光团标记到目标蛋白上应用。另外，本筛选方法能够同时筛选hACE2-RBD相互作用位点的hACE2或者RBD的抑制剂分子
附图说明
图1为荧光探针与hACE2蛋白作用前后的SDS-PAGE电泳图。
图2为荧光探针与RBD蛋白作用前后的SDS-PAGE电泳图。
图3为SNAP-hACE2-560Dye与RBD541-Halo-640Dye作用前后的荧光光谱图。
图4为加入中和抗体前后SNAP-hACE2-560Dye与RBD541-Halo-640Dye相互作用的荧光光谱图。
图5为SNAP-hACE2-560Dye与RBD525-Halo-640Dye作用前后的荧光光谱图。
图6为加入中和抗体前后SNAP-hACE2-560Dye与RBD525-Halo-640Dye相互作用的荧光光谱图。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
hACE2和标签蛋白融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化
用常规分子克隆方法先将hACE2的非跨膜区域M1-S740氨基酸的cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将C端带有6His的SNAP标签蛋白的cDNA亚克隆到hACE2的C端，得到pCMV-hACE2-SNAP-6His。用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-hACE2-SNAP-6His，然后用Ni-NTA柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量约为117.4kDa的目的蛋白hACE2-SNAP约0.65mg。
实施例2
荧光标记hACE2-SNAP蛋白并纯化
hACE2-SNAP蛋白溶于PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液中，制成0.25mg/mL的母液。SNAP560荧光染料溶于DMSO配置成2mM的母液。取hACE2-SNAP蛋白溶液100μL，加入SNAP560荧光染料0.32μL，使得蛋白与探针的摩尔比值为1:3，室温下反应1小时得到hACE2-SNAP-560dye。然后用PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液过葡聚糖凝胶柱G-25除盐，洗脱下来的hACE2-SNAP-560dye用浓缩柱浓缩，用考马斯亮蓝染色法测出纯化后的hACE2-SNAP-560dye蛋白浓度为0.18mg/mL，摩尔浓度约为1.7μM。
取hACE2-SNAP和hACE2-SNAP-560dye少量，跑SDS-PAGE电泳，其考马斯亮蓝染色图像以及紫外光激发成像如图1所示。图1的左图为考马斯亮蓝染色，右图为紫外激发的荧光成像，其中第1和2道分别为hACE2-SNAP和hACE2-SNAP-560dye。蛋白hACE2-SNAP的分子量约为117.4kDa，略大于标准蛋白116.0kDa，荧光标记后的hACE2-SNAP-560dye在紫外光激发下显示出黄红色的荧光。
实施例3
hACE2和标签蛋白融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化
用常规分子克隆方法先将hACE2的非跨膜区域M1-S740氨基酸的cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将N端带有10His的SNAP标签蛋白的cDNA亚克隆到hACE2的N端信号肽(hACE2的第1-51个碱基为信号肽)之后，得到pCMV-10His-SNAP-hACE2。用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-10His-SNAP-hACE2，然后用Ni-NTA柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为117.4kDa的目的蛋白SNAP-hACE2约0.7mg。
实施例4
荧光标记SNAP-hACE2蛋白并纯化
SNAP-hACE2蛋白溶于PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液中，制成1.5mg/mL的母液。SNAP560荧光染料溶于DMSO配置成2mM的母液。取SNAP-hACE2蛋白溶液20μL，加入SNAP560荧光染料0.4μL，使得蛋白与探针的摩尔比值为1:3，室温下反应1小时得到SNAP-hACE2-560dye。然后用PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液过葡聚糖凝胶柱G-25除盐，洗脱下来的SNAP-hACE2-560dye用浓缩柱浓缩，用考马斯亮蓝染色法测出纯化后的SNAP-hACE2-560dye蛋白浓度为0.37mg/mL，摩尔浓度约为3.2μM。
取SNAP-hACE2和SNAP-hACE2-560dye少量，跑SDS-PAGE电泳，其考马斯亮蓝染色图像以及紫外光激发成像如图1所示。图1的左图为考马斯亮蓝染色，右图为紫外激发的荧光成像，其中第3和4道分别为SNAP-hACE2和SNAP-hACE2-560dye。蛋白SNAP-hACE2的分子量约为117.4kDa，略大于标准蛋白116.0kDa，荧光标记后的SNAP-hACE2-560dye在紫外光激发下显示出黄红色的荧光。
实施例5
RBD525-Halo融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化
用常规分子克隆方法先将新型冠状病毒RBD(333-525)cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将C端带有6His的Halo标签蛋白的cDNA亚克隆到RBD的C端，得到pCMV-RBD-Halo-6His。用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-RBD-Halo-6His，然后用Ni-NTA柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为57KDa的目的蛋白RBD525-Halo约0.5mg。
实施例6
荧光标记RBD525-Halo蛋白并纯化
RBD525-Halo蛋白溶于PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液中，制成1.1mg/mL的母液。Halo640荧光染料溶于DMSO配置成2mM的母液。取RBD525-Halo蛋白溶液20μL，加入Halo640荧光染料0.6μL，使得蛋白与探针的摩尔比值为1:3，室温下反应2小时得到RBD525-Halo-640dye。将蛋白溶液的总体积补充到100μL，然后用PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液过葡聚糖凝胶柱G-25除盐，洗脱下来的RBD525-Halo-640dye用浓缩柱浓缩，用考马斯亮蓝染色法测出纯化后的RBD525-Halo-640dye蛋白浓度为0.17mg/mL，摩尔浓度约为3μM。
取RBD525-Halo和RBD525-Halo-640dye少量，跑SDS-PAGE电泳，其考马斯亮蓝染色图像以及紫外光激发成像如图2所示。图2的左图为考马斯亮蓝染色，右图为紫外激发的荧光成像，其中第3和4道分别为RBD525-Halo和RBD525-Halo-640dye。蛋白RBD525-Halo的分子量约为57kDa，介于标准蛋白44.3kDa与66.4kDa之间，荧光标记后的RBD525-Halo-640dye在紫外光激发下显示出红色的荧光。
实施例7
RBD541-Halo融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化
用常规分子克隆方法先将新型冠状病毒RBD(319-541)cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将C端带有6His的Halo标签蛋白的cDNA亚克隆到RBD的C端，得到pCMV-RBD-Halo-6His。用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-RBD-Halo-6His，然后用Ni-NTA柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为59.6KDa的目的蛋白RBD541-Halo约0.5mg。
实施例8
荧光标记RBD541-Halo蛋白并纯化
RBD541-Halo蛋白溶于PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液中，制成0.55mg/mL的母液。Halo640荧光染料溶于DMSO配置成2mM的母液。取RBD541-Halo蛋白溶液20μL，加入Halo640荧光染料0.6μL，使得蛋白与探针的摩尔比值为1:3，室温下反应2小时得到RBD541-Halo-640dye。然后用PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液过葡聚糖凝胶柱G-25除盐，洗脱下来的RBD541-Halo-640dye用浓缩柱浓缩，用考马斯亮蓝染色法测出纯化后的RBD541-Halo-640dye蛋白浓度为0.18mg/mL，摩尔浓度约为3.1μM。
取RBD541-Halo和RBD541-Halo-640dye少量，跑SDS-PAGE电泳，其考马斯亮蓝染色图像以及紫外光激发成像如图2所示。图2的左图为考马斯亮蓝染色，右图为紫外激发的荧光成像，其中第1和2道分别为RBD541-Halo和RBD541-Halo-640dye。蛋白RBD541-Halo的分子量约为59.6kDa，介于标准蛋白44.3kDa与66.4kDa之间，荧光标记后的RBD541-Halo-640dye在紫外光激发下显示出红色的荧光。
实施例9
SNAP-hACE2-560Dye与RBD541-Halo-640Dye相互作用荧光检测。
在PBS(20mM,pH＝7,4)缓冲液中配置SNAP-hACE2-560Dye母液3.5μM，RBD541-Halo-640Dye母液1.6μM。在96孔板A1孔加7μL SNAP-hACE2-560Dye和43μLPBS缓冲液，A2孔中加入10μL RBD541-Halo-640Dye和40μL PBS缓冲液，A3孔中加入7μL SNAP-hACE2-560Dye，10μL RBD541-Halo-640Dye，和33μL PBS缓冲液。使得A1，A2，和A3孔中的SNAP-hACE2-560Dye和RBD541-Halo-640Dye分别为0.5μM和0.35μM。静置10分钟后，在500nm激发光下检测A1,A2,和A3孔的荧光光谱，得到图3。
图3中，黑色实线为500nm激发下SNAP-hACE2-560Dye荧光光谱，且在590nm左右发射较强的荧光；黑色虚线为500nm激发下RBD541-Halo-640Dye荧光光谱，在670nm左右发射较弱的荧光；黑色点连成的线为500nm激发下SNAP-hACE2-560Dye和RBD541-Halo-640Dye相互作用之后的荧光光谱，其在590nm左右的发射峰强度比黑色实线弱，而670nm左右发射峰强度比黑色点线强，说明hACE2和RBD蛋白相互作用时，560Dye和640Dye之间发生荧光共振能量转移。
实施例10
RBD中和抗体的检测
在PBS(20mM,pH＝7,4)缓冲液中配置SNAP-hACE2-560Dye母液3.5μM，RBD541-Halo-640Dye母液1.6μM。在96孔板A1孔加入7μL SNAP-hACE2-560Dye，10μL RBD541-Halo-640Dye，和33μL PBS缓冲液。A2孔中加入7μL SNAP-hACE2-560Dye，10μL RBD541-Halo-640Dye，2μL RBD中和抗体(母液为17μM)和31μL PBS缓冲液，使得A1和A2孔中的SNAP-hACE2-560Dye和RBD541-Halo-640Dye分别为0.5μM和0.35μM。静置20分钟后，在500nm激发光下检测A1和A2孔的荧光光谱，得到图4。
图4中，黑色实线为500nm激发下SNAP-hACE2-560Dye和RBD541-Halo-640Dye相互作用之后的荧光光谱，黑色虚线为500nm激发下SNAP-hACE2-560Dye，RBD541-Halo-640Dye和中和抗体，三者相互作用之后的荧光光谱，其在590nm左右的发射峰强度比黑色实线的增强，而670nm左右发射峰强度比黑色实线的弱，说明中和抗体抑制了hACE2和RBD蛋白的相互作用时，因此560Dye和640Dye之间发生的荧光共振能量转移效率减弱。
实施例11
SNAP-hACE2-560Dye与RBD525-Halo-640Dye相互作用荧光检测。
在PBS(20mM,pH＝7,4)缓冲液中配置SNAP-hACE2-560Dye母液3.5μM，RBD525-Halo-640Dye母液4.2μM。在96孔板A1孔加7μL SNAP-hACE2-560Dye和43μLPBS缓冲液，A2孔中加入6μL RBD525-Halo-640Dye和44μL PBS缓冲液，A3孔中加入7μL SNAP-hACE2-560Dye，6μL RBD525-Halo-640Dye，和37μL PBS缓冲液。使得A1，A2，和A3孔中的SNAP-hACE2-560Dye和RBD525-Halo-640Dye均为0.5μM。静置10分钟后，在500nm激发光下检测A1,A2,和A3孔的荧光光谱，得到图5。
图5中，黑色实线为500nm激发下SNAP-hACE2-560Dye荧光光谱，且在590nm左右发射较强的荧光；黑色虚线为500nm激发下RBD525-Halo-640Dye荧光光谱，在670nm左右发射较弱的荧光；黑色点连成的线为500nm激发下SNAP-hACE2-560Dye和RBD525-Halo-640Dye相互作用之后的荧光光谱，其在590nm左右的发射峰强度比黑色实线弱，而670nm左右发射峰强度比黑色点线强，说明hACE2和RBD蛋白相互作用时，560Dye和640Dye之间发生荧光共振能量转移。
实施例12
RBD中和抗体的检测
在PBS(20mM,pH＝7,4)缓冲液中配置SNAP-hACE2-560Dye母液3.5μM，RBD525-Halo-640Dye母液4.2μM。在96孔板A1孔加入7μL SNAP-hACE2-560Dye，6μL RBD525-Halo-640Dye，和37μL PBS缓冲液。A2孔中加入7μL SNAP-hACE2-560Dye，6μL RBD525-Halo-640Dye，3μL RBD中和抗体(母液为17μM)和34μL PBS缓冲液，使得A1和A2孔中的SNAP-hACE2-560Dye和RBD525-Halo-640Dye均为0.5μM。静置20分钟后，在520nm激发光下检测A1和A2孔的荧光光谱，得到图6。
图6中，黑色实线为520nm激发下SNAP-hACE2-560Dye和RBD525-Halo-640Dye相互作用之后的荧光光谱，黑色虚线为520nm激发下SNAP-hACE2-560Dye，RBD525-Halo-640Dye和中和抗体，三者相互作用之后的荧光光谱，其在590nm左右的发射峰强度比黑色实线的增强，而670nm左右发射峰强度比黑色实线的弱，说明中和抗体抑制了hACE2和RBD蛋白的相互作用时，因此560Dye和640Dye之间发生的荧光共振能量转移效率减弱。

Claims (9)

1.一种体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法，其特征在于，该方法基于RBD与ACE2相互作用，通过体外检测荧光能量共振转移(FRET)信号变化来筛选抑制剂分子。
2.根据权利要求1所述的体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法，其特征在于，该方法分别在新型冠状病毒的受体结合蛋白(RBD)及其受体人源血管紧张素转化酶2(hACE2)融合上标签蛋白，分别用FRET给-受体荧光小分子分别标记RBD和hACE2，在溶液中，用给体分子激发光激发，检测给体荧光强弱实现新型冠状病毒抑制剂的筛选。
3.根据权利要求1所述的体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法，其特征在于，该筛选步骤为：
(1)分别用FRET给-受体荧光团标记hACE2和新冠病毒RBD蛋白，并纯化；
(2)在溶液中加入荧光标记后的hACE2和RBD蛋白；用荧光给体的波长激发，采集荧光光谱；
(3)加入带筛选的分子，孵育5-30分钟，用荧光给体的波长激发，采集荧光光谱；
(4)分析光谱数据，得出筛选结果。
4.根据权利要求1所述的体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法，其特征在于：步骤(1)所述的hACE2蛋白为hACE2与标签蛋白的融合蛋白，是分别将SNAP、Halo或者CLIP标签蛋白融合在hACE2蛋白的N端或者C端。
5.根据权利要求1所述的体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法，其特征在于：步骤(1)所述的RBD蛋白为hACE2与标签蛋白的融合蛋白，是分别将SNAP、Halo或者CLIP标签蛋白融合在RBD蛋白的N端或者C端。
6.根据权利要求1所述的体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法，其特征在于：步骤(1)所述的FRET给-受体荧光团为带有标签蛋白专一底物的荧光分子。
7.根据权利要求1所述的体外筛选新型冠状病毒抑制剂的方法，其特征在于：步骤(4)的光谱数据的分析，结果为加了待筛选分子的RBD-hACE2溶液荧光光谱中，如果受体荧光减弱，给体荧光增强，则说明该分子有抑制hACE2与RBD蛋白相互作用的能力。
8.一种如权利要求1-7任一所述方法筛选的新型冠状病毒抑制剂，其特征在于，
该抑制剂为hACE2抑制剂或RBD抑制剂。
9.一种如权利要求8所述的新型冠状病毒抑制剂在治疗新型冠状病毒药物中的应用。
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