CN1254383A - 基于染料二聚作用的生荧光蛋白水解酶底物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生物测试方法,它包括以下步骤:提供一种酶底物,它包含与肽链结合的两个或更多个荧光染料基团,所述肽含有一个或多个可酶切连接键,染料基团足够靠近以至基本上自发猝灭了染料基团的荧光,所述荧光基团荧光的自发猝灭是因染料堆叠所致,然后酶切肽上的一个或多个可酶切连接键,释放出堆叠的荧光染料基团,使得荧光强度增加。本发明还提供用于本发明方法的蛋白水解酶底物。本发明可用于检测和鉴定微生物、消毒灭菌检测、药物开发、酶试验、免疫试验和其它生物测试。

Description

基于染料二聚作用的生荧光蛋白水解酶底物
发明领域
本发明涉及制备和使用蛋白水解酶底物的方法，这种底物会经酶水解而发出强烈的荧光。本发明可用于微生物检测和鉴定、灭菌检测、药物开发、酶试验、免疫试验及其它生物测试。
发明背景
蛋白水解酶是一类催化水解肽键的酶。它们的一级结构和独特的三维结构决定了它们的活性和专一性。根据活性位点的组成，蛋白水解酶主要分成天冬氨酸蛋白水解酶、金属蛋白水解酶、巯基蛋白水解酶和丝氨酸蛋白水解酶。蛋白水解酶的生理作用是众所周知的。它们不仅参与消化、血凝和血纤蛋白溶解等功能(Lottenberg，R.；Christensen，U；Jackson，C.M.；Coleman，P.L.，利用肽生色和生荧光底物进行的凝聚蛋白水解酶测试(Assay of Coagulation Proteases Using PeptiedeChromogenic and Fluorogenic Substrates)；Methods in Enzymology 1981：80：341-361)，而且还参与排卵、致瘤、免疫应答和病毒及细菌感染等(Livingston，D.C.；Brocklehurst，J.R.；Cannon，J.F.；Leytus，S.P.；Wehrly，J.A.；Peltz，S.W.；Peltz，G.A.；Mangel，W.F.，新的丝氨酸蛋白水解酶荧光活性位点滴定剂的合成和特征说明(Synthesis and characterization of a new fluorogenic active-site titrant of serineprotease)；Biochem.1981，20：4298-4306)。例如，已知例如HIV的逆转录病毒编码一种蛋白水解酶，它在特定的剪切位置加工前体蛋白。这种剪切发生在病毒包装时，而且是感染性病毒颗粒成熟所必需的。所以，抑制这种蛋白水解酶已经成为设计抗包括AIDS在内的抗病毒药物的重要目标。
此外，人们对于具有抗生素抗性的菌株和由食物引起的疾病有了越来越多的认识。在物保健、化妆品、食品和饮料行业控制微生造成的危害是一个重要的健康和安全问题。细菌检测是控制微生物危害不可缺的一部分。许多细菌能够产生蛋白水解酶，这被广泛用作鉴定和表征某些致病菌的标准。
要阐明和理解蛋白水解酶的生物功能、诊断生理疾病和开发新药，必需进行灵敏而且定量的酶测试。已经用了许多技术来测量蛋白水解酶的活性，其中包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、高性能液相层析(HPLC)、蛋白免疫印迹分析和薄层电泳分析。但是，这些方法往往需要许多步骤和试剂，而且操作起来很慢很昂贵。有时它们并不适合某些应用，例如大量筛选药物例如蛋白水解酶抑制剂。
生荧光物质即经酶水解从非荧光性变成强荧光的分子。它们被广泛用作分子探针研究和测试病毒和细菌的蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、磷酸酯酶和激酶(Manafit，M.；W.；Bascomb，S.，用于细菌诊断的生荧光和生色底物(Fluorogenic andChromogenic Substrates used in Bacterial Diagnostics)；Microbiological Reviesws1991，55：535-348)。在UV照射下，利用荧光显微镜，可以在96格测试板读数仪中或在流式细胞计数仪中方便地观察荧光。
有几种市售的生荧光蛋白水解酶底物。例如EnzCheckTM试剂盒(MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR)，使用的是带有荧光团4，4-二氟-4-硼酸-3a-氮鎓-4a-氮杂-s-indacene(BODIPY)的快速猝灭酪蛋白底物。切断时，荧光性BODIPY-肽被释放。通常，如果胰蛋白酶浓度高达500ng/ml，在530nm可以观察到强度增加2倍的荧光。有一种HIV蛋白水解酶的生荧光底物(Molecular Probes，Inc.)，它具有HIV蛋白水解酶的剪切位点，其一侧有荧光团5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸(EDANS)，另一侧有受体生色团4-(5-二甲基氨基苯基)偶氮苯磺酸(DABCYL)。如欧洲专利申请428,000中所述，EDANS荧光因分子内共振能的转移而被DABCYL生色团猝灭，该过程要求供体和受体在肽链上彼此间的距离不超过100埃。荧光团在340nm被激发，在490nm生荧光，它会因为细菌培养基吸光或荧光而变暗。
美国专利4,314,936说明的酶试验底物包含一条连续的肽链，在该肽链的一部分连接着荧光团，另一部分连接着荧光猝灭基团。在两基团之间任一位置的剪切释放出荧光团，可供检测和定量。对于特定的酶需制备特定的氨基酸序列。荧光团包括曙红型、罗丹明型和荧光素型染料，以及EDANS型基团。猝灭基团(非染料或荧光团)包括硝基苯基、硝基苄氧基羰基、硝基苯甲酰基等硝基化芳香族化合物。
PCT专利申请WO95/03429说明了一种免疫酶试验过程，其中的荧光示踪剂包含一段被转移荧光能的供体和荧光能受体同时标记的抗原模拟短肽。游离在溶液中时，因为分子内染料的二聚作用(猝灭)，示踪剂表现出很微弱的荧光；当与天然抗原的抗体结合时，荧光显著增强，这是由于示踪肽构象的改变导致了分子二聚体的解离。代表形成分子内二聚体的荧光能染料包括荧光素家族，例如荧光素、四甲基罗丹明、罗丹明B和Texas红。所以，该申请说明的是荧光因结合而增强而非因剪切而增强，以及，荧光的猝灭依赖于能转移与染料二聚作用相结合。
美国专利4,822,764和5,254,477说明了分析物的定量与定性分析，该分析依赖于荧光团与生色性光吸收化合物或与另一种(光吸收)荧光团之间的相互作用。当荧光团处于被激发态时，因其放射能和非放射能转移而发生猝灭，而不是因为染料的二聚作用。此时，专利746的方法在分析物存在下只能使荧光增强10-20％。
美国专利5,605,809说明了用于蛋白酶水解检测的肽，这些肽在其两端缀合有荧光团，经折叠使得荧光团因分子内的能转移而猝灭。被目标蛋白水解酶剪切时，荧光团被释放到附近，产生信号被检测并定量。专利809的图2A和2B显示，当底物被剪切时，荧光最多增强了9倍。该专利说明了许多肽，长度为2至约8个氨基酸，2至约6个更好。这些荧光显示剂吸收和发射可见光区内的光(400-700nm)。
荧光染料的猝灭通常有许多机制，包括能量转移和染料二聚作用。在两种情况中，当含有通过X链连接的荧光染料供体和受体(受体可以是或不是荧光染料)的分子被输入能激发(通常是特殊波长光的辐照)时，能量被从供体染料转移到受体染料，而不是由荧所发散掉。能量转移，又称福斯特型偶极-偶极相互作用，一般发生在远距离(一般约100埃)的供体和受体之间。参见L.Stryer等，能量转移：发光标尺；(Energy Transfer：Spectroscopic Ruler)；Biochemestry，1967，58：719-726。另一方面，染料二聚或染料堆叠则发生在两个或更多个荧光分子距离足够近时，此时它们的平面芳香环相互作用而形成二聚体或三聚体。二聚或堆叠状态下染料的吸收光谱与其在能量转移对中时是完全不同的。染料二聚体吸收谱表现出特征性的主吸收峰随染料浓度增高而减弱，同时表现出特征性的肩峰增强。该现象通常称为“谱带分裂”。参见K.K.Rohatgi和G.S.Singhal，J.Phys.Chem.，1966，70：1695-1701。还下文中的图2。可以通过以在单位体积中增加染料量，或在物理上将两个或更多个染料分子在同一连接分子(例如肽或其它小分子)上相互靠近来实现浓度的增高。二聚作用或堆叠通过形成基态复合物而发生(即通过邻近的物理接触)，而能量转移相互作用则夸空间发生。因此，通过能量转移机制相互作用的染料是观察不到上述光谱改变的。
发明概述
简而言之，本发明提供一种生物学测试方法，它包括以下步骤：
提供一种酶的底物，所述底物包含结合于肽链上的一个或多个荧光染料基团，所述的肽具有一个或多个可酶切连接键，染料基团足够靠近以至基本上自发猝灭了染料基团的荧光，其中染料基团荧光的自发猝灭可以通过染料的堆叠，更好的是通过染料当地二聚作用而发生，以及
酶切一个或多个可酶切连接键，从染料二聚或堆叠中释放荧光染料，导致荧光强度的增加。
在优选实施例中，本发明提供一种蛋白水解酶底物，它包含具有两个荧光染料基团的肽，染料基团足够靠近以至基本上因形成分子内二聚体而猝灭了染料基团的荧光。
显然，两个以上荧光基团可以与蛋白水解酶底物肽结合，并参与分子内猝灭。
检测产生特征酶的微生物的一种方法包括：a)提供所述特征酶的专一性底物，其中包含与肽链结合的两个或更多个荧光染料基团，所述肽链具有一个或多个可被所述特征酶剪切的连接键，染料基团足够靠近以至基本上自发猝灭了染料基团的荧光，其中染料基团荧光的自发猝灭因染料堆叠而发生；和b)用所述的特征酶剪切所述肽的一个或多个可剪切连接键，从染料二聚作用中释放出荧光染料，导致荧光强度的增加。
较好的是，底物是具有两个荧光染料分子的短肽(例如四甲基罗丹明)。肽具有对酶的亲和性和专一性，水解前，染料分子因为靠近而形成二聚体，造成明显的荧光猝灭。特定肽键的酶水解因为染料基团的彼此分离而导致荧光强度的明显增强。在UV辐照下，用荧光显微镜，可以在96格测试板读数仪或在流式细胞计数仪中方便地观察荧光。较好的是在可见光谱内发生荧光。生荧光底物是均一的，因为不需要其它显影剂。这很重要，因为这就能够用主要分离介质来检测和鉴定微生物，而不需要鉴定前耗费时间的分离步骤。
在本申请中：
“染料二聚作用”表示两染料基团间形成复合物；
“染料堆叠”表示两个或更多染料基团间形成复合物；
“荧光”表示物质在给定波长因吸收另外不同波长的光而发光，其中的发光只发生在吸收光的过程中；
“摩尔吸光度”表示吸光物质的相对光吸收，是根据每摩尔浓度每厘米光程的吸光量计算的；
“荧光量子产率”表示发射物质发出的荧光量子数量与被该物质吸收的光子总数之比；
“荧光团”表示吸收另一不同波长(通常较短)的光后在给定波长发光的分子。
本发明具有常规微生物检测和鉴定方法所没有的优点。它提供了快捷而且均质的方法，并使用生色或生荧光底物来测定胞外及胞内酶的活性。本发明的方法和底物改善了检测和鉴定微生物的精确度、提高了速度并降低了总费用。在优选实施例中，本发明提供的荧光显示剂在被剪切时显示出很高的信号水平，而在未剪切时的噪音则很低，而且只在可见光波长范围内有效。此外，通过设计和选用特定的肽和与之结合的荧光团，本发明还可以同时检测多种细菌。
附图简述
图1显示的是基于染料二聚作用的生荧光底物的概念。
图2显示T-VPRGK-T(约10-5M)在被胰蛋白酶水解前(A线)后(B线)的吸光度谱图。
图3显示在接触副溶血弧菌溶解前(D线)后(C线)的荧光光谱。
优选实施例的详细说明
本发明提供蛋白水解酶底物和生物测试方法，使用的蛋白水解酶底物包含两个或更多个荧光染料基团，染料基团足够靠近以至基本上猝灭了染料基团的荧光，蛋白水解酶底物具有一个或多个可酶切连接键，自发的荧光猝灭是通过染料堆叠，更好的是通过染料二聚作用发生的。
酶切所述的一个或多个可酶切连接键，得到各含一个荧光染料基团的产物，由此提高荧光强度。
染料基团是荧光团，在剪切前彼此相距不超过100埃。
较好的是，本发明方法使用含两个自猝灭荧光染料基团的底物。更好的是，本发明方法使用含有两个相同的自猝灭荧光染料基团的底物。
本发明还提供生荧光的酶底物，它包含至少两个与肽链共价连接的荧光染料基团，染料基团足够靠近以至基本上自发猝灭了染料基团的荧光，染料基团荧光的自发猝灭是通过堆叠发生的。较好的是，至少两个的荧光染料基团完全相同。更好的是，生荧光酶底物含有两个相同的荧光染料基团。
荧光是目前最灵敏的检测技术之一。已经用荧光微试验对仄摩尔量(zeptomolar)的酶分子进行了研究。利用荧光显微镜已经能检测发散在一滴油滴中的单个酶分子。人们已经在毛细管内进行了酶的各个分子的电泳，并用荧光光谱学类监测。参见Xue，Q；Yeung，E.S.，酶各分子的化学反应性差异；Nature 1995，373，681-683。已经发明了用β半乳糖苷酶作为标记酶来检测大肠杆菌的试验。与比色法相比，荧光检测法的检测灵敏度提高了250倍，时间缩短了5小时。参见Van Poucher，S.O.；Neils，H.J.，开发灵敏的检测透化大肠杆菌内β半乳糖苷酶的化学发光测定试验并与荧光检测法和比色法相比较(Development of a SensitiveChemiluminometric Assays for the Detection of β-Galoctosidase in Permeabilizedcliform Bacteria and Comparison with Fluorometry and Colorimetry)；Appl.Env.Microbiol.1995，61：4505-4509。
为了制备本发明的生荧光底物，如后文所述选取一段2至10个氨基酸、通过肽键连接的短肽，然后用一对荧光染料标记，染料在与肽正确结合形成“共轭物”时发生特征性的二聚作用或“堆叠”，以至猝灭两个荧光团的全部荧光。染料对不必是荧光能转移的供体和受体。这类染料在与短肽结合并与彼此足够靠近时表现出所述的堆叠特征，其中包括含有基本为平面的芳香结构的染料，此种结构在浓度足够高时(例如10-2至10-4M)，会形成同二聚体或异二聚体。
更具体的是，可以通过短肽(以小于100埃的为佳)和两分子荧光染料的化学反应来制备本发明所用生荧光蛋白水解酶底物。蛋白水解酶底物有市售的(例如GeneMed Biotechnologies，San Francisco，CA)。荧光染料与蛋白水解酶底物的共价连接是本领域众所周知的。
用于产生荧光蛋白水解酶底物的代表性肽包括哪些具有约2至10个氨基酸、更好的是4至8个氨基酸以便染料基团二聚的肽，而且，所述肽还具有酶特异性可剪切位点。总之，随着底物被剪切，荧光强度会因分子内二聚体的解离而增强。
更好的是，本发明所用底物包括至少一段ARGGLY序列。更好的是，所述底物含有序列Val-Pro-Arg-Gly-Lys，两端各共价连接一荧光染料基团的肽。
本发明所用生荧光蛋白水解酶底物可以利用本领域已知方法来制备。参见欧洲专利申请EP0428000。
用于与肽反应形成蛋白水解酶底物的荧光染料包括发生染料堆叠的哪些。公知的是，有些荧光染料(例如荧光素、罗丹明、花青、例如4，4-二氟-4-硼酸-3a-氮鎓-4a-氮杂-s-indacene(BODIPY)等硼-杂环染料)当它们在水溶液中彼此足够靠近时会形成二聚体。
例如荧光素，四甲基罗丹明(TMR)，罗丹明B和Texas红代表了荧光素家族的平面芳香族染料。因为共振二聚体结构偶极间的相互作用，如果不存在能够剪切肽的酶，二聚体的荧光量子得率将很低。当二聚体经酶剪切而解离后，可以观察到水溶液中荧光量子得率显著增高。用这种方式，可以设计一种均质的酶测试：溶液中是带标记的肽，加入待分析酶，酶剪切肽，导致二聚作用降低的同时荧光增强。
酶剪切可以通过生荧光底物与专一性酶或含酶介质接触来进行。
适用于本发明的酶包括一般归为蛋白水解酶的酶，即催化水解肽键的蛋白质，例如天冬氨酸蛋白水解酶、金属蛋白水解酶、巯基蛋白水解酶、逆转录病毒蛋白水解酶和胰蛋白水解酶。较好的是胰蛋白酶家族的成员，例如凝血酶、类胰蛋白酶等。
虽然有许多不同类型的生荧光底物，它们的起效机制可以归为三大类：化学的、物理的和物理化学的。
本发明的生物测试是均质的。它不需要ELISA和生物发光法等试验中分离步骤。这对使用者和卖方来说都意味着试剂、人力、时间和设备的利用效率更高。通常，本发明方法所用荧光团吸收紫外光范围内的光。虽然可用UV检测，但是在含有强烈吸收紫外光的分子的生物样品中其灵敏度可能降低。此外，某些非剪切显示剂会造成严重的背景荧光。较理想的是这样的生荧光显示剂，它在被剪切时显示高信号水平而在完好是的噪音则很低，而且只在可见光范围内反应。本发明说明了一种提供上述优点的方法，还提供了通过特意设计和选择肽以及与之连接的荧光团来同时检测多份细菌的潜力。
罗丹明家族的染料，例如荧光素、四甲基罗丹明、X-罗丹明和罗丹明B在可见光范围内(400-700nm)具有很高的荧光量子得率(约0.85)。因此，它们常被用作激光染料、显示剂、生物标记，用于远程传感或检测微量物质。重要的是，已知这类染料在足够靠近时(例如在高浓度(约10-2至10-4M))，它们会形成二聚体而自发猝灭荧光。对许多应用来说，以上现象显然是不利的。但是，该现象也可以被利用成为优点。如果短肽(2至10个氨基酸残基)两端都连有染料分子，即被标记，带标记的共轭物会因为自发猝灭作用而几乎不生荧光。因为这是局部浓度的有效增高，所以共轭物将不受总体浓度的影响而保持猝灭态。当酶剪切时，两标记分离，产生很高的固有荧光。所以，可以将酶活性与荧光强度的增加直接关联。如果酶是由真核或原核细胞分泌的，可以将荧光强度与细胞的代谢活性相关联。一个酶分子转化数以百万计底物分子的能力是一个放大过程。当酶来自活细胞培养物时，这一放大过程被进一步加强，因为更多的酶分子随着细胞的生长而释放出来。这种“双重放大”与荧光技术相结合时，就提供了一种充满前景的迅速、灵敏、特异性检测细菌的方法。图1显示了这一概念。10代表细菌，例如金色葡萄球菌或副溶血弧菌，它们产生酶12例如类胰蛋白酶。12催化剪切含有两个猝灭态荧光染料基团N和C的肽底物18(非荧光性)，产生片段14’和16’，各自含有强荧光基团N’和C’。
如前所述，代表用于产生生荧光蛋白水解酶底物的肽包括约2至10个氨基酸的肽，以便染料基团堆叠，肽还具有专一性酶切位点。因为有着大量可用于本发明的蛋白水解酶，所以就有着同样大量可用于本发明的肽。特殊要求是：靶肽必须具有受蛋白水解酶攻击所要求的化学键。例如，如下所述，已知胰蛋白酶在精氨酸或赖氨酸残基的羧基侧水解肽，所以各种具有此特征的底物都可以是胰蛋白酶底物。
副溶血弧菌是一种导致海洋食品中毒的病原菌，它胞内产生类胰蛋白酶，它一般用作鉴定副溶血弧菌的标记。它专一地水解精氨酸后面的肽键。使用提高外膜(OM)透性的试剂使得酶能够与生荧光底物接触。二乙胺四乙酸(EDTA)一般通过影响革兰氏阴性肠道菌的外膜屏障来达到上述目的。它通过螯合将稳定化二价阳离子从它们在脂多糖(LPS)内的结合位点上去除。结果从细胞中释出大量LPS。LPS的流失造成OM外部小叶内磷酸脂质的暴露，由此成为通道让疏水性化合物可以通过它们扩散。在特定条件下，OM会开裂而因让大分子透过。参见Vaara，M.提高外膜透性的试剂(Agents that increase the permeability ofthe outer membran)；Microbiol.Reviews 1992，56，395-411。
胰蛋白酶剪切带正电Arg残基后面的任何肽键，不管该残基相邻的残基是什么。但是，同一家族的其它酶(例如凝血酶)的剪切取决于周围的残基，该特性使得它们各自具有专一性。
为了表明这一概念，图1模型中用的是胰蛋白酶和类胰蛋白酶。胰蛋白酶是来自肠道的一种高度专一性蛋白水解酶，而且是已知的最强的酶之一。它水解精氨酸或赖氨酸残基羧基侧的肽键。胰蛋白酶的这种特性是众所周知的。为了评价本发明概念，设计了以下序列：
(N-末端)Val-Pro-ARG-GLY-Lys(羧基末端)    Seq.l
其中的游离氨基在缬氨酸(N末端)上，游离羧基在赖氨酸(C末端)上。
两粗体残基之间的酰胺键即胰蛋白酶的剪切位点。两侧残基的作用是减少结合染料时的位阻。Val和Lys上的氨基被用来与染料基团反应。C末端的羧基可用来根据需要连接固相载体。
本发明与市售使用蛋白水解酶底物的方法的区别在于起效机制及其灵敏度。已经发现，市售常规试剂盒使用蛋白水解酶只增强荧光2倍，与之相比，本发明的荧光至少增强10、20、30倍或更多。
对迅速而灵敏的测试来说，尽可能增大信号与噪音之比是很重要的。大多数传统生荧光底物在远UV波长区(350-450nm)发光，大多数细菌培养基在该区域有明显的自生荧光。例如，金色葡萄球菌的培养基在360nm被激发后，在425nm和475nm有两处明显的发射峰。通常使用高底物浓度来避免这一问题。这会造成使用费用升高、对微生物毒性加强、有时会发生底物沉淀。本发明通过将检测波长向可见光谱红移而克服了自生荧光干扰的难题(四甲基罗丹明：λab＝550nm，λem＝580nm)。而且，本发明的概念可以用于其它发射波长也会发生向甚至更长波长红移的染料。通常，可用的染料具有以下特性：消光系数高(＞80,000cm-1M-1)；量子得率高(在水溶液中＞0.85)；具有对溶剂和pH不敏感的光谱；水溶性好、光稳定性良好；二聚反应常数高。
本发明可以用于检测和鉴定微生物检测、消毒灭菌检测、药物开发、酶测试和免疫测试。此外，针对HIV蛋白酶活性的生荧光底物可用于测试抗病毒药物，这可能可用于AIDS的治疗。
以下实施例将进一步说明本发明的目的和优点，但是实施例中的具体材料及其用量，以及其它条件和细节不应该理解成是对本发明的限定。实施例
在以下实施例中：
Val或V＝缬氨酸；
Pro或P＝脯氨酸；
Arg或R＝精氨酸；
Gly或G＝甘氨酸；
Lys或K＝赖氨酸；
TMR＝四甲基罗丹明或四甲基罗丹明基团；实施例1：生荧光蛋白水解酶底物的制备
用GeneMed Biotechnologies(South San Francisco，CA)合成Val-Pro-Arg-Gly-Lys，并用反相高效液相层析(HPLC)纯化。利用快速原子轰击(FAB)质谱和氨基酸测序来进行其化学鉴定。该肽与四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯在0.1M碳酸氢钠，pH8.3中反应一昼夜。反应混合物用反相HPLC(C-18柱，粒径15微米，WatersCorp.，Milford，MA)纯化。全部化学反应性染料均购自Molecular Probes，Eugene，OR。这些染料-肽共轭物的化学结构如后文结构式I所示为TMR-Val-Pro-ARG-GLY-Lys-TMR(在图2中称为T-VPRGK-T)。用乙腈(ACN)的浓度梯度水溶液来纯化该共轭物。在典型的洗脱过程中，在最初的15分钟内，乙腈浓度由15％升至30％，其后10分钟内，恒定在30％ACN中洗脱，5分钟升至50％，后5分钟恒定在50％ACN中洗脱。全部溶剂都含有0.1％三氟乙酸。纯化后共轭物的分子量据FAB质谱测定为1379，这是根据C74H85N13O14的化学组成的算得分子量。如下所示的双标记共轭物与其单标记的对等物相比具有明显低的荧光。
Figure A9718214700121
实施例2：生荧光底物被纯化酶水解
室温下，在pH8.9的50mM碳酸盐缓冲液中酶水解实施例1的底物。表1列出了用胰蛋白酶处理前后溶液的荧光强度，激发波长分别为360nm、522nm、530nm和553nm。除了荧光强度增加之外，还观察到吸收光谱的改变，如图2所示。完好时，共轭物的最大吸收波长为520nm，肩峰为550nm(A线)。如前所述，这就是染料的二聚作用或堆叠特征。剪切的结果是两个峰的相对吸收逆转，变成了游离四甲基罗丹明水溶液的光谱(线B)。荧光和吸光度数据都令人信服的证明：共轭物内染料分子间存在着基态相互作用，而这种作用被酶切而消除。
                                                    表1
 发射波长           360nm激发            522nm激发            530nm激发             553nm激发
   (nm)     w/o胰蛋白酶     w/胰蛋白酶  比例     w/o胰蛋白酶     w/胰蛋白酶  比例    w/o胰蛋白酶     w/胰蛋白酶  比例     w/o胰蛋白酶     w/胰蛋白酶   比例
  570571572573574575576577578579580581582583584585   319347369365354410401378379392361375376347385353   8625881793229189962997199759977699819872978899609783959193879427   27252525272424262625272726282427   1378152514801509164516431587167216291673159516651567159916011527  40193414164250643406442414503745519456484598045745457574493644724440764328242928  29272929272729272827292729282728  1687171818191844190418951968193919702026197319851948192619051820  46651483144995550871521635268152855537525361153534534145319052569517195070549629  28282728272827282726272727272727  3301340234573658364938023827381638063962369538253736372435933449   82385851208784589719915559300194046948169451694662937159318992281911258941587910     25252525252425252524252425242525
  平均值   26  28  27     25
表1的数据显示，在一段很宽的激发频率中，酶切后底物溶液在570nm至585nm这一人眼可见段发射的荧光强度是酶切前底物溶液的29倍，平均为25至28倍。实施例3：生荧光底物检测副溶血弧菌的用途
以下实验中所用的副溶血弧菌是Transport Swab System of Becton DickinsonMicrobiology Systems(Cockeysville，MD)的质量控制用菌株。它购自美国典型微生物保藏中心(ATCC 49398)。细胞被培养在含有3％氯化钠的营养肉汤培养基中。取10ml培养过夜的培养物离心。弃去肉汤，加入含50μl结构式I双标记共轭物的试验缓冲液(1mM EDTA，50mM pH7.2的磷酸盐缓冲液)，稀释度为1000(参见实施例1有关标记肽的制备)。为了确保酶切完全，反应培养物孵育通宵。测定含细胞和无细胞比色管荧光强度，分别得到曲线C和D。所得的图见附图3。
类胰蛋白酶剪切使荧光增强。该试验提供了一种简明而快捷的方法，在加入胰蛋白酶后的数秒内，不仅可以用简单的荧光计来测定，而且可以用肉眼测定。
对本领域熟练技术人员来说，在本发明范围和宗旨内可进行的修改是显而易见的，必须明白的是，本发明不局限于上述说明性实施例。

Claims (12)

1.一种生物测试方法，它包括以下步骤：
a)提供一种酶底物，它包含与肽链结合的两个或更多个荧光染料基团，所述肽含有一个或多个可酶切连接键，染料基团足够靠近以至基本上自发猝灭了染料基团的荧光，所述染料基团荧光的自发猝灭是因染料堆叠所致，
b)酶切肽上的一个或多个可酶切连接键，释放出堆叠的荧光染料基团，使得荧光强度增加。
2.根据权利要求1所述的方法，所述染料基团相同。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述染料基团包含荧光供体和受体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述染料基团间隔小于100埃。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，所述获释荧光染料基团在可见光范围发射荧光。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，所述荧光染料基团具有平面构型。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，所述荧光染料基团选自荧光素、罗丹明和花青染料基团。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，所述肽包含约2至10个氨基酸，所述染料基团与所述肽结合并形成染料堆叠，所述肽具有至少一个专一性可酶切连接键。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，用来酶切的所述酶选自天冬氨酸蛋白水解酶、金属蛋白水解酶、巯基蛋白水解酶、丝氨酸蛋白水解酶、逆转录病毒蛋白水解酶和胰蛋白水解酶。
10.用于权利要求1至9中任一项所述方法中的蛋白水解酶底物，所述蛋白水解酶底物肽含有两个荧光染料基团，两基团足够靠近以至因分子内堆叠而基本上自发猝灭了染料基团的荧光。
11.根据权利要求10所述的蛋白水解酶底物，其通式为：
TMR-Val-Pro-Arg-Gly-Lys-TMR。
12.一种检测微生物的方法，它形成一种特征性酶试验，所述酶试验是根据权利要求1至9中任一项所述的方法。
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