CN115505030A - 用于tmprss2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针、制备方法及其应用 - Google Patents

用于tmprss2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针，所述荧光探针包含作为荧光信号基团的DQM‑COOH荧光团，所述荧光团DQM‑COOH的化学结构式为：
Figure DDA0003876578320000011
该荧光探针能够对TMPRSS2蛋白酶进行实时、快速、灵敏和特异的检测，亲水的多肽增加了荧光团的水溶性，能够实现TMPRSS2蛋白酶在亲水环境中对探针的识别剪切，从而对TMPRSS2蛋白酶定量检测和抑制剂筛选。

Description

用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针、制备方法 及其应用
技术领域
本发明涉及荧光成像领域，具体涉及一种用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针、制备方法及筛选检测方法。
背景技术
跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)，属于II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSPs)，具有胰蛋白酶样内肽酶活性，在其催化活性位点有一个亲核的丝氨酸残基。TMPRSS2主要表达于前列腺、小肠、肺等多种组织的上皮细胞中。很多研究表明，TMPRSS2是包括SARS-COV-2、SARS-COV、MERS、CoV229E、OC43、NL63和HKU1等已知的7种冠状病毒蛋白水解激活的重要宿主细胞因子，抑制TMPRSS2可减少病毒对小鼠模型的感染。因此，抑制TMPRSS2蛋白酶活性的药物应该能够抑制SARS-CoV家族(包括突变的SARS-CoV-2)冠状病毒进入人细胞的感染。
因此需要一种荧光探针，旨在对TMPRSS2蛋白酶进行实时、快速、灵敏和特异的检测，同时对有潜力的抑制剂进行初步筛选。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针、制备方法及其应用，能够对TMPRSS2蛋白酶进行实时、快速、灵敏和特异的检测，同时对有潜力的抑制剂进行初步筛选。
本发明的用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针，所述荧光探针包含作为荧光信号基团的DQM-COOH荧光团，所述荧光团DQM-COOH的化学结构式为：
Figure BDA0003876578300000021
本发明还公开一种用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针，所述荧光探针包含有多肽序列，所述多肽序列为X1-Arg-X2-nArg-X3-X4。
本发明还公开一种用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针，所述荧光探针由DQM-COOH荧光团与亲水的底物多肽偶联合成，所述荧光探针的化学结构式为：
Figure BDA0003876578300000022
其中n＝1、2、3、4，X1、X2为氨基酸，X3、X4为无或者是为氨基酸；
进一步，所述X1、X2为丙氨酸、谷酰氨、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸、苏氨酸中的一种，所述X3、X4为脯氨酸、谷酰氨、赖氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸中的一种；
进一步，所述DQM-COOH荧光团的合成路线为：
Figure BDA0003876578300000023
进一步，所述QM-COOH荧光团的制备方法包括以下步骤：
将化合物1和4-甲酰苯甲酸溶解在无水乙腈和哌啶中，在惰性气体保护下于85℃-90℃搅拌反应10-14h，冷却至室温并将粗产物纯化制得橙色DQM-COOH荧光团。
本发明的用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
S1.将目的肽的第一个氨基酸C端通过共价键与高分子树脂连接，再脱去该氨基酸N端保护基团作为为合成起点，和过量的已活化的第二个氨基酸进行反应，接长肽链，重复操作，达到理想的合成肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，分离纯化，获得目标多肽；
S2.将目标多肽和荧光团DQM按照同样的操作用酰胺键连接。
本发明的利用荧光探针检测TMPRSS2的方法，包括以下步骤：
将荧光探针和TMPRSS2蛋白酶在缓冲液中孵育一定时间，然后采用380nm的波长激发，得到400-700nm的波长范围内的发射波长。
本发明的利用荧光探针筛选抑制剂的方法，包括以下步骤：
在缓冲液中加入TMPRSS2蛋白酶与待筛选的抑制剂分子并在室温下孵育，然后加入荧光探针充分混匀后继续孵育，并用荧光分析仪380nm的波长激发，得到400-700nm的波长范围内的发射光谱，然后对荧光发射光谱的面积积分，计算抑制剂对TMPRSS2蛋白酶活性的抑制率，完成荧光探针体外抑制剂筛选。
本发明的有益效果是：本发明公开的用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针、制备方法及其应用，该荧光探针能够对TMPRSS2蛋白酶进行实时、快速、灵敏和特异的检测，亲水的多肽增加了荧光团的水溶性，能够实现TMPRSS2蛋白酶在亲水环境中对探针的识别剪切，从而对TMPRSS2蛋白酶定量检测和抑制剂筛选。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：
图1为荧光团DQM-COOH核磁共振氢谱图
图2为采用水/DMSO混合物评价了蒸馏水(DW)的体积分数(fw)对DQM-COOH荧光的影响
图3为反应最优缓冲液筛选的荧光发射图
图4为反应最优缓冲液pH筛选的荧光发射图
图5为反应最优探针浓度筛选的荧光发射图
图6为反应最优蛋白酶浓度筛选的荧光发射图
图7为反应蛋白酶和多肽-荧光探针动力学荧光发射图
图8为反应最优温度筛选的荧光发射图
图9为特异性筛选的荧光发射图
图10为抑制剂筛选结果
图11为探针对细胞内TMPRSS2蛋白酶表达的验证图。
具体实施方式
荧光团DQM-COOH的合成：依次将化合物1(1g 4.25mmol)和4-甲酰苯甲酸(690mg4.6mmol)加入反应瓶中，在氩气保护下加入乙腈30ml和哌啶1ml室温下溶解，转至85℃-90℃度油浴反应12h。反应结束，冷却至室温，粗产物柱层析(二氯甲烷：甲醇＝10:1)得到橙色化合物2，产率33％。
制备产物的核磁共振波谱如下：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.92(d,J＝8.4Hz,1H),8.09(d,J＝8.9Hz,1H),7.99(d,J＝8.2Hz,2H),7.95–7.91(m,3H),7.67(d,J＝15.8Hz,1H),7.64–7.60(m,1H),7.49(d,J＝15.8Hz,1H),7.01(s,1H),4.57(q,J＝7.1Hz,2H),4.10(s,1H),1.39(t,J＝7.1Hz,3H).(图1)
多肽-荧光探针(P-DQM)的合成：Fmoc固相合成法——将目的肽的第一个氨基酸C端通过共价键与高分子树脂连接，再脱去该氨基酸N端保护基团作为为合成起点，和过量的已活化的第二个氨基酸进行反应，接长肽链，重复操作，达到理想的合成肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，分离纯化，获得目标多肽。目标多肽和荧光团DQM按照同样的操作用酰胺键连接。所制得的荧光探针具体结构式为
Figure BDA0003876578300000051
荧光探针的体外性能验证：
(1)荧光性能验证：采用水/DMSO混合物评价了蒸馏水(DW)的体积分数(fw)对DQM-COOH荧光的影响(图2)。
(2)缓冲液筛选：选择了PBS(10mM)、PBST(10mM 0.2％Tween20)、HEPES(20mM)、HEPES(20mM 80mM KCI)、Tris-HCl(50mM,150mM NaCl)、Tris-HCl(50mM,150mM NaCl 0.2％Tween20)等6种缓冲液，pH7.2-7.4,加入TMPRSS2和P-DQM在缓冲液中反应后，用380nm波长光激发，得到400nm到700nm之间的发射光谱(图3)。
(3)缓冲液pH筛选：从上述筛选出的HEPES缓冲液调节pH为3-11，然后在不同pH的缓冲体系下加入探针P-DQM和TMPRSS2蛋白酶。用380nm波长光激发，得到400nm到700nm之间的发射光谱(图4)。
(4)固定酶量，探究合适探针浓度：将TMPRSS2蛋白酶溶液100nM与浓度分别30uM,60uM,90uM,120uM,150uM,200uM的探针溶液孵育，用380nm波长光激发，得到400nm到700nm之间的发射光谱(图5)。
(5)固定探针浓度，探究合适酶量：将探针溶液P-DQM(120uM)与浓度分别为200nM，100nM，80nM，60nM，40nM，20nM，0nM的蛋白溶液在HEPES孵育，用380nm波长光激发，得到400nm到700nm之间的发射光谱。(图6)
(6)动力学测定程序：在反应缓冲液HEPES中加入P-DQM(120uM)和TMPRSS2蛋白酶(100nM)，在室温混合后加入比色皿，在荧光分析仪器上进行120min的动力学测试。Ex＝380nm，Em＝550nm，动力学间隔为1s(图7)。
(7)反应温度的探究：在反应缓冲液HEPES中加入P-DQM(120uM)和TMPRSS2蛋白酶(100nM)，在4℃，25℃，37℃，40℃，45℃下孵育60分钟后，加入比色皿，在荧光分析仪器上进行荧光测试。用380nm波长光激发，得到400nm到700nm之间的发射光谱(图8)。
(8)特异性的测定程序：在反应缓冲液HEPES中加入P-DQM(120uM)和其他蛋白、离子、葡萄糖等，在37℃下孵育80分钟，加入比色皿，在荧光分析仪器上进行荧光测试。用380nm波长光激发，得到400nm到700nm之间的发射光谱。其他蛋白酶或者其他物质分别为：ALP、BSA、D+葡萄糖、L-谷氨酰胺、Mg2+、Fe3+(图9)。
(9)抑制剂筛选：按照以下步骤进行抑制剂筛选：在缓冲液中加入TMPRSS2蛋白酶与待筛选的抑制剂分子在室温下孵育30分钟，再加入上述荧光探针充分混匀后继续孵育60分钟，然后在荧光分析仪上采用380nm的波长激发，得到400nm到700nm的波长范围内的发射光谱，然后对不同组的荧光发射光谱计算积分面积，计算抑制剂对TMPRSS2蛋白酶活性的抑制率，完成荧光探针体外抑制剂筛选(图10)。
(10)细胞培养：将细胞在含5％CO2，37℃的潮湿环境中培养。Vero E6细胞在补充了10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中生长。
(11)TMPRSS2过表达：培养的Vero E6细胞在密度为60％～70％时进行转染，用培养基稀释Lipofectamine 3000试剂，再用P3000试剂制备DNA预混液。两种试剂混合孵育15分钟后直接加入培养基中。
(12)TMPRSS2蛋白酶活性验证：不同浓度探针和对照探针P’-DQM溶解在培养基中，然后孵育细胞，在荧光显微镜下观察(图11)。
本实施例中，当n＝为2、3、4时，以及X1、X2，X3、X4为其他氨基酸时，或者X3、X4为无时，以及X1、X2与X3、X4的氨基酸种类不同时，所制得的荧光探针性能差异性不大，均能实现本发明的目的。
上述实施例中，可采用荧光团DQM-COOH与现有技术中的一般多肽合成荧光探针，或者采用现有技术中荧光团与本发明的多肽合成用于荧光探针，索合成的荧光探针均能用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针包含作为荧光信号基团的DQM-COOH荧光团，所述荧光团DQM-COOH的化学结构式为：
Figure FDA0003876578290000011
2.一种用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针包含有多肽序列，所述多肽序列为X1-Arg-X2-nArg-X3-X4。
3.一种用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针由DQM-COOH荧光团与亲水的底物多肽偶联合成，所述荧光探针的化学结构式为：
Figure FDA0003876578290000012
其中n＝1、2、3、4，X1、X2为氨基酸，X3、X4为无或者是为氨基酸。
4.根据权利要求3所述的用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针，其特征在于：所述X1、X2为丙氨酸、谷酰氨、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸、苏氨酸中的一种，所述X3、X4为脯氨酸、谷酰氨、赖氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸中的一种。
5.根据权利要求1所述的用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针，其特征在于：所述DQM-COOH荧光团的合成路线为：
Figure FDA0003876578290000021
6.根据权利要求5所述的用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针，其特征在于：所述QM-COOH荧光团的制备方法包括以下步骤：
将化合物1和4-甲酰苯甲酸溶解在无水乙腈和哌啶中，在惰性气体保护下于85℃-90℃搅拌反应10-14h，冷却至室温并将粗产物纯化制得橙色DQM-COOH荧光团。
7.根据权利要求1所述的用于TMPRSS2蛋白酶检测和抑制剂筛选的荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.将目的肽的第一个氨基酸C端通过共价键与高分子树脂连接，再脱去该氨基酸N端保护基团作为为合成起点，和过量的已活化的第二个氨基酸进行反应，接长肽链，重复操作，达到理想的合成肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，分离纯化，获得目标多肽；
S2.将目标多肽和荧光团DQM按照同样的操作用酰胺键连接。
8.一种利用权利要求1所述的荧光探针检测TMPRSS2的方法，其特征在于：包括以下步骤：
将荧光探针和TMPRSS2蛋白酶在缓冲液中孵育一定时间，然后采用380nm的波长激发，得到400-700nm的波长范围内的发射波长。
9.一种利用权利要求1所述的荧光探针筛选抑制剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：
在缓冲液中加入TMPRSS2蛋白酶与待筛选的抑制剂分子并在室温下孵育，然后加入荧光探针充分混匀后继续孵育，并用荧光分析仪380nm的波长激发，得到400-700nm的波长范围内的发射光谱，然后对荧光发射光谱的面积积分，计算抑制剂对TMPRSS2蛋白酶活性的抑制率，完成荧光探针体外抑制剂筛选。
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