CN114163502A - 用于3cl蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导aiee荧光探针、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针，所述荧光探针化学结构式为：
其中，n＝2、3、4、5、6；X1，X2均为氨基酸；将三苯胺AIE分子标记到多肽链上制备成探针，多肽链增加了AIE分子的水溶性和细胞渗透性，本探针分子可被细胞内表达的3CL蛋白酶特异性识别切割，AIE荧光基团掉落后在锌离子的诱导作用下和蛋白共同产生聚集发光增强现象，实现对3CL蛋白酶的荧光定量标记，检测3CL蛋白酶的表达及进行其对应的抑制剂筛选。
Description
技术领域
本发明涉及荧光成像领域，具体涉及一种用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针、检测、筛选方法及其应用。
背景技术
荧光成像技术已成为一种快速、简便、功能强大的生物分析物可视化和跟踪工具，具有高灵敏度、低成本和快速响应等优点。但传统的有机荧光团具有光致漂白和信噪比不高、聚集诱导淬灭(ACQ)等缺点。唐本忠院士在2001年首次提出聚集诱导发光(Aggregation-Induced Emission)的概念。在AIE过程中，AIE荧光分子经过聚集后发光增强从而克服了传统荧光材料的聚集诱导淬灭的缺点。但有机AIE分子由于其水溶性有限，进入细胞膜的过程受到限制。在AIE分子上修饰多肽链可大大提高其水溶性及细胞膜通透性，通过溶于水的多肽链及细胞胞吞的作用，将AIE分子带入细胞内进而发挥其作用。
目前为人所知的人群中传播的冠状病毒有七种。大部分冠状病毒后续的复制、分装依赖3CL蛋白酶水解后形成功能蛋白，通过抑制其催化功能可有效抑制病毒前体蛋白的切割，从而有效阻断病毒复制，并且人体中不存在功能相似的蛋白酶，3CL蛋白酶底物结合位点高度保守且具有相似的催化机制，因此， 3CL蛋白酶是冠状病毒引起的相关传染性疾病最具潜力的治疗靶点之一。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针、制备方法及其应用，将三苯胺AIE分子标记到多肽链上制备成探针，多肽链增加了AIE分子的水溶性和细胞渗透性，本探针分子可被细胞内表达的3CL蛋白酶特异性识别切割，AIE荧光基团掉落后在锌离子的诱导作用下和蛋白共同产生聚集发光增强现象，实现对3CL蛋白酶的荧光定量标记，检测3CL蛋白酶的表达及进行其对应的抑制剂筛选。
本发明的用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针，其特征在于：所述荧光探针化学结构式为：
进一步，所述X1为亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸中的一种；
进一步，所述X2为丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸中的一种。
本发明还公开一种用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE 荧光探针的制备方法，将三苯胺AIE分子标记到多肽链上制备成用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针；
进一步，包括以下步骤：
Fmoc保护的单体用碱性溶剂去除氨基的保护基团，然后通过活化剂活化下一个氨基酸的羧基，活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键；按上述反应反复循环直到合成完成，之后将多肽从树脂上洗脱下来，采用脱保护剂洗脱掉碳端氨基酸的保护基团，连接AIE分子。
本发明还公开一种AIEE荧光探针的3CL蛋白酶检测方法，包括以下步骤：将优化浓度后的3CL蛋白酶溶液与探针溶液孵育，并加入Zn2+溶液，然后采用 350nm波长光激发，得到400nm到600nm之间的发射光谱。
本发明还公开一种AIEE荧光探针的3CL蛋白酶抑制剂筛选方法，包括以下步骤：
a.将优化浓度后的3CL蛋白酶溶液与探针溶液孵育，并加入Zn2+溶液，用 350nm波长光激发，得到400nm到600nm之间的发射光谱并计算出该荧光发射光谱的积分面积，即为不加抑制剂时的荧光光谱积分面积；
b.将优化浓度后的3CL蛋白酶溶液先与抑制剂于反应缓冲液中预孵育，然后加入优化浓度的探针溶液和Zn2+溶液，用350nm波长光激发，得到400nm到600nm 之间的荧光发射光谱，计算出该荧光发射光谱的积分面积，即为加抑制剂后的荧光光谱积分面积；
c.将步骤b中不同浓度的抑制剂溶液直接与探针溶液和Zn2+溶液孵育，用 350nm波长光激发，得到400nm到600nm之间的荧光发射光谱，计算出该荧光发射光谱的积分面积，即为背景荧光光谱积分面积；
d.将步骤a、b、c中的光谱积分面积代入以下公式：
抑制率＝(不加抑制剂时的光谱积分面积-加抑制剂后的光谱积分面积)/(不加抑制剂时的光谱积分面积-背景光谱积分面积)*100％，计算得到抑制剂对3CL 蛋白酶的抑制率，从而进行筛选和IC50值的确定。
本发明的用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针的应用，将用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针应用于细胞荧光成像。
本发明的有益效果是：本发明公开的一种用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针、制备方法及其应用，将三苯胺AIE分子标记到多肽链上制备成探针，多肽链增加了AIE分子的水溶性和细胞渗透性，本探针分子可被细胞内表达的3CL蛋白酶特异性识别切割，AIE荧光基团掉落后在锌离子的诱导作用下和蛋白共同产生聚集发光增强现象，实现对3CL蛋白酶的荧光定量标记，检测3CL蛋白酶的表达及进行其对应的抑制剂筛选。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：
图1为探针浓度梯度实验的发射光谱图；
图2为酶浓度梯度实验的发射光谱图；
图3为Zn2+浓度梯度实验的发射光谱图；
图4为pH依赖实验的发射光谱图；
图5为温度依赖实验的发射光谱图；
图6、7、8为抑制剂对3CL蛋白酶的抑制率；
图9为SDS-PAGE检测3CL蛋白酶的表达；
图10为Western-blot检测3CL蛋白酶的表达；
图11为探针体系对细胞内3CL蛋白酶表达的鉴定结果。
具体实施方式
1.荧光探针的合成
1)AIE材料的合成：
将苯甲醛1.06g溶于24ml丙酮和6ml水中，然后加高锰酸钾2.6g(分三次)，加入后混合物颜色变为棕褐色，混合物加热4小时；将反应混合物冷却至室温；用旋转蒸发器除去丙酮，然后在混合物中加入20ml水，过滤粗固体，去除棕色沉淀物(MnO2)，向滤液中添加1MHCl(20mL)，通过过滤收集固体。将固体在真空烘箱(90℃，10小时)中干燥混合物，得到4-二苯氨基苯甲酸。采用MS质谱确定材料分子量。
2)多肽-材料荧光探针的合成：
Fmoc保护的单体用吡啶(碱性溶剂)去除氨基的保护基团，然后用一种活化剂活化下一个氨基酸的羧基，活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。将前两步反应反复循环直到合成完成，之后将多肽从树脂上洗脱下来，用脱保护剂TFA洗脱掉碳端氨基酸的保护基团，连接AIE分子，HPLC和MS质谱确定产物。所采用的活化剂为现有荧光探针合成用的常规活化剂。
2.荧光探针的体外性能验证：
①Reaction Buffer配制：20mM HEPES，pH7.0
②酶液配制：50nM 3CL蛋白酶溶液：2ul 3CL(30uM)和2ul DTT(1M)T溶液混匀后冰上放置3分钟，然后加入1.2ml Reaction Buffer以及2ul的DTT 溶液。
③探针溶液配制：320uM:1mg探针溶于2.02ml灭菌双蒸水溶液中，对倍稀释至160uM,80uM,40uM,20uM,10uM,5uM,2.5uM。
④固定酶液浓度，探针浓度梯度实验：
将3CL蛋白酶溶液与浓度分别为160uM,80uM,40uM,20uM,10uM,5uM,2.5uM的探针溶液孵育，并加入Zn2+溶液，用350nm波长光激发，得到400nm到600nm之间的发射光谱(图1)。
⑤固定探针浓度，酶浓度梯度实验：
将探针溶液与浓度分别为100nM,50nM,25nM,5nM,2.5nM的蛋白溶液孵育，并加入Zn2+溶液，用350nm波长光激发，得到400nm到600nm之间的发射光谱(图2)。
⑥固定探针浓度和酶浓度，Zn2+浓度梯度实验：
将优化浓度的探针溶液和蛋白酶溶液孵育后，加入浓度分别为 1M,100mM,10mM,1mM,100uM,10uM,1uM,100nM,10nM,1nM的Zn2+溶液，用350nm 波长光激发，得到400nm到600nm之间的发射光谱(图3)。
⑦根据优化的浓度，pH依赖实验：
配制pH为2～13的反应缓冲液，用350nm波长光激发，得到400nm到600nm之间的发射光谱，进行pH筛选(图4)。
⑧根据优化的浓度和pH，温度依赖实验：
先将蛋白酶在温度分别为0℃，25℃，37℃的条件下孵育30分钟，然后根据优化的浓度和pH，步骤同上，用350nm波长光激发，得到400nm到600nm之间的发射光谱(图5)。
⑨根据优化的浓度、pH和温度，进行抑制剂筛选：
a.将优化浓度后的3CL蛋白酶溶液与探针溶液孵育，并加入Zn2+溶液，用350nm 波长光激发，得到400nm到600nm之间的发射光谱。算出该发射光谱的积分面积，即为不加抑制剂时的光谱积分面积。
b.将优化浓度后的3CL蛋白酶溶液先与抑制剂于反应缓冲液中预孵育20分钟，然后加入优化浓度的探针溶液和Zn2+溶液，用350nm波长光激发，得到400nm 到600nm之间的发射光谱。算出该发射光谱的积分面积，即为加抑制剂后的光谱积分面积。
c.将步骤b中不同浓度的抑制剂溶液直接与探针溶液和Zn2+溶液孵育，用 350nm波长光激发，得到400nm到600nm之间的发射光谱。算出该发射光谱的积分面积，即为背景光谱积分面积。
d.将前三步算出的荧光积分面积代入以下公式：
抑制率＝(不加抑制剂时的光谱积分面积-加抑制剂后的光谱积分面积)/(不加抑制剂时的光谱积分面积-背景光谱积分面积)*100％
计算得到抑制剂对3CL蛋白酶的抑制率，从而进行筛选和IC50值的确定。(图 6，图7，图8)
3.探针体系对细胞内3CL蛋白酶表达的鉴定
1)293T细胞培养：
将细胞在含5％CO2，37℃的潮湿环境中培养。293T细胞在补充了5％胎牛血清，GlutaMAX和青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中生长。
2)3CL质粒转染：
使用未加血清和双抗的DMEM稀释Lipo3000试剂，以及用P3000试剂制备预混液，然后将两者混合孵育后加入培养皿内，2～4天后分析转染后的细胞。
3)SDS-PAGE检测3CL蛋白酶的表达(图9)
4)Western-blot检测3CL蛋白酶的表达(图10)
5)探针体系对细胞内3CL蛋白酶表达的鉴定
将探针溶于完全培养基内，孵育细胞，然后在荧光显微镜下观察细胞。未转染3CL质粒的细胞设置为对照组。(图11)
蛋白酶的细胞内抑制剂筛选：
293T细胞铺板后24小时进行3CL质粒转染，转染20小时后添加抑制剂， 48小时候探针体系孵育细胞，荧光显微镜下观察。(图11)
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针，其特征在于：所述荧光探针化学结构式为：
2.根据权利要求1所述的用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针，其特征在于：所述X1为亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸中的一种。
3.根据权利要求1所述的用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针，其特征在于：所述X2为丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸中的一种。
4.根据权利要求1所述的用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针的制备方法，其特征在于：将三苯胺AIE分子标记到多肽链上制备成用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针。
5.根据权利要求4所述的用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
Fmoc保护的单体用碱性溶剂去除氨基的保护基团，然后通过活化剂活化下一个氨基酸的羧基，活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键；按上述反应反复循环直到合成完成，之后将多肽从树脂上洗脱下来，采用脱保护剂洗脱掉碳端氨基酸的保护基团，连接AIE分子。
6.根据权利要求1所述的AIEE荧光探针的3CL蛋白酶检测方法，其特征在于：包括以下步骤：将优化浓度后的3CL蛋白酶溶液与探针溶液孵育，并加入Zn2+溶液，然后采用350nm波长光激发，得到400nm到600nm之间的发射光谱。
7.根据权利要求1所述的AIEE荧光探针的3CL蛋白酶抑制剂筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.将优化浓度后的3CL蛋白酶溶液与探针溶液孵育，并加入Zn2+溶液，用350nm波长光激发，得到400nm到600nm之间的发射光谱并计算出该荧光发射光谱的积分面积，即为不加抑制剂时的荧光光谱积分面积；
b.将优化浓度后的3CL蛋白酶溶液先与抑制剂于反应缓冲液中预孵育，然后加入优化浓度的探针溶液和Zn2+溶液，用350nm波长光激发，得到400nm到600nm之间的荧光发射光谱，计算出该荧光发射光谱的积分面积，即为加抑制剂后的荧光光谱积分面积；
c.将步骤b中不同浓度的抑制剂溶液直接与探针溶液和Zn2+溶液孵育，用350nm波长光激发，得到400nm到600nm之间的荧光发射光谱，计算出该荧光发射光谱的积分面积，即为背景荧光光谱积分面积；
d.将步骤a、b、c中的光谱积分面积代入以下公式：
抑制率＝(不加抑制剂时的光谱积分面积-加抑制剂后的光谱积分面积)/(不加抑制剂时的光谱积分面积-背景光谱积分面积)*100％，计算得到抑制剂对3CL蛋白酶的抑制率，从而进行筛选和IC50值的确定。
8.根据权利要求1所述的用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针的应用，其特征在于：将用于3CL蛋白酶检测及抑制剂筛选的锌离子诱导AIEE荧光探针应用于细胞荧光成像。
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