KR20010020359A - 염료 이합체화에 기초한 형광발생 프로테아제 기질 - Google Patents

염료 이합체화에 기초한 형광발생 프로테아제 기질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 두개의 형광 염료 기가 펩티드에 결합되어 있는 효소 기질을 준비하는 단계[상기 염료 기들은 염료 기의 형광을 실질적으로 자체 소광시키기에 충분히 근접 위치하며, 상기 염료 기 형광의 자체 소광은 염료 적층에 의해 일어남] 및 상기 펩티드를 효소적 분할시켜서 염료 적층에 의해 형성된 형광 염료 기를 방출시켜서 형광 세기를 증가시키는 단계를 포함하는 생물학적 분석법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용되는 프로테아제 기질을 개시하고 있다. 본 발명은 미생물의 동정, 멸균 확인, 의약적 발견, 효소 분석, 면역 검증 및 기타의 생물학적 분석에서의 용도를 밝히고 있다.

Description

염료 이합체화에 기초한 형광발생 프로테아제 기질{FLUOROGENIC PROTEASE SUBSTRATES BASED ON DYE-DIMERIZATION}
프로테아제는 펩티드 결합을 촉매 가수분해시키는 효소로 분류된다. 이들의 활성과 특이성은 프로테아제의 주된 화학적 서열 및 독특한 3차원 구조에 의해 정해진다. 활성 부위의 조성에 따라, 프로테아제는 아스파르트산 프로테아제, 메탈로 프로테아제, 티올 프로테아제 및 세린 프로테아제를 포함하는 주 그룹으로 분류된다. 생리적인 프로세스에서의 프로테아제 역할은 광범위하게 인식되어 있다. 이들은 소화, 혈액 응고 및 피브린 용해와 같은 작용과 연관되어 있을뿐아니라[Lottenberg, R.; Christensen, U.; Jackson, C.M.; Coleman, P. L., Assay of Coagulation Proteases Using Peptide Chromogenic and Fluorogenic Substrates; Methods in Enzymology 1981, 80, 341-361], 배란, 종양 형성, 면역 반응, 바이러스성 감염 및 세균성 감염 등[Livingston, D.C.; Brocklehurst, J.R.; Cannon, J.F.; Leytus, S.P.; Wehrly, J.A.; Peltz, S.W.; Peltz, G.A; Mangel, W.F., Synthesis and characterization of a new fluorogenic active-site titrant of serine protease; Biochem. 1981, 20, 4298-4306]에도 관여한다. 예를 들면, HIV와 같은 레트로바이러스들은 특이적인 분할 부위에서 단백질 전구체의 처리 기능을 갖는 프로테아제를 암호화하는 것으로 공지되어 있다. 상기 분할 현상은 비리온 회합 도중에 일어나며, 감염성 비루스 입자가 성숙할 것을 요한다. 따라서, 이들 프로테아제의 저해는 항바이러스성 약제, 특히 AIDS 용 항바이러스성 약제의 고안에 있어서 중요한 문제가 되었다.
또한, 항생물질에 대해 내성이 있는 박테리아 균주 및 혈액 매개 질환에 대한 대중의 인식이 증가하고 있다. 건강 관리, 화장품, 식료품 산업에서 세균 감염의 위험에 대한 관리는 건강상 및 안전상으로 중요한 이슈이다. 세균 테스트는 세균 감염 위험을 관리하는 필수적인 분야이다. 다양한 박테리아의 프로테아제 생성 성능은 특정 병원성 종들의 확인 및 성질 규명에 있어서 광범위하게 사용되는 표준이다.
프로테아제의 생물학적 기능을 발견하고 이해하며, 생리적 장애를 진단하고, 치료 약물을 개발하는 데는 민감하고 정량적인 효소 분석법이 요구된다. 프로테아제 활성을 측정하기 위해서는 효소 연관성 면역흡착제 분석법(ELISA), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 단백질 면역블롯 분석법 및 박층 전기영동 분석법을 포함한 다양한 기법이 사용되어 왔다. 그러나, 이들 방법은 대개 다단계 및 다수의 시약들을 필요로 하므로 조작이 느리고 비싸다. 그리고, 때로는 의약, 예를 들면 프로테아제 저해제를 높은 효율로 선별하는 등의 용도에서는 비실용적일 수 있다.
형광발생 기질은 효소적 가수분해 시, 형광성이 없는 것으로부터 고도로 형광성이 있는 것으로 변화되는 분자이다. 이들은 바이러스성 및 세균성의 프로테아제, 뉴클레아제, 사카리다아제, 포스파타아제 및 키나아제를 연구하고 테스트하기 위한 분자 탐침으로 널리 사용된다[Manafi, M.; Kneifel, W.; Bascomb, S., Fluorogenic and Chromogenic Substrates used in Baterial Diagnostics; Microbiological Reviews 1991, 55, 335-348]. 형광성은 96 웰 플레이트 판독기 또는 유동 세포계산기 내에서 형광 현미경을 사용하여 UV 조명 하에 용이하게 관찰될 수 있다.
몇가지 형광발생 프로테아제 기질이 시판되고 있다. 그 예로는 4,4-디플루오로-4-보레이타-3a-아조니아-4a-아자-s-인다센(BODIPY) 형광단(fluorophore)을 포함하는 고도로 소광(消光)시킨 카제인 기질을 사용하는 EnzCheckTM키트(미국 오리건주 유진에 소재한 Molecular Probes, Inc. 제품)이 있다. 분할 시, 형광 BODIPY-펩티드가 방출된다. 전형적으로, 500 ng/㎖ 이하의 트립신 농도에 대해 530 ㎚에서 형광 세기는 두배 증가하는 것이 관찰된다. 그것의 한 사이드에는 형광단인 5-((2-아미노에틸)아미노)나프탈렌-1-설폰산(EDANS)이, 그리고 그것의 다른 사이드에는 수용체 발색단인 4-(5-디메틸아미노페닐)아조벤젠 설폰산(DABCYL)이 존재하는 HIV 프로테아제 분할 부위를 포함하는 HIV 프로테아제에 대한 형광발생 기질이 입수 가능하다(Molecular Probes, Inc. 제품). 유럽 특허 출원 제428,000호에 기재된 바에 따르면, EDANS 형광성은 내부분자 공명 에너지 전이 과정, 즉 공여체와 수용체를 펩티드 사슬을 따라 100 Å 이하로 분리시키는 과정을 통해 DABCYL 발색단에 의해 소광된다. 형광단은 340 ㎚에서의 복사에 의해 여기되어 490 ㎚에서 형광한다. 이는 세균 배양 배지의 흡광성 또는 형광성에 의해 약화될 수도 있다.
미국 특허 제4,314,936호에는 펩티드의 한 부분에 형광 기가 부착되어 있으며 다른 부분에는 형광 소광기가 부착되어 있는 연속적인 펩티드 사슬을 포함하는 효소 분석 기질이 기재되어 있다. 상기 두부분 사이 임의 지점에서 사슬을 분할시킴으로써 감식 및 정량용 형광단이 유리되게 된다. 특이적인 아미노 산 서열이 특이 효소에 대해 만들어진다. 형광단으로는 에오시닐 타입 염료, 로다미닐 타입 염료 및 플루오레시닐 타입 염료뿐만아니라 EDANS 타입 부를 들 수 있다. 소광 종(이는 염료 또는 형광단이 아님)은 니트로소화된 방향족 화합물, 예를 들면 니트로페닐, 니트로벤질옥시카르보닐, 니트로벤조일 등을 포함한다.
PCT 특허 출원 제WO95/03429호에는 형광발생 트레이서(tracer)가 형광 에너지 전이 공여체 및 형광 에너지 수용체 모두로 표지되어 있는 짧은 항원 유사성(mimicking) 펩티드를 포함하는 면역검증 과정이 기재되어 있다. 트레이서가 용액 중에 유리되면, 트레이서는 내부분자 염료 이합체화(소광)로 인해 거의 형광을 나타내지 않는다. 천연 항원의 항체에 결합되는 경우에는, 트레이서 펩티드에서 배좌 변화에 의해 발생되는 분자 이합체의 해리로 인해 형광성이 상당히 증가한다. 내부 분자 이합체를 형성하는 대표적인 형광성 에너지 염료로는 플루오레신 계열, 예컨대 플루오레신, 테트라메틸 로다민, 로다민 B 및 텍사스 레드를 들 수 있다. 따라서, 상기 출원은 분할 시의 형광성 보다는 결합 시의 형광성 강화를 기재하고 있으며, 형광 소광 현상은 에너지 전이 및 염료 이합체화의 조합에 좌우된다.
미국 특허 제4,822,746호 및 제5,254,477호에는 형광단과, 발색성 광선 흡수용 화합물 또는 제2(광선 흡수) 형광단과의 상호작용에 좌우되는 분석물의 정량 분석 및 정성 분석에 대해 기재하고 있다. 염료 이합체화에 의하기 보다는 여기 상태의 형광단에 의해 복사에너지 전이와 비복사 에너지 전이 현상 모두를 거쳐서 소광이 일어난다. 이로써, 상기 특허 746호의 방법은 분석물의 존재 하에서 형광성을 단지 10 내지 20%만 증가시킬 수 있다.
미국 특허 제5,605,809호에는 프로테아제 감지에 유용하게 사용되는 펩티드를 기재하고 있는데, 상기 펩티드는 형광단이 내부분자 에너지 전이를 통한 소광 현상을 보이도록 각각의 말단에 공액 결합되어 있으며 접혀있는 형광단을 갖는다. 형광단이 목적 프로테아제에 의해 분할되는 경우, 이들은 근위에서 방출되므로 이로 인해 신호가 감지되어 정량화된다. 상기 특허 809호의 도 2a 및 도 2b는 기질 분할 시, 형광성이 최대로 9배 증가한다는 것을 보여준다. 길이가 2 내지 약 8개, 바람직하게는 2 내지 약 6개의 아미노산 범위인 다양한 펩티드가 기재되어 있다. 형광성 지시약은 가시광선 구간(400 내지 700 ㎚)의 광선을 흡수하고 방출한다.
통상, 형광 염료 소광 현상은 에너지 전이 및 염료 이합체화를 비롯한 다양한 메카니즘에 의해 일어난다. 두 경우 모두, 사슬 X로 연결되는 형광 염료 공여체 및 수용체(여기서, 수용체는 형광 염료일 수도 형광 염료가 아닐 수도 있음)를 포함하는 한 분자가 에너지 유입, 전형적으로 특정 파장의 광선에 의한 복사에 의해 여기되는 경우, 에너지는 형광에 의해 소산되기 보다는 공여체 염료로부터 수용체 염료로 전이된다. Forster 타입 쌍극자 상호작용으로도 일컬어지는 에너지 전이는 일반적으로 공여체와 수용체 간의 장거리(약 100 Å)에서 일어난다. 예컨대, 문헌[L. Stryer 등., Energy Transfer: Spectroscopic Ruler; Biochemistry, 1967, 58, 719-726] 참조. 한편, 염료 이합체화 또는 염료 적층은, 형광 분자들의 평면 방향족 고리들이 상호작용하여 상기 이합체 및 삼합체와 같은 집합체를 형성시키기에 충분히 짧은 거리 만큼 상기 두개 이상의 형광 분자들이 분리되어 있는 경우 일어난다. 이합체 상태 또는 적층 상태 염료의 흡광 스펙트럼은 에너지 전이 쌍 내의 동일한 염료의 흡광 스펙트럼과 실질적으로 다르다. 염료 이합체 흡광 스펙트럼은 염료 농도가 증가함에 따라 주 흡광 피크가 특징적으로 감소하는 현상을 보여준다. 반면, 쇼울더 피크는 특징적으로 증가한다. 이러한 현상은 통상 "밴드 스플리팅(band splitting)"으로 일컬어진다. 예컨대, 문헌[K.K.Rohatgi and G.S.Singhal, J. Phys. Chemm., 1966, 70, 1695-1701] 참조. 또한, 도 2(후술함)를 참고한다. 단위 부피 내에서 염료 양을 증가시키거나, 두개(또는 그 이상)의 염료 분자들을 함께 연결(linker) 분자 상에 근접하게 물리적으로 위치시킴으로써 농도를 증가시킬 수 있다. 이합체화 또는 적층은 바닥 상태의 착물 형성을 통해(즉, 근접한 물리적 접촉을 통해) 일어나는 반면, 에너지 전이 상호작용은 공간을 통해 일어난다. 이 때문에, 에너지 전이 메카니즘에 의해 상호작용하는 염료에 대해서는 이같은 스펙트럼 변화가 보이지 않는다.
본 발명은 효소적 가수분해 시, 고도로 형광성을 띄게 되는 프로테아제 기질의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 미생물의 감지 및 동정, 멸균 확인, 의약적 발견, 효소 분석, 면역 검정 및 기타의 생물학적 테스트에서 사용할 수 있음이 밝혀졌다.
도 1은 염료 이합체화에 기초한 형광발생 기질의 개념을 설명하는 것이다.
도 2는 트립신에 의한 효소적 가수분해 전(궤적 A)과 가수분해 후(궤적 B)의 T-VPRGK-T(약 10-5M)의 흡수 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 3은 비브리오 파라하몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus)의 용해질에 노출 전(궤적 D)과 노출 후(궤적 C)의 형광 스펙트럼을 도시한 것이다.
바람직한 실시태양의 상세한 설명
본 발명은 두개 이상의 형광 염료 기를 포함하는 프로테아제 기질 및 이를 사용한 생물학적 분석법을 제공한다. 상기 염료 기들은 염료 기의 형광을 실질적으로 소광시키기에 충분히 근접 위치하며, 상기 프로테아제 기질은 하나 이상의 효소 분할 성 결합을 갖는다. 여기서, 형광의 자체 소광은 염료 적층, 바람직하게는 염료 이합체화 및 하나 이상의 효소 분할성 결합의 효소 분할에 의해 수행되는데, 얻어진 생성물 각각은 형광 세기를 증가시키는 형광 염료 기를 포함한다.
염료 기들은 형광단으로서, 분할 전 100 Å 미만의 거리로 이격되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서는 두개의 자체 소광용 형광 염료 기를 포함하는 기질을 사용한다. 두개의 동일한 자체 소광용 형광 염료 기를 포함하는 기질을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 또 다른 일면은 두개 이상의 형광 염료 기가 펩티드에 공유 결합되어 있는 형광발생 효소 기질을 제공하는 것으로서, 상기 염료 기들은 염료 기의 형광성을 실질적으로 자체 소광시키기에 충분히 근접 위치한다. 여기서, 염료 기 형광의 자체 소광은 염료 적층에 의해 일어난다. 형광 염료 기 중 두개 이상은 동일한 것이 바람직하다. 형광발생 효소 기질은 두개의 동일한 형광 염료 기를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
형광성은 오늘날 사용할 수 있는 가장 민감한 감지 기술 중의 하나이다. 효소 분자의 미지의 몰(zeptomolar) 분량은 형광 미량 분석을 사용하여 연구하여 왔다. 단일 효소 분자들은 형광 현미경에 의해 오일 분산된 소적 중에서 감지되었다. 각각의 효소 분자는 모세관 내에서 전기영동법으로 다루어졌으며 형광 현미경 분석법에 의해 모니터되었다. 문헌[Xue, Q.; Yeung, E.S. Differences in Chemical reactivity of Individuals molecules of an enzyme; Nature 1995, 373, 681-683] 참조. 표지 효소로서 β-갈락토시다아제를 사용하여 대장균을 감지하는 분석법이 개발되었다. 형광측정계를 통한 방법은 색측정 방법에 비해 감수성이 250 배 크며, 감지 시간이 5 시간 감소된다는 것이 밝혀졌다. 문헌[Van Poucke, S.O.; Neils, H.J. Development of a Sensitive Chemiluminometric Assay for the Detection of β-Galactosidase in Permeabilized Coliform Bacteria and Comparison with Fluorometry and Coloimetry; Appl. Env. Microbiol. 1995, 61, 4505-4509] 참조.
본 발명의 형광발생 기질을 제조하기 위해서는, 펩티드 결합을 통해 결합된 2 내지 10개의 아미노산을 포함하는 선택된 비교적 소형 펩티드를 후술한 바와 같이 제조한 후, 한 쌍의 형광 염료로 표지화시키는데, 여기서 상기 형광 염료는펩티드에 적당히 결합되어 "공액결합"을 형성하는 경우, 이량체화 또는 적층화되어 양 형광단의 어떠한 형광도 소광시키는 특징을 갖는다. 이 염료 쌍은 반드시 형광 에너지 전이 공여체 및 수용체일 필요는 없다. 서로에 대해 충분히 근접한 거리로 소형 펩티드에 결합되는 경우, 상기 적층 특성을 보이는 염료 타입으로는 일반적으로 평면 방향족 구조를 갖는 염료들을 들 수 있다. 이러한 염료는 충분히 높은 농도(예, 10-2내지 10-4M)의 용액일 경우 동종 이합체 또는 이종 이합체를 형성할 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명에 유용하게 사용되는 형광발생 프로테아제 기질은 짧은 길이, 바람직하게는 100 Å 미만의 길이를 갖는 펩티드와 형광 염료 2분자의 화학 반응에 의해 제조될 수 있다. 프로테아제 기질은 시판되고 있다(예, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코에 소재한 GeneMed Biotechnologies 제품). 프로테아제 기질에 공유 결합하는 형광 염료는 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
형광발생 프로테아제 기질을 생성하는 데 유용한 본 발명의 대표적인 펩티드로는 상기 염료 기들이 이합체화하고 상기 펩티드가 효소 특이적인 분할가능 부위를 갖도록 약 2개 내지 약 10개의 아미노산, 바람직하게는 약 4개 내지 약 8개의 아미노산을 갖는 펩티드를 들 수 있다. 그러나, 기질의 분할과 동시에, 내부분자 이합체의 해리 결과, 형광 세기는 강화될 것이다.
본 발명에 유용한 기질은 하나 이상의 ARG-GLY 서열을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 기질은 각각의 말단 잔기에 형광 염료 기가 공유 결합된 서열 Val-Pro-Arg-Gly-Lys의 펩티드를 포함하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 유용한 형광발생 프로테아제 기질은 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 예컨대, 유럽 특허 출원 제EP 0 428,000호 참조.
펩티드를 반응시켜서 프로테아제 기질을 생성시키는 데 유용한 형광발생 염료로는 염료 적층을 진행하는 것을 들 수 있다. 일부 형광 염료[예, 플루오레신, 로다민, 시아닌, 붕소-헤테로고리 염료(예, 4,4-디플루오로-4-보레이타-3a-아조니아-4a-아자-s-인다센(BODIPY)) 등]는 서로 근접 위치하는 경우, 수용액 중에서 이합체를 형성하는 것으로 공지되어 있다.
플루오레신, 테트라메틸로다민(TMR), 로다민 B 및 텍사스 레드와 같은 플루오레신 부류의 평면 방향족 염료는 이러한 타입의 염료를 대표한다. 공명화 이합체 구조를 갖는 전이 쌍극자들간의 상호작용으로 인해, 상기 이합체의 형광 양자 수율은 펩티드를 분할시킬 수 있는 어떠한 효소도 존재하지 않는 경우 매우 낮아질 것이다. 효소에 의한 분할 후, 이합체가 해리되는 경우, 수용액 중에는 현저히 높은 형광 양자 수율이 관찰된다. 이러한 방식으로, 표지된 펩티드를 용액 상태로 두고 효소 분석물을 첨가하므로써, 효소가 펩티드를 분할하여 이합체화 감소를 야기하며 부수적으로 형광성이 증가하는, 동종 효소 분석법을 고안할 수 있다.
특이 효소 또는 효소 접촉 매체와 형광발생 기질을 접촉시킴으로써 효소 분할이 이루어진다.
본 발명에서 사용하기에 적당한 효소는 일반적으로 프로테아제로 분류되는 모든 효소, 즉 아스파르트산 프로테아제, 메탈로 프로테아제, 티올 프로테아제, 세린 프로테아제, 레트로바이러스성 프로테아제 및 트립신 프로테아제를 비롯한, 펩티드 결합을 접촉 가수분해시키는 단백질을 포함한다. 바람직한 효소로는 트롬빈 효소, 트립신형 효소 등과 같은 트립신 군의 원소들을 포함한다.
비록 많은 다른 타입의 형광발생 기질이 존재한다고는 하나, 그것의 작용 메카니즘은 세개의 주 카테고리, 즉 화학적 형광발생 기질, 물리학적 형광발생 기질 및 화학-물리학적 형광발생 기질로 분류할 수 있다.
본 발명의 생물학적 분석법은 위와 동일한 부류에 속한다. 그것은 ELISA 및 생물 발광 현상과 같은 분석 형식에서 보여지는 분리 단계를 요하지 않는다. 이는 최종 사용자 및 마찬가지로 판매자에게 약품, 노동력, 시간 및 장비 측면에서 더욱 효과적인 사용 방법을 제공한다. 전형적으로, 본 발명의 방법에 사용되는 형광단은 자외선 범위의 광선을 흡수한다. UV 감지 감수성이 유용하기는 하나, 자외선을 강하게 흡수하는 분자를 함유하는 생물학적 샘플에서는 UV 감지 감수성이 감소될 수 있다. 분할 시, 높은 신호 준위를 보이고 원 상태에서는 매우 낮은 잡음 수준을 보이며, 가시광선 범위에서 독점적으로 조작되는 형광발생 지시약을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명은 이들 잇점을 제공함과 동시에 펩티드 및 이에 부착된 형광단을 적절히 고안하고 선택함으로써 수개의 박테리아를 동시에 검사할 수 있다.
플루오레신, 테트라메틸로다민, X-로다민 및 로다민 B와 같은 로다민 군의 염료는 가시광선 파장 범위(400 내지 700 ㎚)에서 매우 높은 형광성 양자 수율(약 0.85)을 보인다. 따라서, 이들은 원격 감지 및 미량 물질 감지를 위한, 레이저 염료, 지시약, 생물학적 라벨로 종종 사용된다. 중요한 것은, 이들 염료가, 높은 농도(예, 약 10-2내지 약 10-4M)에서 근접 위치에 놓이는 경우 형광이 자체 소광되는 적층 이합체를 형성하는 것으로 공지되어 있다는 것이다. 많은 용도에 있어서, 이러한 현상은 바람직하지 않은 것으로 밝혀져 있다. 그러나, 이러한 현상을 유리하게 이용할 수도 있다. 만약 두개의 염료 분자가 짧은 펩티드(2내지 10개의 아미노산 잔기 함유)의 각 말단 잔기에서 부착된다면, 즉 표지되는 경우, 그 표지된 공액물은 자체 소광으로 인해 형광을 거의 보이지 않는다. 이는 국소 농도를 감소시키는 데 효과적이므로, 공액 물질을 전체 농도에 관계 없이 소광된 상태로 유지하게 된다. 효소에 의해 분할되는 경우, 두개의 라벨이 분리되어 고유 형광도가 높아진다. 그러므로, 효소 활성은 형광 세기의 순 증가에 직접적으로 관련될 수 있다. 만약 효소가 진핵 세포 또는 원핵 세포로부터 분비되는 경우, 형광 세기는 세포의 신진대사 활성에 관여할 수 있다. 하나의 효소 분자가 수백개의 기질 분자를 대사(turn over)시킬 수 있는 것은 증폭 프로세스로 인한 것이다. 증폭은 살아 있는 세포 배양액으로부터 얻은 효소를 사용하는 경우에 추가로 강화된다. 왜냐하면 세포가 성장함에 따라 더 많은 효소 분자가 생성되기 때문이다. 이 "이중 증폭" 현상은 형광 기법을 사용하여 커플링시키는 경우, 박테리아를 신속하고 민감하게, 그리고 특이적으로 감지하는 우수한 접근방법이다. 이러한 개념은 도 1에 설명되어 있다. (10)은 하나의 박테리아, 예를 들면 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus) 또는 비브리오 파라하몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus)를 나타낸다. 이들은 효소(12), 예를 들면 트립신 효소 또는 트립신형 효소를 생성한다. (12)는 두개의 소광된 형광성 염료 기인 N 및 C를 포함하는 펩티드 기질(18)(비형광성)을 접촉 반응에 의해 분할하여, 고도로 형광성이 있는 염료 기인 N' 및 C'를 포함하는 두개의 생성 단편(14') 및 (16')을 생성한다.
전술한 바와 같이, 형광발생 프로테아제 기질을 생성하는 데 유용한 대표적인 펩티드는 상기 염료 기들이 적층될 수 있도록, 그리고 상기 펩티드가 효소 특이적인 분할 부위를 갖도록 약 2개 내지 약 10개의 아미노산을 함유하는 펩티드를 들 수 있다. 많은 프로테아제가 존재하므로, 본 발명에 유용하게 사용할 수 있는 이와 동일한 수의 많은 펩티드가 존재한다. 구체적인 요건은 목적 펩티드가 프로테아제에 의해 공격을 받는 데 필요한 화학 결합을 가져야 한다는 것이다. 예를 들면, 후술하는 바와 같이, 트립신은 아르기닌 또는 리신 잔기의 카르복실 사이드 상에서 펩티드를 가수분해시키는 것으로 공지되어 있으므로, 이러한 성질을 갖는 어떠한 펩티드도 트립신 기질이 될 수 있다.
비브리오 파라하몰리티커스는 해산물 관련 독성을 야기하며, 비브리오 파라하몰리티커스의 동정용 마커로서 통용되는 트립신형 효소를 세포내에서 생성시키는 병원균이다. 그것은 구체적으로 아미노산 아르기닌 뒤의 펩티드 결합을 가수분해시킨다. 외부 막(OM)의 투과성을 증가시키는 시약을 사용함으로써 상기 효소는 형광발생 기질과 접촉할 수 있게 된다. 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)은 그램 음성 장내 세균의 외부막을 차단시킴으로써 이러한 목적에 통상 사용된다. 이는 킬레이트화에 의해, 리포폴리사카라이드(LPS) 내 그것의 결합 부위로부터 안정화용 2가 양이온을 제거한다. 그 결과, 세포로부터 상당량의 LPS를 방출시킨다. 이같은 LPS의 소실로 인해 OM의 외부 소편 내에 인지질이 출현하게 된다. 이는 이후 소수성 화합물이 확산할 수 있는 통로로 작용하게 된다. 특정의 조건 하에서, OM은 파괴되어 거대분자를 투과시킬 수 있다. 문헌[Vaara, M. Agents that increase the permeability of the outer membrane; Microbiol. Reviews 1992, 56, 395-411] 참조.
트립신은 그것의 인접 잔기와 무관하게, 양 전하를 띤 Arg 잔기 뒤의 임의의 펩티드 결합을 분할하는 강력한 효소이다. 그러나, 동일한 군에 속하는 다른의 효소(예, 트롬빈)는 주변 잔기에 좌우되며, 그 주변 잔기의 특성에 따라 효소가 특이성을 띄게 된다.
이러한 개념을 증명하기 위해, 트립신 및 트립신형 효소를 도 1에서 모델로 사용하였다. 트립신은 장관에서 나오는 고도로 특이적인 단백질 분해 효소로서, 공지된 가장 강력한 효소에 속한다. 이는 아르기닌 또는 리신 잔기의 카르복실 측에 존재하는 펩티드 결합을 가수분해한다. 이러한 트립신의 성질은 잘 알려져 있다. 본 발명의 개념을 정립하기 위해, 하기 서열을 고안하였다:
(N-말단) Val-Pro-Arg-Gly-Lys(C-말단) 서열 1
상기 서열 중, 유리 아민은 발린(N-말단) 상에 존재하며 유리 카르복실산은 리신(N-말단) 상에 존재한다.
두개의 잔기(굵은 글자체)간의 아미드 결합이 트립신 분할 부위이다. 측방에 존재하는 잔기의 역할은 염료 부착 시, 입체 장애를 감소시키는 것이다. Val 및 Lys 상의 아미노 기는 염료 기와의 반응에 사용된다. C-말단 내의 카르복실 기는 경우에 따라 고체 지지체에 부착하는 데 이용될 수 있다.
본 발명은 프로테아제 기질을 사용하는 상업적인 접근법과는 작업 메카니즘 및 감수성 모두에서 본질적으로 다르다. 본 발명은 프로테아제 기질을 사용하여 형광성이 단지 2배만 증가한 종래의 시판용 분석 키트에 비해 적어도 10배, 20배 또는 30배 또는 그 이상으로 형광성이 증가한다는 것이 밝혀졌다.
신속하고 감수성이 우수한 테스트를 위해서는, 신호 대 잡음비를 최대화하는 것이 중요하다. 가장 전형적인 형광발생 기질은, 대부분의 박테리아 성장 매체가 뚜렷하게 자가 형광하는 원자외선 파장 영역(350∼450 nm)에서 방출한다. 예를 들면, 스태필로코커스 오레우스에 대한 배양 배지는 360 ㎚에서 여기되는 경우, 425 ㎚ 및 475 ㎚에서 두개의 뚜렷한 최대 방출값을 갖는다. 이러한 문제를 피하기 위해, 통상 높은 기질 농도를 사용한다. 이는 분석 단가를 높게 하고 생물에 대한 독성을 더 높이며, 때로는 기질을 침전시킨다. 본 발명은 감지 파장을 가시광선 스펙트럼(테트라메틸로다민: λab= 550 ㎚, λem= 580 ㎚)으로 적색 이동시킴으로써 자가 형광 간섭 현상의 난점을 해소하였다. 또한, 본 발명에 기재된 개념은 방출 복사선이 더 긴 파장으로 적색 이동되는 기타의 염료에 적용될 수 있다. 전형적으로 유용한 염료는 높은 소멸 계수(＞ 80,000 ㎝-1M-1), 높은 양자 수율(＞ 수용액 중에서 0.85), 용매 및 pH에 대해 감응하지 않는 스펙트럼, 우수한 수용해도, 광안정성 및 높은 이합체화 상수와 같은 특성을 가질 수 있다.
본 발명은 미생물의 감지 및 동정, 안정성 확인, 의약적 발견, 효소 분석 및 면역 검정시에 사용되는 것으로 밝혀졌으나, 이것에 국한하는 것은 아니다. 또한, HIV 프로테아제 활성에 대한 형광발생 기질은 AIDS 치료법에 유용한 항바이러스성 시약의 테스트 물질로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 목적 및 잇점은 다음 실시예에서 추가로 설명하였다. 그러나, 이들 실시예에 인용된 특정한 물질 및 이들의 양뿐아니라 기타의 조건 및 세부 사항에 의해 본 발명을 부당하게 제한하는 것은 아니다.
발명의 개요
간략하게, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 생물학적 분석법을 제공한다:
두개 이상의 형광 염료 기가 하나 이상의 효소 분할성 결합을 포함하는 펩티드에 결합되어 있는 효소 기질을 준비하는 단계[상기 염료 기들은 염료 기의 형광을 실질적으로 자체 소광시키기에 충분히 근접 위치하며, 상기 염료 기 형광의 자체 소광은 염료 적층, 바람직하게는 염료 이합체화에 의해 일어남], 및
하나 이상의 효소 분할성 결합을 효소 분할시킴으로써 염료 이합체화 및 염료 적층에 의해 형성된 형광 염료 기를 방출시켜서 형광 세기를 증가시키는 단계.
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 두개의 형광 염료 기를 함유하는 펩티드를 포함하는 프로테아제 기질을 제공하는데, 상기 염료 기들은 내부분자 이합체 형성에 의해 염료 기의 형광을 실질적으로 소광시키기에 충분히 근접 위치한다.
두개 이상의 형광 기는 프로테아제 기질의 펩티드에 결합할 수 있으며 내부분자 소광에 참여할 수 있음을 인식할 수 있다.
본 발명에서는 하기 (a) 및 (b) 단계들을 포함하여 특징적인 효소를 생성하는 미생물의 감지 방법을 제공한다:
(a) 두개 이상의 형광 염료 기가 특징적인 효소에 의해 분할 가능한 하나 이상의 결합을 포함하는 펩티드에 결합되어 있는, 상기 특징적인 효소에 특이적인 효소 기질을 준비하는 단계[상기 염료 기들은 염료 기의 형광을 실질적으로 자체 소광시키기에 충분히 근접 위치하며, 상기 염료 기 형광의 자체 소광은 염료 적층에 의해 일어남], 및
(b) 상기 특징적인 효소에 의해 하나 이상의 상기 분할성 펩티드 결합을 분할시킴으로써 염료 이합체화에 의해 형성된 형광 염료 기를 방출시켜서 형광 세기를 증가시키는 단계.
기질은 형광 염료(예, 테트라메틸로다민) 두분자를 갖는 짧은 펩티드를 포함하는 것이 바람직하다. 이 펩티드는 효소에 대한 친화도 및 특이성을 제공한다. 가수분해 전, 염료 분자들은 근접하고 있기 때문에 내부 분자 이합체를 형성하여, 그 결과, 상당량의 형광이 소광된다. 특이적인 펩티드 결합의 효소적 가수분해는 염료 기들을 서로 해리시키기 때문에 형광 세기를 현저히 증가시킨다. 형광도는 96 웰 플레이트 판독기 또는 유동 세포계산기 내에서 형광 현미경에 의해 UV 조명 하에서 용이하게 관찰될 수 있다. 형광 복사선은 가시광선 스펙트럼에서 방출되는 것이 바람직하다. 형광발생 기질은 균질한데, 이는 기타의 다른 현상제를 필요로 하지 않기 때문이다. 이는 주 분리 매체를 사용하여 미생물의 감지 및 동정을 수행하게 할 수 있으므로 중요하다. 따라서, 동정 전, 시간 소모적인 분리 과정을 없애준다.
본 명세서에서,
"염료 이합체화"란 두개의 염료 기들 사이에 착물이 형성되는 것을 의미한다.
"염료 적층"이란 두개 이상의 염료 기들 사이에 착물이 형성되는 것을 의미한다.
"형광성"이란 상이한 파장의 광선을 흡수시킴에 따라 물질이 주어진 파장에서 광선을 방출하는 것을 의미한다. 여기서, 광선 방출은 광선 흡수 시에만 일어난다.
"몰 흡광도"란 광선 경로 1 ㎝ 길이 당 1몰 농도에 대한 흡광도로서 계산되는, 광선 흡수종들의 상대적인 흡광도를 의미한다.
"형광 양자 수율"이란 방출 물질에 의해 방출되는 형광 광자의 수 대 상기 물질이 흡수한 광자의 총 수의 비를 의미한다.
"형광단"이란 상이한(대개는 더 짧은) 파장의 광선을 흡수시키는 것에 의해 자극하는 경우, 주어진 파장에서 광선을 방출하는 분자를 의미한다.
본 발명은 미생물을 감지하고 동정하는 종래의 방법에 비해 잇점이 있다. 이는 빠르고 간편한 동종의 방법을 제공하는데, 이는 세포외 및 세포내 효소 활성을 측정하기 위하여 색소발생 기질 및 형광발생 기질을 사용한다. 본 발명의 방법 및 기질은 정확성이 개선되었고, 더 빠르게 감지할 수 있으며, 미생물의 감지 및 동정 에 드는 총 비용을 낮출 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 분할 시 높은 신호 준위를 보여 주고 원 상태에서는 매우 낮은 잡음 수준을 보여 주며, 가시 광선 영역에서 독점적으로 작용하는 형광발생 지시약을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 펩티드 및 이에 부착된 형광단을 적절히 고안하고 선택함으로써 수개의 박테리아를 동시에 검사할 수 있다.
다음 실시예에서,
Val 또는 V = 발린,
Pro 또는 P = 프롤린,
Arg 또는 R = 아르기닌,
Gly 또는 G = 글리신,
Lys 또는 K = 리신,
TMR = 테트라메틸로다민 또는 테트라에틸로다민 부이다.
실시예 1. 형광발생 프로테아제 기질의 제조
Val-Pro-Arg-Gly-Lys는 미국 캘리포니아주 싸우스 샌프란시스코에 소재한 젠메드 바이오테크놀로지스(GeneMed Biotechnologies)에서 합성하였으며, 이들을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 상에서 정제하였다. 그것의 화학적 성질을 패스트 아톰 봄바르드먼트(Fast Atom Bombardment(FAB))의 질량 분광법 및 아미노산 분석법으로 확인하였다. 그 펩티드를 하룻밤동안 0.1 M 중탄산나트륨 용액(pH 8.3) 중의 테트라메틸로다민 숙시미딜 에스테르와 반응시켰다. 반응 혼합물을 역상 HPLC(C-18 컬럼, 입자 크기 15 ㎛, 미국 매사츄세츠주 밀포드에 소재한 워터스 코포레이션(Waters Corp.) 제품) 상에서 정제하였다. 화학 반응성 염료는 모두 미국 오리건주 유진에 소재한 몰리큘라 프로브스 인코포레이티드(Molecular Probes, Inc.)에서 구입하였다. 염료 펩티드 공액 물질은 하기 화학식 I로 표시되는 바와 같이 TMR-Val-Pro-Arg-Gly-Lys-TMR(도 2에서는 T-VPRGK-T로 표시됨)의 화학 구조를 갖는다. 아세토니트릴(ACN) 수용액의 복합 구배를 사용하여 이 공액 물질을 정제하였다. 전형적인 용출법으로, 아세토니트릴 함량을 초기 15분간 15%에서 30%로 증가시켰다. 이후, 30% ACN에서 10 분간 등용매 용출시키고, 50%로 5 분간 구배시킨 후, 50% ACN에서 5 분간 등용매 용출시켰다. 모든 용매는 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하였다. 정제된 공액물질의 분자량은 FAB 질량 분광법을 사용하여 정하였는데, C74H85N13O14의 원소 조성에 기초한 계산된 분자량은 1379였다. 이하에 도시한 이같이 이중 표지된 공액 물질은 대응하는 단일 표지된 것에 비해 실질적으로 낮은 형광성을 보였다.
실시예 2. 정제된 효소에 의한 형광발생 프로테아제 기질의 가수분해
실시예 1에서 얻은 기질의 효소적 가수분해를 실온에서 50 mM 탄산염 완충액(pH 8.9) 중에 수행하였다. 트립신으로 처리하기 전과 후의 용액의 형광 세기를 표 1에 수록하였다. 여기 파장은 각각 360 ㎚, 522 ㎚, 530 ㎚ 및 553 ㎚이었다. 형광 세기의 증가외에, 도 2에 도시한 바와 같이 흡광 스펙트럼의 변화도 관찰되었다. 원래 상태인 경우, 공액 물질은 550 ㎚에서 쇼울더(shoulder)를 가지면서 520 ㎚에서 최대 흡광도를 보였다(궤적 A). 이는 전술한 바와 같은 염료 이합체화 및 염료 적층상의 특징이다. 분할로 인해 두 피크의 상대 흡광도가 역전되어, 수용액 중의 유리 테트라메틸 로다민의 스펙트럼으로 복귀하였다(궤적 B). 형광도 및 흡광도 결과 모두 공액 물질에서의 염료 분자들간에는 바닥 상태의 상호작용이 존재하며 이 작용은 효소 분할 후 감소된다는 것을 입증하였다.
방출 파장(㎚) 360 ㎚에서 여기 522 ㎚에서 여기 530 ㎚에서 여기 553 ㎚에서 여기
w/o 트립신 w/ 트립신 비 w/o 트립신 w/ 트립신 비 w/o 트립신 w/ 트립신 비 w/o 트립신 w/ 트립신 비
570 319 8625 27 1378 40193 29 1687 46615 28 3301 82385 25
571 347 8817 25 1525 41416 27 1718 48314 28 3402 85120 25
572 369 9322 25 1480 42506 29 1819 49955 27 3457 87845 25
573 365 9189 25 1509 43406 29 1844 50871 28 3658 89719 25
574 354 9629 27 1645 44241 27 1904 52163 27 3649 91555 25
575 410 9719 24 1643 45037 27 1895 52681 28 3802 93001 24
576 401 9759 24 1587 45519 29 1968 52855 27 3827 94046 25
577 378 9776 26 1672 45648 27 1939 53752 28 3816 94816 25
578 379 9981 26 1629 45980 28 1970 53611 27 3806 94516 25
579 392 9872 25 1673 45745 27 2026 53534 26 3962 94662 24
580 361 9788 27 1595 45757 29 1973 53414 27 3695 93715 25
581 375 9960 27 1665 44936 27 1985 53190 27 3825 93189 24
582 376 9783 26 1567 44724 29 1948 52569 27 3736 92281 25
583 347 9591 28 1599 44076 28 1926 51719 27 3724 91125 24
584 385 9387 24 1601 43282 27 1905 50705 27 3593 89415 25
585 353 9427 27 1527 42928 28 1820 49629 27 3449 87910 25
평균 26 28 27 25
표 1의 데이타는 여기 주파수의 광범위한 스펙트럼에 있어서, 분할된 기질 용액의 형광 세기는 원 기질 용액의 형광 세기의 29배라는 것을 보여준다. 육안으로 쉽게 볼 수 있는 범위인 570 내지 585 ㎚의 방출 파장에 있어서, 평균적으로 상기 세기의 25 내지 28배였다.
실시예 3. 비브리오 파라하몰리티커스를 감지하는 데 형광발생 프로테아제 기질을 사용하는 방법
이들 실험에 사용된 비브리오 파라하몰리티커스는 벡톤 디킨슨 마이크로바이올로지 시스템(Becton Dickinson Microbiology Systems)(미국 미드랜드 콕키스빌 소재)의 트랜스포트 스왑 시스템(Transport Swab System)에 사용되는 고급 대조군 균주이다. 이것을 미국 모식균 배양 수집소(ATCC 기탁번호 제49398호)에서 구입하였다. 세포들을 3% 염화나트륨을 함유하는 영양 브로쓰 내에서 37℃에서 성장시켰다. 하룻밤의 배양물 10 ㎖를 원심분리하였다. 브로쓰를 처리하고 이중 표지된 상기 화학식 I의 공액물 50 ㎕를 함유하는 1000 배 희석한 분석 완충액(1 mM EDTA, 50 mM 인산염 완충액, pH 7.2) 3 ㎖를 첨가하였다. 확실히 완전 분할되도록, 반응 혼합물을 하룻밤동안 항온시켰다. 세포를 함유하거나 또는 함유하지 않는 크벳의 형광 세기를 각각 측정하였다(궤적 C 및 D). 얻어진 스펙트럼을 도 3에 도시하였다.
트립신형 효소에 의한 분할은 형광성을 증가시킨다. 이 분석법은 간단한 형광 측정계를 사용하여 감지할 수 있을뿐아니라 트립신 도입 후 단지 수초 내에 육안으로 감지되었다.
본 발명의 다양한 변형 및 수정은 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않는 한 당업자에게는 자명한 것이다. 이는 본 명세서에 기재된 예시적인 실시태양으로 부당하게 제한하지 않는 것으로 이해하여야 한다.

Claims (12)

  1. 하기 (a) 내지 (b) 단계를 포함하는 것이 특징인 생물학적 분석 방법:
    (a) 두개 이상의 형광 염료 기가 하나 이상의 효소 분할성 결합을 포함하는 펩티드에 결합되어 있는 효소 기질을 준비하는 단계[상기 염료 기들은 염료 기 형광을 실질적으로 자체 소광시키기에 충분히 근접 위치하며, 상기 염료 기 형광의 자체 소광은 염료 적층에 의해 일어남], 및
    (b) 상기 펩티드의 하나 이상의 효소 분할성 결합을 효소적으로 분할시킴으로써 염료 적층에 의해 형성된 형광 염료 기를 방출시켜서 형광 세기를 증가시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 염료 기들은 동일한 것이 특징인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 염료 기들은 형광 공여체 및 형광 수용체를 포함하는 것이 특징인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 염료 기들은 서로 100 Å 미만의 거리로 이격되어 있는 것이 특징인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 방출된 형광 염료 기들은 가시광선 범위의 복사선을 방출하는 것이 특징인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 형광 염료 기들은 평면 배열을 갖는 것이 특징인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 염료 기들은 플루오레신, 로다민 및 시아닌 염료 기들로 이루어지는 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 펩티드는 약 2개 내지 약 10개의 아미노산을 포함하며, 상기 펩티드에 결합된 상기 염료 기는 염료 적층물을 형성하고, 상기 펩티드는 효소 특이적인 분할성 결합을 하나 이상 갖는 것이 특징인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    상기 효소 분할에 관련된 상기 효소는 아스파르트산 프로테아제, 메탈로 프로테아제, 티올 프로테아제, 세린 프로테아제, 레트로바이러스성 프로테아제 및 트립신 프로테아제로 이루어지는 군에서 선택된 것이 특징인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 의한 방법에 사용되는 프로테아제 기질로서, 상기 프로테아제 기질은 펩티드를 포함하며 두개의 형광 염료 기를 포함하고, 상기 염료 기들은 분자내 적층에 의해 염료 기의 형광성을 실질적으로 자체 소광시키기에 충분히 근접하고 있는 것이 특징인 프로테아제 기질.
  11. 제10항에 있어서,
    식 TMR-Val-Pro-Arg-Gly-Lys-TMR을 갖는 것이 특징인 프로테아제 기질.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 의한 방법에 의해 효소 분석을 수행하는 것이 특징인 미생물의 감지 방법.
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