JPH03172196A - 蛍光発生基質およびそれを用いたタンパク質分解酵素の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） び測定法に関する。さらに詳しくは、タンパク質分解酵
素活性の検出および測定のための蛍光発生（ｆ　Ｉｕｏ
ｒｏｇｅｎ　ｉｃ）アッセイ法、およびそれに用いる蛍
光発生基質に関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）レト
ロウィルスは、動物やヒトに種々の疾患を引き起こす一
本鎖ＲＮＡ含有ウィルスの１科を構成している［バイス
（Ｒ．Ｗｅｉｓｓ）ら、ＲＮＡチューマー・パイラスイ
ズ（ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）（コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コー
ルドスプリングハーバー、ＮＹ，＋９８５）］。これら
ウィルス群はＤＮＡ媒体を介して増殖し、ＤＮＡ媒体は
ウィルスにコードされた逆転写酵素により合成される。

他のクラスの陽鎖（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄ）
ＲＮＡウィルスと同様、レトロウィルスのタンパク質し
、最初は大きなポリタンパク質前駆体として合成され、
これが後に翻訳後開裂によりプロセシングされる。レト
ロウィルスの内部構造タンパク質、複製酵素およびエン
ベロープ糖タンパク質は、それぞれｇａｇ遺伝子、ｐｏ
ｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子によりコードされている。

該ウィルスの多ンストロン性メッセンジャーＲＮＡ（Ｉ
ＩＩＲＮＡ）が翻訳されると、２つの前駆体ポリタンパ
ク質、すなわち構造カブシドタンパク質を含むＰｒｇａ
ｇ、および構造タンパク質と複製酵素の両方を含む読み
抜けタンパク質であるＰｒｇａｇ−ｐｏｌが合成される
。ｅｎｖ遺伝子産物は、別にスプライスされたｍＲＮＡ
転写物から前駆体ポリタンパク質として翻訳される。レ
トロウィルスはまた、小さな１０〜１２キロダルトン（
ｋｄ）のプロテアーゼをもコードしている。このプロテ
アーゼは、ニワトリレトロウィルスの場合にＰｒｇａｇ
のＣ末端部として合成される他は、一般にＰｒ　ｇａｇ
−ｐｏｌ前駆体の一郎として発現される［オロツラン（
Ｓ．Ｏｒｏｓｚｌａｎ）＆コープランド（Ｔ　．　Ｃ　
ｏｐｅｌａｎｄ）、Ｃ　ｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ．　ｌ　ｌ　５、２２１（
１９８５）］。

レトロウィルスのプロテアーゼは、ＰｒｇａｇおよびＰ
　ｒ　，ｇａｇ　−　ｐｏｌ前駆体ポリタンパク質の両
方の特異的開裂部位でのプロセシングにあずかる。この
開裂は、ウィルス粒子の集合中、または集合後に起こる
と思われ、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）およびマウ
ス白血病ウィルスの場合には感染性ウィルス粒子の成熟
に必要であることが示されている［クローフオード（Ｓ
．Ｃｒａｗｒｏｒｄ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏ１．５３、８９
９（＋９８５）；カトー（　１　．　Ｋ　ａｔｏｈ）ら
、Ｖ　ｉｒｏｌｏｇｙ　Ｉ　４　５、２８４（１９８５
）；コール（Ｎ．Ｅ．Ｋｏｈ１）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、４６８４（１９
８８）］。従って、ＡＩＤＳに関しては、ＨｒＶプロテ
アーゼ活性を抑制することが抗ウィルス剤を設計する上
での重要な目標となってきており、タンパク質分解活性
を検出することもまた同時に薬物療法をモニターし疾患
を診断するのに重要である。

レトロウィルスのタンパク質分解活性を測定するために
種々の技術がすでに用いられており、たとえば、ウエス
タンプロット法によるｇａｇボリタンパク質およびその
開裂産物の分析［カトーら、Ｎａｔｕｒｅ，　３　２　
９、６５４（１９８７），シールマイヤ−（Ｓ　．　Ｓ
　ｅｅｌｍｅｉｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ，Ｓｃｉ．８５、６６１２（＋９８８）；ギアム（Ｃ
．Ｚ．Ｇｉａｍ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎ．２　６
　３、１４６１７（＋９８８）：シュナイダー（　Ｊ　
．　Ｓ　ｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、Ｃｅｌｌ、５４、３　
６　３（＋　９　８　８）．ハンセン（　Ｊ　，　Ｈ　
ａｎｓｅｎ）ら、ＥＭＢＯ・Ｊ．７、１７８５（＋９８
８）；グレープズ（Ｍ　．　Ｃ　．　Ｇ　ｒａｖｅｓ）
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５、２
４４９（１９８Ｂ）］、高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）法［ビリッヒ（Ｓ．Ｂｉｌｌｉｃｈ）ら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．ＣｈｅＩｌ１．２　６　３、１　７　９　
０　５（１９　８　８）；ダーク（Ｐ　．　Ｌ　．　Ｄ
　ａｒｋｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｉ．　２　６　
４、２３０７（１９８９）；ダークら、Ｂｉｏｃｈｅｎ
＋．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏａｕａ．　Ｉ　５　
６、２９７（１９８８）：リチャーズ（Ａ　．　Ｄ　．
　Ｒ　ｉｃｈａｒｄｓ）ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ２４７、
１１３（１９８９）．ミーク（ＴＤ．Ｍｅｅｋ）ら、Ｐ
　ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓ　ｃｉ．　８　６
、！８４　１（１　９８９）；ナット（Ｒ．Ｆ．ＮｕＬ
ｔ）９、Ｐｒｏｃ．ＮａＬＩ．Ａｃａｄ．　Ｓ　ｃｉ．
　８　５、７１２９（１９８８）：クラウスリッヒ（Ｈ
．Ｇ，Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８　６、８０７（１９８９）．ム
ア（Ｍ　，　Ｌ　．Ｍｏｏｒｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｓ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ畦，１５９、４２０（１
９８９）］、または合成ペプチド開裂断片の薄層電気泳
動分析［コルター（Ｍ．Ｋｏｌｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８　５、４１８５（１９
８８）；コルターら、Ｊ　．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
４、３４２８（＋９８９）］が挙げられる。しかしなが
ら、これらの方法は比較的時間がかかるため、多数のプ
ロテアーゼインヒビターをスクリニングし特徴付けをす
るには実用的でない。これらの方法はまた、プロテアー
ゼ反応動力学の連続的な測定ができないため、酵素研究
の正確さという点でも欠点がある。

分子内共鳴エネルギー移動を加水分解酵素活性の測定に
適用する可能性は、ほぼ２０年前に示されている［ラッ
ト（Ｓ．Ａ．ＬａｔＬ）ら、Ａ　ｎａｌ．　Ｂ　ｉｏｃ
ｈｅｍ．５０、５　６（１　９　７　２）：カーメル（
Ａ　，　Ｃ　ａｒｉｅ１）ら、ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔ　
　３０、（＋９７３）］。しかしながら、それ以降、プ
ロテアーゼアッセイに該方法（類似の消光（ｑｕｅｎｃ
ｈｉｎｇ）／開裂法）を使用することは実用に限界があ
った［ヤロン（Ａ，Ｙａｒｏｎ）ら、Ａｎａｌ．Ｂ　ｉ
ｏｃｈｅｍ．　９　５、２２Ｂ（１９７９）および？の
中の文献：パーソン（Ａ　．　Ｐ　ｅｒｓｓｏｎ）ら、
Ａｎａｌ．Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ．　８　３、２９６（＋９
７７），ニシノ（Ｎ．Ｎｉｓｈｉｎｏ）ら、Ｊ　．Ｂ　
ｉｏｌ．ｃｈｅｍ．　２　５　５、３４８２（１９８０
）．デイラップ（　Ｃ　．　Ｄ　ｅｙｒｕｐ）ら、Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ｌ　２　９、５０２（＋９８
３）．フィリッポバ（■．Ｙｕ．Ｆｉｌｉｐｐｏｖａ）
ら、Ｂ　ｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．　ｌ　２、１１７　２
（１　９　８　６）：ボール（Ｊ．Ｐｏｈ１）ら、Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ｌ　６　５、９　６（１　９
　８　７）；ボラック（Ｓ．Ｊ．ｐ　■ｌ　ｌａｃｋ）
ら、Ｊ　．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．　＋　１　１１５
　９６１（１９８９）］。

（課題を解決するための手段） 本発明は、ペプチドに結合した蛍光ドナーおよび消光ア
クセプターからなり、該ペプチドは該蛍光ドナーと該消
光アクセプターとの間で分子内共鳴エネルギー移動が行
なわれるに充分な立体構造を有し、該ペプチドはウィル
ス性プロテアーゼにより開裂し得ることを特徴とする新
規な蛍光発生基質に関する。一般に、該ペプチドは該蛍
光ドナーと該消光アクセプターとを約１００オングスト
ローム未満の距離にて分離している。蛍光ドナーはペプ
チドのＣ末端に、消光アクセプターはペプチドのＮ末端
に結合してよいし、またその逆であってもよい。

本発明の新規な基質は、試料中のウィルス性プロテアー
ゼの存在または活性を検出するためのアッセイにおいて
有利に用いることができる。そのようなアッセイにおい
て、試料と本発明の蛍光発生基質とを混合すると、試料
中に目的酵素が存在している場合には該酵素は本発明の
基質を開裂し、蛍光ドナーと消光アクセプターとを分離
する。ついで、得られる蛍光放出を検出ないし測定する
ことができる。

本発明の基質はまた、プロテアーゼインヒビターの活性
を検出するために有利に用いることができる。そのよう
なアッセイにおいて、インヒビタ、プロテアーゼおよび
本発明の蛍光発生基質を混合する。酵素インヒビターの
有効性は、酵素が基質を加水分解するのを抑制される度
合により示される。

本発明の新規な基質は、基質の加水分解により引き起こ
された蛍光ドナーの蛍光放射を連続的にモニターするこ
とを可能にする。動力学的分析に必要な反応速度の決定
が簡単かつ正確であるため、これらのアッセイにより、
高速液体クロマトグラフィーまたは電気泳動法を用いた
従来のアッセイ法に比べて多くの利点が得られる。本発
明の基質は、ヒト免疫不全ウィルスのプロテアーゼおよ
びニワトリ骨髄芽球ウィルス（ＡＭＶ）のプロテアーゼ
の存在または抑制を検出するのに特に有用である。

１１ｋｄのプロテアーゼ［ヒト免疫不全ウィルス１（Ｈ
ＩＶ−１）によりコードされている］は、ウィルスのポ
リタンパク質のプロセシングおよび感染性ウィルス．の
その後の成熟に必要である。それゆえ、プロテアーゼ活
性の抑制は、ＡＩＤＳの治療の主要な目標である。ＨＩ
Ｖブロテアーゼの酵素学および抑制に関する綿密な研究
を容易にするため、本発明では分子内蛍光エネルギー移
動に基づく新規なアッセイ法を記載する。

本発明は、ＨＩＶやラウス肉腫ウィルス関連ＡＭＶなど
によってコードされているようなレトロウィルスブロテ
アーゼのための新規な蛍光アッセイを提供する。本発明
のアッセイでは新規な蛍光発生プロテアーゼ基質を用い
、該基質はペプチドが蛍光ドナーと消光アクセプターを
結合している構造を有する。一般に、蛍光ドナーおよび
消光アクセプターは、それぞれペプチドのＣ末端および
Ｎ末端で結合している。本発明に適した蛍光ドナーとし
ては、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体、Ｎ
−（２−アミノペンチル）−３−アミノ−２．７−ジス
ルホ−ｌ１８−ナフタルイミドニカリウム塩（ルシファ
ーイエロー）およびその誘導体、５−（（２−アミノエ
チル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸（Ｅ　Ｄ　
Ａ　Ｎ　Ｓ　）、クマリンおよびクマリン誘導体、およ
びそれらの等価物が挙げられるが、これらに限られるも
のではない。本発明に適した消光アクセプターとしては
、２．４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、４−（４−ジ
メチルアミノフエニル）アゾベンゼンスルホン酸（Ｄ　
Ａ　Ｂ　ＳＹＬ）、４−（４−ジメチルアミノフェニル
）アゾ安磨，香酸（ＤＡＢＣＹＬ）およびその等価物が
挙げられるか、これらに限られるものではない。本発明
には実質的にあらゆる蛍光団および消光アクセプターを
用いろことができるか、所定の蛍光発生プロテアーゼ基
質に用いるための特定のドナー／アクセプターの組合わ
せは、エネルギー移動効率が最適となるように選択する
。

ペプチドが蛍光ドナー／消光アクセプターの対を結合さ
せる仕方は、該蛍光ドナー（たとえば、ＥＤＡＮＳ）と
該消光アクセプター（たとえば、ＤＡＢＣＹＬ）との間
での分子内共鳴エネルギー移動のために該ドナーの固有
の蛍光が劇的に減少するようなものにする。分子内共鳴
エネルギー移動は約１００オングストロームを越える距
離では微々たるものになるので、ペプチド構造がプロテ
アーゼのような酵素により開裂されて最初の基質の蛍光
ドナー−ペプチド断片から蛍光消光アクセプター−ペプ
チド断片が放出された後は、蛍光団の全蛍光量子収量が
回復される。ドナー／アクセプターの組合わせを結合す
るペプチド構造は、ドナ一とアクセプターとの間に必要
な距離を提供し、かつ所望のプロテアーゼのための適当
な開裂部泣を有するしのであればいかなるペプチドであ
ってしよい。

プロテアーゼ反応の連続的な検出また；ｉ測定のための
本発明の蛍光発生プロテアーゼ基質の具体ρＩとして（
よ、下記式： （基質■） 〜場０へ 日ンー６ および式 （基質■） Ｏ〜Ｘイ上 日ンいＳ で示される化合物が挙げ与れる。

ＪＸ７’ｔｌ中のべブチド配列は、Ｓ　ｅｒ　−　Ｇ　
Ｉｎ　−　Ａ　ｓｎＴｙｒ　−　Ｐ　ｒｏ　−　Ｉ　Ｉ
ｅ　−　Ｖａｌ　−　Ｇ　Ｉｎのオクタペプチドであり
、これはＨＩＶブロテアーゼによる天然に存在するｇａ
ｇ　ｐ　ｌ　７　／ｇａｇ　ｐ２　４開裂部位に対応す
る。ＨｒＶプロテアーゼは、Ｔｙｒ−Ｐｒｏペプチド結
合にて該ペプチドを開裂する。基質Ｈに用いたペプチド
配列（Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−　Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ　−　Ｇ　Ｉｎ）は、ＨＩＶブロテアーゼ
の活性部位に存在するかもしれない対称性を利用して設
計したものである。しかしながら、この配列は、ＡＭＶ
プロテアーゼに一層適した基質であることがわかった。

これはＡＭＶプロテアーゼの天然の基質配列ではないが
、ＡＭＶポリタンパク質で種々の開裂部位を調べた結果
に基づき、高Ｖａｌ含量は基質効率を高めるであろうこ
とが予測される［コープランドおよびオロツラン、ペプ
タイズ：シンセシス、ストラクチャー・アンド・ファン
クション（Ｐ　ｅｐｔｉｄｅｓ：　Ｓ　ｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ，　Ｓ　ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎ
）、リッチ（Ｄ，Ｈ．Ｒｉｃｈ）およびグロス（Ｅ．　
Ｇ　ｒｏｓｓ）編（ピアス、ロックフィールド、ｒＬ１
１　９　Ｂ　２）、４９７〜５００頁］。このかさ高い
アクセプターの結合により、基質が立体的に妨害されな
いよう、ＤＡＢＣＹＬ基とＮ末端Ｓｅｔとの間に７−ア
ミノ酪酸（ｇａｂａ）スベーサーを挿入した。

本発明の基質を用いれば、蛍光強度の連続的な増加によ
り、酵素のタンパク質分解活性を経時的にモニターする
ことができる。酵素がペプチドを開裂するにつれ、蛍光
団が連続的かつ増加して放出されるからである。さらに
、この増加は蛍光発生基質の加水分解速度と一次相関を
有する。というのは、開裂された基質各１モルに対して
新たに生成したドナー−ペプチド断片１モルが存在する
ため、全蛍光は正味の強度により増加するからである。

この現象は、有利にも感度が高く定量的なアッセイ法の
基礎となることがわかった。その際、タンパク質分解反
応速度は、蛍光の変化を経時的に検出することにより決
定することができる。加えて、本発明の蛍光発生基質は
、酵素インヒビターの存在下での酵素活性を決定するた
めにも用いることができる。それゆえ、本発明の新規な
基質は、タンパク質分解酵素インヒビターの既存のライ
ブラリーおよび微生物発酵ビール、並びに新規な合成酵
素インヒビターなどを含む種々の源からの化合物を正速
かつ大スケールでスクリーニングするために有利に用い
ることができる。

簡単に説明すると、化合物の抑制能は下記方法により決
定することができる。プロテアーゼ（たとえば、ＨＩＶ
ブロテアーゼ）、プロテアーゼ抑制化合物（たとえば、
ペプスタチン、アセチルベブスクチンなど、これらに限
られない）および本発明の蛍光発生基質（たとえば、基
質Ｉ）を混合して反応混合物を生成する。一般に、アッ
セイ反応は緩衝溶液を用いて行い、反応は実質的に完了
するまで進行させる。プロテアーゼによる蛍光発生基質
の加水分解は、分光蛍光計を用いた定常状態蛍光により
モニターする。蛍光強度の測定値は連続的に得られ、接
続したマイクロコンピューターで直接記録する。ついで
、蛍光基質の加水分解速度を直線回帰分析から計算する
。このアッセイにおいては、蛍光発生基質の加水分解速
度はプロテアーゼ濃度に正比例する。反応混合物からプ
ロテアーゼ抑制化合物を除くことにより、酵素活性によ
る蛍光強度の変化の速度を決定することができる。本発
明により実質的にあらゆるプロテアーゼを検出すること
ができる。以下の説明で使用するプロテアーゼは、ハン
センら、ＥＭＢＯ　Ｊ．７、１７８５（１９８Ｂ）；ミ
ークら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓ　ｃｉ．
　８　６、１８４１（１９８９）；およびナットら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８　５、７　１
　２　９（１９８８）の記載の従って製造することがで
きる。

蛍光分子内共鳴エネルギー移動法の成功は、適当なドナ
ー／アクセプターのエネルギー移動対を選択したことに
基づいている。ドナーとアクセプターとの間のエネルギ
ー移動効率を最適にすることにより、完全基質中のドナ
ー化合物の残留蛍光を最小になり、その結果、基質が開
裂したときに蛍光シグナルの大きな変化が得られる。こ
の特徴は、全基質の極めて小部分の加水分解から反応速
度の決定を可能とするものであり、このことは初期反応
速度を評価するために非常に望ましいことである。

一つの好ましいドナー／アクセプタ一対としてのＥＤＡ
ＮＳおよびＤＡＢＣＹＬの選択は、数多くの考慮に基づ
いて行ったものである。第一に、ＥＤＡＮＳの蛍光放出
とＤＡＢＣＹＬの強い可視吸収バンドとの間に非常に大
きなスペクトルの重複があり、そのためエネルギー移動
か非常に効率的である。

第二に、ＥＤＡＮＳなどの比較的寿命の長い蛍光ドナー
を使用することは、ドナー残基とアクセプター残基との
拡散による分子内共鳴エネルギー移動の増大が有意とな
るため、残留する基質蛍光の抑制が改善されることにな
る。たとえば、基質ｉおよびＨにおいて、最大ドナー／
アクセプター分離距離（Ｒ）は約２９オングストローム
であると思われる（伸張されたオクタペプチドの立体配
置を想定して）。Ｒ．（５　０％エネルギー移動効率の
フェルスター（Ｐ　ｏｅｒｓｔｅｒ）距離）は、このド
ナー／アクセプタ一対については３３オングストローム
であると推定された。それゆえ、ＲはＲ０よりも小さく
、Ｒ＜Ｒ。の距離に対してはＲか減少するにつれエネル
ギー移動効率は急速に増加する。基質Ｉの末端の相対分
子内拡散係数を５　Ｘ　Ｉ　Ｏ　−’ｃｍ”／秒［ハー
ス（Ｅ　．　Ｈ　ａａｓ）ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ
　　Ｉ　７、ＩＩ（１９７８）］と仮定すると、ドナー
蛍光の２０倍消光はＲ＝０．６１Ｒ．で達成され、６５
倍消光はｎ＝ｏ．ｓＩ１．で達成されるであろう。ドナ
ーおよびアクセプターは、ＥＤＡＮＳの励起状態にある
寿命の間に互いに約１３オングストローム移動し得る。

Ｒ０は、配向因子に関して０．６７の値を用いて推定し
た。このことは、ドナーおよびアクセプター双極子がド
ナーの励起状態の寿命中に相対配向の動的なランダム化
を受けているときには妥当である［共鳴エネルギー移動
の計算法についてはストライアー（Ｌ　．　Ｓ　ｔｒｙ
ｅｒ）、Ａ　ｎｎ．　Ｒ　ｅｖ．　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ４
７、８１９（１９７８）を参照］。この仮定は、ペプチ
ドへのＤＡＢＣＹＬ結合およびＥＤＡＮＳ結合のかなり
の可撓性、およびペプチド自体の可撓性のため妥当であ
ると思われる。ドナーの量子収量の値（Ｑ）である０．
１　３は、基質断片Ｐｒｏ！　１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−
ＥＤＡＮＳについて測定した収量に基づき、ＩＮ硫酸中
のキニンサルフェート［Ｑ＝０．５４６；デマス（Ｊ．
Ｎ．Ｄｅｍａｓ）ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．　Ｃ　ｈｅｍ．　
７　５、９９１（１９７１）］と比較して用いた。

第三に、ＥＤＡＮＳの検出能は、中位に良好な量子収量
、光漂白に対する妥当な安定性、およびスペクトルの吸
収バンドと放出バンドとが大きく分離していることを含
む幾つかの因子により高められる。第１図は、ＥＤＡＮ
Ｓの吸収スペクトルおよび技術的蛍光スペクトル、並び
にＤＡＢＣＹＬ吸収スペクトルを示す。第１図は、ＥＤ
ＡＮＳの蛍光スペクトルとＤＡＢＣＹＬの吸収スペクト
ルとが重複していることを示しており、その結果、ドナ
ー／アクセブタ一対として効率的なエネルギー移動度か
可能となる。第１図にＥＤＡＮＳの吸収スペクトルを入
れたのはスペクトルの吸収バンドと放出バンドとが大き
く分離していることを示すためであり（ストークス（Ｓ
　ｔｏｋｅｓ）シフトは１００ナノメーター以上）、そ
の結果、低濃度のＥＤＡＮＳを検出することが可能とな
り、さらにアッセイの感度が高められる。

第四に、｝｛ＩＶブロテアーゼのための蛍光発生基質中
に用いるのに適しているような疎水性ペプチドを可溶化
するには、ＥＤＡＮＳが水中に可溶であることは特に有
益である。

第五に、ＤＡＢＣＹＬの可視吸収バンドが充分に分離し
ていることは、基質の精製および定量、並びにタンパク
質分解により生成した基質断片の分析を容易にする。Ｄ
ＡＢＣＹＬが非蛍光であるという事実によってもまた、
ＥＤＡＮＳ蛍先の検出能が改善される。というのは、カ
ット才フフィルターまたは非常に広いバンド通過モノク
ロメータースリットまたはフィルターを用いてＥＤＡＮ
Ｓ蛍光を測定することができるからである。原問として
、蛍光性のアクセプターを利用することら可能であり、
感光アクセプターの蛍光が時間に依存して減少していく
のをモニターすることにより反応速度を得ることができ
る。しかしながら、実際問題としては、この方法により
匹敵する感度を得ることは困難である。というのは、（
１）消光アクセプターが有意に直接励起することなくド
ナーが励起し得、さらに（２）アクセプターおよびドナ
ーの蛍光スペクトルが互いに充分に分離しているような
ドナー／アクセプタ一対を用いる必要があるからである
。

本発明においては、蛍光基質中に比較的大きなペプチド
を用いた場合でさえも、レトロウィルスのプロテアーゼ
活性をアッセイするために分子内共鳴エネルギー移動を
有効に用いることができる。

分子内共鳴エネルギー移動アッセイの簡単さ、迅速さ、
および正確さにより、本アッセイを容易に多くの用途お
よび態様に適用することができる。

本発明の基質は、酵素学的研究、およびプロテアーゼイ
ンヒビターとしての価値を有する化合物の特徴付けに特
に有用である。大スケールのスクリニング用としては、
分子内共鳴エネルギー移動アッセイは容易に９６ウエル
蛍光プレートリーダーのような自動化態様とすることが
できる。分子内共鳴エネルギー移動法はまた、レトロウ
ィルスプロテアーゼの基質特異性要件に関する研究にも
有用である。というのは、必要とされるのは、ドナー基
とアクセプター基とが酵素／基質相互反応を乱すのを最
小にするように位置していることだナであり、有効なド
ナー／アクセブタ一対を実質的にあらゆるベブヂド配列
または巨大分子ととらに用いることができるからである
。

つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例ｌ 蛍光発生基質の調製： 蛍光発生基質Ｉを下記のようにして調製した。

蛍光ドナーはＥＤＮＡＳであり、消光アクセプターはｇ
ａｂａスベーサーを介して結合したＤＡＢＣＹＬであっ
た。

基質【およびＨの才クタペプチドであるＳｅｒＧｌｎ−
Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ　−　ｒ　ｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌ
ｎおよびＳｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−ＶａｌＧＩｎ（マルチブル・ペプチド・システム
ズ（ＭｕｌｔｉｐＩｅ　ＰｅｐＨｄｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ
）、サンジエゴ、ＣＡ）を、それぞれ該オクタベブヂド
のアミノ末端およびカルボキンル末端とのＤＡＢＣＹＬ
およびＥＤＮＡＳの通常の縮合化学を用いて誘導体化し
た。

（ａ）Ｄ　Ａ　Ｂ　Ｃ　Ｙ　Ｌ　−ｇａｂａ　−　Ｎ−
ヒドロキノースクンンイミトの調製 ４−（ｐ−ジメヂルアミノフェニルーアゾ）安息香酸（
ｄａｂｃｙｌ　−　Ｏ　ｒ｛）（沸騰水中の対応ナトリ
ウム塩（シグマ、セントルイス、ＭＯから入手可能）の
溶液に充分な量の１）Ｈ４．Ｏの緩衝液を加えて調製）
をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解し、各１．
３当量のノシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）お
よびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を加えた
。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により反応完了が
示された後、この混合物を濃縮し、塩化メチレンでトリ
チュレートして不溶性の副生戊物であるＮ．Ｎ’−ジシ
クロヘキシル尿素（ＤＣＵ）を除いた。この塩化メチレ
ン溶液を濃縮してほぼ純枠なＤＡＢＣＹＬ−ＮＨＳを得
た。この物質をＤＭＦ中に溶解し、１，２当量の４−ア
ミノ酪酸（ｇａｂａ）を加え、ついで１．２当量のトリ
エチルアミンを加えた。反応が完了するまで（ＴＬＣに
より示される）、この混合物を室温にて撹拌した。ＤＭ
Ｐを蒸発させ、残渣をメタノール／塩化メチレン混合物
から再結晶させて実質的に純粋なＤＡＢＣＹＬ−ｇａｂ
ａ−ＯＨを得た。

ＤＡＢＣＹＬ−ｇａｂａ−ＯＨ（２．０ｇ、５．６ミリ
モル）を乾燥ＤＭＰ（３　０　０ｚＱ）中に溶解した。

この溶液にＮＨＳ（０．８９、１．２当量）およびＤＣ
Ｃ（１．４９、１，２当量）を加えた。室温にて一夜撹
拌した後、ＴＬＣにより反応が完了したことが示された
。固体物質を濾過した。この濾液を濃縮し、残渣を塩化
メチレンで２回洗浄して残留するＤＣＵを除いた。つい
で、この塩化メチレン溶液をシリカカラム上のクロマト
グラフィーにかけ（溶出液としてＥｔＯＡｃを使用）、
純枠なＤＡＢＣＹＬ　−ｇａｂａ−ＮＨＳ（１．５　８
９）を得た。

（ｂ）ＤＡＢＣＹＬ　−ｇａｂａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｎ−Ｔｙｒ　−　Ｐ　ｒｏ　−　１　１ｅ　−　Ｖａ
ｌ　−　Ｇ　Ｉｎの調製：ペプチドＳｅｒ−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ　−　１　１ｅＶａｌ−Ｇｌｎ（
４　９．０ｘ９、０．０４６ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（
５０ｘ１２）中に溶解し、この溶液にトリエチルアミン
（約０．２村、過剰量）を加えた。ついで、この溶液に
約１　２当量のＤＡＢＣＹＬ−ｇａｂａ　−　Ｎ　Ｉ−
Ｉ　Ｓを加えた。室温にて一夜撹拌した後、溶媒を蒸発
させ、残渣を塩化メチレンでトリチュレートした。濾過
すると、実質的に純枠な生成物（６０１１？）か暗赤色
固体として得られた。

（ｃ）ＤＡＢＣＹＬ　−ｇａｂａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ　−　［１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−
ＥＤＮＡＳの調製＝ＤＡＢＣＹＬ　−ｇａｂａ−Ｓｅｒ
−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−ＴｙｒＰ　ｒｏ　−　＋　１ｅ　−
　Ｖａｌ−Ｇ　Ｉｎ（５　０　．　Ｏ　ｙ９、０．０３
９ミリモル）を乾燥ＤＭＦ（５０ｘ（！）中に溶解した
。

この溶液に１、５当量の５−（２−アミノエチルアミノ
）−１−ナフタレンスルホン酸ナトリウム塩（ＥＤＮＡ
Ｓ、シグマ）、１．５当量のＮＨＳ、および１．５当量
んおｌ一エチル−３−（３−ジメチルアミノブロビル）
カルボノイミド塩酸塩（ＥＤＣ：ノグマ）を加えた。室
温にて一夜撹拌した後、この混合物を濃縮し、残渣をジ
メチルスルホキンド（ＤＭＳＯ）／水混合物中に再溶解
し、ＨＰＬＣ精製に供した。

ＨＰＬＣの条件はつぎのようであった。（ｉ）ライニン
（Ｒａｉｎｉｎ）Ｃ　−　８逆相カラム（２１ｘ２５０
ｍｙ）　；および（ｉｉ）溶媒Ａ（１００％水とＩＯｎ
＋Ｍ酢酸ナトリウム［ＮａＯＡｃ］、ｐＨ５）を用いた
溶媒勾配をｌＯ分間、ついで６０％溶媒Ｂ（９０％水性
アセトニトリルとＩ　ＯｍＭ　ＮａＯＡｃ，ｐＨ５）へ
の直線勾配を６０分間。一般に、二重チャネル（ｄｕａ
ｌ−　ｃｈａｎｎｅ１）　Ｕ　Ｖ　−　Ｖ　［　Ｓデテ
クターを用いた場合には、所望のＨＰＬＣビークは２６
０ｎｍでの吸収値に対する４９０ｎ＋ｏでの吸収値の比
は大体Ｉであり、これは所望の生成物に特徴的なもので
ある。

所望の生成物を含むフラクンヨンを集め、濃縮した。残
渣をＤＭＰで処理し、濾過して酢酸ナトリウムを除いた
。ついでＤＭＦａａを蒸発乾固させ、残渣を塩化メチレ
ンおよびヘキサンで処理した。

濾過すると結晶性の暗赤色の固体（４９．Ｏｎ）が得ら
れた。

実施例２ ｝［　Ｉ　Ｖブロテアーゼインヒビターのスクリーニン
グのための蛍光発生アッセイ インヒビター化合物（ベプスタヂン、シグマ）をＤＭＳ
Ｏ中に溶解し、小アリコートをさらにＤＭＳＯで試験に
必要な最終濃度の３０倍に希釈した。

このインヒビター溶液（２０μ１２）を激しく回転撹拌
しながら緩衝溶液（３８０ｃｚｉ２；Ｏ．ＩＮ　ＮａＯ
Ａｃ，ＩＭ塩化ナトリウム、ｌｍＭエチレンジアミン四
酢酸、ｌｍＭンチオスレイトールおよびＩ．Ｏｙ／１．
Ｑウン血清アルブミン［ＢＳＡ］）にゆっくりと加え、
インヒビターの水溶戒を得た。この緩衝インヒビター溶
液を室温にて貯蔵し、水に難溶解性の化合物の時間依存
性凝集を最小にするため、数時間以内に使用に供した。

プロテアーゼ（｝ｉｌＶプロテアーゼ）を上記緩衝溶液
（さらにｌＯ％ＤＭＳＯを含有）で希釈してプロテアー
ゼ溶ｍ（６．７ｎＭ：７　３ｒ＋ｇ／ｘ１２）を得た。

このプロテアーゼ溶液を水上で貯蔵した。

激しく回転撹拌しながら緩衝液で基質（純粋なＤＭＳＯ
中に４８０μＭ）を２０倍に希釈することにより、蛍光
発生基質Ｉ溶液（２４μＭ．ＤＡＢＣＹＬ　−ｇａｂａ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ１　１ｅ−
Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＥＤＡＮＳ）を凋製した。この基質溶
液らまた室温にて貯蔵した。

アッセイ反応は蛍光マイクロセル（３ＪＩＩＩ）中（た
いていの蛍光計において１２０μＱの全試料容量が適当
である）で行った。酵素溶液（２０μ１２）をインヒビ
ター溶液（８０μＯとマイクロセル中で直接混合した。

このマイクロセルを、３０℃にて少なくとも１分間、蛍
光計セルホルダー中に置いた。

ついで、前以て温めた基質溶液（２０μＱ，３０℃）を
マイクロセルに加え、反応混合物の蛍光強度を時間の関
数として記録した。反応混合物の完全な温度平衡を確実
にするため、最初の２分間のデータは無視した。その後
の５分〜８分における蛍光強度の変化速度を直線回帰に
より決定した。観察された速度は、単位モル当たりに開
裂された基質のモル数に正比例した。それゆえ、抑制（
％）はｌ０　０　Ｘ（１−（．インヒビターの存在下で
の速度）／（インヒビターの不在下での速度））として
計算した。

実施例３ プロテアーゼの蛍光発生アッセイ： プロテアーゼおよび本発明の蛍光発生基質を含有する反
応混合物についても、蛍光強度の経時的な変化速度を測
定した。このアッセイは、インヒビター化合物を用いＧ
かった他は実質的に実施例２に記載の方法に従って行っ
た。

実施例４ 蛍光発生基質のＨＰＬＣ分折： 蛍光発生基質およびその反応生戊物のＨＰＬＣ分析を下
記のようにして行った。

当該技術分野でよく知られた方法に従い、ダイオードア
レイ吸収および蛍光デテクターを備えたヒューレットバ
ッカードＩ　Ｏ　９　０Ｍシステム（Ｈｅｗｌｅｔｔ　
Ｐａｃｋａｒｄ　ｌ　０　９　０　Ｍ　ｓｙｓｔｅａ１
）上で、ｐＨ値が５未満のブラウンリー（Ｂ　ｒｏｖｎ
ｌｅｅ）　２　５　０　Ｘ　４　．６ｘｚＣ８ンリカカ
ラムか、またはｐＨ範囲が２〜８のハミルトン（Ｈａｍ
ｉｌｔｏｎ）５　０　Ｘ　４　．　ｌ　ｚｘ　Ｐ　ＲＰ
３ボリマーカラムのいずれかを用い、基質断片の分析的
ＨＰＬＣおよび単離を行った。水／アセトニトリル勾配
を用い、０．１％トリフルオロ酢酸（ｐＨ約２）、ＩＯ
Ｉｌ＋Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．９）または１　０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−　Ｈ　Ｃ　ｌ（ｐＨ　８　）のいず
れかを含有させてｐ｝［を変化させた。

この検出ンステムでは、蛍光および幾つかの吸光度波長
についてのクロマトグラム、並びにすべてのピークの吸
収スペクトルを同時に得ることができた。蛍光（３４０
ｒ＋ｏ＋で励起、４９０ｎｍで放出）および４７５ｎｍ
での吸光度シグナル（それぞれＥＤＮＡＳ基およびＤＡ
ＢＣＹＬ基から生成する）を用いて、基質の加水分解に
よって生成した断片をモニターし定量した。

蛍光および４７５ｎｍでの吸光度についてのクロマトグ
ラムを第２図および第３図に重ねて示す。

第２図は、ＨＩＶブロテアーゼを加える前の蛍光発生基
質【のらのであり、第３図は、実施例２に記載した条件
下でＨＩＶブロテアーゼで２．５時間加水分解した後の
基質■の生成物のものである。

基質【のモル蛍光増大らまた、加水分解反応が完了する
前の時間でＨＩＶプロテアーゼ／基質Ｉ反応混合物のＨ
ＰＬＣ分析により評価した。第２図の蛍光および４７５
ｎｍ吸光度クロマトグラム上のピークを積分すると、親
組成物である基質Ｉに対してＰｒｏ　−　１　ｌｅ−Ｖ
ａｌ−Ｇｌｎ−ＥＤＡＮＳペプチド断片の蛍光量子収量
が明らかに３３倍増大していた。しかしながら、アッセ
イ条件下で得られた４０倍の増大値か一層正確であるよ
うに思われる。というのは、このＨＰＬＣは同様のｐＨ
（４．９）にて行ったものではあったが、アセトニトリ
ル／水溶媒系で行ったからである。アセトニトリル／水
媒体はブローブの光物理学的性質およびペブヂドの立体
配置を変化させ、このことが今度は分子内共鳴エネルギ
ー移動による消光の度合に影響を与える。

プロテアーゼによる蛍光発生基質の酵素開裂が特異的で
あり定量的であるという証拠は、以下の方法で得られた
。まず、Ｈ［Ｖプロテアーゼとともに２，５時間インキ
ユベートした後の反応生成物のＨＰＬＣ分折は、５３．
５′における最初のペプチド溶出の完全な消失、および
それと同時に３６、４　および４７，２゜の保持時間に
おける新たな２種の分子種の出現を示していた（第３図
）。この結果は、蛍光発生基質が単一の結合部で定量的
に開裂されたことを示唆していた。３６．４゜ピークは
非消光ＥＤＡＮＳ蛍光団に特徴的な蛍光収量を示してお
り、４７　２分子種は非蛍光であり４７５ｒ＋ｍ吸光度
クロマトグラム上に存在していた。クロマトグラフィー
の間にオンラインで得られた各ピークについての吸収ス
ペクトルにより、各ピークがＥＤＡＮＳ（３　６．４゜
）、ＤＡＢＣＹＬ（４７，２゛）、およびＥＤＡＮＳ＋
ＤＡＢＣＹＬ（５３．５゜）に対応することが確認され
た。

ＨＰＬＣにより単離した基質■の開裂生成物はまた、ア
ミノ酸分析に供した。３６．４’に溶出した断片は、Ｐ
ｒｏ　−　１　１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＥＤＡＮＳであ
ると同定された。４７．２゜に溶出した断片はＤＡＢＣ
ＹＬ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒであると同定さ
れた。この分析により、基質■のタンパク質加水分解は
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ結合で特異的に起こったことが確認され
た。加えて、これら２つの蛍光団標識テトラペプチド断
片を独立に合成したところ、そ４−．らの逆相Ｈ　Ｐ　
Ｌ　Ｃ上での保持時間は、基質特異的開裂生戒物である
と予測されたＨＩＶブロテアーゼ放出断片のものと区別
することができなかった。

実施例５ ペプスクチンによるＨＩＶブロテアーゼの抑制ペブスタ
チンによるＨＩＶブロテアーゼの抑制をも、本発明の新
規な蛍光発生基質を用いて凋べた。ペブスタチンは多く
の細胞性アルパラギン酸ブロテイナーゼの強力なインヒ
ビターであり、Ｈｌｖプロテアーゼのインヒビターであ
ることが報告されている［シールマイアーら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓ　ｃｉ．　８　５、６６１
２（１９８８）；ギアムら、Ｊ　．Ｂ　ｉｏｌ．ｃｈｅ
ａ＋．　２　６　３、１４６１７（１９８８）；ンユナ
イダーら、Ｃｅ１１５４、３６３（＋９８８）；ハンセ
ンら、ＥＭＢＯ　　Ｊ．７、１７８５（１９８８）：ダ
ークら、Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｉ．２６４、２３０７（
１　９　８　９）；リチャーズら、ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔ
ｔ　２４７、１１３（１９８９）：ナットら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａ　ｃａｄ．　Ｓ　ｃｉ．　８　５、７１
２９（１９８８）；クラウスリッヒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８　６、８０７（１９８９）
コ。

本実施例では、Ｉ）Ｈ４．７、３０℃でのべブスクチン
によるＨＩＶブロテアーゼの抑制の測定を説明する。反
応は実質的に実施例２に記載した方法に従って行った。

３つの濃度の基質１（１０μＭ１３３μＭおよび１２９
μＭ）からデータを得、ベプスタヂン濃度（ｎＭ）とＩ
／Ｖ（反応速度，分／　ｎ　Ｍ　）のディクソンプロッ
トでプロットした［ディクソン（Ｍ．Ｄｉｘｏｎ）、Ｂ
　ｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ　．　５　５、＋７０（１９５３
）、参考のため本明細書中に引用する］。このデータを
第４図に示す。３つの直線の交差点から１７ナノモルの
抑制定数（Ｋ　ｉ）が得られ、これは、たいていのアス
パラギン酸プロテアーゼに対してそうであるように、ペ
ブスタチンが非常にＨＩＶプロテアーゼの強力なインヒ
ビターであることを示していた。

第５図に示すようにペプスタチン濃度（ｎＭ）と基質濃
度／Ｖ（分／ｎＭ）とでコーニッシューボーデン（Ｃｏ
ｒｎｉｓｈ　−　Ｂｏｗｄｅｎ）の方法［コーニッンユ
ボーデン、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ　．　ｌ　３　７、
１４３（１９７４）］によりプロットしたデータからは
平行な直線が得られ、ペブスタチンによるプロテアーゼ
の抑制が全く競合的であることを示していた（３３μＭ
の基質１度についてのデータは１０μＭの基質■濃度に
ついてのデータとほぼ一致したので、明瞭のため省いた
）。

実施例６ ＡＭＶプロテアーゼの蛍光発生アッセイ：蛍光発生基質
Ｉｆ（ＤＡＢＣＹＬ　−ｇａｂａ−ＳｅｒＶａｌ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＥＤＡ
ＮＳ）はＡＭＶプロテアーゼの有効な基質であることが
わかったので、この酵素のインヒビターを同定し特徴付
けるために有用である。このアッセイは実質的に実施例
３に記載の方法に従って行った。

ＡＭＶプロテアーゼ（モレキュラー・ジェネティック・
リソースイズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　
Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）、タンバ、ＦＬ）は、基質Ｉに対
するよりも基質Ｈに対して少なくとも５０倍活性であっ
た。

逆に、Ｈ　Ｉ　Ｖプロテアーゼは基質Ｉｔ（３．４μＭ
）よりも基質１（３．４μＭ）をｌＯ倍速く開裂した。

このアッセイではペプスタチンはＡＭＶプロテアーゼを
かなり弱く抑制し、［Ｃｓｏ（５０％抑制を引き起こす
インヒビターの濃度）はｐＨ６で約４０マイクロモル（
μＭ）であった。

実施例７ 種々の蛍光発生基質の凋製： 蛍光団および色原体消光剤（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　
ｑｕｅｎｅｈｅｒ）の両者の選択は、本発明のウィルス
性プロテアーゼ蛍光団一消光剤基質の設計を成功させる
ためのポイントであった。最適なスペクトルの重複、す
なわち蛍光ドナーの放出か消光アクセプターの吸収と重
複することが、バックグラウンド蛍光を最小にするため
、それゆえアッセイの最大の動的範囲を得るために望ま
しいことであった。アクセプターおよびドナーの水性緩
衝液中での溶解度もまた考慮に入れた。これらのことを
考慮に入れて、消光剤としてＤＡＢＣＹＬを、蛍光団と
してＥＤＡＮＳを選択した。

Ｈ　Ｉ　ＶプロテアーゼおよびＡＭＶプロテアーゼの種
々の開裂部位に対応する一連のべブチトを、Ｎ末端■リ
はＤＡＢＣＹＬ基で、Ｃ末端側はＥＤＡＮＳで官能化し
て一連の蛍光団一消光剤プロテアーゼ基質を生成した。

これら基質の凋製は、実質的に実施例１に記載の方法に
従って行った。この方法においては、アゾ型の色原体を
アセチル４アミノ酪酸結合を介してペプチドのＮ末端に
結合させた。

別法として、４−メチルアミノ酪酸のスルファミド（ａ
ａｂａ）結合を用いることもできた。対応するＮ標識試
薬であるＤＡＢＣＹＬ−ｍａｂａ−ＮＨＳは以下のよう
にして調製した。

（ａ）　Ｎ−メチルーＮ−［４−（４゜−ジメチルアミ
ノフェニル）アゾーベンゼンスルホニル］一γ−アミノ
醋酸（ＤＡＢＣＹＬ−ｍａｂａ−ＯＨ）の調製；γ−メ
チルアミノ酪酸（１．０９、過剰量、アルドリッチ・ケ
ミカル）を水（５０ｍ１２）中に溶解し、この溶液を炭
酸ナトリウムを用いてｐＨＩＯに凋節した。ノメトキン
エクン（３０ｄ）中の４−（４゜ノメチルアミノフェニ
ル）アゾーベンゼンスルホニルクロライド（０．８５９
、２．６３ミリモル、シグマ）の溶液を加えた。この混
合物を一夜還流した。冷却後、この混合物を濃縮し、残
渣をシリカゲルカラム」二のクロマトグラフィーにかけ
溶媒として２０％ＭｅＯ　Ｈ　／　Ｅ　ｔ　Ｏ　Ａ　ｃ
を用いて赤色の固体生威物（０．７５０）を得た。

（ｂ）　Ｎ−メヂルーＮ−［４−（４’−ジメチルアミ
ノフェニル）アゾーベンゼンスルホニル］一γ−アミノ
酪酸Ｎ−ヒドロキンスクシンイミド（ＤＡＢＣＹＬ　−
ｍａｂａ−ＮＨＳ）の調製 Ｎ−メチルーＮ−［４−（４’−ジメチルアミノフェニ
ル）アゾーベンゼンスルホニル］一γ−アミノ酪酸（Ｄ
ＡＢＣＹＬ−ｍａｂａ−ＯＨ，０．７５ｙ、１．９ミリ
モル）を乾燥ノメトキシエタン（５０ｉ０中に懸濁した
。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０３ｇ、２，８ミリ
モル）およびジンクロへキシルカルボジイミドＣ０．４
５９、２．２ミリモル）を加えた。ＴＬＣにより反応が
完了したことが示された後、混合物を濾過してＤＣＵ副
生成物を除いた。

濾肢をａ縮乾固し、残渣を塩化メチレンで２回トリヂュ
レートした。ついて、得られた溶液をＥｔ○Ａｃを溶媒
として用いたシリカゲルカラム上のクロマトグラフィー
にかけて所望の生成物ＤＡＢＣＹＬ−ｍａｂａ−ＮＨＳ
（０．９　０ｇ）を得た。

ついで、実質的に上記実施例Ｉに記載の方法に従い、ペ
プヂド配列および蛍光ドナーを結合させた。

かくして実施例！および実施例７に記載の方法に従って
調製した種々の蛍光発生プロテアーゼ基質を第１表にま
とめて示す。

（以下、余白） 第１表（蛍光発生基質およびプロテアーゼ活性）基質　
　　　　　　　　　ＨＩＶプロテアーゼＡＭＶブａテ７
−ゼ活性　　　　活性 Ｔ　　ＤＡＢＣＹＬ−ｇａｂａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓ
ｎ−　　　＋　　　　　　−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ４
ａｌ−Ｇｌｎ−ＥＤＡＮＳＩＩ　　ＤＡＢＣＹＬ−ｇａ
ｂａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−　　　−　　　　　　
＋Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−’／ａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＥＤＡ
ＮＳＩ［Ｉ　　ＤＡＢＣＹＬ−ｍａｂａ−Ｖａｌ−Ｓｅ
ｒ−Ｐｈｅ−　　　ＮＴ＊　　　　　ＮＴ＊Ａｓｎ−Ｐ
ｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−１　１ｅ−ＴｈｒＬｅｕ−ＥＤ
ＡＮＳ ＩＶ　　ＤＡＢＣＹＬ−ｍａｂａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｎ−　　ＮＴ＊　　　　　ＮＴ＊Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｉ
ｌｅ−Ｖａｌ−（ｉｌｎ−ＥＤＡＮＳＶ　　ＤＡＢＣＹ
Ｌ−ｇａｂａ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−　　　＋　　
　　　ＮＴ＾１ａ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ｌｅｕ−ＥＤＡＮＳ ＶＩ　　ＤＡＢＣＹＬ−ｇａｂａ−＾１ａ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｅｕ−　　　＋　　　　　ＮＴＡｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ
−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−ＧｌｎＧｌｕ−ＥＤＡＮＳ ■　ＤＡＢＣＹＬ−ｇａｂａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ
−　　　＋　　　　　ＮＴＩｌｅ−ＭｅＬ−Ｍｅｔ−Ｇ
ｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＥＤＡＮＳ ■　ＤＡＢＣＹＬ−ｇａｂａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ
−　　　＋　　　　　ＮＴλＩａ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−＾１ａ−ＥＤＡＮＳ （注）＊：化合物は、使用したアブセイ緩衝液中で不充
分に可溶性であった。

ＮＴ．試験せず。

実施例８ 蛍光発生基質に対するプロテアーゼ活性実質的に実施例
３に記載の方法に従い、種々の蛍光発生基質に対するＨ
ｒＶプロテアーゼおよびＡ　Ｍ　Ｖプロテアーゼの活性
を試験した。その結果を第１表にまとめて示す。これら
の化合物のうち、ＤＡＢＣＹＬ　−ｇａｂａ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｎ−Ａｓｎ−ＴｙｒＰｒｏ−　ｒｌｅ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｎ−ＥＤＡＮＳをもっと詳しく調べた。この化合物は
、ＨｒＶブロテアーゼによっては極めて有効に開裂され
るが、ＡＭＶプロテアーゼによっては開裂されないこと
がわかった。この化合物はＴｙｒ−Ｐｒｏ結合において
特異的に開裂されて蛍光シグナルを生成し、酵素活性を
連続的にモニターすることが可能になった。酵素の動力
学的測定により、ミカエリスーメンテンの反応速度定数
（ＫＩ＋１）が１０３μＭであり、酵素反応の最大速度
（Ｖｎ＋ａｘ）が４７ｎＭ／分であることが示された。

第１表中の他の化合物の酵素活性については、表記のよ
うに定性的にのみ決定した。基質■および■はＨＩＶプ
ロテアーゼによって開裂されたが、基質Ｉほどには有効
に開裂されなかった。基質■は基質！よりも有効な基質
であることがわかった（Ｋｍ＝５．９　μＭ，Ｖｍａｘ
＝　１　．８ｎＭ／分）。

実施例９ 水溶解性の改善された蛍光発生ドナー／アクセプター基
質 ＥＤＡＮＳの負の荷電によりＤＡＢｃＹＬ／ＥＤＡＮＳ
、ドナー／アクセプター基質に水性媒体中での所望の溶
解度が付与されるであろうことが予想されたが、溶解度
は制限因子であった。第Ｉ表中の化合物■および■の酵
素活性は、これら化合物の溶解度が低いために測定しな
かった。

基質の溶解度を上昇させるために２つの方法をとった。

すなわち、ドナー基またはアクセプター基を修飾するこ
と、およびペプチドを修飾することである。

第一の方法では、荷電をより多く有する蛍光団または色
原体をＥＤＡＮＳまたはＤＡＢＣＹＬの代わりに用いた
。この目的のため、ルンファーイエロー型の蛍光団であ
るＮ−（２−アミノベンチル）一３−アミノ−２．７−
ジスルホ−１．８−ナフタルイミドニカリウム塩を用い
た。この分子中の２つのイオン性スルホン酸基により溶
解度を所望通りに上昇させることができた。

この蛍光団を用いて２つの化合物、ＤＡＢＣＹＬ　−ｇ
ａｂａ　−　Ｓｅｒ　−　Ｇ　Ｉｎ　−　Ａｓｎ　−　
Ｔｙｒ　−　Ｐｒｏ　−　１　１ｅＶａｌ−Ｇｌｎ−ル
シファーイエロー型蛍光団およびＤ　Ａ　Ｂ　Ｃ　Ｙ　
Ｌ　−ｇａｂａ　−　Ｖａｌ　−　Ｓｅｒ　−　Ｐｈｅ
　−　Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ　−　ｌｉｅ−
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ルシファ−イエロー型蛍光団を調製し
た。これらの基質は、実質的に実施例Ｉに記載の方法に
従って調製した。

実質的に実施例３に記載の方法に従ってアッセイを行っ
たところ、これら両方の化合物がＨｒＶプロテアーゼ活
性であることが示された。データの示すところによると
、対応するＥＤＡＮＳ基質のＮａＯ　Ａｃ（ｐＨ　４　
．　７　）中での溶解度が約１５０μＭであるのと比較
して、ＤＡＢＣＹＬ　−ｇａｂａ−Ｓｅｔ−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ　−　Ｔｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ一
ルシファ−イエロー型蛍光団のＮａＯ　Ａｃ（ｐＨ　４
　．７）中での溶解度の上限は３５０μＭまたはそれ以
上であった。

ｐＨ４．７の緩衝液中では、ルシファーイエロー化合物
は４４０ｎｍにおいて最大励起を、５２０ｎＩｍにおい
て最大放出を示し、一方、ＤＡＢＣＹＬの最大吸収はｐ
｝［４．７において約４７０ｒｖにおいて認められた。

それゆえ、最適なプロテアーゼ基質調製物を得るために
は、ＤＡＢＣＹＬアクセプター基の代わりに、ルシファ
ーイエロー型蛍光団ともっと最適に重複するスペクトル
を有する色原体消光剤を用いるべきである。

溶解度を高める第二の方法は、開裂部位から最も遠い末
端部に極性アミノ酸を付加することによりペプチド配列
を修飾することであった。その例としては、Ｈｉｓ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−　Ｉ　ｌｅ−
Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ（ヒスチジンが溶解度を高める
）、またはＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ　
−　Ｐ　ｈｅ　−　Ｐ　ｒｏ　−　Ｇ　Ｉｎ　−　１　
１ｅ　−　Ｔｈｒ　一Ａｒｇ（アルギニンが溶解度を高
める）などが挙げられる。これらのペプチドを含有する
基質は、実質的に実施例１に記載の方法に従って調製し
た。

本発明の発明眼念が、他の酵素のための蛍光発生基質の
製造、並びにそのような基質の種々の蛍光アッセイ法中
での使用または試薬またはアブセイキットの製造に適用
可能であることは、当業者には明らかであろう。本発明
は、ウィルス性プロテアーゼの存在の検出に用いるため
の、蛍光ドナーと消光アクセプターとの間の分子内共鳴
エネルギー移動を利用した蛍光発生基質の製造を教示す
るものである。本明細書に示した態様は例示として示し
たもので本発明を制限することを意図したものではなく
、本発明の範囲内ですべての等価物を包含することを意
図するものである。

【図面の簡単な説明】

第Ｉ図は、５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタ
レン−ｌ−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）の吸収スペクトル
および技術的蛍光スペクトル、および４−（４−ジメチ
ルアミノフェニル）アゾ安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）の吸
収スペクトルを示すグラフ；第２図は、ＨＩＶプロテア
ーゼを添加する前の蛍光発生基質ＤＡＢＣＹＬ　−ｇａ
ｂａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ　一Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−　
＋　１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−ＥＤＡＮＳ（基質」）の蛍
光および４７５ｒ＋ｍでの吸光度を示すクロマトグラム
； 第３図は、Ｈ　Ｉ　Ｖプロテアーゼによるタンパク質加
水分解後の基質Ｉの生成物の蛍光および４７５ｎｍでの
吸光度を示すクロマトグラム；第４図は、ペブスクチン
によるＨＩＶプロテアーゼ活性の抑制をベブスタチン濃
度と反応速度の逆数とのディクソンプロットにより示し
たグラフ；第５図は、ペブスタチンに上るＨ［Ｖプロテ
アーゼ活性の抑制をペブスタチン濃度と基質濃度／反応
速度とのコーニッシューボーデンプロットにより示した
グラフである。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）ペプチド、 （ｂ）該ペプチドに結合した蛍光ドナー、および（ｃ）
   該ペプチドに結合した消光アクセプターからなり、該ペ
   プチドは該蛍光ドナーと該消光アクセプターとの間で分
   子内共鳴エネルギー移動が行なわれるに充分な立体構造
   を有し、該ペプチドはウィルス性プロテアーゼによる酵
   素開裂部位を有することを特徴とする、蛍光発生基質。
2. （２）該蛍光ドナーと該消光ドナーとが、約１００オン
   グストローム未満の距離で離れている、請求項（１）に
   記載の蛍光発生基質。
3. （３）該蛍光ドナーが、フルオレセインおよびフルオレ
   セイン誘導体；Ｎ−（２−アミノペンチル）−３−アミ
   ノ−２，７−ジスルホ−１，８−ナフタルイミド二カリ
   ウム塩およびその誘導体；５−（（２−アミノエチル）
   アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸；およびクマリン
   およびクマリン誘導体よりなる群から選ばれたものであ
   る、請求項（１）に記載の蛍光発生基質。
4. （４）該消光アクセプターが、２，４−ジニトロフェニ
   ル；４−（４−ジメチルアミノフェニル）アゾベンゼン
   スルホン酸；および４−（４−ジメチルアミノフェニル
   ）アゾ安息香酸およびその誘導体よりなる群から選ばれ
   たものである、請求項（１）に記載の蛍光発生基質。
5. （５）該ペプチドが、 Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｖ
   ａｌ−Ｇｌｎ：Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒ
   ｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ：Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ
   −Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−
   Ｌｅｕ：Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｉ
   ｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ：Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌ
   ａ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ：Ａｌａ
   −Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−
   Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ：Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉ
   ｌｅ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
   ｕ：Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ
   −Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ：Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−
   Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇ
   ｌｎ−Ｈｉｓ；および Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐ
   ｒｏ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｒｇよりなる群から
   選ばれたものである、請求項（１）に記載の蛍光発生基
   質。
6. （６）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ かまたは式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される蛍光発生基質。
7. （７）該蛍光ドナーが該ペプチドのＣ末端に結合してお
   り、該消光アクセプターが該ペプチドのＮ末端に結合し
   ている、請求項（１）に記載の蛍光発生基質。
8. （８）該ウィルス性プロテアーゼがヒト免疫不全ウィル
   スのプロテアーゼである、請求項（１）に記載の蛍光発
   生基質。
9. （９）該ウィルス性プロテアーゼがニワトリ骨髄芽球症
   ウィルスのプロテアーゼである、請求項（１）に記載の
   蛍光発生基質。
10. （１０）試料中のウィルス性プロテアーゼの存在または
    活性を検出するためのアッセイ法であって、（ａ）該試
    料を、蛍光発生基質であって （ｉ）ペプチド、 （ｉｉ）該ペプチドに結合した蛍光ドナー、および（ｉ
    ｉｉ）該ペプチドに結合した消光アクセプターからなり
    、該ペプチドは該蛍光ドナーと該消光アクセプターとの
    間で分子内共鳴エネルギー移動が行なわれるに充分な立
    体構造を有することを特徴とする蛍光発生基質と混合す
    ることにより、目的酵素により該基質を開裂させて該蛍
    光ドナーおよび該消光アクセプターを分離させ、ついで （ｂ）該蛍光ドナーの蛍光放出を検出する ことを特徴とする方法。
11. （１１）基質の加水分解による該蛍光ドナーの蛍光放出
    を連続的に検出する工程をさらに含む、請求項（１０）
    に記載のアッセイ法。
12. （１２）プロテアーゼがヒト免疫不全ウィルスのプロテ
    アーゼであり、該蛍光発生基質が式：▲数式、化学式、
    表等があります▼ で示される化合物である、請求項（１０）に記載のアッ
    セイ法。
13. （１３）プロテアーゼがニワトリ骨髄芽球症ウィルスの
    プロテアーゼであり、該蛍光発生基質が式：▲数式、化
    学式、表等があります▼ で示される化合物である、請求項（１０）に記載のアッ
    セイ法。
14. （１４）プロテアーゼインヒビターの活性を検出するた
    めのアッセイ法であって、 （ａ）該インヒビターを、プロテアーゼ、および蛍光発
    生基質であって （ｉ）ペプチド、 （ｉｉ）該ペプチドに結合した蛍光ドナー、および（ｉ
    ｉｉ）該ペプチドに結合した消光アクセプターからなり
    、該ペプチドは該蛍光ドナーと該消光アクセプターとの
    間で分子内共鳴エネルギー移動が行なわれるに充分な立
    体構造を有することを特徴とする蛍光発生基質と混合す
    ることにより、該酵素により該基質を開裂させて該蛍光
    ドナーおよび該消光アクセプターを分離させ、ついで （ｂ）該蛍光ドナーの蛍光放出を検出する ことを特徴とする方法。
15. （１５）基質の加水分解による該蛍光ドナーの蛍光放出
    を連続的に検出する工程をさらに含む、請求項（１４）
    に記載のアッセイ法。