DE69737977T2

DE69737977T2 - Fluorogene protease-substrate basierend auf farbstoffdimerisierung

Info

Publication number: DE69737977T2
Application number: DE69737977T
Authority: DE
Inventors: Ai-Ping Saint-Paul WEI; Michael G. Saint Paul WILLIAMS
Original assignee: Minnesota Mining and Manufacturing Co
Current assignee: 3M Co
Priority date: 1997-05-01
Filing date: 1997-09-08
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2017-09-09
Also published as: US7256012B2; CN1254383A; AU4355097A; JP4065931B2; EP0980440B1; JP2002506343A; US20050089946A1; KR100487715B1; US6787329B1; DE69737977D1; EP0980440A1; KR20010020359A; WO1998050579A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verwendung von Proteasesubstraten, die nach einer Enzymhydrolyse hoch fluoreszierend werden. Die Erfindung findet Anwendung bei Nachweis und Identifizierung von Mikroorganismen, Sicherung der Sterilität, pharmazeutischen Entdeckungen, Enzymassays, Immunassays und anderen biologischen Prüfungen.
Allgemeiner Stand der Technik
Proteasen stellen eine Enzymklasse dar, die katalytisch Peptidbindungen hydrolisieren. Ihre chemische Primärsequenz und ihre einmalige dreidimensionale Struktur bestimmen ihre Aktivität und Spezifität. In Abhängigkeit von der Zusammensetzung am aktiven Zentrum werden Proteasen in Hauptgruppen unterteilt, zu denen Asparagin-, Metallo-, Thiol- und Serinproteasen gehören. Die Rolle von Proteasen in physiologischen Prozessen ist weitestgehend anerkannt. Sie sind nicht nur an Funktionen, wie Verdauung, Blutgerinnung und Fibrinolyse beteiligt (Lottenberg, R.; Christensen, U.; Jackson, C.M.; Coleman, P.L.; Assay of Coagulation Proteases Using Peptide Chromogenic and Fluorogenic Substrates; Methods in Enzymology 1981, 80, 341-361), sondern auch an Ovulation, Tumorigenität, Immunreaktion sowie Virus- und Bakterieninfektionen usw. (Livingston, D.C.; Brocklehurst, J.R.; Cannon, J.F.; Leytus, S.P., Wehrly, J.A., Peltz, S.W., Peltz, G.A.; Mangel, W.F.; Synthesis and characterization of a new fluorogenic active-site titrant of serine protease; Biochem. 1981, 20, 4298-4306). Beispielsweise ist bekannt, dass Retroviren, wie HIV, eine Protease kodieren, die als Prozessvorläuferproteine an spezifischen Spaltstellen dienen. Diese Spaltungen treten während der Virionzusammensetzung auf und sind für die Reifung der infektiösen Viruspartikel erforderlich. Demzufolge wurde die Hemmung dieser Proteasen ein wichtiges Ziel bei der Entwicklung von antiviralen Mitteln, einschließlich solcher gegen AIDS.
Ferner nimmt das Bewusstsein in der Öffentlichkeit bezüglich resistenter Bakterienstämme und über Lebensmittel verbreiteter Krankheiten zu. Die Beherrschung mikrobieller Risiken im Gesundheitswesen, der Kosmetik-, Nahrungsmittel- und Getränkeindustrie ist ein wichtiges Thema für Gesundheit und Sicherheit. Die Prüfung auf Bakterien ist fester Bestandteil der Beherrschung mikrobieller Risiken. Die Fähigkeit vieler Bakterien, Proteasen zu produzieren, ist ein weithin verwendetes Kriterium für die Identifizierung und Charakterisierung bestimmter pathogener Arten.
Empfindliche und quantitative Enzymassays sind für die Entdeckung und das Verständnis der biologischen Funktionen von Proteasen, die Diagnose physiologischer Störungen und die Entwicklung therapeutischer Arzneimittel erforderlich. Zur Bestimmung der Proteaseaktivitäten werden eine Vielfalt von Techniken verwendet, darunter enzymgekoppelte Immunadsorptionsassays (ELISA), Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), Proteinimmunoblot-Analyse und Dünnschicht-Elektrophoreseanalyse. Diese Verfahren verlangen jedoch in der Regel mehrere Schritte und mehrere Reagenzien und ihre Ausführung ist langsam und teuer. Sie sind gelegentlich für Anwendungen, wie das Hochleistungs-Screening von pharmazeutischen Stoffe, z. B. Proteasehemmern, nicht praktisch.
Fluorogene Substrate sind Moleküle, die nach einer Enzymhydrolyse von einem nicht fluoreszierenden in einen hoch fluoreszierenden Zustand übergehen. Sie finden in Studien und Untersuchungen viraler und bakterieller Proteasen, Nukleasen, Saccharidasen, Phosphatasen und Kinasen weit verbreitet als Molekülsonden Anwendung (Manafi, M.; Kneifel, W.; Bascomb, S.; Fluorogenic and Chromogenic Substrates used in Bacte rial Diagnostics; Microbiological Reviews 1991, 55, 335-348). Die Fluoreszenz kann ohne weiteres unter UV-Beleuchtung in einem Fluoreszenzmikroskop, in einem 96-Well-Mikrotiterplatten-Lesegrät oder in einem Durchflusszytometer beobachtet werden.
Mehrere fluorogene Proteasesubstrate sind im Handel erhältlich. Zu Beispielen gehören EnzCheck^TM-Kits (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), für die hoch löschende Kaseinsubstrate mit 4,4-Difluor-4-borat-3a-azonia-4a-aza-s-indacen-Fluorophoren (BODIPY) verwendet werden. Nach der Spaltung werden fluoreszierende BODIPY-Peptide freigesetzt. In der Regel wird bei Trypsinkonzentrationen von bis zu 500 ng/ml ein zweifacher Anstieg der Fluoreszenzintensität bei 530 nm beobachtet. Es ist ein fluorogenes Substrat für HIV-Protease erhältlich (Molecular Probes, Inc.), das die Spaltstelle der HIV-Protease und auf einer Seite davon das Fluorophor 5-((2-Aminoethyl)amino)naphthalin-1-sulfonsäure (EDANS) und auf der anderen Seite davon das Akzeptorchromophor 4-(5-Dimethylaminophenyl)azobenzolsulfonsäure (DABCYL) enthält. Wie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 428,000 beschrieben, wird die EDANS-Fluoreszenz mittels intramolekularem Resonanzenergietransfer durch das DABCYL-Chromophor gelöscht, ein Verfahren, das verlangt, dass der Donor und der Akzeptor auf der Peptidkette nicht mehr als 100 Ångström voneinander entfernt sind. Das Fluorophor wird durch Strahlung mit 340 nm angeregt und fluoresziert bei 490 nm, was durch die Extinktion oder die Fluoreszenz des Mediums der Bakterienkultur verdeckt werden kann.
US-Patent Nr. 4,314,936 beschreibt ein Enzymassaysubstrat, das eine ununterbrochene Peptidkette umfasst, an die an einen Teil des Peptids eine fluoreszierende Gruppe gebunden ist und eine Fluoreszenz löschende Gruppe an einen anderen Teil. Die Spaltung der Kette an einem Punkt zwischen diesen beiden setzt als Nachweis und zur quantitativen Bestimmung das Fluorophor frei.
Für bestimmte Enzyme werden bestimmte Aminosäuresequenzen hergestellt. Zu Fluorophoren gehören eosinyl-, rhodaminyl- und fluroesceinylartige Farbstoffe sowie Gruppen vom EDANS-Typ. Zu Löschspezies (die keine Farbstoffe oder Fluorophore sind) gehören nitrosierte aromatische Verbindungen, wie Nitrophenyl, Nitrobenzyloxycarbonyl, Nitrobenzoyl usw.
PCT-Patentanmeldung Nr. WO 95/03429 beschreibt eine Immunassay-Prozedur, wobei ein fluorogener Tracer ein kurzes, ein Antigen imitierendes Peptid umfasst, welches mit sowohl einem fluoreszierenden Energietransferdonor als auch einem fluoreszierenden Energieakzeptor markiert ist. Frei in Lösung zeigt der Tracer aufgrund der intramolekularen Dimerisierung von Farbstoff (Löschung) sehr geringe Fluoreszenz; an einen Antikörper des nativen Antigens gebunden kommt es aufgrund der Dissoziation des molekularen Dimers, die durch Konformationsänderungen im Tracer-Peptid verursacht wird, zu einem wesentlichen Anstieg der Fluoreszenz. Zu repräsentativen Farbstoffen mit Fluoreszenzenergie, die intramolekulare Dimere bilden, gehört die Fluorescein-Familie, wie Fluorescein, Tetramethylrhodamin, Rhodamin B und Texas Red. Demzufolge beschreibt die Anwendung eine Fluoreszenzverstärkung nach Bindung anstatt Fluoreszenz nach Spaltung und die Fluoreszenzlöschung beruht auf einer Kombination aus Energietransfer und Dimerisierung von Farbstoffen.
US-Patent Nr. 4,822,746 und 5,254,477 beschreiben quantitative und qualitative Analysen von Analyten, die auf der Wechselwirkung eines Fluorophors mit einer chromophoren Licht absorbierenden Verbindung oder mit einem zweiten (Licht absorbierenden) Fluorophor beruhen. Die Löschung findet über den Transfer von sowohl strahlender als auch nicht strahlender Energie durch das Fluorophor im angeregten Zustand statt anstatt durch Dimerisierung von Farbstoffen. Auf diese Weise lässt sich mit dem Verfahren gemäß '746 nur ein 10- 20%iger Anstieg der Fluoreszenz in Gegenwart eines Analyten erreichen.
US-Patent Nr. 5,605,809 beschreibt Peptide, die zum Nachweis von Proteasen nützlich sind, wobei die Peptide ein Fluorophor aufweisen, das an jedes Ende konjugiert und derart gefaltet ist, dass die Fluorophore Löschung mittels intramolekularem Energietransfer zeigen. Beim Spalten durch eine Zielprotease werden die Fluorophore im engen Abstand freigesetzt und das entstandene Signal wird nachgewiesen und quantifiziert. 2A und 2B von '809 zeigen, dass beim Spalten des Substrats höchstens ein 9-facher Anstieg der Fluoreszenz beobachtet wird. Eine große Anzahl Peptide mit einer Länge im Größenbereich von 2 bis etwa 8, vorzugsweise 2 bis etwa 6 Aminosäuren, ist beschrieben. Die Fluoreszenzindikatoren absorbieren und emittieren Licht im sichtbaren Bereich (400-700 nm).
GB-A-2278356 betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptidsubstrats, insbesondere eines Substrats mit Förster-Energietransfer (FREI) mit einer Donorspezies und einer Akzeptorspezies auf gegenüberliegenden Seiten einer proteolytischen Spaltstelle, und wobei die Donorspezies und/oder die Akzeptorspezies über die Seitenkette(n) der Aminosäure(n) darin gebunden sind, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen einer reaktiven Donorspezies oder Akzeptorspezies mit einem Polypeptidsubstrat umfasst, wobei die Seitenkette(n) der Aminosäure(n) darin für die Reaktion mit der reaktiven Spezies angepasst sind, und wonach das derart erhaltene Substrat mit einer entsprechenden reaktiven Donorspezies oder Akzeptorspezies in Kontakt gebracht wird. Die derart hergestellten Substrate können in Assays zur Identifizierung von Modulatoren der Proteaseaktivität verwendet werden.
Fluoreszenzfarblöschung findet normalerweise über eine Reihe von Mechanismen statt, darunter Energietransfer und Dimerisierung von Farbstoffen. In beiden Fällen wird, wenn ein Molekül, das einen Donor und einen Akzeptor von Fluoreszenzfarbstoffen umfasst (wobei der Akzeptor ein Fluoreszenzfarbstoff sein kann oder nicht), die über eine Kette X verbunden sind, durch Energiezufuhr, üblicherweise durch Bestrahlen mit Licht einer bestimmten Wellenlänge, angeregt wird, Energie von dem Donorfarbstoff auf den Akzeptorfarbstoff übertragen anstatt durch Fluoreszenz abgeleitet zu werden. Der Energietransfer, auch als Dipol-Dipol-Wechselwirkung nach Förster bezeichnet, findet im Allgemeinen über einen größeren Abstand zwischen Donor und Akzeptor statt (in der Größenordnung von 100 Ångström). Siehe beispielsweise L. Stryer et al., Energy Transfer: Spectroscopic Ruler; Biochemistry, 1967, 58, 719-726. Die Dimerisierung von Farbstoffen oder die Bildung von Farbstapelstrukturen wiederum tritt auf, wenn zwei oder mehr Fluoreszenzmoleküle einen Abstand zueinander haben, der eng genug ist, dass eine Wechselwirkung zwischen den planaren aromatischen Ringen unter Bildung von Aggregaten, wie Dimeren und Trimeren, möglich ist. Die Extinktionsspektren der Farbstoffe im Dimer- oder Stapelzustand unterscheiden sich wesentlich von denjenigen desselben Farbstoffs als Energietransferpaar. Absorptionsspektren von Farbstoffdimeren zeigen mit zunehmender Konzentration des Farbstoffs einen charakteristischen Abfall der wichtigsten Absorptionspeaks und gleichzeitig einen charakteristischen Anstieg des Schulterpeaks. Dieses Phänomen wird gewöhnlich als "Bandenaufspaltung" bezeichnet. Siehe beispielsweise K. K. Rohatgi und G. S. Singhal, J. Phys. Chem., 1966, 70, 1695-1701. Siehe auch 2 (infra). Konzentrationsanstiege können entweder durch die Erhöhung der Farbstoffmenge pro Volumeneinheit oder durch physikalisches Anbringen von zwei (oder mehr) Farbstoffmolekülen eng beieinander auf einem Linker-Molekül, wie einem Peptid oder einem anderen kleinen Molekül, erreicht werden. Die Dimerisierung oder Stapelung findet über die Bildung von Grundzustandkomplexen statt (d. h. durch engen direkten Kontakt), wohingegen Energietransfer-Wechselwirkungen im Raum auftreten. Aus diesem Grund werden diese Spektralveränderungen nicht bei Farbstoffen beobachtet, deren Wechselwirkungen auf Energietransfermechanismen beruhen.
Kurzdarstellung der Erfindung
Kurz gesagt, stellt diese Erfindung ein Verfahren für biologische Assays bereit, umfassend die Schritte:
Bereitstellen eines Enzymsubstrats, umfassend zwei oder mehr Fluoreszenzfarbgruppen, die an ein Peptid gebunden sind, welches Val-Pro-Arg-Gly-Lys umfasst und eine oder mehrere enzymatisch spaltbare Bindungen aufweist, wobei die Farbgruppen einen Abstand aufweisen, der eng genug ist, um die Fluoreszenz der Farbgruppen im Wesentlichen selbst zu löschen, wobei die Selbstlöschung der Fluoreszenz der Farbgruppen durch die Bildung von Farbstapelstrukturen (Dye Stacking) bewirkt wird, und
enzymatisches Spalten eines oder mehrerer der enzymatisch spaltbaren Bindungen zur Freisetzung der Fluoreszenzfarbgruppen aus der Dimerisierung von Farbstoffen oder den Farbstapelstrukturen, was zu Anstieg der Fluoreszenzintensität führt.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt diese Erfindung ein Proteasesubstrat bereit, das ein Peptid Val-Pro-Arg-Gly-Lys umfasst und zwei oder mehr Fluoreszenzfarbgruppen aufweist, wobei die Farbgruppen einen Abstand aufweisen, der eng genug ist, um die Fluoreszenz der Farbgruppen durch intramolekulare Dimerbildung im Wesentlichen zu löschen.
Es ist offensichtlich, dass mehr als zwei Fluoreszenzgruppen an das Peptid des Proteasesubstrats gebunden sein können und an der intramolekularen Löschung beteiligt sein können.
Das Substrat umfasst vorzugsweise ein kurzes Peptid Val-Pro-Arg-Gly-Lys mit zwei Molekülen eines Fluoreszenzfarbstoffs (z. B. Tetramethylrhodamin). Das Peptid stellt die Affinität und Spezifität für das Enzym bereit. Vor der Hydrolyse bilden die Farbmoleküle aufgrund des engen Abstands ein intermolekulares Dimer, was zu einer wesentlichen Fluoreszenzlöschung führt. Die Enzymhydrolyse einer bestimmten Peptidbindung erzeugt einen wesentlichen Anstieg der Fluoreszenzintensität, da die Farbgruppen voneinander dissoziieren. Die Fluoreszenz kann ohne weiteres unter UV-Beleuchtung in einem Fluoreszenzmikroskop, in einem 96-Well-Mikrotiterplatten-Lesegerät oder in einem Durchflusszytometer beobachtet werden. Vorzugsweise wird die Fluoreszenzstrahlung im sichtbaren Spektrum emittiert. Fluorogene Substrate sind homogen, da keine anderen Entwicklungsreagenzien erforderlich sind. Das ist deswegen wichtig, weil dies die Durchführung von Nachweis und Identifizierung der Mikroorganismen unter Verwendung des primären Isoliermediums zulässt, wobei die ansonsten erforderlichen zeitaufwändigen Isolierprozeduren vor der Identifizierung vermieden werden.
In dieser Anmeldung:
bedeutet "Dimerisierung von Farbstoffen" die Bildung eines Komplexes zwischen zwei Farbgruppen;
bedeutet "Farbstapelstrukturen" die Bildung eines Komplexes zwischen zwei oder mehr Farbgruppen;
bedeutet "Fluoreszenz" die Emission von Licht einer bestimmten Wellenlänge durch einen Stoff nach Absorption von Licht einer anderen Wellenlänge, wobei die Lichtemission nur während der Lichtabsorption stattfindet;
bedeutet "molarer Extinktionskoeffizient" die relative Lichtabsorption einer Licht absorbierenden Spezies, ermittelt als die Extinktion pro molar Konzentration pro 1 cm Weglänge des Lichts;
bedeutet "Fluoreszenzquantenausbeute" das Verhältnis der Anzahl fluoreszierender Photonen, die von einem Strahlungsstoff emittiert werden, zur Gesamtanzahl Photonen, die von dem Stoff absorbiert werden;
bedeutet "Fluorophor" ein Molekül, das Licht einer bestimmten Wellenlänge emittiert, wenn es durch Absorption von Licht einer anderen (üblicherweise kürzeren) Wellenlänge angeregt wird.
Diese Erfindung bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von Mikroorganismen. Sie stellt einen schnellen und bequemen homogenen Ansatz dar und verwendet chromogene und fluorogene Substrate zur Bestimmung der Aktivitäten extrazellulärer und intrazellulärer Enzyme. Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Substrate führten zu einer verbesserten Genauigkeit, einem schnelleren Nachweis und insgesamt zu geringeren Kosten bei Nachweis und Identifizierung von Mikroorganismen. In bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung fluorogene Indikatoren bereit, die bei der Spaltung einen hohen Signalpegel und in intaktem Zustand einen sehr niedrigen Störpegel zeigen und die ausschließlich im sichtbaren Bereich arbeiten. Darüber hinaus ermöglicht diese Erfindung dank überlegter Anordnung und Wahl von Peptiden und der daran gebundenen Fluorophore die Untersuchung von mehreren Bakterien gleichzeitig.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Konzeptdarstellung eines fluorogenen Substrats auf der Grundlage der Dimerisierung von Farbstoffen.
2 zeigt die Absorptionsspektren von T-VPRGK-T (etwa 10^-5 M) vor (Kurve A) und nach (Kurve B) der Enzymhydrolyse mit Trypsin (etwa 10^-7 M).
3 zeigt die Fluoreszenzspektren vor Exposition (Kurve D) und nach Exposition (Kurve C) an ein Lysat von Vibrio parahaemolyticus.
Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Diese Erfindung stellt ein Proteasesubstrat und ein Verfahren für ein biologisches Assay unter Verwendung eines Proteasesubstrats bereit, umfassend zwei oder mehr Fluoreszenzfarbgruppen, wobei die Farbgruppen einen Abstand aufweisen, der eng genug ist, um die Fluoreszenz der Farbgruppen im Wesentlichen zu löschen, wobei das Proteasesubstrat eine oder mehrere enzymatisch spaltbare Bindungen aufweist, wobei die Selbstlöschung der Fluoreszenz durch die Bildung von Farbstapelstrukturen (Dye Stacking), vorzugsweise durch Dimerisierung von Farbstoffen, bewirkt wird, und enzymatisches Spalten eines oder mehrerer der enzymatisch spaltbaren Bindungen, sodass die gebildeten Produkte jeweils eine Fluoreszenzfarbgruppe umfassen, die einen Anstieg der Fluoreszenzintensität erzeugt.
Die Farbgruppen sind Fluorophore, die vor dem Spalten vorzugsweise durch einen Abstand von weniger als 100 Å voneinander getrennt sind.
Vorzugsweise nutzt das Verfahren ein Substrat, das zwei selbst löschende Fluoreszenzfarbgruppen umfasst. Mehr bevorzugt nutzt das Verfahren ein Substrat, das zwei identische selbst löschende Fluoreszenzfarbgruppen umfasst.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein fluorogenes Enzymsubstrat bereitgestellt, umfassend mindes tens zwei Fluoreszenzfarbgruppen, die kovalent an ein Peptid gebunden sind, wobei die Farbgruppen einen Abstand haben, der ausreichend eng ist, um die Fluoreszenz der Farbgruppen im Wesentlichen selbst zu löschen, wobei die Selbstlöschung der Fluoreszenz der Farbgruppen durch Stapelstrukturbildung bewirkt wird. Vorzugsweise sind mindestens zwei der Fluoreszenzfarbgruppen identisch. Mehr bevorzugt umfasst das fluorogene Enzymsubstrat zwei identische Fluoreszenzfarbgruppen.
Fluoreszenz ist eine der empfindlichsten Nachweistechniken, die heute zur Verfügung stehen. Zeptomolare Mengen an Enzymmolekülen wurden mit Fluoreszenz-Mikroassays untersucht. In einem in Öl dispergierten Tröpfchen konnte mittels Fluoreszenzmikroskopie ein einziges Enzymmolekül nachgewiesen werden. Einzelne Moleküle eines Enzyms konnten mittels Fluoreszenzspektroskopie elektrophoretisch in einem Kapillarröhrchen manipuliert und überwacht werden. Siehe Xue, Q.; Yeung, E.S. Differences in Chemical reactivity of Individuals molecules of an enzyme; Nature 1995, 373, 681-683. Assays zum Nachweis von Colibakterien unter Verwendung von β-Galactosidase als Markerenzym sind entwickelt. Es hat sich herausgestellt, dass die Fluorometrie eine 250-fache höhere Empfindlichkeit und eine um 5 Stunden kürzere Nachweiszeit als kolorimetrische Verfahren bietet. Siehe Van Poucke, S.O.; Neils, H.J. Development of a Sensitive Chemiluminometric Assays for the Detection of β-Galactosidase in Permeabilized Coliform Bacteria and Comparison with Fluorometry and Colorimetry; Appl. Env. Microbiol. 1995, 61, 4505-4509.
Zur Herstellung erfindungsgemäßer fluorogener Substrate wird ein ausgewähltes verhältnismäßig kleines Peptid, umfassend 2 bis 10 Aminosäuren, die über Peptidbindungen miteinander verbunden sind, wie nachstehend offenbart, erhalten und anschließend mit einem Paar Fluoreszenzfarbstoffe markiert, das bei passender Bindung an das Peptid unter Bildung eines "Konjugat" die Eigenschaft hat, zu dimerisieren oder "Stapelstrukturen zu bilden" und so jegliche Fluoreszenz der beiden Fluorophore löscht. Die Farbstoffpaare müssen nicht zwangsläufig Donoren und Akzeptoren beim Fluoreszenzenergietransfer sein. Zu der Art von Farbstoffen, die beim Binden an das kurze Peptid innerhalb eines ausreichend engen Abstands zueinander derartige Stapelstruktureigenschaften zeigen, gehören solche Farbstoffe, die eine im Allgemeinen planare aromatische Struktur aufweisen und so in Lösung bei Konzentrationen, die ausreichend hoch sind (beispielsweise 10^-2 bis 10^-4 M), Homo- oder Heterodimere bilden können.
Insbesondere können fluorogene Proteasesubstrate, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, durch chemisches Umsetzen eines Peptids mit kurzer Länge, vorzugsweise weniger als 100 Å, mit zwei Molekülen eines Fluoreszenzfarbstoffs erhalten werden. Proteasesubstrate sind im Handel erhältlich (z. B. GeneMed Biotechnologies, San Francisco, CA). Die kovalente Bindung von Fluoreszenzfarbstoffen an Proteasesubstrate ist im Fachgebiet gut bekannt.
Zu repräsentativen Peptiden, die bei der Erzeugung der fluorogenen Proteasesubstrate nützlich sind, gehören die Peptide, die Val-Pro-Arg-Gly-Lys umfassen, sodass die Farbgruppen dimerisieren können und sodass das Peptid eine enzymspezifische spaltbare Stelle aufweist. Nach Spaltung des Substrats steigt die Fluoreszenzintensität jedoch aufgrund der Dissoziation der intramolekularen Dimere an.
Mehr bevorzugt gehört zu den Substraten (wie in Anspruch 1 festgelegt), die in der Erfindung nützlich sind, mindestens eine ARG-GLY-Sequenz. Am meisten bevorzugt umfasst das Substrat ein Peptid mit der Sequenz Val-Pro-Arg-Gly-Lys, wobei die Fluoreszenzfarbgruppen kovalent an jeden endständigen Rest ge bunden sind.
In der vorliegenden Erfindung nützliche fluorogene Proteasesubstrate können mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren hergestellt werden, siehe Europäische Patentanmeldung Nr. 0 428,000 .
Zu nützlichen Fluoreszenzfarbstoffen für die Reaktion mit den Peptiden unter Erzeugung der Proteasesubstrate gehören diejenigen, die eine Farbstapelbildung durchführen. Es ist gut bekannt, dass einige Fluoreszenzfarbstoffe (z. B. Fluoresceine, Rhodamine, Cyanine, heterocyclische Borfarbstoffe, wie 4,4-Difluor-4-borat-3a-azonia-4a-aza-s-indacen (BODIPY) usw.) in wässriger Lösung Dimere bilden, wenn sie in engem Abstand zueinander sind.
Planare aromatische Farbstoffe der Fluorescein-Familie, wie Fluorescein, Tetramethylrhodamine (TMR), Rhodamin B und Texas Red, sind repräsentative Farbstoffe dieser Art. Aufgrund der Wechselwirkung zwischen den Übergangsdipolen der mesomeren Dimerstruktur ist die Fluoreszenzquantenausbeute des Dimers recht gering, wenn kein Enzym zum Spalten des Peptids vorhanden ist. Wenn das Dimer nach der Spaltung durch das Enzym dissoziiert, wird eine wesentlich höhere Fluoreszenzquantenausbeute in der wässrigen Lösung beobachtet. Auf diese Weise kann ein homogenes Enzymassay entwickelt werden, wobei das markierte Peptid in Lösung gebracht und der Enzymanalyt zugegeben wird, sodass das Enzym das Peptid spaltet, wobei die Dimerisierung bei gleichzeitigem Anstieg der Fluoreszenz abnimmt.
Die Enzymspaltung wird durch In-Kontakt-Bringen des fluorogenen Substrats mit dem spezifischen Enzym oder Enzymkontaktmedium erreicht.
Zu Enzymen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, gehören alle Enzyme, die im Allgemeinen als Proteasen klassifiziert sind, d. h. Proteine, die katalytisch Peptidbindungen hydrolysieren, einschließlich beispielsweise Asparagin-, Metallo-, Thiol-, Serin, retroviraler und Trypsinproteasen. Zu bevorzugten Enzymen gehören Mitglieder der Trypsin-Familie, wie Thrombin, trypsinähnliche Enzyme usw.
Zwar gibt es zahlreiche verschiedene Arten von fluorogenen Substraten, die Mechanismen, der sie sich bedienen, können jedoch in drei Hauptklassen unterteilt werden: chemisch, physikalisch und physikalischchemisch.
Das erfindungsgemäße biologische Assayverfahren ist homogen. Es verlangt keine Trennschritte, wie sie in Assayformen, wie ELISA und Biolumineszenz erforderlich sind. Dies bedeutet eine effektivere Verwendung von Reagenzien, Arbeitskraft, Zeit und Ausrüstung für sowohl Endbenutzer als auch Lieferanten. In der Regel absorbieren Fluorophore, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, Licht im ultravioletten Bereich. Die Empfindlichkeit eines UV-Nachweises ist zwar nützlich, kann aber bei biologischen Proben, die Moleküle mit ausgeprägter Absorption im ultravioletten Bereich enthalten, herabgesetzt sein. Darüber hinaus zeigen einige nicht gespaltete Indikatoren eine erhebliche Hintergrundfluoreszenz. Es ist wünschenswert, fluorogene Indikatoren zu haben, die bei der Spaltung einen hohen Signalpegel und in intaktem Zustand einen sehr niedrigen Störpegel zeigen und die ausschließlich im sichtbaren Bereich arbeiten. Die vorliegende Erfindung lehrt ein Verfahren zur Bereitstellung dieser Vorteile und bietet die Möglichkeit, durch überlegte Anordnung und Wahl von Peptiden und der daran gebundenen Fluorophore mehrere Bakterien gleichzeitig zu untersuchen.
Farbstoffe der Rhodamin-Familie, wie Fluorescein, Tetramethylrhodamin, X-Rhodamin und Rhodamin B, weisen im sichtbaren Bereich (400-700 nm) sehr hohe Fluoreszenzquantenausbeuten (etwa 0,85) auf. Aus diesem Grund werden sie häufig als Laserfarbstoffe, Indikatoren, biologische Marker, zur Fernerkennung und zum Nachweis von minimalen Mengen von Substanzen verwendet. Wichtig ist hierbei, dass diese Farbstoffe bekanntermaßen Dimerstapelstrukturen bilden, die die Fluoreszenz bei engem Abstand, wie hohen Konzentrationen (~10^-2 bis 10^-4 M), selbst löschen. In zahlreichen Anwendungen ist dieses Phänomen offensichtlich unerwünscht. Dieses Phänomen kann aber auch vorteilhaft genutzt werden. Wenn zwei Farbstoffmoleküle an den endständigen Resten eines kurzen Peptids (2 bis 10 Aminosäuren) gebunden sind, d. h. diese markiert sind, zeigt das markierte Konjugat aufgrund der Selbstlöschung eine geringe Fluoreszenz. Da dies effektiv einen Anstieg der lokalen Konzentration darstellt, bleibt das Konjugat ungeachtet der Gesamtkonzentration gelöscht. Beim Spalten durch ein Enzym werden die beiden Markierungen getrennt, was eine hohe intrinsische Fluoreszenz erzeugt. Aus diesem Grund kann die Enzymaktivität direkt mit dem Nettoanstieg der Fluoreszenzintensität in Verbindung gesetzt werden. Wenn das Enzym von einer eukaryontischen oder prokaryontischen Zelle sezerniert wird, lässt sich die Fluoreszenzintensität mit der Stoffwechselaktivität der Zellen in Bezug bringen. Die Fähigkeit eines Enzymmoleküls, Millionen von Substratmolekülen zu bearbeiten, ist ein Verstärkungsprozess. Diese Verstärkung wird dann weiter verstärkt, wenn das Enzym aus einer Lebendzellkultur stammt, da mit der Vermehrung der Zellen auch mehr Enzymmoleküle erzeugt werden. Diese "doppelte Verstärkung" bietet zusammen mit Fluoreszenztechniken einen vielversprechenden Ansatz für den schnellen, empfindlichen und spezifischen Nachweis von Bakterien. Dieses Konzept ist in 1 dargestellt. 10 repräsentiert eine Bakterie, beispielsweise Staphylococcus aureus oder Vibrio parahaemolyticus, die ein Enzym 12 produziert, beispielsweise ein oder trypsin ähnliches Enzym. 12 spaltet das Peptidsubstrat 18 (nicht fluoreszierend), umfassend zwei gelöschte Fluoreszenzfarbgruppen N und C katalytisch unter Erzeugung von zwei Produktfragmenten 14 und 16', die die hoch fluoreszierenden Farbgruppen N' und C' umfassen.
Wie vorstehend angegeben, gehören zu den repräsentativen Peptiden, die bei der Erzeugung von fluorogenen Proteasesubstraten nützlich sind, Peptide mit etwa 2 bis 10 Aminosäuren, sodass die Farbgruppen Stapelstrukturen bilden können und sodass das Peptid eine enzymspezifische Spaltstelle aufweist. Da es eine große Anzahl von Proteasen gibt, gibt es eine ebenso große Anzahl an Peptiden, die in der Erfindung nützlich sein können. Die spezielle Herausforderung besteht darin, dass ein Zielpeptid die erforderliche chemische Bindung aufweist, die von der Protease angegriffen wird. Wie nachstehend besprochen, ist bekannt, dass Trypsin Peptide auf der Carboxylseite eines Arginin- oder Lysinrests hydrolysiert, somit kann jedes Peptid mit dieser Eigenschaft ein Trypsinsubstrat sein.
Vibrio parahaemolyticus ist ein Pathogen, das mit Meerestieren assoziierte Vergiftungen verursacht und intrazellulär ein trypsinähnliches Enzym erzeugt, das im Allgemeinen als Marker zur Identifizierung von Vibrio parahaemolyticus verwendet wird. Es hydrolysiert spezifisch die Peptidbindung nach der Aminosäure Arginin. Das Enzym wird unter Verwendung von Mitteln, die die Durchlässigkeit der Außenmembran (OM) erhöhen, mit dem fluorogenen Substrat in Kontakt gebracht. Für diese Zwecke wird im Allgemeinen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) verwendet, die die Außenmembranbarriere von gramnegativen Enterobakterien verändert. Sie entfernt mittels Chelatbildung stabilisierende Kationen von den Bindungsstellen in den Lipopolysacchariden (LPS). Dies führt zur Freisetzung eines signifikanten Anteils an LPS aus den Zellen. Der LPS-Verlust führt zum Erscheinen von Phospholipiden an der Außenhaut der OM, die dann als Kanäle für die Diffusion von hydrophoben Verbindungen dienen. Unter bestimmten Umständen wird die OM gespalten und für Makromoleküle durchlässig. Siehe Vaara, M. Agents that increase the permeability of the outer membrane; Microbiol. Reviews 1992, 56, 395-411.
Trypsin ist ein kräftiges Enzym, das ungeachtet der benachbarten Reste jede Peptidbindung nach einem positiv geladenen Arg-Rest spaltet. Andere Enzyme derselben Familie (z. B. Thrombin) sind jedoch von den umgebenden Resten abhängig, eine Eigenschaft, die ihnen Spezifität verleiht.
Trypsin und trypsinähnliche Enzyme werden in 1 als Modell zur Demonstration dieses Konzepts verwendet. Trypsin ist ein hoch spezifisches proteolytisches Enzym im Darm und gehört zu den kräftigsten Enzymen, die bekannt sind. Es hydrolysiert Peptidbindungen auf der Carboxylseite von Arginin- und Lysinresten. Diese Eigenschaft von Trypsin ist ausführlich beschrieben. Zur Beurteilung des erfindungsgemäßen Konzepts wurde folgende Sequenz entwickelt:
(N-Terminus) Val-Pro-ARG-GLY-Lys (C-Terminus) Seq 1
wobei das freie Amin an Valin (N-Terminus) und die freie Carboxylsäure an Lysin (C-Terminus) ist.
Die Amidbindung zwischen den beiden Resten (fett gedruckt) ist die Spaltstelle von Trypsin. Die Rolle der benachbarten Reste besteht darin, die sterische Hinderung beim Binden der Farbstoffe zu verringern. Die Aminogruppen an Val und Lys werden verwendet, um mit den Farbgruppen zu reagieren. Die Carboxylgruppe am C-Terminus kann dazu verwendet werden, falls erforderlich, an einen festen Träger zu binden.
Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich von im Handel erhältlichen Ansätzen unter Verwendung von Proteasesubstraten sowohl hinsichtlich des Wirkmechanismus als auch hinsichtlich der Empfindlichkeit. Es hat sich herausgestellt, dass die vorliegende Erfindung im Vergleich zu herkömmlichen im Handel erhältlichen Assaykits, die bei Verwendung eines Proteasesubstrats nur zu einem 2-fachen Anstieg der Fluoreszenz führen, mindestens einen um das 10-, 20-, 30-fache und mehr Anstieg der Fluoreszenz bereitstellen.
Bei schnellen und empfindlichen Tests ist es wichtig, das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren. Die meisten herkömmlichen fluorogenen Substrate emittieren am Ende des UV-Wellenlängenbereichs (350-450 nm), in dem die meisten Bakteriennährmedien eine wesentliche Autofluoreszenz zeigen. Das Nährmedium für Staphylococcus aureus zeigt bei Anregung mit 360 nm beispielsweise zwei signifikante Emissionsmaxima bei 425 nm und 475 nm. Um dieses Problem zu vermeiden werden in der Regel hohe Substratkonzentrationen verwendet. Dies kann zu höhren Assaykosten, höherer Toxizität für den Organismus und gelegentlich zur Ausfällung des Substrats führen. Die vorliegende Erfindung löst das Problem von Autofluoreszenzstörungen durch eine Rotverschiebung der Nachweiswellenlänge in den sichtbaren Bereich (Tetramethylrhodamin: λ_ab = 550 nm, λ_em = 580 nm). Ferner kann das in der Erfindung beschriebene Konzept auch auf andere Farbstoffe angewandt werden, bei denen die Emission mittels Rotverschiebung auf noch längere Wellenlängen gebracht wird. In der Regel können nützliche Farbstoffe die folgenden Merkmale aufweisen: hoher Extinktionskoeffizient (>80,000 cm^-1M^-1); hohe Quantenausbeuten (>0,85 in wässriger Lösung); Spektren, die Lösungsmittel und pH-Wert gegenüber unempfindlich sind; gute wässrige Löslichkeit, Photostabilität; und hohe Dimerisierungskonstante.
Die Erfindung findet, ohne darauf beschränkt zu sein, Anwendung bei Nachweis und Identifizierung von Mikroorganismen, Sicherung der Sterilität, pharmazeutischen Entdeckungen, Enzymassays und Immunassays. Darüber hinaus kann ein fluorogenes Substrat für HIV-Proteaseaktivität als Test für antivirale Mittel nützlich sein, die bei der AIDS-Therapie von Nutzen sind.
Ziele und Vorteile dieser Erfindung sind weiter anhand der nachfolgenden Beispiele erklärt, wobei jedoch keines der spezifischen Materialien oder deren Menge, die in den Beispielen genannt werden, sowie keine anderen Bedingungen und Einzelheiten als unnötige Begrenzung der Erfindung ausgelegt werden sollen.
BEISPIELE
In den folgenden Beispielen
Val oder V = Valin;
Pro oder P = Prolin;
Arg oder R = Arginin;
Gly oder G = Glycin;
Lys oder K = Lysin;
TMR = Tetramethylrhodamin oder Tetramethylrhodamin-Gruppe;
Beispiel 1. Herstellung von fluorogenen Proteasesubstraten
Val-Pro-Arg-Gly-Lys wurde von GeneMed Biotechnologies (South San Francisco, CA) synthetisiert und mittels Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) aufgearbeitet. Die chemische Identität wurde mittels Massenspektroskopie unter Beschuss mit schnellen Atomen (FAB) und Aminosäureanalyse bestätigt. Das Peptid wurde über Nacht mit Tetramethylrhodaminsuccimidylester in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 8,3, umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde mittels Umkehrphase-HPLC (C-18-Säule, Teilchengröße 15 μm, Waters Corp., Milford, MA) gereinigt. Alle chemisch reaktiven Farbstoffe wurden von Molecular Probes, Eugene, OR, er worben. Das Farbstoff-Peptid-Konjugat hatte die chemische Struktur TMR-Val-Pro-Arg-Gly-Lys-TMR (in 2 als T-VPRGK-T bezeichnet), die nachstehend als Formel I dargestellt ist. Zur Reinigung des Konjugats wurde ein Mischgradient von Acetonitril (ACN) in Wasser verwendet. Bei einer typischen Elution wurde der Acetonitril-Gehalt innerhalb der ersten 15 Minuten von 15 % auf 30 % erhöht, daran schlossen sich eine 10-minütige isokratische Elution mit 30 % ACN, ein 5-minütiger Gradient auf 50 %, dann eine 5-minütige isokratische Elution mit 50% ACN an. Alle Lösungsmittel enthielten 0,1 % Trifluoressigsäure. Das Molekulargewicht des gereinigten Konjugats, das mittels FAB-Massenspektroskopie ermittelt wurde, betrug, 1379, was der Molekularmasse entspricht, die auf der Grundlage der Elementzusammensetzung C₇₄H₈₅N₁₃O₁₄ ermittelt wurde. Dieses nachstehend dargestellte zweifach markierte Konjugat zeigte eine wesentlich geringere Fluoreszenz als das einfach markierte Gegenstück.
Formel I
Beispiel 2. Hydrolyse von fluorogenen Proteasesubstraten durch gereinigte Enzyme
Die Enzymhydrolyse des Substrats aus Beispiel 1 wurde in 50 mM Carbonatpuffer, pH 8,9, bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Fluoreszenzintensität der Lösung vor der Behandlung mit Trypsin und nach der Behandlung mit Trypsin bei den Wellenlängen 360 nm, 522 nm, 530 nm bzw. 553 nm geht aus Tabelle 1 hervor. Neben einem Anstieg der Fluoreszenzintensität wurden auch Veränderungen der Absorptionsspektren beobachtet, wie in 2 dargestellt. In intaktem Zustand zeigte das Konjugat ein Absorptionsmaximum bei 520 nm mit einer Schulter bei 550 nm (Kurve A). Dies ist ein Kennzeichen der Dimerisierung von Farbstoffen oder der Bildung von Farbstapelstrukturen, wie vorstehend beschrieben. Die Spaltung führte zu einer Umkehr der relativen Extinktion der beiden Peaks, wodurch wieder die Spektren des freien Tetramethylrhodamins in wässriger Lösung (Kurve B) erschienen. Sowohl die Fluoreszenz- als auch die Absorptionsergebnisse stellten einen überzeugenden Nachweis dar, dass zwischen Farbstoffmolekülen des Konjugats Grundzustandwechselwirkungen auftraten, die durch die enzymatische Spaltung verringert wurden.
Die Daten aus Tabelle 1 zeigen, dass die Fluoreszenzintensität des gespaltenen Substrats bei einem breiten Spektrum an Anregungsfrequenzen um bis das 29-fache der der intakten Substratlösung und bei Wellenlängen von 570 bis 585 nm, einem für das menschliche Auge problemlos sichtbaren Bereich, im Durchschnitt das 25- bis 28-fache der Intensität beträgt.
Beispiel 3. Verwendung von fluorogenen Proteasesubstraten zum Nachweis von Vibrio Paraeamolyticus
Vibrio parahaemolyticus, der in diesen Versuchen verwendet wird, war ein qualitätskontrollierter Stamm für das Transport Swab System von Becton Dickinson Microbiology Systems (Cockeysville, MD). Er wurde von American Tissue Culture Collection (ATCC Zugriffsnr. 49398) erworben. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer Nährlösung mit 3 Prozent Natriumchlorid gezüchtet. 10 ml der über Nacht stehen gelassenen Kultur wurden zentrifugiert. Die Nährlösung wurde verworfen und 3 ml Assay-Puffer (1 mM EDTA, 50 mM Phosphatpuffer bei pH 7,2) zugefügt, der 50 μl doppelt markiertes Konjugat der Formel I, 1000-fache Verdünnung (zur Herstellung des markierten Peptids siehe Beispiel 1), enthielt. Um eine vollständige Spaltung zu gewährleisten, wurde die Reaktionsmischung über Nacht inkubiert. Die Fluoreszenzintensität der Küvetten mit und ohne Zellen wurde bestimmt (Kurve C bzw. D). Die ermittelten Spektren gehen aus 3 hervor.
Die Spaltung durch trypsinähnliches Enzym führte zu einem Anstieg der Fluoreszenz. Dieses Assay stellt ein verständliches, schnelles Verfahren bereit, das nicht nur mit einem einfachen Fluorometer nachweisbar, sondern auch Sekunden nach der Trypsinzugabe für das menschliche Auge erkennbar war.
Verschiedene Abwandlungen und Veränderungen dieser Erfindung sind für den Fachmann offensichtlich und es ist offensichtlich, dass diese Erfindung nicht unnötig durch die hier dargelegten veranschaulichenden Ausführungsformen eingeschränkt wird.

Claims

Verfahren für ein biologisches Assay, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Enzymsubstrats, umfassend zwei oder mehr Fluoreszenzfarbgruppen, die an ein Peptid gebunden sind, welches Val-Pro-Arg-Gly-Lys umfasst und eine oder mehrere enzymatisch spaltbare Bindungen aufweist, wobei die Farbgruppen einen Abstand aufweisen, der eng genug ist, um die Fluoreszenz der Farbgruppen im Wesentlichen selbst zu löschen, wobei die Selbstlöschung der Fluoreszenz der Farbgruppen durch die Bildung von Farbstapelstrukturen (Dye Stacking) bewirkt wird, und b) enzymatisches Spalten eines oder mehrerer der spaltbaren Bindungen des Peptids zur Freisetzung der Fluoreszenzfarbgruppen aus den Farbstapelstrukturen und Erzeugen eines Anstiegs der Fluoreszenzintensität.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Farbgruppen identisch sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Farbgruppen durch einen Abstand von weniger als 100 Å voneinander getrennt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die freigesetzten Fluoreszenzfarbgruppen eine Strahlung im sichtbaren Bereich aussenden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Fluoreszenzfarbgruppen eine planare Konfiguration aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Farbgruppen ausgewählt sind aus Fluorescein-, Rhodamin- und Cyaninfarbgruppen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das an der enzymatischen Spaltung beteiligte Enzym ausgewählt ist aus Asparagin-, Metallo-, Thiol-, Serin-, retroviralen und Trypsinproteasen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das an der enzymatischen Spaltung beteiligte Enzym von einem Mikroorganismus produziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Fluoreszenzfarbgruppen identische Rhodaminmoleküle sind.
Enzymsubstrat zur Verwendung im Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Proteasesubstrat ein Peptid Val-Pro-Arg-Gly-Lys umfasst und zwei oder mehr Fluoreszenzfarbgruppen aufweist, wobei die Farbgruppen einen Abstand haben, der ausreichend eng ist, um die Fluoreszenz der Farbgruppen durch intramolekulare Stapelstrukturbildung im Wesentlichen selbst zu löschen.
Enzymsubstrat nach Anspruch 10 mit der Formel: TMR-Val-Pro-Arg-Gly-Lys-TMR.
Enzymsubstrat nach Anspruch 10, wobei die Farbgruppen eines intramolekularen Stapels, der durch die intramolekulare Stapelstrukturbildung gebildet wurde, durch einen Abstand von weniger als 100 Å voneinander getrennt sind.