TWI647237B - 具重複性螢光團之酵素檢測法 - Google Patents

具重複性螢光團之酵素檢測法 Download PDF

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Abstract

本發明公開之組合物及方法提供一種快速、靈敏且精準的基於細胞之酵素活性檢測法，特別是肉毒桿菌毒素相關之酵素活性。提供表現一構造之一細胞，該構造包含一錨區、一切割位置及具有二個以上相同報導肽之一報導區。在該切割位置的酵素活性將該報導區釋放至該胞質液，多個降解事件發生在其中。在該訊號中觀察到的變化正比於該酵素活性。

Description

具重複性螢光團之酵素檢測法
本申請案主張於西元2013年10月25日申請之第61/895,533號美國臨時申請案、西元2013年10月30日申請之第61/897,352號美國臨時申請案、西元2014年6月19日申請之第62/014,586號美國臨時申請案及西元2014年10月1日申請之第62/058,532號美國臨時申請案之優先權。
本發明領域係關於蛋白酶檢測法，特別關於肉毒桿菌(Clostridium botulinum)神經毒素之蛋白酶檢測法。
肉毒桿菌神經毒素(Botulinum neurotoxins，BoNTs)係由肉毒桿菌(Clostridium botulinum)製造，且已知其為最強有力之毒素的其中之一。這些毒素係公認為食物中毒之源頭，時常導致受害者嚴重的傷害甚至死亡。有若干結構相似的肉毒桿菌神經毒素或血清型(A型至G型肉毒桿菌神經毒素及一被提出的H型肉毒桿菌神經毒素)，每一種係由一重鏈(~100kD)和一輕鏈(~50kD)構成。重鏈係引導毒素藉由受體引導的細胞內吞作用進入一目標細胞。一旦內化，輕鏈會自胞內體囊泡內腔易位進入胞質液中，並作為一鋅依賴性蛋白酶以切割會引導囊泡目標膜融合之受質專一性蛋白，而囊泡目標膜融合係釋放神經傳導物質重要的過程。
肉毒桿菌神經毒素受質蛋白質包含細胞膜蛋白-突觸融合蛋白、膜周邊蛋白-可溶性NSF固著蛋白-25(SNAP-25，以下稱為SNAP-25)及囊泡膜蛋白-突觸囊泡蛋白(Syb)。這些蛋白質統稱為可溶性N-乙基馬來醯亞胺敏感性因子附著蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，以下稱為SNARE)蛋白。切割SNARE蛋白會阻礙囊泡與細胞膜的融合而破壞神經肌肉接合處神經傳導物質之釋放。在SNARE蛋白中，突觸融合蛋白及SNAP-25通常駐留在目標膜，因此被稱 為t-SNAREs，而突觸囊泡蛋白只與在突觸內之突觸囊泡有關，因此被稱為v-SNARE。此三種蛋白質合起來形成一複合物，被認為係引導囊泡膜和細胞膜間融合所需之最小機構。A型、E型及C型肉毒桿菌神經毒素切割SNAP-25，而B型、D型、F型及G型肉毒桿菌神經毒素在個別且不同的位置上切割突觸囊泡蛋白(Syb)。C型肉毒桿菌神經毒素除了SNAP-25以外亦切割突觸融合蛋白。由於肉毒桿菌神經毒素作為酵素，甚至微量即可對一感染的個體有一破壞性極大的影響。
雖然肉毒桿菌毒素係食物中毒之一源頭且具有作為生物恐怖武器使用之潛力，但也有醫療之應用。近來，肉毒桿菌毒素已用於治療與多餘的肌肉收縮相關之症狀(例如斜視)，及用於治療持續性偏頭痛。其也廣泛地用於美容目的，其中皮膚下小肌肉的選擇性麻痺可暫時地減少與年齡相關之皺紋的出現。由於如此廣泛的使用而有靈敏地且快速地表徵肉毒桿菌神經毒素蛋白質的需求。這個過程由於需要精準定量肉毒桿菌神經毒素活性而非簡單定量肉毒桿菌神經毒素蛋白質出現的量而複雜化，如用於分離這些蛋白質的純化過程會導致這些蛋白質顯著程度之變性及去活化。
現在普遍用於檢測肉毒桿菌神經毒素及定量其活性之方法係利用小鼠進行毒性試驗。這些方法需要使用大量的小鼠並耗費時間且無法用於研究毒素之催化動力學。現亦已發展許多基於研發用於抗肉毒桿菌神經毒素蛋白質之抗體的免疫試驗系統，然而這些試驗可用於定量肉毒桿菌神經毒素蛋白質出現的量，但無法用於測定該毒素的酵素活性。為了測量這些毒素的酵素活性，已發展用於檢測肉毒桿菌神經毒素反應產物的方法，例如利用高效能液相層析法或針對切割產物的免疫測定法。然而，這些方法通常複雜、耗時且昂貴(例如使用特殊的抗體)，使得其難以自動化且不能應用於大規模之篩選。
近來，研究人員開始探索使用螢光共振能量轉移(FRET)方法於定量酵素活性。螢光共振能量轉移方法涉及使用兩個螢光部分，一供者螢光團及一受者螢光團。該供者發光體的發射光譜與該受者發光體的激發光譜重疊，因此在限定的情況下及在適當的螢光團間距及方向，該供 者發光體的激發可導致該受者發光體的發射。這種能量轉移之效能高度依賴於該供者發光體及該受者發光體間之距離，且許多螢光試驗已經發展利用此現象。在基於細胞之檢測法的應用，這樣的螢光共振能量轉移探針可藉由基因操作在細胞內產生。在這樣的方法中，通常使用螢光蛋白，特別是如WO2008/145301A1號國際專利申請案(Tasdemir及Corazza)所述之綠色螢光蛋白及其變體，因為這些蛋白質不需要額外的輔因子或受質以發出螢光。這些檢測法中之其中一些能夠檢測酵素活性。例如，第7,749,759號美國專利案(Fernandez-Salas、Steward及Aoki)揭露了含有一梭菌(Clostridium)毒素之一受質的細胞的使用，其中該受質(其由一基因構造表現)包含一供者螢光團及一受者螢光團，且其被由梭菌毒素切割之一肽所分開。暴露於梭菌毒素係導致受質之裂解，而供者螢光團與受者螢光團間隨後分離係導致觀察到的螢光的變化。然而，這種基於螢光共振能量轉移之檢測法有極限。供者螢光團之激發光譜及受者螢光團之激發光譜經常重疊，導致來自受者螢光團一固有的高背景訊號，即使在缺乏螢光共振能量轉移的情況下。同樣地，在一些報導構造中，該些螢光團可能自體聚合而在聚合構造中及/或聚合構造之間形成螢光團複合物，其不會在目標位置裂解處分離。此外，為了提供更複雜的酵素結合及切割位置(例如梭菌神經毒素之酵素結合及切割位置)，使用較長的肽序列作為切割位置可顯著地減少被這些肽序列隔開之螢光團間的能量轉移效能。
由於這種低效能及高背景螢光，基於螢光共振能量轉移之構造常常在細胞中過度表現，因而導致不良的細胞毒性及構造聚集。第6,936,428號美國專利(Davis及Vellencourt)描述了一方法，其中利用供者及受者螢光蛋白之螢光共振能量轉移構造中的背景螢光藉由使用構造而降低，該構造中成對的多聚體蛋白螢光團被定位以形成分子內同質二聚體，從而降低了會產生背景螢光之供者/受者異質二聚體的形成。此外，第8,067,231號美國專利(Fernandez-Salas等人)描述了一種基於細胞之檢測法，其可觀察到自一細胞膜至細胞質空間的可觀察到的螢光分布之改變，然而所述特性分析需要精密的光學儀器及影像分析。
本文所引用之所有其他的公開透過引用相同範圍併入，如同 每一個別的公開或專利申請被具體地且個別地指出透過引用而併入。在一併入文獻中之一技術用語之使用或定義與本文所提供之技術用語定義不一致或相反時，適用本文所提供之技術用語定義，而不適用文獻中之技術用語定義。
因此，改良的組合物及方法是需要的以提供快速且精準的肉毒桿菌神經毒素及肉毒桿菌神經毒素活性的特性分析。
本發明提供使用於檢測肉毒桿菌神經毒素(BoNTs)之檢測法的組合物及方法，其使用包含相同報導體的至少二個出現之一構造，例如一螢光團或發色團。該構造包含一錨定位置，其將該構造附著於一細胞膜及/或囊泡膜，兩者相應地提供保護該報導體免於胞質液中之降解活性。該構造亦包含一切割位置，其將該錨定位置及該些報導體的至少其中之一分開，且亦作為一酵素活性(例如蛋白酶活性)之一受質。在該切割位置之酵素活性自該構造釋放出報導體，在胞質液中該些報導體隨後之降解會導致自一基線訊號起始之一可測量到的改變，且其正比於酵素活性。
本發明概念之實施例包含一報導構造及細胞，該報導構造可用於表徵一酵素活性(例如一肉毒桿菌神經毒素之活性)，而該些細胞包含用於編碼該一報導構造之一核酸。該報導構造包含一膜錨定域，其與一細胞之一膜交互作用(例如一細胞膜或一囊泡膜)；一報導域，其包含一訊號產生肽之二個以上之出現(例如對應於一螢光蛋白或具有至少80%之序列與綠色螢光蛋白相同之一肽序列)；及一切割位置，其位於該膜錨定域及該報導域之間。該些訊號產生肽產生難以區別的訊號，而由該報導域產生之該總訊號係這些個別還難以區別的訊號之一合計。該切割位置包含一肽，其易感於該酵素活性之切割(例如一SNARE蛋白或其一片段)，且該切割導致該報導域釋放至該細胞質中。該些切割位置可被選為易感於一種以上酵素(例如A型肉毒桿菌神經毒素及E型肉毒桿菌神經毒素兩者)之切割。在釋放至該細胞質中後，該報導域經歷降解事件，個別的降解事件引起每一該訊號產生肽之一訊號的減少且導致該報導域之該合計訊號的一逐漸減 少。在一些實施例中，一連接肽介於該些訊號產生肽之間。在本發明概念之一較佳實施例中，該構造可被一種以上的酵素切割，而相較於具有帶有一單一訊號產生肽之一報導域的一同功構造，該構造表現出降低的偏差於以一酵素活性(例如A型肉毒桿菌神經毒素)切割與以一第二酵素活性(例如E型肉毒桿菌神經毒素)切割之易感性。在一些實施例中，該報導構造包含一輔助報導域，其提供一訊號且可區別於該報導域之訊號。
本發明概念之另一實施例係藉由提供表現一報導構造之一細胞以表徵一酵素活性之一方法，以疑似含有該酵素活性之一樣本接觸該細胞，然後觀察在該酵素活性存在下該報導構造產生之一訊號的一下降。該報導構造包含一膜錨定域，其與一細胞之一膜交互作用(例如一細胞膜或一囊泡膜)；一報導域，其包含一訊號產生肽之二個以上之出現(例如對應於一螢光蛋白及/或具有至少80%之序列與綠色螢光蛋白相同之一肽序列)；及一切割位置，其位於該膜錨定位置及該報導域之間。該些訊號產生肽產生難以區別的訊號，而由該報導域產生之總訊號係這些個別還難以區別的訊號之一合計。該切割位置包含一肽，其易感於該酵素活性之切割(例如一SNARE蛋白或其一片段)，且該切割導致該報導域釋放至細胞質中。在釋放至該細胞質中後，該報導域經歷降解事件，個別的降解事件引起每一該訊號產生肽之一訊號的減少且導致該報導域之該合計訊號的一逐漸減少。在一些實施例中，在自一降解事件中的該些訊號產生肽其中之一的訊號減少之後，可觀察到該報導域之該合計訊號。在本發明概念之一較佳實施例中，該構造可被一種以上的酵素切割，而相較於具有帶有一單一訊號產生肽之一報導域的一同功構造，該構造表現出降低的偏差於以一酵素活性(例如A型肉毒桿菌神經毒素)切割與一第二酵素活性(例如E型肉毒桿菌神經毒素)切割之易感性。
在本發明概念之一些方法中，提供一參考訊號，其可區別於該報導域提供之該訊號，且該參考訊號可用於標準化來自該報導構造之該報導域之該訊號。在一些實施例中，含有一輔助報導體之該構造提供該參考訊號，其中該輔助報導體產生一訊號，其可區別於該報導域且不受該酵素活性影響。在其他實施例中，以一細胞染料(例如一膜染料或一核染料) 接觸該細胞以提供該參考訊號。該一細胞染料可於以該酵素活性接觸該細胞之前、當中或之後接觸到該細胞。
120、130、330、335、430、435‧‧‧報導體
125‧‧‧介於錨/初級報導體之間之連接體
140‧‧‧介於初級報導體/初級報導體之間之連接體
150‧‧‧錨/切割位置連接體
160、260、340、440‧‧‧切割位置
165‧‧‧切割位置/報導體連接體
165A‧‧‧第一切割位置/發光體連接體
165B‧‧‧第二切割位置/發光體連接體
170、270‧‧‧膜錨
220‧‧‧一對相同初級報導體之第一出現
230‧‧‧一對相同初級報導體之第二出現
240‧‧‧初級報導體/初級報導體連接體
245‧‧‧錨/初級報導體連接體
250‧‧‧錨/切割位置連接體
255‧‧‧次級報導體/切割位置連接體
265‧‧‧切割位置/初級報導體連接體
265A‧‧‧第一切割位置/初級報導體連接體
265B‧‧‧第二切割位置/初級報導體連接體
275‧‧‧初級報導體/次級報導體連接體
275A‧‧‧第一初級報導體/次級報導體連接體
275B‧‧‧第二初級報導體/次級報導體連接體
280‧‧‧次級報導體
285‧‧‧錨/次級報導體連接體
300、400‧‧‧檢測法
310、410‧‧‧細胞膜
315、415‧‧‧胞質液
320、425‧‧‧酵素活性
330A、335A、430A、435A‧‧‧降解的報導體
350‧‧‧細胞膜錨定部分
360、365、460、465‧‧‧強烈訊號
370、375、470、475‧‧‧修飾訊號
420‧‧‧囊泡
450‧‧‧囊泡膜錨定部分
510、520、530、540、550、610、620、630、640、650、810、820、830、840、850‧‧‧步驟
圖1A至1D示意性地出示本發明概念之構造並顯示典型的結果。圖1A至1C示意性地出示本發明概念構造其係在不同組態具有兩個相同報導肽。圖1D顯示利用如圖1A所示結構之一報導體對兩個不同肉毒桿菌神經毒素(A型肉毒桿菌神經毒素及E型肉毒桿菌神經毒素)進行一基於細胞的檢測法的典型結果。結果亦係針對表現帶有一單一報導體之一同功構造之細胞而顯示。令人意外的，在表現本發明概念之該構造的細胞中，對於A型肉毒桿菌神經毒素及E型肉毒桿菌神經毒素間之靈敏度偏差顯著地降低。
圖2A至2K示意性地出示本發明概念之構造，其包含兩個相同的報導體及一不同的第三報導體。
圖3出示本發明之一基於細胞的檢測法，其中該構造包含一細胞膜錨定域。
圖4出示本發明之一基於細胞的檢測法，其中該構造包含一囊泡膜錨定域。
圖5顯示本發明之一檢測方法論。
圖6顯示本發明之另一檢測方法論。
圖7顯示一螢光蛋白(增強型黃色螢光蛋白)及一次級染料之激發光譜及發射光譜。
圖8示意性地出示本發明概念之一檢測方法，其納入一次級染料之使用。
圖9A及9B顯示本發明概念之一檢測法的示例性數據，分別是未經校正的數據及利用一次級染料進行數據標準化的數據。
圖9C顯示表現本發明概念之一構造的細胞的顯微照片，其係在一對應的肉毒桿菌毒素不存在及存在的情況下利用螢光顯微鏡法及亮視野顯微鏡法產生。
本發明概念之實施例利用一或多個包含一構造的細胞(例如經由轉染及/或顯微注射後之表現導入)，該構造包含隔離在一受保護區中之一可觀察到的報導體部分或區與一分析物敏感區的部分。報導體部分可包含二個以上相同的報導體。受保護區可在接近一細胞膜及/或一囊泡膜之處。分析物與分析物敏感區交互作用將導致報導體經由一切割事件自受保護區釋放，其導致報導體之降解及報導體訊號之一可觀察到的改變。分析物之例子可包含蛋白質水解酵素，而在該些例子中分析物敏感區可為一切割位置，其可作為一酵素受質。
本發明標的之各種目的、特徵、方面及優點將會於以下較佳實施例之詳細說明與所附之圖式而變得更加明白，圖式中相同的元件符號表示相同之元件。
本發明概念之實施例包含方法，其中該些構造表現於細胞中，其隨後暴露於關注之一分析物(例如一肉毒桿菌毒素及/或一破傷風桿菌(Clostridium tetani)毒素)。該些細胞可為分裂停滯細胞。應當理解的是，本發明概念之構造新穎的排列及組成對於該些檢測法之機轉與性能特性具有一直接影響。在本發明概念較佳實施例中，關注之分析物的暴露係導致在該構造之一分析物敏感區或域之一切割事件，其導致包含帶有二個以上相同訊號產生區(例如一對相同的螢光團)之一報導區的一構造片段釋放，每一訊號產生區可產生一可檢測的訊號。相異於利用螢光團排列為螢光共振能量轉移對(例如不同螢光團排列為異螢光共振能量轉移對及/或相似或相同螢光團排列為同螢光共振能量轉移對)之構造及方法，釋放為構造片段之報導體之每一訊號產生區其在切割事件之前及發生後皆立即直接促成一可檢測的合計訊號。例如在一些實施例中，一合計訊號係可為自每一訊號產生區觀察到的訊號之一大致上的總和(或其他函數)。在本發明概念之構造及檢測法中，在形成檢測基礎之可檢測的訊號中之改變係在切割事件之後發生於胞質液中之複數個降解事件的結果，雖然損失一對相同的訊號產生區(例如為一對實質上相同的螢光團)的其中一個，但仍能 提供一發射報導體片段。在利用一單一報導體之一構造中，發生於一被釋放的構造片段之一單一降解事件係可導致單一報導體之斷裂及可檢測的訊號之減少。同樣地，在利用重複性報導體之構造中，其中可檢測的訊號係報導體之間交互作用的結果(例如一構造其係利用排列要執行異螢光共振能量轉移及/或同螢光共振能量轉移之一對螢光團)，由一單一降解事件造成之一單一訊號產生區的斷裂亦導致來自該構造之可檢測的訊號的減少。
相比之下，藉由針對本發明概念一構造之一切割事件產生的一含有報導體片段係被配置為要在切割事件後釋放二個以上相同的/難以區別的訊號產生區，且可在發生於訊號產生區之其中一個出現上之一單一降解事件後繼續提供一可檢測的訊號。既然終止構造切割片段之可檢測的訊號的產生係需要複數個降解事件，在增加分析物濃度時可檢測的訊號會降低但在分析物高濃度時可檢測訊號仍會留存(相對於單一報導體構造或依靠成對報導體產生訊號的構造)。這可造成基於本發明概念構造之檢測法一改良的動態範圍。
本發明概念一構造之該些組成部分可以多種方式排列。以下的說明包含若干例子，其中一報導構造之功能域，例如一膜錨(A)、一切割位置(B)、一初級訊號產生區/報導體之複數個出現(C,C’)及在一些情況下之一次級報導體(D)，其係藉由連接區或連接體(-)以各種排列連接。應當理解以下圖式及其說明中，這些連接體之存在可認為係可選擇的。因此在本發明概念實施例中，描述為一連接體之一個以上的部分可被省略。在一些實施例中，本發明概念之連接區亦可包含一功能區之部分，其不直接涉及該區之該功能。例如，如果一報導體係一蛋白質螢光團，則一連接體可為該蛋白質螢光團序列之一部分，且其不直接涉及發出螢光。同樣地，一連接體可為切割位置序列之一部分，且其不直接作為一蛋白酶受質。此外，在本發明概念其他實施例中，一連接體可為一合成的或工程化的肽序列，其可例如設計為降低訊號產生區間之螢光共振能量轉移(即同螢光共振能量轉移及/或異螢光共振能量轉移)至無用的程度(例如小於約5%)。這種合成肽序列可為一彈性序列、一剛性序列或兼具彈性及剛性部分之一序列。SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8及SEQ ID NO.9顯示示例性合成連接體序列。在一些實施例中，一連接區係可包含這樣的連接體序列的重複出現(例如以一多聯體狀排列)以提供所希望之長度、彈性及/或其他所希望的結構特徵。應當理解的是，本文所用之技術用語「連接體」意思並非是以一酵素分析物切割之一切割位置，而是連接一報導構造之其他功能區之一結構區。
在一些實施例中，該含有報導體區係可包含一初級報導體的至少兩個出現，其為一螢光團及/或一發色團。在本發明概念之一些實施例中，一初級報導體之兩個出現具有相同的胺基酸序列。在其他實施例中，一初級報導體之兩個出現可具有不同的組成，但具有大致上相似的(即展現大於或等於80%重疊)激發和發射光譜。在較佳實施例中，一初級報導體可為一螢光蛋白，例如綠色螢光蛋白(SEQ ID NO.10)或具有至少80%序列與綠色螢光蛋白序列相同之一肽。合適的螢光蛋白螢光團係包含黃色螢光蛋白(例如增強型黃色螢光蛋白，SEQ ID NO.11)、紅色螢光蛋白、青色螢光蛋白(SEQ ID NO.12)、mBanana、mStrawberry、mCherry、tdTomato、J-Red、DsRed monomer、mCitrine、Venus(SEQ ID NO.13)、YPet蛋白、Emerald、增強型綠色螢光蛋白、CyPet、mCFPm、Cerulean、mPlum、mOrange、mKO、T-Sapphire、黃色螢光蛋白之一衍生物、mCitrine之一衍生物、Venus之一衍生物、YPet蛋白之一衍生物及/或一綠色螢光蛋白變體。在一特別較佳實施例中，一初級報導體可為源自維多利亞多管發光水母(Aequorea victoria)綠色螢光蛋白之一單體螢光蛋白，例如Sirius、Azurite、EBFP2、TagBFP、mTurqoise、增強型青色螢光蛋白、Cerulean、TagCFP、mTFP1、mUkG1、mAG1、AcGFP1、TagGFP2、EDFP、mWasabi、EmGFP、TagYFP、增強型黃色螢光蛋白(SEQ ID NO.11)、Topaz、SYFP2、Venus、Citrine、mKO、mKO2、mOrange、mOrange2、TagRFP、TagRFP-T、mStrawberry、mRuby、mCherry、mRaspberry、mKate2、mPlum、mNeptune、T-Sapphire、mAmetrine及/或mKeima(參照<螢光蛋白及其於活細胞和組織成像之應用>Chudakov,D.M.等人，Physiol.Rev.90：1103-1163,2010)。同樣地，合適的初級報導體可為源自維多利亞多管發光水母綠色螢 光蛋白之蛋白質螢光團，其包含一A206K突變。另外，一初級報導體可為一非螢光團及/或一非發色團，例如一螢光淬滅體。
在本發明概念之構造中，該含有報導體部分中初級報導體之排列係可為距離彼此足夠遠及/或定向的，使得其展現實質上無用(即少於5%)的螢光共振能量轉移(例如同螢光共振能量轉移)。預期的低程度同螢光共振能量轉移可為小於或等於約1%、小於或等於約0.1%、小於或等於約0.01%及/或小於或等於約0.001%的發光體間能量轉移。同樣地，預期的低程度同螢光共振能量轉移可為小於或等於約10%、小於或等於約1%、小於或等於約0.1%、小於或等於約0.01%及/或小於或等於約0.001%的可觀察到的訊號之背景雜訊。另外，在本發明構造之一些實施例中，該初級報導體120、130係可排列以使其展現顯著的(即大於約1%)同螢光共振能量轉移。利用介於該些初級報導體間之一連接區或連接體的長度係可控制該現象。在本發明概念之一些實施例中，這種連接體可具有20個、30個、40個、50個或更多個胺基酸的長度。同樣地，當該構造在其天然且折疊的狀態，這種連接體可具有至少約4、約6、約8、約10、約15、約20或更多奈米之線性尺寸。
可以預期的是本發明概念之一構造之一初級報導體係可包含一個以上之螢光部分。例如，具有不同卻重疊的激發和發射光譜之一對螢光團係可被排列為一螢光共振能量轉移對，其作為一初級報導體之一單一出現。同樣地，一對相同的螢光團可被排列為一同螢光共振能量轉移對，其作為一初級報導體之一單一出現(例如，以螢光異向性檢測)。例如，在實施例中，一報導構造可包含一對初級螢光團，其中每一初級螢光團包含兩個螢光團其係具有不同但重疊的激發和發射光譜且排列為一異螢光共振能量轉移對。另外，在實施例中，一報導構造可包含一對初級螢光團，其中每一初級螢光團包含兩個螢光團其係具有相似或相同的激發和發射光譜且排列為一同螢光共振能量轉移對。
如上所述，本發明概念之一構造之域係可以各種方式排列。圖1A示意性地顯示本發明概念之一較佳實施例，其可被表徵為一A-B-C-C’的排列。這種報導構造可包含一膜錨170，其係藉由一介於錨/ 切割位置之間之連接體150連接至一切割位置160。切割位置藉由一切割位置/報導體連接體165依序連接至一對相同初級報導體之一第一出現120。一對相同初級報導體之第一出現120係藉由一介於初級報導體/初級報導體之間之連接體140連接至一對相同初級報導體之一第二出現130。在實施例中，該含有報導體區係可包含一初級報導體之至少兩個出現。一報導構造之一例子具有顯示於SEQ ID NO.14之結構。
該報導構造之一另一種排列(其可被表徵為A-C-B-C’)示意性地顯示於圖1B，其中一膜錨170係藉由一介於錨/初級報導體之間之連接體125連接至一對相同初級報導體之一第一出現120。一對相同初級報導體之第一出現120係經由一第一切割位置/發光體連接體165A連接至一切割位置160。切割位置160係經由一第二切割位置/發光體連接體165B亦連接至一對相同初級報導體之一第二出現130。自這種保留的報導體120之發射係可例如用以作為一基線或標準化訊號。
該報導構造之另一種排列(其可被表徵為C-A-B-C’)顯示於圖1C，其中一對相同初級報導體之一第一出現120係藉由一介於錨/初級報導體之間之連接體125連接至一膜錨部分170。膜錨170藉由一錨/切割位置連接體150亦連接至一切割位置160。切割位置160係經由一切割位置/報導體連接體165依序連接至一對相同初級報導體之一第二出現130。自這種保留的報導體120之發射係可例如用以作為一基線或標準化訊號。雖然僅顯示該組態之一種代表，應當理解的是報導體連接體140在實施例中係可以放置於切割位置160之任一側。
在如圖1A、圖1B及圖1C所示之該構造的組態中，切割位置160係經由例如一蛋白酶之水解，導致一或多個初級報導體120、130自膜錨定域170釋放。基於這種供專一酵素活性之構造，切割位置因此至少部分決定了檢測法的專一性，且較佳地包含水解位置及辨識位置，在水解位置，酵素活性導致該構造之肽骨幹的裂解，而辨識位置係提供與酵素交互作用之位置且賦予至少一部分之受質專一性。在一些實施例中，切割位置可包含與一目標酵素之外結合位置或異位交互作用之區。在本發明概念之較佳實施例中，切割位置係易感於一肉毒桿菌神經毒素蛋白酶活性之切 割，例如A型肉毒桿菌神經毒素、B型肉毒桿菌神經毒素、C型肉毒桿菌神經毒素、D型肉毒桿菌神經毒素、E型肉毒桿菌神經毒素、F型肉毒桿菌神經毒素及/或G型肉毒桿菌神經毒素。可預期的是，一切割位置序列係可被選擇或設計為提供二種以上不同肉毒桿菌神經毒素(例如A型肉毒桿菌神經毒素及E型肉毒桿菌神經毒素兩者)切割及辨識位置。在一些實施例中，切割位置可包含完整的序列或源自一SNARE蛋白之序列，例如為一突觸體相關蛋白(例如SNAP-25；SEQ ID NO.10)、一囊泡相關膜蛋白(例如VAMP或突觸囊泡蛋白；SEQ ID NO.11)、及/或源自一突觸融合蛋白之序列。合適的切割位置序列之例子係包含SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18。
如上所述，自一膜錨定域之釋放係可容許一個或多個初級報導體自一受保護區擴散開。這種受保護區係可包含一細胞膜及/或一囊泡膜之鄰近處。因此，一錨定域可包含一細胞膜定位肽及/或一囊泡膜定位肽。這種錨定區係可包含一跨膜區，其中至少一部分之肽鏈進入及/或穿過該細胞之一膜。另外，一錨定區可包含一棕櫚酸酯化作用位置，其係在細胞之轉譯後處理之後提供與細胞之一膜交互作用之一位置。另外，一膜錨定位置可包含一肽序列，其係與一膜結合受體或配體交互作用。在本發明概念之一些實施例中，一錨定域係可包含源自一突觸囊泡蛋白之序列(例如為突觸囊泡蛋白之一跨膜肽)及/或源自SNAP-25之序列(例如為SNAP-25之一棕櫚酸酯化作用區)。在本發明概念之其他實施例中，一膜錨定域可為一突觸融合蛋白或一突觸融合蛋白片段。
如上所述，一旦自一錨定區170釋放，初級報導體可擴散進入胞質液中。使用二個以上初級報導體提供若干技術上之優點。在切割後立即釋放二個以上初級報導體之構造的優點如上所述。其他優點係包含在一基於細胞之檢測法中利用較低表現程度之構造的能力(從而最小化毒性的風險及/或構造聚集)及/或利用極少的細胞的能力。此外，由複數個初級報導體產生之相對強的訊號係可提供用於更穩定且可再現的基線測量，其亦可藉由使訊號更有力的區別於雜訊以增加檢測法之靈敏度。應當指出的是，先前的研究者(A.G.von Armin、X.W.Deng及M.G.Stacey；Gene 221(1998),pp.35-43)已利用併入兩套以上黃色螢光蛋白序列之構造，其係作為基因表現之標記，而發現遍佈細胞之發亮螢光，這種構造未能展示降解事件，其不僅係本發明概念之構造的特徵且對於其在基於細胞的檢測法中之利用是必須的。
令人意外的，發明人發現相較於報導區含有一初級報導體之一單一出現的同功構造，具有包含複數個初級報導體之報導區的構造係可提供酵素目標之間不同的選擇性。圖1D為其一實例，顯示對於A型肉毒桿菌神經毒素及E型肉毒桿菌神經毒素之基於細胞的檢測法之反應的比較數據，其中，細胞係包含本發明概念之一構造或一同功構造的其中之一，本發明概念之一構造係含有兩個增強型黃色螢光蛋白蛋白質螢光團且以一A-B-C-C’排列，而同功構造係含有一單一增強型黃色螢光蛋白蛋白質螢光團且以一A-B-C排列。A型肉毒桿菌神經毒素及E型肉毒桿菌神經毒素皆可辨識並切割兩種構造之切割位置，然而單一螢光團構造對於A型肉毒桿菌神經毒素具有超過E型肉毒桿菌神經毒素一近乎80倍的偏差(即近乎80倍之較佳靈敏度，以EC50表示)，參見圖1D之37℃。使用表現「雙螢光團」報導構造(即帶有兩個增強型黃色螢光蛋白螢光團之構造)之細胞進行相同之研究，顯示對於A型肉毒桿菌神經毒素相似的靈敏度，但是增加對於E型肉毒桿菌神經毒素之靈敏度，減少了檢測法之偏差至26倍。檢測法偏差的降低係有利地容許相同的構造使用於針對一種以上之酵素分析物的檢測法。不希望受理論束縛，發明人認為使用額外的螢光肽序列給予構造一三級結構，其係在構造之切割域中提供了更多辨識位置的改良的使用。
在本發明概念之一些實施例中，一報導構造除了二個以上的初級報導體還可包含不同於初級報導體之一次級報導體。次級報導體可具有一化學結構，其係可區別於或不同於初級報導體之化學結構。這種次級報導體可具有一發射光譜，其係與一初級報導體之激發光譜重疊。在實施例中，可排列該構造以致一次級報導體與一初級報導體之間發生顯著的螢光共振能量轉移(即大於約1%)。在一較佳實施例中，次級報導體係一螢光蛋白，例如黃色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、青色螢光蛋白、綠色螢光蛋白、mBanana、mStrawberry、mCherry、tdTomato、J-Red、DsRed monomer、 mCitrine、Venus、YPet蛋白、Emerald、增強型綠色螢光蛋白、CyPet、mCFPm、Cerulean、mPlum、mOrange、mKO、T-Sapphire、黃色螢光蛋白之一衍生物、mCitrine之一衍生物、Venus之一衍生物、YPet蛋白之一衍生物及/或一綠色螢光蛋白變體。
較佳地，可排列報導構造以致次級報導體與一初級報導體之間不發生顯著的或有用的螢光共振能量轉移(即發生螢光共振能量轉移的程度小於或等於5%)。在報導構造中次級報導體及初級報導體的至少其中一個的排列係可為距離彼此足夠遠，以至於它們展現實質上無用(即少於或等於5%)的螢光共振能量轉移。預期的無用程度螢光共振能量轉移之能量轉移係可為小於或等於約10%、小於或等於約5%、小於或等於約1%或小於或等於約0.1%的相關背景螢光。這可藉由選擇一連接體來達成，其係提供次級報導體與一初級報導體之間足夠的距離。在本發明概念之一些實施例中，這種連接體可具有20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個或更多個胺基酸的長度。同樣地，當構造在其天然且折疊的狀態，兩個初級報導體間之一連接體係可具有至少約4、約6、約8、約10、約15、約20或更多奈米的長度。合適之連接體可包含合成肽，且這些肽可為彈性肽、剛性肽或可包含彈性及剛性部分兩者。
在本發明概念之一些實施例中，來自一次級報導體之一訊號或發射係可用作為一參考或用作為對於調整或標準化自含有報導體部分之一個以上報導體觀察到之一訊號有用的標準化數據，從而增進利用這種構造之一檢測法的精準度及/或靈敏度。在其他實施例中，來自一次級報導體之一訊號或發射藉由一影像辨識系統係可用來在一獲得的影像中確認位置，檢測法之一反應可發生在其中，從而簡化數據之獲得。
圖2A示意性地顯示包含一次級報導體之一實施例的一例子(其可表示為具有A-D-B-C-C’之結構，其中“D”代表次級報導體)。在這種報導構造中，一膜錨270係經由一介於錨/次級報導體之間之連接體285連接至一次級報導體280。次級報導體280係經由一次級報導體/切割位置連接體255亦連接至一切割位置260。切割位置260係經由一切割位置/初級報導體連接體265依序連接至一對相同初級報導體之一第一出現 220，且一對相同初級報導體之第一出現220與一對相同初級報導體之第二出現230係藉由一介於初級報導體/初級報導體之間之連接體240連結。
圖2B示意性地出示具有二個以上初級報導體及至少一個次級報導體之一報導構造(其可描述為D-A-B-C-C’)之一另一實施例。在此實施例中，一次級報導體280係經由一介於錨/次級報導體之間之連接體285連接至一膜錨270。膜錨270係經由一錨/切割位置連接體250依序連接至一切割位置260。一對相同初級報導體220、230係經由一初級報導體/初級報導體連接體240連結，且係經由一切割位置/初級報導體連接體265依序連接至切割位置260。
圖2C示意性地出示一報導構造之一實施例(其可描述為C-D-A-B-C’)，其中一對相同初級報導體之一第一出現220係經由一初級報導體/次級報導體連接體275連接至一次級報導體280。次級報導體280係經由一介於錨/次級報導體之間之連接體275依序連接至一膜錨270。膜錨270以介於兩者之間的一錨/切割位置連接體250進一步連接至一切割位置260。一對相同初級報導體之一第二出現230係經由一切割位置/初級報導體連接體265亦連接至切割位置260。
圖2D示意性地出示一報導構造之一實施例(其可描述為D-C-A-B-C’)，其中一次級報導體280係經由一初級報導體/次級報導體連接體275連接至一對相同初級報導體之一第一出現220。一對相同初級報導體之第一出現220係以介於兩者之間的一錨/初級報導體連接體245依序連接至膜錨270。膜錨270係經由一錨/切割位置連接體250亦連接至一切割位置260。一對相同初級報導體之一第二出現230係經由一介於切割位置/初級報導體之間之連接體240連接至切割位置260。
圖2E示意性地出示一報導構造之一實施例(其可描述為A-D-C-B-C’)，其中一膜錨270係經由一錨/次級報導體連接體285連接至一次級報導體280。次級報導體280係經由一介於初級報導體/次級報導體之間之連接體275亦連接至一對相同初級報導體之一第一出現220。一對相同初級報導體之第一出現220係經由一切割位置/初級報導體連接體265A依序連接至一切割位置260。一對相同初級報導體之第二出現230係 經由另一切割位置/初級報導體連接體265B亦連接至此切割位置260。
圖2F示意性地出示一報導構造之一實施例(其可描述為A-C-D-B-C’)，其中一膜錨270係經由一介於錨/初級報導體之間之連接體245連接至一對相同初級報導體之一第一出現220。一次級報導體280係經由一初級報導體/次級報導體連接體275亦連接至一對相同初級報導體之第一出現220。此次級報導體280係經由一次級報導體/切割位置連接體255連接至一切割位置260。隨後，切割位置260係經由一切割位置/初級報導體連接體265連接至一對相同初級報導體之一第二出現230。
圖2G示意性地出示一報導構造之一實施例(其可描述為A-C-B-C’-D)，其中一膜錨270係經由一錨/初級報導體連接體245連接至一對相同初級報導體之一第一出現220。一對相同初級報導體之第一出現220係經由一第一切割位置/初級報導體連接體265A連接至一切割位置260。切割位置260係經由一第二切割位置/初級報導體連接體265B亦連接至一對相同初級報導體之一第二出現230。一次級報導體280係經由一介於初級報導體/次級報導體之間之連接體275亦連接至一對相同初級報導體之第二出現230。
圖2H示意性地出示一報導構造之一實施例(其可描述為A-C-B-D-C’)，其中一膜錨270係經由一錨/初級報導體連接體245連接至一對相同初級報導體之一第一出現220。一對相同初級報導體之第一出現220係經由一切割位置/初級報導體連接體265連接至一切割位置260。切割位置260係經由一次級報導體/切割位置連接體255亦連接至一次級報導體280。一對相同初級報導體之一第二出現230係經由一介於初級報導體/次級報導體之間之連接體275亦連接至次級報導體280。
圖2I示意性地出示一報導構造之一實施例(其可描述為A-B-C-D-C’)，其中一膜錨270係經由一錨/切割位置連接體250連接至一切割位置260。切割位置260係經由一切割位置/初級報導體連接體265連接至一對相同初級報導體之一第一出現220。一對相同初級報導體之第一出現220係經由一第一初級報導體/次級報導體連接體275A亦連接至一次級報導體280。一對相同初級報導體之一第二出現230係經由一第二初級報 導體/次級報導體連接體275B亦連接至次級報導體280。
圖2J示意性地出示一報導構造之一實施例(其可描述為C-A-B-D-C’)，其中一對相同初級報導體之一第一出現220係經由一介於錨/初級報導體之間之連接體245連接至一膜錨270。膜錨270係經由一錨/切割位置連接體250亦連接至一切割位置260。切割位置260係經由一切割位置/次級報導體連接體255隨後連接至一次級報導體280。一對相同初級報導體之一第二出現230係經由一初級報導體/次級報導體連接體275亦連接至次級報導體280。
圖2K示意性地出示一報導構造之一實施例(其可描述為C-A-B-C’-D)，其中一對相同初級報導體之一第一出現220係經由一介於錨/初級報導體之間之連接體245連接至一膜錨270。膜錨270係經由一錨/切割位置連接體250亦連接至一切割位置260。切割位置260係經由一切割位置/初級報導體連接體265隨後連接至一對相同初級報導體之一第二出現230。一次級報導體280係經由一初級報導體/次級報導體連接體275亦連接至一對相同初級報導體之第二出現230。
在一些實施例中，一初級報導體係經由一介於中間之連接體連接至一次級報導體。在一些這樣的實施例中，前述的初級/次級報導體連接體被選為提供一初級報導體與一次級報導體之間不顯著的(即少於5%)螢光共振能量轉移。例如，一初級/次級報導體連接體可被選為具有用以維持一初級報導體與一次級報導體間之一距離及/或方向的一長度、幾何形狀及/或剛性以降低螢光共振能量轉移至一可以忽略的量(即<5%)。在其他實施例中，可將一初級/次級報導體連接體配置為提供初級報導體與一次級報導體之間一有用程度之螢光共振能量轉移(即>5%)。
圖3出示了本發明概念之一示例性檢測法300的一示意圖。具有一細胞膜310及胞質液315之一細胞表現一構造，其係包含一細胞膜錨定部分350、一切割位置340及二個相同的報導體330、335。錨定於細胞膜310時，報導體330、335產生一強烈訊號360、365。為了進行檢測法，將細胞暴露於一酵素活性320，其係可作用於切割位置340上。切割位置之肽骨幹的水解將報導體釋放進入胞質液315。隨後的複數個降解事件造成降 解的報導體330A、335A，其產生一修飾訊號370、375。在本發明概念之一些實施例中，前述報導體為螢光蛋白，且來自降解的螢光蛋白之螢光訊號會減弱。
圖4出示了本發明概念之一另一檢測法400。具有一細胞膜410、胞質液415及一囊泡420之一細胞表現一構造，其係包含一囊泡膜錨定部分450、一切割位置440及二個報導體430、435。錨定於囊泡420時，報導體430、435產生一強烈訊號460、465。為了進行檢測法，將細胞暴露於一酵素活性425，其係可作用於切割位置440上。切割位置之水解會釋放報導體，導致報導體430、435之釋放。隨後的複數個降解事件造成降解的報導體430A、435A，其產生一修飾訊號470、475。在本發明概念之一些實施例中，前述報導體為螢光蛋白，且來自降解的螢光蛋白之該螢光訊號會減弱。
除了利用不同的錨定位置，本發明概念之檢測法還可使用各種不同的試驗方案。圖5顯示一試驗方案之一實施例。最初510，提供一細胞其係表現本發明概念之一構造。獲取一基線或第一訊號520，然後將細胞暴露於酵素活性530。例如，可將含有一酵素活性(例如一肉毒桿菌神經毒素)之一樣本加入含有前述細胞之培養基中。在一培養期間之後可檢測一第二訊號540，且隨後與第一訊號比較550。前述第一及第二訊號係可為即時測量值、隨著時間獲得的平均測量值及/或比率測量值。
圖6顯示本發明概念之一試驗方法之一另一實施例。最初610，提供一細胞其係表現本發明概念之一構造。然後將細胞暴露於酵素活性620。例如，可將含有一酵素活性(例如一肉毒桿菌神經毒素)之一樣本加入含有前述細胞之培養基中。在一第一培養期間之後，檢測一基線或第一訊號630，而在一第二培養期間之後檢測一第二訊號640，且隨後與第一訊號比較650。前述第一及第二訊號係可為即時測量值、隨著時間獲得的平均測量值及/或比率測量值。
在本發明概念之另一實施例中，將表現如前所述之構造的細胞暴露於一個以上次級染料(例如一細胞結合染料，如一膜染料或一核染色劑/染料)，其係可區別於前述構造且可產生獨立於肉毒桿菌神經毒素活 性之訊號。這種次級染料可與一細胞之一膜及/或核以一種獨立於一分析物(例如一肉毒桿菌神經毒素或其他酵素活性)存在的方式結合，且係可用以產生一基線或參考訊號其可用於標準化。例如，可將表現如前所述之一構造的一細胞暴露於一染料，其係與細胞之核或細胞膜結合且相應地提供一基線螢光訊號。在本發明概念之一較佳實施例中，這種次級染料係被選為使得膜染料之發射波長可區別於表現在細胞中之構造的一報導螢光團之發射波長。在本發明概念之一些實施例中，可選擇一次級染料，以便有效激發波長之範圍與構造之一報導螢光團之有效激發波長之範圍重疊，容許次級染料及報導螢光團兩者同時激發，因此同時獲得一基線訊號及一報導螢光團訊號。在本發明概念之其他實施例中，可選擇一次級染料，以便有效激發波長之範圍與報導螢光團之有效激發波長之範圍不顯著重疊，容許基線螢光之有選擇性的激發。合適的次級染料之實例包含4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)、一般稱為CELLMASKTM深紅色細胞膜染色劑之染料及一般稱為HOECHST3342TM之核染色染料。在本發明概念之一較佳實施例中，次級染料被選為提供與構造之報導螢光團的激發光譜和發射光譜幾乎沒有重疊的激發光譜和發射光譜，以致於實質上無因螢光共振能量轉移而發生之能量轉移(即小於約5%)。圖7顯示一合適的次級染料(所述染料一般稱為CELLMASKTM深紅色細胞膜染色劑，表示為“細胞面具”)及一黃色螢光蛋白報導螢光團之激發光譜及發射光譜的實例。本案發明人預期其他合適的次級染料可包含蛋白質(例如抗體)或其他對細胞具有一親和力且與螢光結合或複合之大分子或其他易被檢測之分子。
由於次級染料與細胞之結合係獨立於分析物之存在或關注之活性，其可提供一基線訊號為細胞數量、密度及/或分布之一獨立基準。這種基線訊號對於標準化在本發明概念之一檢測法實行期間自細胞獲取之報導訊號係具有相當大之實用性。例如，以一比率表現一檢測法之一結果，其係來自一報導構造且反應分析物或關注的活性之測量的報導訊號與來自一膜染料且為螢光形式之測量的基線訊號之比率，提供了由於細胞數量、密度及/或分布不同而造成的測試位置間之報導訊號強度差異之校正。這有利於增進前述檢測法之精準度，其相應地導致有效靈敏度之增進。亦應 當理解的是，這種基線訊號係可利用於提供除了螢光以外之報導訊號的標準化。
實例
1.如圖8示意性地所示，將以一編碼為如圖1A所述之一構造的一表現載體轉化的細胞接種810至96孔盤中，且在37℃及5%二氧化碳的條件下隔夜培養。
2.接著將細胞以細胞培養基沖洗，然後立即接觸肉毒桿菌神經毒素820，其以每孔100μl稀釋入該細胞培養基中(典型地)。
3.接著將細胞在37℃及5%二氧化碳的條件下培養48小時(典型地)。
4.在48小時培養期間結束時，以一次級染料將細胞染色830。不同的次級染料可利用不同之方案施加。
方案A：對於DAPI及一般稱為HOECHST3342TM之染料有用。
1.將25μl之5μM DAPI或含有25μg/ml一般稱為HOECHST3342TM之染料的細胞培養基直接加入96孔盤的每一孔，以產生最終濃度為1μM DAPI或5μg/ml一般稱為HOECHST3342TM之染料。核染料之有用的最終濃度範圍自0.001至10μM或自0.1至50μg/ml。操作溶液濃度可適當地調整。
2.將細胞在37℃及5%二氧化碳的條件下培養30分鐘(典型地)。
方案B：對於一般稱為CELLMASKTM深紅色細胞膜染色劑之染料有用。
1.製備在杜氏磷酸鹽緩衝液中0.625至10μg/ml之一操作溶液(典型為5μg/ml)。
2.自每一孔移除含有肉毒桿菌神經毒素之細胞培養基。
3.於每一孔中直接加入50μl之膜染料操作溶液。
4.將細胞在37℃及5%二氧化碳的條件下培養20分鐘(典型地)。
暴露於膜染料之後，利用一自動洗盤機以磷酸鹽緩衝液沖洗試驗盤。然後以一螢光微量盤分析儀利用濾光體以接近構造之螢光團及所使用之次級染料的激發和發射波長分析試驗盤840。例如，利用約345nm 之一激發波長及約485nm之一發射波長可表徵DAPI及一般稱為HOECHST3342TM之染料，而利用約650nm之一激發波長及約680nm之一發射波長可表徵一般稱為CELLMASKTM深紅色細胞膜染色劑之染料。構造之螢光團的測量係獨立於膜染料的測量，使用激發波長及發射波長表徵螢光團。為了數據分析，直接激發構造螢光團之發射(即該肉毒桿菌神經毒素敏感部份)係標準化850，例如藉由將構造螢光團之發射除以次級染料發射(即該肉毒桿菌神經毒素不敏感部份)。
圖9A、圖9B及圖9C顯示以如前所述之報導構造結合次級染料實行之檢測法的典型結果。圖9A顯示以一蛋白酶接觸含有一報導構造之細胞的典型未經校正之結果(在此實例中，蛋白酶係A型肉毒桿菌神經毒素且構造包含A型肉毒桿菌神經毒素之一切割位置)。此實例中之偵測極限(LOD)為10pM之A型肉毒桿菌神經毒素，而定量極限(LOQ)為100pM。圖9B顯示來自圖9A之螢光數據標準化的影響，其係使用來自施用於在前述步驟中所述之相同細胞之一次級染料的發射數據。如圖9B所示之數據，其偵測極限降低至3pM且定量極限降低至10pM。圖9C顯示兩孔含有具有A型肉毒桿菌神經毒素反應構造之細胞的顯微照片，透過(自左至右)亮視野、在構造之一螢光團的發射波長之螢光顯微鏡法及在施用於細胞之次級染料的發射波長之螢光顯微鏡法。在上面系列之顯微照片中之孔係無暴露於A型肉毒桿菌神經毒素；在下面系列之顯微照片中之孔係暴露於1nM之A型肉毒桿菌神經毒素。在1nM之A型肉毒桿菌神經毒素的孔中(即下面系列)，來自構造之螢光團的螢光明顯地減少。相比之下，次級染料之發射與無暴露於A型肉毒桿菌神經毒素之孔(即上面系列)的次級染料之發射係維持在一相似(儘管截然不同)之程度及分布。
這些方案之變化亦可為有效的。例如，次級染料係可於以肉毒桿菌神經毒素接觸細胞前施用、實質上與以肉毒桿菌神經毒素接觸細胞時同時施用或係於以肉毒桿菌神經毒素接觸細胞後不到48小時的時間間隔施用。同樣地，在暴露細胞於次級染料之前及之後的額外沖洗步驟係可預期的。
應當理解的是，本發明概念之檢測法係依靠流體量之簡單的 螢光測量，而非個別細胞之成像及/或分析。例如其係可利用一簡單螢光計(例如一微量盤螢光計)操作，且其有利地高度適合適應於自動操作及高處理能力的篩檢過程。數據分析也同樣簡單明瞭，像是其未涉及處理器密集型圖像處理任務，例如細胞計數、識別個別細胞及識別位於特定亞細胞區或隔室之螢光。
除了提供為了數據標準化目的之一基線訊號，前述次級染料可用於其他目的。例如可建立一基線訊號數值，低於前述基線訊號數值則認為細胞數量不足以提供一準確的分析結果，使得來自這樣的試驗位置之數據被標記或摒棄。同樣地，可建立一基線訊號數值，高於前述基線訊號數值則認為細胞數量太多而不能提供一準確的分析結果(例如，由於用於表徵螢光之系統的光學限制)。在一檢測法的過程中加入含有這種次級染料之特殊試劑亦可用以確認在檢測法過程中試劑實際上被傳送至一試驗位置，例如確認自動化檢測系統正常地執行。
在較佳實施例中，被表徵之酵素活性係與肉毒桿菌毒素相關，且切割序列係適當地匹配。在本申請的內文中，一肉毒桿菌神經毒素可被定義為一天然的或修飾的肉毒桿菌神經毒素，其係可切割一SNARE蛋白序列或一SNARE蛋白序列的一部分。例如，A型、E型及C型肉毒桿菌神經毒素係切割SNAP-25，而B型、D型、F型及G型肉毒桿菌神經毒素係在單一但不同的位置上切割突觸囊泡蛋白(Syb)。C型肉毒桿菌神經毒素除了SNAP-25以外亦切割突觸融合蛋白。因此，用以表徵A型、E型及C型肉毒桿菌神經毒素之構造可包含切割位置序列其係含有全部或一部分的SNAP-25。同樣地，用以表徵B型、D型、F型及G型肉毒桿菌神經毒素之構造可包含切割位置序列其係含有突觸囊泡蛋白之全部或突觸囊泡蛋白各個易感區之部分。另外，C型肉毒桿菌神經毒素之活性可利用含有切割位置其係具有源自全部或部分突觸融合蛋白序列的構造來表徵。
預期的切割位置序列可有利地包含一SNARE蛋白、模體或突變蛋白。一蛋白質之“突變蛋白”在此應解釋為具有與一對應之天然蛋白質至少30%相同，例如包含具有與該天然蛋白質至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98% 相同之組成。本身的變異可包含任一或更多的添加、缺失及置換。預期的突變蛋白包含片段、斷片及融合蛋白。
進一步預期本發明概念之細胞係可被修飾為表現二個以上的構造。這樣的構造可例如以其各自報導體的發射光譜區別，並提供不同酵素活性實質上獨立且同時的測量。另外，這樣的構造可以不同的受質序列測量相同酵素之活性。例如，一第一構造可包含源自SNAP-25之一切割位置而且一第二構造可包含源自突觸融合蛋白之一切割位置，兩者皆係用於表徵C型肉毒桿菌神經毒素之活性。在實施例中，比較來自這兩個構造之結果可增進準確度、動態範圍及/或專一性。
本發明概念之另一實施例係一套組，其包含一次級報導體。這樣的套組可包含如上所述之表現一適當檢測構造的細胞及一次級染料(例如一膜染料)。任選的，這樣的套組可包含給使用者操作檢測法的說明。在一些實施例中，這樣的套組可包含對照或校準材料，前述對照或校準材料係包含一合適的細胞培養基及一酵素活性，其對應於待表徵之樣本的酵素活性。在這種情況下，一對照樣本已知為用於證明檢測法執行之一樣本，而一校準樣本已知為用於校準一檢測法輸出之一樣本，以提供一定量或定性結果。例如，疑似含有一肉毒桿菌神經毒素之一樣本待表徵，前述對照及/或校準樣本可包含一對應的肉毒桿菌神經毒素。在一些實施例中，可提供預先混合且實質上準備好使用之對照及/或校準樣本。在其他實施例中，(例如由於穩定的因素)一第一容器之一合適的細胞培養基及一第二容器之酵素活性之一儲備溶液係可提供為對照及/或校準樣本。在前述實施例中，第一及第二容器可能需要不同的運送及/或貯藏條件，且本身係可被分別運送及/或貯藏，然而仍是相同套組之部分。
本發明概念之其他實施例包含利用如前所述之構造的無細胞檢測法。例如，這樣的檢測法可利用一無細胞囊泡懸浮液，其中囊泡攜帶一個以上適合於與一構造之一膜錨定部分交互作用之位置。前述囊泡與本發明概念之一構造可懸浮於一培養基中，其係包含一蛋白酶或能夠水解一報導體的相似酵素，這樣切割構造之一連接體部分可將報導體釋放進入培養基中以進行水解。另外，被一構造之一錨定部分辨識之位置係可以一 適當的界面化學連接至一適當大小之微粒。前述微粒可攜帶立體阻斷劑，例如高分子量的葡萄糖聚糖或聚丙烯酸酯，其容許肉毒桿菌毒素接近微粒表面而阻礙蛋白酶或相似酵素接近。為達成此目的，蛋白酶或相似的酵素係可以高分子量的形式(例如為高分子量分子之聚合物或結合物)提供，以增進選擇性。
除了已描述的之外，可能有更多不偏離本發明概念的修改對本領域技術人員而言係顯而易見的。因此，本發明標的並不被限制，除了在所附之申請專利範圍中。此外，在解釋說明書及申請專利範圍兩者時，所有技術用語應以與上下文一致之最廣的可能方式解釋。特別是用語“包含”應解釋為指的是要素、元件或一非排他性方法之步驟，表示所指之要素、元件或步驟可存在或被利用，或是與其他未被明確提及之要素、元件或步驟結合。其中，說明書之申請專利範圍提及某物的至少其中之一係選自由A、B、C…及N所組成之群組，該內容應解釋為僅需要該群組中之一要素，而非A加N、或B加N等等。
<110> 拜奧麥迪遜股份有限公司 沃德 塔克
<120> 具重複性螢光團之酵素檢測法
<130> 102320.0014
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 2
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 3
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 4
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 6
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 7
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 8
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 9
<210> 10
<211> 239
<212> PRT
<213> 維多利亞多管發光水母
<400> 10
<210> 11
<211> 247
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 11
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<211> 351
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 12
<210> 13
<211> 248
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 13
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<211> 719
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 14
<210> 15
<211> 205
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 15
<210> 16
<211> 66
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 16
<210> 17
<211> 116
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 17
<210> 18
<211> 63
<212> PRT
<213> 合成序列
<400> 18

Claims (26)

  1. 一種用於表徵一酵素活性之報導構造包含：一膜錨定域，包含一第一肽，其與一細胞之一膜形成一複合體；一報導域，包含一第二肽之一第一出現，其在一第一波長產生一第一訊號、以及該第二肽之一第二出現，其在該第一波長產生一第二訊號，其中該報導域產生一合計訊號，其係該第一訊號與該第二訊號之一總和或者僅為該第一訊號或該第二訊號；一切割位置，包含一第三肽，該切割位置介於該膜錨定域及該報導域之第一出現間或該報導域之二個以上之出現間；其中，該第三肽被選為於暴露於該酵素活性時要經歷一切割事件，其中，在一降解事件使該第一訊號或該第二訊號任一者減少後，仍可觀察到該合計訊號。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之報導構造，其中在一切割事件之後，在該細胞之胞質液中該第二肽之該第一出現易感於一第一降解事件，且在該細胞之胞質液中該第二肽之該第二出現易感於一第二降解事件，其中該第一降解事件係導致該第一訊號產生的減少且該第二降解事件係導致該第二訊號產生的減少。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之報導構造，其中該第二肽係一螢光蛋白。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之報導構造，更包含一連接肽，其介於該第二肽之該第一出現及該第二肽之該第二出現之間。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之報導構造，其中該第二肽具有至少80%之序列與SEQ ID NO.10相同。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之報導構造，其中該第三肽係一SNARE蛋白或其一片段。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之報導構造，更包含一輔助報導域，其在一第二波長提供一訊號，其中該第二波長係可區別於該第一波長。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之報導構造，其中，相較於包含該第二肽之一單一出現之一同功報導構造，該報導構造表現出降低的選擇性偏差於一第一酵素活性及一第二酵素活性之間，其中該第三肽被選為於暴露於該第一酵素活性或該第二酵素活性其中之一時經歷一切割事件。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之報導構造，其中該第一酵素活性係與A型肉毒桿菌神經毒素相關聯，且該第二酵素活性係與E型肉毒桿菌神經毒素相關聯。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之報導構造，其中該報導構造不表現出有用程度之螢光共振能量轉移。
  11. 一種表徵一第一酵素活性之方法包含：提供表現一報導構造之一細胞，該報導構造包含一膜錨定域，其包含與一細胞之一膜形成一複合體之一第一肽、一報導域其包含一第二肽之一第一出現，其在一第一波長產生一第一訊號、以及該第二肽之一第二出現，其在該第一波長產生一第二訊號，其中該報導域產生一合計訊號，其係該第一訊號與該第二訊號之一總和或者僅為該第一訊號或該第二訊號、以及一切割位置，其包含一第三肽，該切割位置介於該膜錨定域及該報導域之第一出現間或該報導域之二個以上之出現間，其中，該第三肽被選為於暴露於該第一酵素活性時經歷一切割事件；以疑似含有該第一酵素活性之一樣本接觸該細胞；及當該樣本含有該第一酵素活性時，觀察一可檢測訊號之一下降，其中，在一降解事件使該第一訊號或該第二訊號任一者減少後，仍可觀察到該合計訊號。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該第二肽係一螢光蛋白。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中，相較於利用包含該第二肽之一單一出現之一同功報導構造之一檢測法，該方法表現出降低的選擇性於該第一酵素活性及一第二酵素活性之間，其中該第三肽被選為於暴露於該第一酵素活性或該第二酵素活性其中之一時經歷一切割事件。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該第一酵素活性係與A型肉毒桿菌神經毒素相關聯，且該第二酵素活性係與E型肉毒桿菌神經毒素相關聯。
  15. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該第二肽具有至少80%之序列與SEQ ID NO.10相同。
  16. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該第三肽係一SNARE蛋白或其一片段。
  17. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該報導構造更包含一參考報導體，其產生一參考訊號，其中該參考訊號係可區別於該可檢測訊號且獨立於該樣本之該酵素活性。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該參考訊號係用於標準化該合計訊號。
  19. 如申請專利範圍第11項所述之方法，更包含以一細胞染料接觸該細胞之步驟，其中該細胞染料被選為提供一染料訊號，其係可區別於該合計訊號。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該染料訊號係用於標準化該合計訊號。
  21. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該細胞在與該樣本接觸之前與該細胞染料接觸。
  22. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該細胞在與該樣本接觸之後與該細胞染料接觸。
  23. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該細胞係於相同時程與該細胞染料及該樣本接觸。
  24. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該報導構造不表現出有用程度之螢光共振能量轉移。
  25. 一種用於表徵一酵素活性之報導構造包含：一膜錨定域，包含一第一肽，其與一細胞之一膜形成一複合體；一報導域，包含一第二肽之一第一出現，其在一第一波長產生一第一訊號、以及該第二肽之一第二出現，其在該第一波長產生一第二訊號，其中該報導域產生一合計訊號，其係該第一訊號與該第二訊號之一總和或者僅為該第一訊號或該第二訊號；一切割位置，包含一第三肽，該切割位置介於該報導域之第一出現間及該報導域之第二出現間或者介於膜錨定域及該報導域之第二出現間；其中，該第三肽被選為於暴露於該酵素活性時要經歷一切割事件，其中，在一降解事件使該第一訊號或該第二訊號任一者減少後，仍可觀察到該合計訊號。
  26. 一種表徵一第一酵素活性之方法包含：提供表現一報導構造之一細胞，該報導構造包含一膜錨定域，其包含與一細胞之一膜形成一複合體之一第一肽、一報導域其包含一第二肽之一第一出現，其在一第一波長產生一第一訊號、以及該第二肽之一第二出現，其在該第一波長產生一第二訊號，其中該報導域產生一合計訊號，其係該第一訊號與該第二訊號之一總和或者僅為該第一訊號或該第二訊號、以及一切割位置，其包含一第三肽，該切割位置介於該報導域之第一出現間及該報導域之第二出現間或者介於膜錨定域及該報導域之第二出現間，其中，該第三肽被選為於暴露於該第一酵素活性時經歷一切割事件；以疑似含有該第一酵素活性之一樣本接觸該細胞；及當該樣本含有該第一酵素活性時，觀察一可檢測訊號之一下降，其中，在一降解事件使該第一訊號或該第二訊號任一者減少後，仍可觀察到該合計訊號。
TW103137023A 2013-10-25 2014-10-27 具重複性螢光團之酵素檢測法 TWI647237B (zh)

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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3270162B2 (en) * 2013-08-09 2023-08-16 BioMadison, Inc. Botulinum toxin assay with improved sensitivity
KR20170073588A (ko) 2014-08-12 2017-06-28 바이오메디슨, 인코퍼레이티드 변형된 경쇄 특이성을 갖는 보툴리눔 신경독 및 이를 생성하기 위한 방법
US11396499B2 (en) 2018-12-12 2022-07-26 University Of Washington Lysosomal acid lipase assay
TW202248635A (zh) * 2021-04-06 2022-12-16 美商伯克利之光生命科技公司 微流體分析與來自非哺乳動物細胞之生物生產的方法及用於其之套組

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000026408A2 (en) * 1998-10-30 2000-05-11 Cellomics, Inc. A system for cell-based screening
US20130065259A1 (en) * 2007-06-05 2013-03-14 City Of Hope Methods for detection of botulinum neurotoxin

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002230920A1 (en) 2000-12-15 2002-06-24 Stratagene California Dimeric fluorescent polypeptides
US7183066B2 (en) 2002-09-27 2007-02-27 Allergan, Inc. Cell-based fluorescence resonance energy transfer (FRET) assays for clostridial toxins
WO2005076785A2 (en) * 2003-12-19 2005-08-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Method and compositions for detecting botulinum neurotoxin
DE602006017237D1 (en) 2005-04-05 2010-11-11 Allergan Inc Clostridientoxinaktivitätstests
EP1997885A1 (en) 2007-05-29 2008-12-03 AXXAM S.p.A. Fluorescent proteins and methods of use thereof
BRPI1009115A2 (pt) * 2009-03-13 2015-10-06 Allergan Inc ensaios de atividade de endopeptidase redirecionada imunobaseados
WO2011047265A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Biosentinel, Inc. Resonance energy transfer assay with synaptobrevin substrate moiety
KR101853103B1 (ko) * 2011-06-01 2018-04-27 바이오메디슨, 인코퍼레이티드 비-ｆｒｅｔ 보툴리눔 검정법
EP3270162B2 (en) 2013-08-09 2023-08-16 BioMadison, Inc. Botulinum toxin assay with improved sensitivity

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000026408A2 (en) * 1998-10-30 2000-05-11 Cellomics, Inc. A system for cell-based screening
US20130065259A1 (en) * 2007-06-05 2013-03-14 City Of Hope Methods for detection of botulinum neurotoxin

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