KR20140145113A

KR20140145113A - 보툴리눔 분석 감도를 증진시키기 위한 방법 및 화합물

Info

Publication number: KR20140145113A
Application number: KR1020147021359A
Authority: KR
Inventors: 티모시 엠. 피아자; 와드 터커
Original assignee: 바이오메디슨, 인코퍼레이티드
Priority date: 2012-01-04
Filing date: 2013-01-03
Publication date: 2014-12-22
Also published as: EP2800973B1; KR102168506B1; EP2800973A4; KR20210107179A; KR20200120770A; KR20190142447A; EP2800973A1; KR20220067004A; WO2013103737A1; KR102059091B1; KR102296109B1; KR20230164228A; LT2800973T; ES2678695T3; KR102607322B1

Abstract

장치, 시스템 및 방법은 보툴리눔 신경 독소의 향상된 검출을 제공할 수 있다. 한 측면에서 FRET 및 비-FRET 세포-기반 분석 모두의 감도를 향상시키기 위해 이소퀴놀리닐 화합물이 사용될 수 있다. 또 다른 측면에서, 비-FRET 분석 및 작제물은 제 2 형광 물질과 현저한 FRET을 생성하는 방식으로 연결되지 않은 리포터를 사용한다. 이 주제에서, 환경 세포는 절단 후에 절단 전보다 리포터의 분해를 현저히 빠르게 하는 효소를 포함할 수 있으며, 보툴리눔 독소의 존재는 기준 신호로부터의 신호 감소와 관련이 있다. 환경이 세포인 경우, 세포는 리포터를 포함하는 작제물, 및 분해를 가능하게 하는 효소 모두를 바람직하게 발현할 수 있다.

Description

보툴리눔 분석 감도를 증진시키기 위한 방법 및 화합물{METHODS AND COMPOUNDS FOR INCREASING SENSITIVITY　OF　BOTULINUM　ASSAYS}

우선권 청구

본 출원은 전체가 참조로 본 발명에 포함된 2012년 1월 4일에 출원된 US 가출원 번호 61/582940 명세서, 및 2012년 5월 31일에 출원된 US 실용신안 출원 번호 13/485537 명세서에 기반하여 우선권을 주장한다. 상기 발명들 및 본 발명에서 논의된 모든 다른 외인성 물질은 이들 전체가 참고로서 포함된다. 포함된 참고문헌에서의 용어의 정의 또는 사용이 본 발명에서 제공되는 용어의 정의와 일치하지 않거나 반대되는 경우, 본 발명에서 제공된 용어의 정의가 적용되며 참고문헌에서의 용어의 정의는 적용되지 않는다.

본 발명의 기술 분야

본 발명의 기술 분야는 보툴리눔 신경독소(Botulinum Neurotoxins, BoNTs)의 검출이다.

보툴리눔 신경독소는 알려진 가장 치명적인 물질이며, 혈청형에 따라 인간 치사량은 체중 kg 당 1 내지 3 ng 독소 범위로 추정된다. BoNT의 쉬운 정제 및 고역가로 인해, BoNT는 생물학적 무기로 이용될 실질적 및 잠재적 위협을 제기한다. 또한, BoNT는 미용 및 치료 목적의 사용이 증가하고 있다. 최근, 정부 및 산업 실험실에서 완료된 대다수의 BoNT 검출 및 역가 측정은 높은 비용과 부족한 정확성의 문제가 있는 동물-기반 분석법을 이용하여 수행되었다.

BoNT 역가 측정을 위한 세포-기반 분석법 (cell-based assays, CBAs) 이용의 주요 장점은 CBA 시스템이 중독 시 신경 세포에서 발생하는 각각의 생리학적 단계를 근접하게 모방한다는 것이다. BoNT는 신경 세포-특이적 수용체 결합 및 세포 진입에 관련된 중쇄, 및 시냅스 단백질(synaptic protein)의 절단에 관련된 촉매 경쇄로 이루어진 아연-의존성 엔도펩티다아제(endopeptidase)이다. 신경 세포에 진입 시, BoNT는 시냅스 비히클와 원형질막의 융합에 관련된 단백질 기구를 특이적으로 손상시킴으로써, 신경전달물질의 시냅스-후 연접부(post-synaptic junction)로의 방출을 억제한다. 모든 생리학적 단계가 CBA에서 처리되어야 하기 때문에, 대부분의 분석법은 BoNT 활성 측정의 감도 요건을 충족시키지 못한다.

BoNT의 검출을 위해 수립된 고정 세포주 모델(stable model cell lines)을 사용하는 것이 최근 개시되었으나, 종래의 CBA는 BoNT의 약학적 제제의 정량 또는 임상 시료에서의 BoNT의 검출을 위한 감도 요건을 충족시키지 못했다. 아마도, 최근 수립된 세포주 모델은 효과적인 BoNT 흡수를 위해 필요한 중요한 신경 세포의 특성이 부족할 것이다. BoNT 감도를 증가시키기 위한 최근의 해결책은 마우스 배아 줄기세포(mouse embryonic stem cell, mESC)를 이용하는 것이다. 상기 세포들은 최종적으로 신경 세포로 분화될 수 있기 때문에, 이들은 BoNT 처리에 더욱 민감하다. 하지만 이 방법의 가장 큰 단점은 mESC로 완전히 분화하는데 몇 주가 걸린다는 것이다.

따라서, 생화학 무기 방어, 식품 매개 질환 및 치료 목적을 위해 BoNT-함유 시료의 역가를 측정 및 정량하기 위한 세포 기반 분석법의 개발이 시급하게 필요하다.

본 발명의 개요

한 측면에서, 본 발명의 주제는 보툴리눔 신경 독소에 대한 세포-기반 분석법의 감도를 향상시키기 위해 이소퀴놀리닐 화합물이 사용되는 장치, 시스템 및 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 화합물은 1-(5-이소퀴놀리닐설포닐)-2-메틸피페라진 디클로라이드 (H7)를 포함한다. 리포터는, 세포에서 발현되고 YFP(Yellow Fluorescent Protein), 시트린(Citrine), 비너스(Venus) 및 YPet 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 1 형광 물질, 및 SNARE 단백질, 모티프 및 뮤테인(mutein) 중 하나 이상을 포함하는 절단 부위를 가지는 인공 작제물(construct)인 것이 바람직하다.

또한, 세포가 B27을 함유하는 배양 배지에서 인큐베이션되는 분석법이 고려된다.

본 발명의 주제의 또 다른 측면은 리포터가 제 2 형광 물질과 현저한 FRET(Forster resonance energy transfer)을 발생하는 방식으로 연결되지 않은 비-FRET 분석법 및 작제물을 수반한다. 이러한 양태에서, 세포는 절단 전보다 절단 후에 리포터의 분해를 열 배 이상 빠르게 촉진시키는 효소를 바람직하게 발현할 수 있으며, 보툴리눔 독소의 존재는 기준 신호로부터의 신호 감소와 연관성이 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같은, 용어 "비-FRET 분석 및 작제물"은 문헌 ["FRET or No FRET: A Quantitative Comparison ", Claude Berney and Gaudenz Danuser, Biophys J. 2003 June; 84(6): 3992-4010]에 기재된 E₁ 방법 (수용체(acceptor)의 존재(FDA) 및 부재(FD)시 공여체(donor)의 상대적 형광 E₁= 1 - FDA/FD)에 따라, (a) 검출 불가능한 FRET 신호를 가지거나, (b) 5% 미만의 FRET 전달 효율을 가지는 FRET 신호를 발생하는 분석법 및 작제물을 말한다. 5% 미만의 전달 효율을 가지는 임의의 FRET 신호는 FRET-연결된 요소의 농도에 대한 양적 측정을 제공하기 위한 신호로 이용하기에 실용적이지 않은 미미한 수준인 것으로 간주된다.

일부 양태에서 리포터-포함 부분을 화학적으로 가지는 인공 작제물은 작제물의 나머지 부분으로부터 리포터-포함 부분을 절단하는 방식으로 조사 물질과 상호작용하는 절단 부위와 연결되고, 리포터-포함 부분은 세포질에서 분해된다.

특정 종류의 양태는,

(i) 인공 작제물 및 효소를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서,

상기에서 작제물은 (a) 리포터-포함 부분 및 (b) 작제물의 나머지 부분으로부터 리포터-포함 부분을 절단하는 방식으로 보툴리눔 독소 부분과 상호작용하는 절단 부위를 가지며,

상기에서 조성물은 기준 신호 확인 방출을 나타내고; 및

상기에서 효소는 리포터-포함 부분의 분해를 절단 전보다 절단 후에 두 배 이상, 다섯 배 이상, 열 배 이상 또는 스무 배 이상 빠르게 촉진시키는 단계;

(ii) 상기 기준 신호로부터 제 1 방출 측정값을 얻는 단계

(iii) 상기 조성물을 보툴리눔 독소에 노출시키는 단계; 및 그 뒤

(iv) - 작제물 절단 부위를 절단하는 독소, 및

- 리포터-포함 부분의 분해

의 표시로 기준 신호의 감소를 위한 조성물을 테스트하여 추가 방출 측정값을 얻는 단계

(v) 단계 (ii)의 제 1 방출 측정값과 단계 (iv)의 추가 측정값을 비교하는 단계를 포함하는, 보툴리눔 독소의 정성 및 정량 검출 방법에 관한 것이다.

또한, 비-FRET 분석을 위한 본 발명의 주제는 인공 작제물 및 효소를 가지는 세포를 포함하는, 조사 물질의 존재를 테스트하기 위한 분석법에 관한 것이다, 상기에서 작제물은 보호된 부분이 리포터를 포함하도록 선택된, 보호된 부분 및 보호하는 부분을 가지며, 조사 물질은 시험관 내에서 보호된 부분을 탈-보호하도록 작용하고, 상기에서 효소는 보호된 부분이 보호되었을 때보다 탈-보호되었을 때 두 배 이상, 다섯 배 이상, 열 배 이상 또는 스무 배 이상으로 분해되도록 하고, 그렇게 함으로써, 리포터로부터 얻을 수 있는 신호를 감소시켜 조사 물질의 정량적 측정에 사용된다.

절단된 리포터-포함 부분은 현지 환경에 의해 파괴되거나 그렇지 않으면 분해되며, 조사 물질이 존재한다면 리포터로부터의 신호 감소에 의해 증명된다. 본 명세서의 문맥에서, 보호된 부분은 일반적으로 세포 내에서, 단백질을 프로테아좀으로 보내는 것을 목표로 하는 유비퀴틴-의존 과정에 의한 또는 자가포식-리소좀 경로(autophagy-lysosomal pathway)에 의한, 두 경로 중 하나 이상에 의해 분해될 것이다. 한 경로에서, 프로테아좀이 상기 효소이다. 리소좀 경로에서, 관심 효소는 특히 카텝신(cathepsin)으로 불리는 프로테아제 계열을 포함하는 가수분해효소(hydrolase)인 것으로 간주된다.

바람직한 양태의 다른 측면에서, 절단 가능한 리포터-포함 부분은 형광 단백질, 그 예로서, YFP를 포함한다. YFP는 에쿠오리아 빅토리아(Aequorea Victoria) 유래 녹색 형광 단백질의 유전적 돌연변이이며, 514 nm의 여기 피크(excitation peak) 및 527 nm의 방출 피크(emission peak)를 가진다.

또한 절단 가능한 리포터-포함 부분의 고려된 용도는 시트린, 비너스 및 YPet 단백질과 밀접하게 관련된다. 변형은 감소된 클로라이드 감도, 더 빠른 성숙화(maturation), 증가된 밝기를 가진다 (흡광 계수(extinction coefficient) 및 양자 수율(quantum yield)의 산물). 물론, 본 발명에서 언급된 임의의 형광 단백질이 특정 특성 (예를 들어, 스펙트럼(spectral))을 포함하도록 변형되거나 특정 크기로 트렁케이션될 수 있다.

절단 시, 작제물은 두 부분, 세포질 또는 다른 현지 환경에 의해 파괴되거나 그렇지 않으면 분해되는 리포터 포함 부분 및 제 2 부분으로 절단된다. 신호 검출을 표준화하기 위해, 제 2 부분은 유리하게 제 2 형광 단백질을, 바람직하게는 리포터의 반대쪽 끝에 포함할 수 있으며, 이는 분석을 표준화하는데 도움이 될 수 있다. 제 2 형광 단백질은, 예를 들어, CFP(Cyan Fluorescent Protein), m체리 또는 m스트로베리일 수 있다. 리포터-포함 부분은 제 2 형광 물질과 FRET(Forster resonance energy transfer)을 생성하는 방식으로 연결되지 않는다.

따라서, 작제물을 BoNT 또는 다른 절단 물질에 노출하기 전에, 작제물을 함유하는 조성물 (세포-기반이든 그 밖의 것이든 간에)은 기준 신호를 나타내며, 그런 다음 노출 후에 감소된 신호를 나타낸다. YFP 분해 측정을 위해, 직접적으로, 각기 여기된 YFP 방출 (상단, Ex500, Em526) 및 CFP 방출 (중간, Ex434, Em470)이 수집된다. 그 뒤에 상기 방출들에서 백그라운드를 차감하고, 세포 밀도 및 각각의 세포에서의 리포터 발현에 대한 대조군(control)으로서, YFP 방출 값을 CFP 방출 값으로 나눈다. 상기 방출 비율 (YFP/CFP, 하단)이 분석을 보고하는 방법이다.

리포터-포함 부분의 파괴 또는 다른 분해는 BoNT 노출 전보다 노출 후에 훨씬 빠른 속도로 일어난다. 바람직한 양태에서, 리포터 포함 부분의 파괴 또는 다른 분해가 노출 전보다 노출 후에 2x (두 배) 이상 빠르게 일어나는 것이 고려되나, 더욱 바람직하게는 노출 후 속도가 노출 전 속도에 대해 5x 이상, 10x 이상, 100x 이상이다.

바람직한 양태의 또 다른 측면에서, 현지 환경은 살아있는 세포의 세포질이다. 예를 들어, YFP는 C-말단 형광 물질로 사용될 수 있으며, CFP는 N-말단 형광 물질로 사용될 수 있다. 이제 실험 작업은 BoNT/A가 없을 때, YFP가 직접적으로 여기될 수 있으며 방출이 수집될 수 있는 것을 확인했다. 여기는 일반적으로 505nM에서 발생하며 이에 상응하는 방출은 527nM이다. BoNT/A의 존재 시, 리포터가 절단되고 YFP 포함 단편이 방출된다. 상기 단편은 세포에 의해 분해되어 YFP 및 이의 방출을 파괴한다. 따라서, BoNT/A 활성은 YFP 방출의 손실에 대해 측정하여 검출된다. 따라서 상기에 나타낸 모든 한계 및 문제들을 피할 FRET이 요구되지 않는다.

또한, 예를 들어, 용해된 세포의 세포질, 및 리포터 분자에서 절단되었을 때, 절단성(cleavable) 단편을 분해할 수 있지만, 리포터 분자에서 절단되기 전에 절단성 단편을 분해할 수 없거나 훨씬 덜 분해할 수 있는, 하나 또는 그 이상의 효소를 함유하는 합성 배지를 포함한, 살아있는 세포 외에 비-FRET 작제물에 대한 현지 환경이 고려된다.

상기 기재된 작제물을 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공하는 것이 추가로 고려된다. 작제물은 프로모터와 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터인 것이 바람직하다. 바람직한 프로모터는 유도성 프로모터이다.

추가적인 양태에서, 키트는 본 발명에서 고려된 바와 같은 작제물을 적합한 컨테이너에 포함한다.

또한, 본 발명의 주제는, 상기 기재된 바와 같은 작제물을 발현하도록 유전적으로 조작된 세포를 제공하는 단계, 후보 억제제 화합물이 있는 상태에서 상기 세포를 보툴리눔 신경 독소에 노출시키는 단계; 및 상기 보툴리눔 신경 독소에 노출 전 및 노출 후에 세포의 형광 또는 다른 신호를 검출하고, 후보 억제제가 없는 상태에서 보툴리눔 신경 독소에 노출된 세포의 신호와 비교하는 단계를 포함하는 보툴리눔 신경 독소의 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 신호 감소가 회피되는 범위 내에서, 후보 억제제가 보툴리눔 신경 독소를 억제할 수 있는 것으로 간주될 수 있다. 일부 고려된 양태에서, 후보 화합물은 화합물 라이브러리의 구성원 일 수 있으며, 방법은 고효율(high througput) 방법일 수 있다.

본 발명의 주제의 다양한 목적, 특징, 측면 및 장점은 동일한 숫자가 동일한 구성요소를 나타내는 첨부된 도면과 함께, 하기의 바람직한 양태의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.

도 1은 H7 처리가 BoCell™ 분석 감도의 증가를 야기하고, 칼포스틴(calphostin), IBMX, db-cAMP 또는 8-Br-cAMP처리에서는 BoCell™ 분석 감도의 증가를 야기하지 않는 것을 나타내는 그래프이다.
도 2는 H7 효과가 용량 의존적이며, 용량이 세포 생존율에 영향을 미치지 않음을 나타내는 그래프이다.
도 3은 H7의 전-처리 효과 (BoNT/A 첨가 전)를 나타내는 그래프이다. 여기서, H7은 BoNT/A와 인큐베이션될 뿐만 아니라 BoNT/A에 포함된다.
도 4는 1) 경쇄 (BoNT/A 단편)가 아닌 오직 홀로톡신(holotoxin) (완전한 BoNT/A)만이 BoCell™ 분석에서 반응을 이끌어내고 2) BoNT/A 활성이 세포 수용체에 대해 경쟁하는 HcR/A의 첨가에 의해 차단될 수 있음을 나타내는 그래프이다. 따라서, 분석에서의 BoNT/A 반응이 자연적인 메커니즘을 통해 발생한다.
도 5는 서로 다른 제조사의 복수의 H7 로트들(lots)이 모두 감도를 증가시킨 것을 나타내는 그래프이다. (어떤 제조사의 일부 H7 로트가 실제 H7이 아니라는 문헌에 보고가 있으므로, 본 발명자들은 다양한 로트로 효과를 확인하기 원했다.)
도 6은 H7 존재 시에 BoNT/A와의 24시간 및 48시간 인큐베이션 뒤 분석 반응 및 감도를 나타내는 그래프이다. 본 발명자들은 분석 최적화를 통해 <3 pM의 검출 한도가 가능할 것이라고 기대한다.
도 7A는 BoCell™ 작제물의 도식이다.
도 7B는 BoNT/A 세포-기반 리포터들이 YFP 형광 손실로 BoNT/A 활성을 검출하는데 이용된 분석 예시의 도식이다.
도 8A는 BoNT/A-유발에 의한 형광 반응 변화 이미지이다
도 8B는 세포-기반 리포터들의 형광 비율 및 BoNT/A 감도를 나타내는 차트이다.
도 8C는 리포터에 상관없이 세포에서의 BoNT/A의 활성을 나타내는 블롯이다.
도 9는 최신 기술 실시에 따른 정확히 동일한 플레이트의 세포로부터의 YFP 분해 및 FRET의 손실 둘 모두에 대한 방출 데이터를 나타내는 복수의 차트를 포함한다.

구체적인 설명

절단 서열(들)

바람직한 양태에서, 조사 물질은 보툴리눔 독소(BoNT)이며, 절단 서열은 조사 물질과 적당히 일치한다. 예를 들어, BoNT/A, E 및 C는 SNAP-25를 단일 부위에서 절단하고, BoNT/B, D, F, G는 시넵토브레빈(synaptobrevin, Syb)을 단일 부위에서 절단하지만 다른 부위를 절단한다. 또한 BoNT/C는 SNAP-25뿐만 아니라 신탁신(syntaxin)도 절단한다.

고려된 절단 부위 서열은 (a) SNARE 단백질, 모티프, 또는 뮤테인을 바람직하게 포함할 수 있다. 단백질의 "뮤테인(Mutein)"은 본 발명에서 상응하는 자연형 단백질과 30% 이상의 동일성을 가지는 것으로 해석될 것이며, 예를 들어, 자연형 단백질과 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 동일성을 가지는 조성물을 포함한다. 동일성의 변화는 임의의 또는 그 이상의 첨가, 결실 및 치환을 포함할 수 있다. 고려된 뮤테인은 단편, 트렁케이트(truncate) 및 융합 단백질을 포함한다.

트랜스펙션된 세포

트랜스펙션된 세포에서 형성된 하이브리드 단백질(들)은 바람직하게 BoNT/B, D, F 및 G에 대해 세포 내 비히클(vesicle)에 위치하는 경향이 있는 막관통 도메인(transmembrane domain)을 포함함으로써 비히클-결합된 기질을 제시한다. BoNT의 트랜스펙션된 세포로의 중쇄-매개 내포작용(Heavy chain-mediated endocytosis)에 뒤이어 비히클 바깥 표면 상에 경쇄가 제시되어, 경쇄의 프로테아제 활성이 하이브리드 단백질(들)의 절단 서열을 절단할 수 있게 함으로써, 리포터-포함 부분을 절단한 뒤에 파괴되거나 분해되어 테스트되는 신호를 감소시킨다. 예를 들어, 전-장의 Syb는 116 아미노산을 포함하며, 단일 막관통 도메인을 통해 비히클에 국한된다.

트랜스펙션된 세포에서 형성된 하이브리드 단백질(들)은 BoNT/A, C 및 E에 대해 원형질막에 위치하는 경향이 있는 막관통 도메인을 포함하는 것이 바람직하다. 일부 고려된 분석에서, 막-고정 도메인은 팔미토일화 부위(palmitoylation site)를 포함하는 단편을 포함한다. 적합한 막-고정 도메인은 예를 들어, Chapman의 US 20060134722에 기재되었다.

막관통 도메인이 시넵토브레빈의 막관통 도메인, 이의 돌연변이 (예를 들어, 전이(transition), 전환(transversion), 삽입(insertion), 결실(deletions), 역위(inversion), 등)인 것이 특히 바람직하지만, 심지어 비-시넵토브레빈 막관통 도메인도 또한 본 발명의 용도에 적합한 것으로 간주된다. 유사하게, 적어도 일시적으로 하이브리드 단백질을 막에 고정시켜 하이브리드 단백질의 나머지 부분이 세포질에 노출되게 하는 또 다른 폴리펩타이드 모이어티로도 막관통 도메인이 대체될 수 있음을 인식해야 한다.

하이브리드 단백질을 발현하는 트랜스펙션된 세포에 대하여, 세포는 안정하게 트랜스펙션되는(stably transfected) 것이 일반적으로 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 일시적 트랜스펙션도 고려된다. 트랜스펙션된 세포가 신경 세포인 것이 더욱더 일반적으로 바람직하다. 그러나, 많은 다른 비-신경 세포 (포유동물, 설치류, 곤충 세포 및 심지어 효모 및 박테리아 세포까지 포함하는) 또한 본 발명에서 고려된다. 가장 일반적으로, 세포는 하이브리드 단백질(들)을 항시 발현할 것이며, 따라서 이들은 적절한 조절 요소 하에 있을 것이다. 다른 측면에서, 발현도 유도될 수 있다.

바람직한 양태에 따라, BoNT 기질 폴리펩타이드 및 적합한 리포터를 인코딩하는 재조합 핵산 분자, 바람직하게는 발현 벡터는 적합한 숙주 세포로 도입된다. 통상의 기술자는 적합한 발현 벡터, 바람직하게는 포유동물 발현 벡터를 선택할 수 있으며, 방대한 수의 선택권이 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, pCI 및 pSi (Promega, Madison, Wis.)와 같은 pcDNA 벡터 시리즈, CDM8, pCeo4. 대다수의 이러한 벡터들은 바이러스성 프로모터를 사용한다. 바람직하게는, Clontech (Mountain View, CA )의 tet-off 및 tet-on 벡터와 같은 유도성 프로모터가 사용된다.

숙주 세포로서 세포주의 많은 선택이 적합하다. 바람직하게는, 세포는 각각의 BoNT가 그의 독성 활성을 나타내는 종류의 세포이다. 다시 말해서, 세포는 적합한 세포 표면 수용체를 디스플레이(display)하거나 그렇지 않으면 독소가 세포 내로 충분히 효율적으로 이동하도록 하고, 독소가 적합한 기질 폴리펩타이드를 절단하도록 하는 것이 바람직하다. 구체적인 예는 일차 배양된 신경 세포(primary cultured neurons) (대뇌피질 신경 세포(cortical neuron), 해마 신경 세포(hippocampal neuron), 척수 운동신경 세포(spinal cord motor neuron), 등); PC12 세포 또는 PC12 유래 세포주; 일차 배양된 크롬 친화성 세포; 쥐의 콜린성 Neuro 2a 세포주, 인간 아드레날린성 SK-N-SH 세포주 및 NS-26 세포주와 같은 배양된 여러 신경아세포종 세포주를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Foster and Stringer (1999), Genetic Regulatory Elements Introduced Into Neural Stem and Progenitor Cell Populations, Brain Pathology 9: 547-567] 참조.

리포터/절단 부위 작제물의 코딩 영역은 적합한 프로모터의 조절하에 있다. 사용된 숙주 세포의 종류에 따라, 많은 적합한 프로모터가 알려져 있으며 기술 분야에서 쉽게 사용 가능하다. 이러한 프로모터들은 유도성 또는 항시성(constitutive)일 수 있다. 항시성 프로모터는 원하는 폴리펩타이드의 발현을 유도하기 위해 선택될 수 있다. 이러한 발현 작제물은 발현 숙주를 유도성 기질을 함유하는 배지에서 배양할 필요가 없기 때문에 추가적인 이점을 제공할 수 있다. 적합한 프로모터들의 예는 포유동물 시스템에서 LTR, SV40 및 CMV; 박테리아 시스템에서 E. coli lac 또는 trp; 곤충세포 시스템에서 바큘로바이러스 다면체 프로모터(baculovirus polyhedron promoter, polh) 및 진핵 및 원핵 세포 또는 이들의 바이러스에서 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 프로모터들일 것이다. 진균 발현 숙주에 이용하기에 바람직한 강력한 항시성 및/또는 유도성 프로모터들의 예는 진균 유전자들로부터 얻을 수 있는 자일라나제(xylanase, xlnA), 피타아제(phytase), ATP-합성효소(ATP-synthetase), 서브유닛 9 (oliC), 삼탄당인산이성질체화효소(triose phosphate isomerase, tpi), 알콜탈수소효소(alcohol dehydrogenase, AdhA), 알파-아밀라아제(alpha-amylase, amy), 아밀로글루코시다아제(amyloglucosidase, AG--glaA 유전자 유래), 아세트아미다아제(acetamidase, amdS) 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gpd) 프로모터들이다. 강력한 효모 프로모터들의 예는 알콜탈수소효소, 락타아제(lactase), 3-포스포글리세라이트 키나아제(3-phosphoglycerate kinase) 및 삼탄당인산이성질체화효소 유전자들로부터 얻을 수 있는 프로모터들이다. 강력한 박테리아 프로모터의 예는 세포 외 프로테아제(extracellular protease) 유전자 유래 프로모터들뿐만 아니라 SPO2 프로모터를 포함한다.

또한 하이브리드 프로모터들이 발현 작제물의 유도성 조절을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 프로모터는 적합한 숙주에서의 발현을 보장하거나 증가시키는 특징을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 특징은 Pribnow Box 또는 TATA box와 같은 보존 영역(conserved region)일 수 있다. 프로모터들은 뉴클레오티드 서열의 발현 수준에 영향 (유지, 향상 또는 감소와 같은)을 미치기 위해 심지어 다른 서열도 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 다른 서열은 Shl-인트론 또는 ADH 인트론을 포함한다. 다른 서열은 온도 유도성 요소, 화학물질 유도성 요소, 빛 유도성 요소 또는 스트레스 유도성 요소와 같은 유도성 요소를 포함한다. 또한, 전사 또는 번역을 향상시키기에 적합한 요소가 존재할 수 있다. 후자 요소의 예는 TMV 5' 신호 서열이다 (Sleat, 1987, Gene 217: 217-225; and Dawson, 1993, Plant Mol. Biol. 23: 97 참조).

또한 발현 벡터는 발현을 증폭시키기 위해 프로모터에 작용하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, SV40, CMV, 및 폴리오마 시스-작용 요소 (인핸서) 및 선택 마커(selectable marker)가 선별을 위한 표현형 특성을 제공할 수 있다 (예를 들어, 디하이드로엽산환원효소(dihydrofolate reductase) 또는 포유동물 세포를 위한 네오마이신 저항성 또는 E.coli를 위한 엠피실린/테트라사이클린 저항성). 적절한 프로모터 및 선택 마커를 포함하는 적절한 벡터의 선택이 통상의 기술분야의 기술자들의 수준 내에서 자명하다.

바람직하게는, 작제물 코딩 영역은 유도성 프로모터의 조절하에 있다. 세포에서 리포터를 적절한 농도로 조절할 수 있기 때문에, 신호 변화의 측정이 매우 용이하게 되므로, 항시성 프로모터에 비해 유도성 프로모터가 바람직하다

예를 들어, 발현은 Tet-on & Tet-off 시스템 Clontech (Mountain View, CA)을 이용하여 조절될 수 있다. 상기 프로모터의 조절 하에, 유전자 발현이 가역적 및 정량적인 방식으로 정밀하게 조절될 수 있다. 간단히, Tet-on 시스템에서, 하류(downstream) 유전자의 전사는 독시사이클린(doxycycline)이 배양 배지에 존재할 때만 발생한다. 일정 시간 전사 후, 실험자는 독시사이클린을 제거하기 위해 배양 배지를 바꿔서, 새 리포터 단백질의 합성을 중단시킬 수 있다. 따라서, 새로 합성된 리포터 단백질의 백그라운드가 없으며, 실험자는 독소 처리 후에 더 빨리 변화를 볼 수 있다.

형광 분석

형광 분석은 예를 들어, 단일 광자 계수 에피형광 현미경 시스템(photon counting epifluorescent microscope) (특정 범위에서 형광 방출을 관찰하기 위한 적절한 다이크로익 미러 및 필터를 함유하는), 단일 광자 광전자증배관 시스템(photon counting photomultiplier system) 또는 형광계(fluorometer)를 이용하여 수행될 수 있다. 에너지 방출을 시작하기 위한 여기(excitation)가 아르곤 이온 레이저(argon ion laser), 고강도 수은 (Hg) 아크 램프(high intensity mercury arc lamp), 광섬유 광원 또는 원하는 범위에서 여기되도록 적절하게 필터링된 다른 고강도 광원으로 수행될 수 있다. 검출 감도를 향상시키기 위하여 여기/검출 방법에 광전자증배관 방법을 도입하여 보강할 수 있는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 단일-분자 규모로 검출하기 위해 이 광자 교차 상관관계(two photon cross correlation) 방법이 사용될 수 있다 (예를 들어, Kohl et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 99:12161, 2002 참조).

증감제( Sensitizer )

특정 양태에서, 억제제 1-(5-이소퀴놀리닐설포닐)-2-메틸피페라진 디클로라이드 (H7)는 BoCell™ 모델 세포주의 보툴리눔 신경 독소 A 타입 (BoNT/A)에 대한 감도를 현저하게 향상시킨다.

변형된 신경아세포종 세포인 BoCell™의 H7 전처리는 신경 세포 돌기(neurite) 길이 및 세포 당 신경 세포 돌기 개수 모두에서 빠른 증가를 야기한다. H7 효과는 시간 및 용량 둘 모두에 의존적이었으며 최대 효과는 1mM의 H7 처리로 나타났다. 또한, 이 표현형 변화는 H7의 제거에 의해 "구제된(rescued)"것 일 수 있다. 최종적으로, 세포의 H7 전처리는 SNAP-25 리포터 절단으로 측정된 상기 세포들의 BoNT/A 처리에 대한 감도를 현저하게 증가시켰다.

또한, cAMP 및 cGMP 키나아제 선택적 억제제인 약물 HA1004의 세포 전처리는 신경아세포종 세포에 형태적 변화를 유도하는 것을 실패하였지만, H7은 cAMP-의존적 키나아제 및 cGMP-의존적 키나아제를 억제하여, 효과가 PKC 억제에 특이적임을 시사한다 (1990, JBC paper). 한편, 일부 PKA 및 PKC의 억제제들을 포함하는 신경 세포 분화제(differentiators)로 알려진 다른 분자들은 BoCell™ 분석 감도를 증가시키지 않는다. 증가된 감도는 이전에 신경 세포 돌기 형성을 유도하는 것으로 나타난 다른 약물들: 칼포스틴 C, IBMX, 디부티릴-cAMP 및 8-브로모아데노신-cAMP에서는 나타나지 않았다.

따라서, 선택적인 이소퀴놀리닐 유사체 및 다른 약물들에 의한 특정 PKC 아이소형의 억제는 수립된 모델 세포주에서 신경 세포 돌기 형성 유도에 의한 BoNT/A 감도의 유사 증가를 암시할 수 있음이 고려된다.

또한 배양 배지가 H7 및 B27 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있고, 배양 배지의 삼투압이 특정 보툴리눔 독소, 특히 표 1에 기재된 특정 보툴리눔 독소에 대한 효과를 최적화하기 위해 변경될 수 있음이 고려된다. 삼투압은 특히 염 및/또는 당 함량 변경을 포함하는, 알려진 원칙에 따라 조정될 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "최적화(optimization)"는 원하는 결과를 향상시키기 위한 조치를 의미하며, 실제로 최상의 결과를 얻을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.

증감제 실험 결과

우리의 발견은 우리의 BoCell™ 세포를 화합물 H7으로 처리하면 우리의 BoCell™ 분석 감도가 증가한다는 것이다. 방법의 관점에서, H7 처리로 인한 가능한 기술적 장점은 하기를 포함한다:

1. 감소된 분석 시간. 통용되는 분석 조건으로 BoNT/A를 72 시간 처리한 감도와 동일한 감도인 BoCell™ BoNT/A 감도를 H7 처리로 BoNT/A 처리 24 시간 후에 얻는다. 분석 시간 48시간 감소.

2. 분석 감도의 전반적인 증가. H7을 이용하여 BoNT/A 48시간 처리시 분석 감도를 통용되는 분석 조건에 비해 0.5 로그 내지 1.0 로그 증가시킬 수 있다. 분석 최적화로 감도가 더 증가될 것이라고 기대한다.

3. 다른 BoNT 혈청형에 대한 신경 세포 감도 증가. 본 발명자들은 최근 이를 테스트하는 중이다.

따라서 본 발명에서 고려된 화합물의 이용이 분석 감도를 0.5 로그 이상, 0.6 로그 이상, 0.7 로그 이상, 0.8 로그 이상, 0.9 로그 이상 및 1.0 로그 이상 증가시킬 수 있음이 고려된다. 문맥이 다르게 나타내지 않는 한, 본 발명에서 설명한 모든 범위가 이들의 종점(endpoint)을 포함하는 것으로 해석되어야 하며 미정-수량 범위(open-ended ranges)는 상용적으로 실제 값(practical values)만을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 유사하게, 모든 값의 목록은 문맥이 다르게 나타내지 않는 한 중간값을 포함하는 것으로 고려되어야 한다.

도 1 내지 6은 H7을 이용하여 발생한 데이터를 보여준다.

도 1에서, BoCell을 플레이팅하고, A) H7, B) 칼포스틴 C, C) IBMX, D) 디부티릴-사이클릭 AMP (db-cAMP) 또는 E) 8-브로모(bromo)-사이클릭 AMP (8-Br-cAMP)로 표시된 농도로 24 hr 동안 전-처리하였다. 대조군 세포들은 테스트된 약물의 가장 높은 농도와 동일한 비히클로 처리하였다. 전-처리 후, BoCell들을 표시된 농도의 약물을 함유하는 BoNT/A로 추가 24 hr 동안 테스트하였다. 분석 반응은 Tecan™ Infinite 500 시리즈 마이크로플레이트 리더를 이용하여 485 및 535 nm에서의 방출을 읽음으로써 수집되었다. 방출 비율 (YFP/CFP)을 BoNT/A 농도의 함수로서 플로팅하였다. 데이터는 세 번 반복 실행한 샘플 평균의 평균 ± 표준 편차로 나타낸다.

도 2에서, A) BoCell을 플레이팅하고, 표시된 농도의 H7로 24 hr 동안 전-처리하였다. 대조군 세포들은 테스트된 약물의 가장 높은 농도와 동일한 비히클로 처리하였다. 전-처리 후, BoCell들을 표시된 농도의 약물을 함유하는 BoNT/A로 추가 24 hr 동안 테스트하였다. Tecan™ Infinite 500 시리즈 마이크로플레이트 리더를 이용하여 485 및 535 nm에서의 방출을 읽음으로써 분석 반응이 수집되었다. 방출 비율 (YFP/CFP)을 BoNT/A 농도의 함수로서 플로팅하였다. 데이터는 세 번 반복 실행한 샘플 평균의 평균 ± 표준 편차로 나타낸다. B) BoCell을 트립판 블루(trypan blue)로 염색하였으며, 그 후 50의 3x 필드(field) 또는 그 이상의 세포들을 처리 당 계수하였으며 세포 생존율이 계산되었다.

도 3에서, BoCell을 플레이팅하고, 0.75 mM H7로 3, 6, 12 또는 24 hr 동안 전-처리하였다. 전-처리 후에, BoCell들을 0.75 mM H7를 함유하는 BoNT/A로 추가 24 hr 동안 처리하였다. Tecan™ Infinite 500 시리즈 마이크로플레이트 리더를 이용하여 485 및 535 nm에서의 방출을 읽음으로써 분석 반응이 수집되었다. 방출 비율 (YFP/CFP)을 BoNT/A 농도의 함수로서 플로팅하였다. 데이터는 세 번 반복 실행한 샘플 평균의 평균 ± 표준 편차로 나타낸다.

도 4에서, A) BoCell을 플레이팅하고 0.75 mM H7로 24 hr 동안 전-처리하였다. 전-처리 후, BoCell을 0.75 mM H7를 함유한 BoNT/A 홀로톡신 또는 0.75 mM H7를 함유한 BoNT/A 경쇄로 추가 24 hr 동안 처리하였다. B) BoCell은 0.75 mM H7로 24 hr 동안 전-처리되었다. 10 mM HcR/A 또는 비히클를 BoNT/A 첨가 1 hr 전에 웰에 첨가하였다. Tecan™ Infinite 500 시리즈 마이크로플레이트 리더를 이용하여 485 및 535 nm에서의 방출을 읽음으로써 24 hr 후에 분석 반응이 수집되었다. 방출 비율 (YFP/CFP)을 BoNT/A 농도의 함수로서 플로팅하였다. 데이터는 세 번 반복 실행한 샘플 평균의 평균 ± 표준 편차로 나타낸다.

도 5에서, BoCell은 세 독립적인 제조사 (목록)의 0.75 mM H7로 24 hr 동안 사전-인큐베이션되었고, 그 후 0.75 mM H7 존재하에 BoNT/A로 처리되었다. Tecan™ Infinite 500 시리즈 마이크로플레이트 리더를 이용하여 485 및 535 nm에서의 방출을 읽음으로써 24 hr 후에 분석 반응이 수집되었다. 방출 비율 (YFP/CFP)을 BoNT/A 농도의 함수로서 플로팅하였다. 데이터는 세 번 반복 실행한 샘플 평균의 평균 ± 표준 편차로 나타낸다.

도 6에서, BoCell은 0.75 mM H7로 24 hr 동안 사전-인큐베이션되었고, 그 후 0.75 mM H7 존재하에 BoNT/A로 처리되었다. Tecan™ Infinite 500 시리즈 마이크로플레이트 리더를 이용하여 485 및 535 nm에서의 방출을 읽음으로써 24 hr 및 48 hr 후에 분석 반응이 수집되었다. 방출 비율 (YFP/CFP)을 BoNT/A 농도의 함수로서 플로팅하였다. 데이터는 세 번 반복 실행한 샘플 평균의 평균 ± 표준 편차로 나타낸다.

비- FRET 기반 분석

도 7A는 BioSentinel의 BoCell™ A BoNT/A 작제물을 나타낸다. 리포터 형광 물질인 YFP 및 표준화 형광 물질인 CFP가 절단 서열인 SNAP-25 (녹색)에 의해 연결된다. SNAP-25 팔미토일화는 리포터를 원형질막에 국한시킨다.

도 7B는 BoNT/A 세포-기반 리포터들이 YFP의 형광 손실로 BoNT/A 활성을 검출하는데 사용된 분석의 예시를 나타낸다. 여기서, YFP 모이어티는 BoNT/A가 없이 직접 여기되어 형광 방출을 초래한다. BoNT/A에 의한 리포터 절단은 YFP 모이어티를 포함하는 C-말단 리포터 단편을 세포질로 방출시킨다. 단편은 빠르게 분해되고, 따라서, YFP 방출이 사라진다. CFP 신호는 여전히 세포 간(cell-to-cell) 리포터 발현 수준 및 세포 밀도에 대한 대조군으로 사용되었다.

놀랍게도, YFP와 관련된 모든 형광 단백질들이 리포터 형광 물질로 효과적이지는 않았다. 예를 들어, 도 8A 내지 8C는 YFP 또는 밀접하게 관련된 비너스 유도체 포함 리포터는 세포에서 BoNT/A 활성을 검출할 수 있으나, m체리 또는 m스트로베리 포함 리포터는 그렇지 못하다는 증거를 제공한다. 여기에서, Neuro2A 세포들은 96-웰 플레이트에서 70% 컨플루언시(confluency)가 될 때까지 성장하였고 Lipofectamine 2000 (Invitrogen™)을 이용하여, 표시된 N-말단 및 C-말단 (N-term/C-term) 형광 물질 쌍(fluorophore pair)을 포함하는 리포터로 일시적으로 트랜스펙션되었다. 24 h 후에, 세포들은 10 nM BoNT/A 존재 또는 부재하에 37 ℃에서 72 h 동안 페놀 레드-비함유 MEM 배지 100 ㎕에서 인큐베이션되었다.

도 8A는 형광 반응에서의 BoNT/A-유도 변화를 보여준다. 20x 확대 Nikon™ TE2000-U 형광 현미경 및 Nikon NIS Elements 3.4 소프트웨어를 이용하여 반-자동 YFP 및 CFP 형광 측정이 수행되었다. 도시된 것은 C-말단/N-말단 형광 단백질 (FP) 형광 비율에 대해 위색-착색된(pseudo-colored) 랜덤하게 선택된 필드(field)이다. 비율은 각각의 형광 물질의 직접적인 여기에 따라 수집된 방출로부터 계산되었다.

도 8B는 세포-기반 리포터의 형광 비율 및 BoNT/A 감도를 나타낸다. 조건 당 랜덤하게 선택된 30개의 세포들이 10 nM BoNT/A의 존재 또는 부재시의 형광 비율에 대해 분석되었다. 다른 3개의 웰에서의 5개의 현미경 필드(microscopic fields)로부터 30개 세포의 평균 신호를 나타낸다. 과-포화된 형광을 나타내는 세포들은 제외되었다.

도 8C는 BoNT/A가 리포터에 상관없이 세포에서 활성임을 나타내는 블롯이다. 모든 리포터는 BoNT/A 존재시 일부 절단을 보이며, 모든 자연형 SNAP25는 절단되었다. 세포들은 상기에 기재된 바와 같이 트랜스펙션되었으며 BoNT/A로 처리되었으나 6-웰 플레이트로 스케일 업되었다. BoNT/A와 인큐베이션한지 72 h 후, 세포들은 혈청-비함유 MEM으로 3회(3X) 세척되고, 스크래핑에 의해 수집되고, M-Per Lysis Buffer (Pierce™)를 이용하여 용해되었다. 세포 용해물 40 ㎍을 SDS-PAGE 를 실시한 후 니트로셀룰로오스 페이퍼로 옮기고 및 SNAP-25에 대해 유도된 항체 (clone 71.2, Synaptic Systems)를 이용하여 면역 블롯 분석하였다. 화살표는 전-장의 리포터 (채워진 화살표) 및 절단된 형태의 리포터 (빈 화살표)의 위치를 표시한다. 전-장 (*) 및 절단된 (**) 자연형 SNAP-25가 표시되었다.

본 발명의 주제는 탈-보호되어 그 뒤에 세포질 또는 다른 현지 환경에 의해 어떤 방식으로 분해될 수 있는 리포터가 있는 작제물을 가지는 임의의 분석을 위해 절단 가능한 기질 이상으로 확장될 수 있다. 예를 들어, 민감한 리포터는 베이트 도메인과 결합했을지도 모르는 재조합 단백질의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용되는 '베이트(bait)' 도메인을 포함하도록 변형될 수 있다. 결합 단백질로 보호되는 베이트 도메인 없이, 민감한 리포터가 분해될 것이다. 이러한 분석에서, 베이트 결합 파트너(binding partner)를 발현하는 세포들은 발광하는 반면, 결합 단백질을 발현하는 세포들은 민감한 리포터가 분해되지 않도록 보호하기 위해 복합체를 형성할 것이다. 베이트 도메인은 바람직하게는 작은 펩타이드일 수 있으며, 결합 파트너는 단백질 (또는 돌연변이 단백질) 라이브러리의 구성원일 수 있다. 또한 시스템은 단일 테스트 단백질 (또는 테스트 단백질 라이브러리)에 대해 테스트된 베이트 도메인의 라이브러리가 되도록 뒤바뀔 수 있다.

이러한 각각의 경우에 노출-후 세포질 또는 다른 현지 환경에 의해 분해되지 않거나, 적어도 노출-후 제 1 리포터보다 훨씬 더 천천히 분해되는 제 2 리포터를 포함하도록 고려되는 것이 바람직하다.

또한 여전히, 리포터가 적합한 형광 물질들로부터 용이하게 선택될 수 있는 반면, 리포터가 (a) 세포에서 보호 없이 상대적으로 빠른 회전율(turnover)을 가지는 것으로 알려지고, (b) 결합 파트너와의 상호작용에 의해 보호될 수 있는 것으로 정의된 기능을 가진 임의의 다른 단백질 또는 다른 요소로 대체되거나 보강될 수 있음이 고려된다. 정의된 기능은 리포터 유전자에 대한 전사 활성화인자(transcription activator), 치사 유전자(lethal genes)에 대한 전사 억제인자(repressor), 등 (이에 대해 쉽게 확인 또는 선택될 수 있는 모든 것들)을 포함한다.

도 9는 최신 기술 실시에 따른 정확히 동일한 플레이트의 세포로부터의 YFP 분해 및 FRET의 손실 둘 모두에 대한 방출 데이터를 나타내는 복수의 차트를 포함한다. YFP 분해에 대해, 직접적 및 특이하게 여기된 YFP 방출 (상단, Ex500, Em526) 및 CFP 방출 (중간, Ex434, Em470)이 수집된다. 그 뒤에 상기 방출들에서 백그라운드를 차감하고, 각각의 웰에서의 세포 밀도 및 리포터 발현의 대조군으로서, YFP 방출을 CFP 방출로 나눈다. 그 뒤 상기 방출 비율 (YFP/CFP, 하단)이 분석 보고를 위해 사용된다.

FRET 손실에 대해, FRET 방출 (상단, Ex434, Em526) 및 CFP 방출 (중간, Ex434, Em470)이 수집된다. 그 뒤에 상기 방출들에서 백그라운드가 차감되고, 각각의 웰에서의 세포 밀도 및 리포터 발현에 대한 대조군으로, FRET 방출을 CFP 방출로 나눈다. 통상의 방법과 비교하기 위한 방출 비율 (FRET/CFP, 하단)을 본 발명에 나타낸다.

핵심 비교는 직접적으로 여기된 YFP의 손실 대 FRET 방출의 손실이다. 측정 및 해당 곡선의 비교로부터, YFP 분해에 대한 전반적인 동적 범위(dynamic range)가 FRET 방출 손실의 동적 범위보다 훨씬 더 큰 것이 바로 명백해진다. 일부 경우에, 미가공 FRET 방출만을 전적으로 봤을 때 BoNT로 처리하지 않은 세포와 포화 농도의 BoNT가 처리된 세포 사이에 통계학적인 차이가 없다. FRET 방법의 손실에 대해, BoNT 용량 반응은 오직 CFP (공여체) 방출로 FRET 방출을 나눈 뒤에야 확실해진다. 탈-소멸(de-quenching)로 인해 CFP (공여체) 방출은 리포터 절단에 대한 반응으로 작은 증가 방출을 나타낸다.

요컨대, FRET 방법의 손실은 리포터에서 BoNT-유도 변화가 매우 저조하거나 전혀 변화 없음을 보고하며, 따라서 정확한 정성 및 정량 측정을 위해 사용될 수 없다. 반대로, 본 발명에서 고려된 바람직한 방법은 높은 정도의 특이성 및 재현성을 가지며, 이는 정성 및 정량 분석 모두에 대해 데이터에 의존할 수 있게 한다.

본 발명의 개념에서 벗어남 없이 이미 기재된 것들 이외에 더 많은 변형이 가능한 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 주제는 첨부된 청구항의 범위를 제외하고 제한되지 않는다. 게다가, 명세서 및 청구항 모두의 해석에서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 가능한 가장 넓은 방식으로 해석되어야 한다. 특히, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 비 독점적인 방식으로 요소, 구성 요소 또는 단계를 말하는 것으로 해석되어야 하며, 참조된 요소, 구성 요소, 또는 단계가 존재하거나, 사용되거나 또는 명시적으로 참조되지 않은 다른 요소, 구성 요소 또는 단계와 결합될 수 있음을 나타낸다. 명세서의 청구범위가 A, B, C … 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 무언가를 말하는 경우, 본문은 A 및 N, 또는 B 및 N, 등이 아닌, 군으로부터 오직 하나의 요소를 필요로 하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

(a) 보툴리눔 독소 부분과 상호작용하는 절단 부위가 있는 분자 및 (b) 보툴리눔 독소에 의해 유도되는 절단 부위에서의 분자의 절단에 반응하는 신호를 보고하는 리포터를 가지는 세포를 분석에 제공하는 단계; 및
분석 감도를 0.5 로그 이상 증가시키는데 효과적인 화합물을 함유하는 배양 배지에서 세포를 인큐베이션하는 단계;
세포를 보툴리눔 독소의 양으로 처리한 뒤, 신호를 감지하고, 보툴리눔 독소의 존재 또는 부재에 따른 신호를 비교하는 단계를 포함하는, 보툴리눔 독소의 존재를 검출하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 (a) 이소퀴놀리닐(isoquinolynyl) 및 (b) 단백질 키나제 억제제(protein kinase inhibitor)로부터 선택되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 1-(5-이소퀴놀리닐설포닐)-2-메틸피페라진 디클로라이드 (H7)을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 배양 배지는 B27을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 배지의 삼투압(osmolarity)은 Botox®에 최적화된 방법.
제 1항에 있어서, 상기 배지의 삼투압은 Dysport®/Reloxin®에 최적화된 방법.
제 1항에 있어서, 상기 배지의 삼투압은 Xeomin®에 최적화된 방법.
제 1항에 있어서, 상기 리포터는 세포에서 발현되는 인공 작제물인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 분자는 제 1 형광 물질(fluorophore) 및 절단 부위를 포함하며, 절단 부위는 SNARE 단백질, 모티프 및 뮤테인(mutein) 중 하나 이상을 포함하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 제 1 형광 물질은 YFP(Yellow Fluorescent Protein), 시트린(Citrine), 비너스(Venus) 및 YPet 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 제 1 형광 물질은 YFP를 포함하는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 분자는 리포터 및 제 2 형광 물질을 포함하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 리포터는 제 2 형광 물질과 FRET(Forster resonance energy transfer)을 발생하는 방식으로 연결되지 않는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 세포는 리포터의 분해를 절단 전보다 절단 후에 두 배 이상 빠르게 촉진시키는 효소를 발현하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 세포는 리포터의 분해를 절단 전보다 절단 후에 다섯 배 이상 빠르게 촉진시키는 효소를 발현하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소의 존재가 기준 신호에서 신호가 감소하는 것과 관련된 방법.
(i) 인공 작제물 및 효소를 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서,
상기에서 작제물은 (a) 리포터-포함 부분 및 (b) 작제물의 나머지로부터 리포터-포함 절단 부위를 생성하는 방식으로 보툴리눔 독소 부분과 상호작용하는 절단 부위를 가지며,
상기에서 조성물은 기준 신호를 식별하는 방출(emissions)을 나타내고; 및
상기에서 효소는 리포터-포함 부분의 분해를 절단 전보다 절단 후에 열 배 이상 빠르게 촉진시키는 단계;
(ii) 기준 신호로부터 기준 방출 측정값을 얻는 단계;
(iii) 조성물을 보툴리눔 독소에 노출시킨 뒤, 이로부터 테스트 방출 측정값을 얻는 단계; 및
(iv) 기준 방출 측정값과 테스트 방출 측정값을 비교하는 단계를 포함하는, 보툴리눔 독소의 정성 및 정량 검출 방법.
제 17항에 있어서, 상기 리포터-포함 부분은 형광 물질을 포함하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 형광 물질은 YFP를 포함하는 방법.
제 17항에 있어서, 상기 형광 물질은 YFP, 시트린, 비너스 및 YPet 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제 17항에 있어서, 상기 형광 물질은 YFP, 시트린, 비너스 및 YPet 단백질 중 하나 이상의 유도체인 방법.
제 17항에 있어서, 상기 작제물은 제 2 형광 단백질을, 바람직하게는 리포터-포함 부분의 반대쪽 끝에 추가로 포함하는 방법.
제 22항에 있어서, 상기 리포터-포함 부분은 제 2 형광 물질과 FRET을 발생하는 방식으로 연결되지 않는 방법.
제 22항에 있어서, 상기 리포터는 YFP를 포함하며, 제 2 형광 단백질은 CFP(Cyano Fluorescent Protein)를 포함하는 방법.
제 22항에 있어서, 상기 리포터는 YFP, 시트린, 비너스 및 YPet 단백질 중 하나 이상을 포함하고, 제 2 형광 단백질은 CFP, m스트로베리(mStrawberry) 및 m체리(mCherry) 중 하나 이상을 포함하는 방법.
제 17항에 있어서, 상기 리포터-포함 부분은 발색단(chromophore)을 포함하는 방법.
제 17항에 있어서, 상기 작제물은 살아있는 트랜스펙션된 세포에 의해 생산되는 방법.
제 17항에 있어서, 상기 조성물은 살아있는 트랜스펙션된 세포에 함유되며, 절단 부위는 SNARE 단백질, 모티프 및 뮤테인 중 하나 이상을 포함하고, 리포터는 YFP, 시트린, 비너스 및 YPet 단백질 중 하나 이상을 포함하며, 추가로 제 2 형광 단백질을 포함하는 방법.
제 28항에 있어서, 상기 기준 방출 측정값은 리포터-포함 부분을 직접 여기(exciting)하여, 바람직하게는 YFP를 여기하여 얻어지는 방법.
제 28항에 있어서, 상기 테스트 방출 측정값은 리포터가 YFP를 포함하고 제2 형광 단백질이 CFP를 포함하는 경우, 리포터 및 제 2 형광 단백질의 여기된 방출을 별도로 측정함으로써 얻어지는 방법.
제 28항에 있어서, 세포 밀도 및 각각의 세포에서의 리포터 발현에 대한 대조군(control)으로, 상기 YFP 방출을 CFP 방출로 나누는 방법.
인공 작제물 및 효소를 가지는 세포를 포함하는, 조사 물질의 존재를 테스트하기 위한 분석법으로서,
상기에서 작제물은 보호된 부분이 리포터를 포함하도록 선택된, 보호된 부분 및 보호하는 부분을 가지며, 조사 물질은 시험관 내에서 보호된 부분을 탈-보호하도록 작용하고, 상기에서 효소는 보호된 부분이 보호되었을 때보다 탈-보호되었을 때 열 배 이상 빠르게 분해되도록 하고, 그렇게 함으로써 리포터로부터 얻을 수 있는 신호를 감소시켜 조사 물질의 정량적 측정에 사용되는 분석법.
제 32항에 있어서, 상기 리포터는 형광 물질, 바람직하게는 YFP, 시트린, 비너스 및 YPet 단백질인 형광 물질 중 하나 이상을 포함하며, 작제물은 SNARE 단백질, 모티프 및 뮤테인 중 하나 이상을 포함하는 분석법.
제 32항에 있어서, 제 2 형광 단백질, 바람직하게는 CFP, m스트로베리 및 m체리 중 하나 이상을 추가로 포함하는 분석법.
제 32항에 있어서, 상기 작제물은 막-국소화 도메인(membrane-localizing domain)을 포함하고, 효소는 세포의 세포질에 존재하는 분석법.