CN1690691A - Sars冠状病毒3cl蛋白酶活性测定和抑制剂筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SARS冠状病毒3CL蛋白酶活性测定和抑制剂筛选方法，该方法采用合成SARS冠状病毒3CL蛋白酶荧光底物将荧光底物与反应缓冲液混合再加入3CL蛋白酶在一定条件下激发，检测发射波长的荧光值变化，完成对SARS冠状病毒3CL蛋白酶的体外活性测定。3CL蛋白酶与待筛选小分子化合物在一定条件下孵育，再加上荧光底物混匀，用光激发检测发射波长下的荧光值，测定加入小分子化合物后的3CL蛋白酶的活性，与不加入化合物的3CL蛋白酶进行活性比较，计算出小分子化合物对3CL蛋白酶的活性抑制率。
Description
技术领域
本发明涉及分子和细胞生物学研究领域，具体涉及SARS冠状病毒3CL蛋白酶荧光底物的合成；利用荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)方法，测定SARS冠状病毒3CL蛋白酶的活性以及进行其抑制剂的筛选。
背景技术
2003年春季我国爆发了SARS(严重急性呼吸综合症，Severe Acute RespiratorySyndrome，SARS)疫情，并迅速蔓延至世界30多个国家和地区。4月16日，经过科学家们的共同努力，世界卫生组织(WHO)在各国研究成果的基础上，正式宣布SARS冠状病毒(SARS Coronavirus，SARS_CoV)为导致严重急性呼吸综合症(SARS)的病原体。SARS在我国内地的北京、山西、内蒙等25个省市自治区“肆意横行”，对我国人民群众的生命财产曾构成严重威胁。SARS是一种传染性强、生存强、致死率高的新型病毒，截止到2003年5月19日，全球累计报告病例已达7864人，死亡病例643人。SARS已被世界公认为人类的共同敌人。
根据SARS冠状病毒(SARS_CoV)的基因组分析发现，在编码SARS冠状病毒RNA聚合酶的多聚蛋白质开放阅读框(OPF)中，除了RNA聚合酶编码序列，还存在一类主要蛋白酶(M proteinase)的编码序列，因为这一类蛋白酶的底物剪切特异性类似小RNA病毒(Picomavirus)的3C蛋白酶，所以又被称为3CL蛋白酶(3 chymotrypsin-likeproteinase，3CLpro)。3CL蛋白酶是SARS冠状病毒复制过程中的关键蛋白，其主要功能是水解冠状病毒所表达的两个多聚蛋白质ppla(replicase la，约450kD)和pplab(replicase lab，约750kD).这两个多聚蛋白质编码了冠状病毒复制和转录所需的所有蛋白，其中pplab的表达是在ppla开放阅读框的基础上，通过-1核糖体移码阅读(-1 ribosomal frameshifting)完成的。3CL蛋白酶能够在不同的位点切割ppla和pplab，释放出各种成熟形式的非结构性蛋白，完成病毒的复制和转录。
序列分析表明不同的冠状病毒3CL蛋白酶具有很高的同源性，其中SARS CoV 3CL蛋白酶与人冠状病毒(Human coronavirus，HCoV 229E)，猪传染性胃肠炎病毒(Porcinetransmissible gastroenteritis virus，TGEV)的3CL蛋白酶的序列同一性分别达到了40％和44％，与鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)和牛冠状病毒(Bovine coronavirus，BCoV)的3CL蛋白酶的序列同一性达到了50％和49％，与鸟感染性支气管炎病毒(Avian infectiousbronchitis virus，IBV)的3CL蛋白酶的序列同一性也达到了39％。由于冠状病毒3CL蛋白酶的序列具有高度的保守性，科学家通过同源建模的方法，分别以HCoV 229E 3CL蛋白酶的结构和TGEV 3CL蛋白酶与CMK(hexapeptidyl chloromethal ketone)抑制剂的复合物结构为模板，得到了SARS CoV 3CL蛋白酶的三级结构。3CL蛋白酶的单体结构由三个结构域(domain)构成，结构域1(residue 8-99)和结构域2(residue 100-183)由6个反向平行的β折叠构成，紧密堆积成类似小病毒3C蛋白酶的糜胰蛋白酶样结构，底物结合位点位于结构域1和2之间的裂缝中。结构域3(residue 200-300)是一个由5个α螺旋构成的相对独立的球状区域，通过一个长的环状区(loop，residue 184-189)与结构域2相连，结构域3对于3CL蛋白酶的水解活性是必需的。在晶体结构中3CL蛋白酶以二聚体的形式存在，其中一个蛋白酶分子的结构域2与另一个蛋白酶分子的N末端残基通过疏水相互作用，以相互垂直的方式相结合，其埋藏面积约为1300A2。在二聚体结构中，一个单体分子的N末端位于自身的结构域2，3与另外一个单体分子的结构域2所形成的复合结构中，N末端的这种定位有利于3CL蛋白酶对多聚蛋白质的切割。
SARS-CoV 3CL蛋白酶模型的底物结合位点与TGEV和HCoV 229E 3CL蛋白酶晶体结构的底物结合位点匹配得相当好。因此可以推测，与TGEV 3CL蛋白酶结合的抑制剂应当可以与HCoV 229E、SARS-CoV 3CL蛋白酶以类似的方式结合。这一点已经通过底物切割实验得到证实。序列为H2N-VSVNSTLQ↓SGLRKMA-COOH的十五肽(代表TGEV 3CLpro的氨基末端自切割位点)可以有效地被SARS-CoV 3CLpro水解，说明TGEV 3CLpro与SARS-CoV3CLpro的作用方式是十分类似的。
由于3CL蛋白酶在SARS冠状病毒的复制过程中具有关键性作用，同时它在不同的冠状病毒中具有高度的保守性，所以SARS冠状病毒3CL蛋白酶已成为研究抗SARS药物的一个重要靶标。如果可以有效抑制该蛋白酶的活性，就可以控制住SARS冠状病毒在体内的传播，从而发现治疗SARS的有效药物。
因此，在体外有效的测定SARS冠状病毒3CL蛋白酶的活性，建立SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂的分子筛选模型将具有重要的现实意义。本发明者经过反复实验并利用实验过程中所积累的独特相关技术经验，首次利用荧光共振能量转移(Fluorescence Resonanceenergy Transfer.FRET).合成了SARS冠状病毒3CL蛋白酶的荧光底物，成功地在体外测定了SARS冠状病毒3CL蛋白酶的活性，并对可能的抑制剂进行了筛选，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供能够在体外对SARS冠状病毒3CL蛋白酶进行活性测定和抑制剂筛选的荧光底物。
本发明的另一个目的是提供SARS冠状病毒3CL蛋白酶的体外测活方法和抑制剂分子高通量筛选模型。
1)SARS冠状病毒3CL蛋白酶荧光底物的合成根据SARS冠状病毒3CL蛋白酶的底物切割特异性，即底物氨基酸序列(Leu，Ile)-Gln↓-(Ser，Ala，Gly)的保守性，参照文献[1]，通过固相合成技术合成SARS冠状病毒3CL蛋白酶的类似底物十二肽，其氨基酸序列为Val-Asn-Ser-Thr-Leu-Gln-↓-Ser-Gly-Leu-Arg-Lys-Met，并利用荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)，在两端的缬氨酸(Val)和赖氨酸(Lys)残基上分别连接荧光基团5′-(2′-氨乙基氨基萘-1-磺酸)(EDANS)和淬灭基团4′-(4′-二甲基氨基叠氮苯)苯甲酸(Dabcyl)，最终得到3CL蛋白酶的荧光底物。([1]CarlosGarcia-Echeverria，Daniel H.Rich New intramolecularly quenched fluorogenic peptidesubstrates for the study of the kinetic specificity of papain FEBS Lett，Vol297，100-102)；
2)SARS冠状病毒3CL蛋白酶的体外活性测定
将荧光底物与反应缓冲液(20mM Sodium Phosphate，pH7.5，100mM Nacl)混合，25℃下平衡30分钟，再加入SARS冠状病毒3CL蛋白酶，利用荧光分光光度计以340nm波长的光激发，检测490nm发射波长下的荧光值变化，完成对SARS冠状病毒3CL蛋白酶的体外活性测定。
3)SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂的筛选
将SARS冠状病毒3CL蛋白酶与待筛选的小分子化合物25℃下孵育30分钟，再加入上述合成的荧光底物，充分混匀，利用荧光分光光度计以340nm波长的光激发，检测490nm发射波长下的荧光值，测定加入小分子化合物后3CL蛋白酶的活性，与不加入化合物的3CL蛋白酶进行活性比较，计算小分子化合物对3CL蛋白酶活性的抑制率，完成对SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂的体外筛选。
优选实施方案
实验材料：
荧光底物(十二肽)根据Carlos Garcia-Echeverria，Daniel H Rich所报道的方案[1]，通过固相合成技术获得。SARS冠状病毒3CL蛋白酶为本实验室借助细胞分子生物学方法，选用pQE30载体构建表达质粒(pQE30-3CL)，在大肠杆菌中表达，通过NTA-Ni柱层析的方法纯化所获得，具体方法参照文献[2]。用于筛选的小分子化合物为本实验室所合成([2]Haifang Sun，Haibin Luo，Changying Yu，Tao Sun etc，Molecular cloning，expression，purification，and mass spectrometric characterization of 3C-like protease of SARScoronavirus Protein Expression and Purification，Vol32,302-308)。
实验原理：
基本原理是荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)。如图1，多肽底物上合成有两个荧光基团：一个荧光供体(Donor)及该供体的淬灭受体(Acceptor)。由于荧光供体(D)的发射波长和淬灭受体(A)的激发波长有重叠，两个基团之间的距离很短(10-100埃米)，使得在光激发状态下，荧光供体(D)的能量被受体(A)特异性的淬灭，该量子现象称为共振能量转移。经过蛋白酶特异性切割后，多肽底物断裂，荧光供体与淬灭受体分离，恢复其本身的全部荧光，所以一个低荧光的多肽底物经过酶切割反应以后成为高荧光的物质，而且荧光强度的增加与多肽水解的程度呈线性相关。
本发明提供的SARS冠状病毒3CL蛋白酶的荧光底物是根据3CL蛋白酶的底物切割特异性，根据Carlos Garcia-Echeverria，Daniel H.Rich所报道的方案[1]，通过固相合成技术合成的十二肽，其氨基酸序列为Val-Asn-Ser-Thr-Leu-Gln-Ser-Gly-Leu-Arg-Lys-Met。在十二肽的两端分别连接荧光基团5′-(2′-氨乙基氨基萘-1-磺酸)(EDANS)和淬灭基团4′-(4′-二甲基氨基叠氮苯)苯甲酸(Dabcyl)。EDANS和Dabcyl为常用的荧光-猝灭分子对，结构如下图所示，EDANS是一种常用的蓝绿色荧光分子，最适激发波长为340nm，最适发射波长为490nm，Dabcyl是一种常用的荧光淬灭分子，其吸收光谱与EDANS的荧光发射光谱重叠(图2)。Dabcyl对EDANS的淬灭效率大于95％，检测的荧光背景很低。
5′-(2′-氨乙基氨基萘-1-磺酸(EDANS)结构
4′-(4′-二甲基氨基叠氮苯)苯甲酸(Dabcyl)结构
将本发明提供的荧光底物与SARS冠状病毒3CL蛋白酶孵育，由于3CL蛋白酶能特异性地识别并切割该荧光底物的核心序列(Leu-Gln↓-Ser)，使得底物两端的EDANS和Dabcyl分离。通过荧光分光光度计以340nm波长的光激发，检测490nm波长下发射光的荧光强度，就能在体外准确测定SARS冠状病毒3CL蛋白酶的活性，如图3所示。
实验内容：
1.SARS冠状病毒3CL蛋白酶的表达和纯化
利用本实验室构建的3CL-pQE30表达质粒转化大肠杆菌M15，选用合适的条件(IPTG浓度、温度、表达时间)，通过NTA-Ni柱层析的方法纯化SARS冠状病毒3CL蛋白酶，具体方案参照(Haifang Sun，Haibin Luo，Changying Yu，Tao Sun etc，Molecular cloning，expression，purification，and mass spectrometric characterization of 3C-like protease ofSARS coronavirus Protein Expression and Purification，Vol32,302-308)。
2.SARS冠状病毒3CL蛋白酶的体外活性测定
将荧光底物与反应缓冲液(20mM Sodium Phosphate，pH7.5，100mM Nacl)混合，25℃下平衡30分钟，再加入SARS冠状病毒3CL蛋白酶，利用荧光分光光度计以340nm波长的光激发，检测490nm发射波长下的荧光值变化，完成对SARS冠状病毒3CL蛋白酶的体外活性测定。
附图说明
图1是FRET基本原理示意图。
图2A是3CL蛋白酶的荧光底物质谱分析图。
图2B是3CL蛋白酶的荧光底物反相HPLC分析图。
图3是EDANS和Dabeyl的荧光光谱图。
图4是SARS冠状病毒3CL蛋白酶活性测定原理。
图5是荧光底物420nm-600nm荧光发射光谱。
图6A是荧光底物490nm波长下的荧光强度-反应时间作图。
图6B是被切割的底物浓度-反应时间作图。
图7是3CL蛋白酶切割荧光底物的反应初速度。
图8A是荧光底物(不加入3CL蛋白酶)420nm-600nm的荧光发射光谱。
图8B是荧光底物(不加入3CL蛋白酶)490nm波长下的荧光强度-反应时间作图。
图9是3CL蛋白酶(不加入荧光底物)420nm-600nm的荧光发射光谱。
图10是双倒数作图法(Lineweaver-Burk double-reciprocal plot)。
图11是荧光底物(加入待筛选的化合物)490nm波长下的荧光强度-反应时间作图。
图12是筛选结果图。
具体实施方式
1、SARS冠状病毒3CL蛋白酶的体外活性测定；
1)SARS冠状病毒3CL蛋白酶荧光底物的合成；
2)荧光底物和3CL蛋白酶的准备
荧光底物母液的制备：将棕红色粉末状荧光底物溶解于10％二甲基亚砜dimethylsulfoxide，DMSO)溶液至终浓度100μM，-20□保存。
3CL蛋白酶浓度测定：通过U-2010紫外分光光度计(HITACHI公司)测定蛋白浓度，100μl(1∶10)体系，10μl待测3CL蛋白酶加入90μl缓冲液(20mM Sodium PhosphatepH7.5，100mM Nacl)，用该缓冲液作空白对照，测定280nm的吸光值，蛋白浓度计算公式如下：
C：待测蛋白浓度(g/L) A：280nm吸光值(unity)
Mag：稀释倍数 M：待测蛋白分子量(Da)
ε：待测蛋白的摩尔消光系数(L/Mol/cm) L：比色杯内径(cm)
3CL蛋白酶分子量：35833.153 Da 3CL蛋白酶摩尔消光系数：34390 L/Mol/cm
3)3CL蛋白酶体外活性的测定
反应条件：3CL蛋白酶浓度：1μM(0.36mg/ml)
荧光底物浓度：10μM
温度：25℃
反应缓冲液：20mM Sodium Phosphate，pH7.5
100mM Nacl
实验仪器：F-2500荧光分光光度计(HITACHI公司)：激发光波长340nm，发射光光谱
420nm-600nm，狭缝宽度10nm
荧光石英比色杯(HITACHI公司)：内径(path length)1cm
SDC-6数控超级低温恒温槽(上海新芝生物技术研究所)
总反应体系：1000μl
取100μl荧光底物母液(100μM)与比色杯中的反应缓冲液(20mM Sodium Phosphate，pH7.5，100mM Nacl)混合至终浓度10μM，25℃平衡30分钟，再加入一定体积的3CL蛋白酶母液至终浓度1μM，以340nm波长的光激发，记录420nm-600nm波长范围的发射光谱，总反应时间4小时，每10分钟检测一次。如图4所示，随着反应时间的延长，490nm波长下的荧光强度显著增强。
将490nm波长下的荧光强度对应反应时间作图，并扣除反应时间为0时的本底荧光值，如图5A所示。将纵坐标荧光强度转换为被切割的底物浓度(产物浓度)，对应反应时间作图(图5B)，符合标准的酶促反应动力学，反应初期，产物形成速度恒定，符合一级反应(afirst-order reaction)动力学，随着反应的进行，产物形成速度逐渐下降，到反应末期，产物形成速度趋近于0，符合零级反应(a zero-order reaction)动力学。
由于反应初期(2％-10％的荧光底物被3CL蛋白酶切割)产物形成的速度恒定，符合一级反应(a first-order reaction)动力学，所以可将反应初期被切割的底物浓度对应反应时间作图，其线性回归的斜率就是3CL蛋白酶切割该荧光底物的反应初速度(initialvelocity，V0)，如图6所示，该酶促反应的初速度为0.028μM/min。
对照实验：总反应体系1000μl，温度为25℃，取100μl荧光底物母液(100μM)与比色杯中的反应缓冲液混合，终浓度为10μM，不加入3CL蛋白酶，以340nm波长的光激发，记录420nm-600nm波长范围的发射光谱，总反应时间3小时，前1小时每10分钟检测一次，后2小时每20分钟检测一次，如图7A所示。再将490nm波长下的荧光强度对应反应时间作图，并扣除反应缓冲液的本底荧光值，如图7B所示，随着时间的延长，490nm波长下的荧光强度几乎没有变化，说明荧光底物本身淬灭效率很高，检测的荧光背景很低，且在反应缓冲液中十分稳定。
对照实验：总反应体系1000μl，温度为25℃，取一定体积的3CL蛋白酶母液与比色杯中的反应缓冲液混合至终浓度1μM，不加入荧光底物，以340nm波长的光激发，检测420nm-600nm波长范围的发射光谱，如图8所示，3CL蛋白酶本身在该波长范围荧光背景很低，对测活反应几乎没有影响。
4)动力学常数KM，kcat以及kcat/KM的测定
双倒数作图法(Lineweaver-Burk double-reciprocal plot)：
固定3CL蛋白酶的浓度(1μM)，温度为25℃，改变荧光底物的浓度，测定不同底物浓度下3CL蛋白酶切割底物的反应初速度，以反应初速度的倒数对应底物浓度的倒数作图，通过线性回归求得斜率和纵截距，就能测定米氏常数KM和转换数kcat，(图9)，具体数值见表1。
| 动力学常数 | |
| 米氏常数KM最大反应速度Vmax转换数kcatkcat/KM | 404.34±8.67μM1.082±0.14μM/min1.082±0.14min-144.59±5.77Mol-1s-1 |
表1：3CL蛋白酶促反应的动力学常数
2、SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂的筛选
将SARS冠状病毒3CL蛋白酶与待筛选的小分子化合物孵育，再加入荧光底物，利用荧光分光光度计以340nm波长的光激发，检测490nm发射波长下的荧光值变化，测定加入小分子化合物后3CL蛋白酶的活性，与不加入化合物的3CL蛋白酶进行活性比较，完成对SARS冠状病毒抑制剂的体外筛选。
1)待筛选抑制剂的制备
待筛选的小分子化合物：DC060037，DC060117，DCO060185均为本实验室通过计算机药物辅助设计，在原有化合物结构基础上改造所得。
小分子化合物母液的制备：将粉末状小分子化合物溶解于100％二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)溶液至终浓度10mM，4℃保存。
2)抑制剂体外筛选
反应条件：3CL蛋白酶浓度：1μM
荧光底物浓度：10μM
小分子化合物浓度：10μM(DMSO终浓度0.1％)
温度：25℃
反应缓冲液：20mM Sodium Phosphate，pH7.5
100mM Nacl
总反应体系：1000μl
取100μl荧光底物母液(100μM)与比色杯中的反应缓冲液混合至终浓度10μM，25℃平衡30分钟。
取10-50μl的3CL蛋白酶母液和待筛选的小分子化合物母液，25℃孵育30分钟，然后加入比色杯中，使3CL蛋白酶终浓度为1μM，小分子化合物终浓度为10μM(DMSO终浓度0.1％)。
通过F-2500荧光分光光度计以340nm波长的光激发，记录420nm-600nm波长范围的发射光谱，总反应时间2小时，每10分钟检测一次，测定3CL蛋白酶的活性。
对照实验：不加小分子化合物，加入相应体积的100％DMSO溶液，终浓度为0.1％，其它反应条件同上，测定3CL蛋白酶的活性。
筛选结果：将490nm波长下的荧光强度对应反应时间作图，并扣除反应时间为0时的本底荧光值，如图10所示，不同的小分子化合物对SARS冠状病毒3CL蛋白酶的活性具有不同程度的抑制作用。
将不加入小分子化合物所测得的3CL蛋白酶的活性设为100％，则加入小分子化合物后的3CL蛋白酶相对活性为：
如图11所示，0.1％DMSO对3CL蛋白酶的活性几乎没有影响，化合物DC060117对3CL蛋白酶没有明显的抑制作用，DC060037表现出一定的抑制作用，DC060185则表现出较好的抑制作用。抑制作用强的化合物可通过浓度梯度进一步测定其IC50值，并检验其在细胞或动物水平上的药效，抑制活性不强的则可通过计算机辅助设计进行结构修饰提高其活性，进行进一步的高通量大规模筛选。
上述抑制剂筛选结果证明，利用本发明提供的荧光底物所建立的SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂分子筛选模型是有效和可靠的，为抗SARS新药的发现提供了一个很好的筛选平台。
本发明的有益效果是：
(1)利用本发明，首次人工合成了SARS冠状病毒3CL蛋白酶的荧光底物。
(2)使用本发明提供的荧光底物，利用荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance EnergyTransfer，FRET)检测490nm波长处荧光强度的变化，测定SARS冠状病毒3CL蛋白酶的体外活性，是一种非常灵敏和有效的方法。
(3)利用本发明可实现SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂的高通量筛选，为抗SARS药物的结构修饰和先导化合物的发现提供实验基础。
本发明可用于SARS冠状病毒3CL蛋白酶体外活性的测定以及抑制剂的高通量筛选：
1)由于不同种类3CL蛋白酶的底物识别位点具有高度保守性，因此本发明不仅可应用于SARS冠状病毒3CL蛋白酶体外活性的测定，还可用于3CL蛋白酶家族其它成员(如TGEV和HCoV 229E 3CL蛋白酶等)的体外活性测定。
2)本发明不仅可应用于SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂的高通量筛选，还可用于3CL蛋白酶家族其它成员(如TGEV和HCoV 229E 3CL蛋白酶等)抑制剂的高通量筛选。
Claims (6)
1、一种对SARS冠状病毒3CL蛋白酶进行体外活性测定或抑制剂筛选方法，体外活性测定步骤如下：
a.合成SARS冠状病毒3CL蛋白酶的荧光底物；
b.将SARS冠状病毒3CL蛋白酶与荧光底物孵育，用340nm波长光激发，检测490nm
发射波长下的荧光值变化，荧光值强弱代表体外活性强弱。
2、根据权利要求1所述的SARS冠状病毒3CL蛋白酶进行体外活性测定方法，其特征在于合成SARS冠状病毒3CL蛋白酶的荧光底物十二肽、氨基酸序列如下：Val-Asn-Ser-Thr-Leu-Gln↓-Ser-Gly-Leu-Arg-Lys-Met
利用荧光共振能量转移，在两端的缬氨酸(Val)和赖氨酸(Lys)残基上分别连接荧光基团5’-(2’-氨乙基氨基萘)-1-磺酸(EDANS)和淬灭基团4’-(4’-二甲基氨基叠氮等)苯甲酸(Dabcyl)。
3、根据权利要求1所述的SARS冠状病毒3CL蛋白酶进行体外活性测定方法，其特征在于将荧光底物与反应缓冲液(20mM Sodium Phosphate，pH7.5，100mM Nacl)混合至终浓度10μM，25℃下平衡30分钟，再加入SARS冠状病毒3CL蛋白酶，终浓度为1μM。
4、根据权利要求1所述的SARS冠状病毒3CL蛋白酶进行体外活性测定或抑制剂筛选方法，其特征在于SARS冠状病毒3CL蛋白酶抑制剂筛选步骤如下：
a.将SARS冠状病毒3CL蛋白酶与待筛选的小分子化合物孵育；
b加入合成的荧光底物，用340nm波长光激发，检测490nm波长下的荧光值变化；
c.测定加入小分子化合物后3CL蛋白酶的活性。
5、根据权利要求4所述抑制剂筛选方法，其特征在于将SARS冠状病毒3CL蛋白酶与待筛选小分子化合物在25℃下孵育30分钟。
6、根据权利要求4所述抑制剂筛选方法，其特征在于将荧光底物与孵育后的SARS冠状病毒3CL蛋白酶和待筛选小分子化合物溶液混合，利用荧光分光光度计以340nm波长光激发，检测490nm发射波长下荧光值变化，测定出加入小分子化合物后3CL蛋白酶的活性，再与不加入化合物的3CL蛋白酶进行活性比较，计算小分子化合物对3CL蛋白酶活性的抑制率，进行抑制剂筛选。
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