DE69933855T2

DE69933855T2 - Indolderivate zum nachweis von peptidasen von mikroorganismen

Info

Publication number: DE69933855T2
Application number: DE69933855T
Authority: DE
Inventors: Sylvain Orenga
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1998-01-28
Filing date: 1999-01-28
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2019-01-29
Also published as: WO1999038995A1; FR2774097B1; AU759503B2; PL342028A1; JP2002501756A; CA2318461A1; AU2167999A; ES2276514T3; ATE344330T1; DE69933855D1; US6649365B1; EP1051509A1; EP1051509B1; FR2774097A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einer Verbindung auf der Basis eines Indolaminderivats für den Nachweis einer Aminopeptidase- oder Peptidaseaktivität in einer Mikroorganismenkultur sowie ein Verfahren zum Nachweisen einer solchen enzymatischen Aktivität oder zur Identifizierung der Mikroorganismen, die diese Aktivität exprimieren oder nicht exprimieren.
Aminopeptidase nennt man allgemein ein Enzym, das in der Lage ist, die zwischen einem Aminosäureacyl und einem primären Amin gebildete Amidgruppe durch Hydrolyse zu spalten, und Peptidase nennt man ein Enzym, das in der Lage ist, die zwischen dem Acylrest eines Peptids und einem primären Amin gebildete Amidgruppe durch Hydrolyse zu spalten. In der vorliegenden Anmeldung kann der Begriff "Peptidase" je nach den Fällen sowohl eine Peptidase, wie sie oben definiert wurde, als auch eine Aminopeptidase bezeichnen.
Die Erfassung und die Identifizierung der Mikroorganismen sind insbesondere in der Medizin, in der Agrar- und Nahrungsmittelindustrie und für die Überwachung der Umwelt, beispielsweise der Kontrolle des Wassers, sehr wichtig. Die Mikroorganismen können wegen ihrer Pathogenizität, als Kontaminationsindikatoren oder bei der Kontrolle von Herstellungsverfahren gesucht werden.
Die Techniken der Erfassung und Identifizierung von Mikroorganismen beruhen gegenwärtig auf der Suche nach charakteristischen Nucleotidsequenzen, auf der Suche nach Antigenen oder Antikörpern, auf der Kultur in selektivem oder nicht selektivem Medium oder auch auf der Suche nach metabolischen und insbesondere enzymatischen Aktivitäten (beispielsweise Osidase-, Esterase-, Peptidase-, Oxydase-Aktivitäten usw.).
Meistens kombinieren die Verfahren zur Erfassung und Identifizierung von Mikroorganismen mehrere dieser Techniken. So wird die Kultur verwendet, um die gesuchten Mikroorganismen zu vervielfältigen und zu selektieren. Um ihre Erfassung zu vereinfachen, wurde vorgeschlagen, biochemische Aktivitäten nachzuweisen, indem direkt in das Kulturmedium Moleküle eingeführt werden, die eine Färbung oder eine Fluoreszenz erzeugen. Derartige Medien werden Erfassungsmedien genannt. Die gesuchten biochemischen Aktivitäten können durch verschiedene Methoden nachgewiesen werden, wie:

– die physikalisch-chemische Änderung des Mediums: beispielsweise pH-Änderung, die mit Hilfe eines farbigen oder fluoreszierenden Indikators (Methylumbelliferon) nachgewiesen wird,
– die Änderung des Redoxpotentials, die mit Hilfe eines farbigen (Tetrazoliumsalz) oder fluoreszierenden Indikators nachgewiesen wird,
– die Reaktion eines durch die Mikroorganismen erzeugten Moleküls mit einer in dem Medium vorhandenen Verbindung, die zu einer Färbung führt,
– oder die Hydrolyse von Molekülen, die eine farbige oder fluoreszierende Verbindung (Naphtol, Cumarin) freisetzt.

Die erfassten Hydrolysen sind im Allgemeinen das Ergebnis der Wirkung eines durch die Mikroorganismen erzeugten Enzyms auf ein natürliches oder synthetisches enzymatisches Substrat. Diese enzymatischen Aktivitäten sind beispielsweise diejenigen der folgenden Enzyme: Esterasen (beispielsweise Lipasen, Phosphatasen), Osidasen (β-Galactosidase, β-Glucuronidase, N-Acetylhexosaminidase), Pepitdasen (Alaninaminopeptidase, Trypsinase, Gelatinase), DNAsen, Decarboxylasen, Desaminasen, Ureasen, Tryptophanasen, Oxydasen, Katalasen usw.
Man weiß übrigens, dass die gelierten Medien besonders gut für die Kultur und für die Isolierung von Mikroorganismen aus einer Entnahme sowie für die Erfassung von "Ziel"-Mikroorganismen in einer Mikroorganismenmischung geeignet sind. Auf diesen Medien bilden die Mikroorganismen mit bloßem Auge feststellbare Kolonien, und es ist äußerst wünschenswert, dass die Produkte der gesuchten biochemischen Aktivitäten auf ihren Erzeugungsort lokalisiert bleiben. Dies gestattet nämlich, eine Kolonie von ihren Nachbarkolonien zu unterscheiden, wenn diese nicht dieselben Aktivitäten exprimieren. Man kann auf diese Weise verschiedene Methoden verwenden, die beispielsweise pH-Änderungen (FR-A-2 671 100), Esteraseaktivitäten (FR-2 457 323), Osidaseaktivitäten (FR-A-2 684 110) etc. erfassen. Es ist in der Tat möglich, gleichzeitig mehrere dieser Methoden zu verwenden, um mehrere Arten oder Stämme nachzuweisen und/oder um die Sensibilität und/oder die Spezifität der Erfassung zu erhöhen.
Die Patente US-B-5210022 und US-B-5358854 beschreiben chromogene Substrate, die gegenüber der Wirkung der β-Galactosidase empfindlich sind. Diese von 3-Hydroxyindol abgelei teten Substrate sind beispielsweise Indolyl-β-D-galactosidasen, deren Indolring Halogensubstituenten in den Positionen 4, 5, 6 oder 7 tragen kann.
Aus DE 41 19 956 ist die Verwendung von L-Prolin-4-nitroanilin als chromogenes Mittel zum Nachweis der Aminopeptidaseaktivität von Bakterien bekannt.
Die Schrift EP-A-0 224 830 beschreibt eine Methode zur Erfassung von gramnegativen Bakterien in einer Urinprobe, bei der man der Probe einen natürlichen Extrakt zusetzt, der von gewissen Krabbenarten stammt, und dann nach Inkubation die Probe mit einem Träger in Kontakt bringt, der ein Peptidsubstrat enthält, das eine chromogene Abgangsgruppe umfasst. Der verwendete natürlich Extrakt enthält ein Proenzym, und wenn die Probe gramnegative Bakterien in ausreichender Anzahl enthält, aktivieren die Endotoxine dieser Bakterien das Proenzym zu einem Enzym, das in der Lage ist, das Peptidsubstrat unter Bildung eines farbigen Produkts auf dem Träger zu spalten.
Man verfügt gegenwärtig nicht über ein Mittel, das an die gelierten Medien angepasst ist, um Aminopeptidase- und Peptidasewirkungen von Mikroorganismen nachzuweisen. Die bisher verwendeten enzymatischen Substrate besitzen nämlich den Nachteil, dass sie farbige oder fluoreszierende Moleküle freisetzen, die in die gelierten Medien diffundieren, oder die nur durch UV-Bestrahlung nachgewiesen werden (Fall von Naphthylamin oder Aminocumarin), oder die den Zusatz von Reagentien erfordern (Fall von Naphthylamin) oder deren Färbung in den in der Mikrobiologie verwendeten Reaktionsmedien wenig kontrastiert (Fall von Nitroanilin).
In der vorliegenden Anmeldung bezeichnet eine Bezeichnung vom Typ (Aminosäure)-BIA oder (Peptidase)-BIA eine Verbindung vom Typ 3-Acylamino-5-bromoindol, deren Acyl dasjenige dieser Aminosäure oder dieses Peptids ist.
Es ist bekannt, dass L-Leucin-aminopeptidase in histologischen Schnitten von Säugetieren mit Hilfe eines enzymatischen Substrats nachgewiesen wurde, des 3-L-Leucylamino-5-bromoindols, auch L-Leucin-3-(5-bromoindolamin) genannt, abgekürzt L-Leu-BIA, das nach Hydrolyse eine farbige Verbindung erzeugt; vgl. PEARSON et al., 1963, Lab. Invest., 12: 712. Im Jahr 1967 haben YARBOROUGH et al., J. Reticuloendoth. Soc., 4: 390, die Technik von PEARSON et al. in ähnlichen Anwendungen (histologische Schnitte) wieder aufgenommen. Sie geben an, dass der Zusatz einer Mischung von Eisen(III)-cyanid und Eisen(II)-cyanid von Kalium oder von Kupfersulfat die Reaktion hemmt.
Im Jahr 1975 schlagen LOJDA und HAVRANKOVA, Histochemistry, 43: 355, vor, die Methode, die das Substrat L--Leu-BIA benutzt, durch Zusatz einer Mischung aus Tetrazoliumsalz und Phenazinmethosulfat zu verbessern, wobei die beobachtete farbige Reaktion nun von der Reduktion des Tetrazoliumsalzes zu Formazan kommt.
Die Schrift WO-98/04735, die nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, beschreibt die Verwendung eines Acylierungsderivats von 5-Bromoindolamin, wobei Acyl aus den Leucyl- und Alanylresten ausgewählt wurde, als Nachweismittel, das den Nachweis einer Peptidaseaktivität in einer Mikroorganismenkultur durch Bildung eines farbigen Produkts gestattet.
Bei Arbeiten, die zu der vorliegenden Erfindung geführt haben, hat man untersucht, ob es möglich ist, dieses enzymatische Substrat bei der Erfassung von kultivierten Mikroorganismen insbesondere auf gelierten Medien zu verwenden. In Vorversuchen hat man L-Leu-BIA oder L-Pro-BIA einem gewöhnlich bei der Untersuchung von Oxidasen verwendeten Medium zugesetzt, das im nachstehenden Beispiel 1 beschrieben wird. Es war nicht möglich gewesen, eine Leucinaminopeptidase- oder Prolinaminopeptidaseaktivität nachzuweisen, welcher Mikroorganismus auch in diesem Medium kultiviert wurde (insbesondere von den Gattungen Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Pseudomonas, Enterococcus, Staphylococcus, Streptococcus). Der Zusatz der von LOJDA und HAVRANKOVA vorgeschlagenen Reagentien hat sich in einer mehr oder weniger kompletten Hemmung des Wachstums der Mikroorganismen geäußert, ohne den Nachweis einer Pepitdaseaktivität mit L-Leu-BIA oder L-Pro BIA zu gestatten.
Wenn man dagegen demselben Medium von Beispiel 1 7-L-Leucylamino-4-methylcumarin (L-Leu-AMC) oder 7-L-Propylylamino-4-methylcumarin (L-Pro-AMC) zusetzt, wird bei manchen von diesen Mikroorganismen eine Fluoreszenz (also eine Leucinaminopeptidase- oder Prolinaminopeptidaseaktivität) festgestellt (vgl. Beispiel 1). Ebenso kann man in diesem Medium mit Oxidasesubstraten (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid und 6-Chloro-3-indolyl-β-D-glucuronid) die β-Galactosidase und β-Glucuronidaseaktivitäten der Mikroorganismen erfassen.
Auch mit dem in dem nachstehenden Beispiel 2 verwendeten Medium war es nicht möglich, eine Peptidaseaktivität mit L-Leu-BIA oder L-Pro-BIA nachzuweisen.
Man hat jetzt entdeckt, dass das Fehlen von Resultaten mit den Indolaminderivaten nicht auf eine Inkompatibilität mit den Mikroorganismen oder auf eine Hemmung ihrer Vervielfältigung in Kultur zurückzuführen war, sondern im Wesentlichen auf Mediumbedingungen zurückzuführen war. Man hat nämlich entdeckt, dass es möglich ist, die Peptidaseaktivität von Mikroorganismen mit den Indolaminderivaten unter Verwendung von anderen Kulturmedien nachzuweisen. Die Gründe, warum manche Medium verwendbar sind und andere nicht, sind nicht bekannt. Dennoch ist es möglich, durch einfache Routineversuche, die denen ähnlich sind, die im nachstehenden experimentellen Teil beschrieben sind, die Medien und/oder Zusätze zu bestimmen und zu erstellen, die sich eignen oder die sich nicht eignen. Die Erfindung bestand also zunächst darin, zu untersuchen und nachzuweisen, dass es möglich ist, Kulturmedien zu finden, in denen die von Indolamin abgeleiteten Peptidasesubstrate, die im Nachstehenden erwähnt werden, verwendbar sind, um die entsprechenden enzymatischen Aktivitäten in einer Mikroorganismenkultur nachzuweisen.

So hat man insbesondere entdeckt, dass ein verwendbares Medium das folgende ist, das enthält:

– Hefeextrakt	0,5–25 g/l
– Gelatinepepton	0,5–25 g/l
– NaCl	0–50 g/l
und gegebenenfalls:
– pH-Regulierungsmittel, ausreichende Menge für pH 3–9
und/oder
– Geliermittel	5–35 g/l

Das Geliermittel ist ein gebräuchliches Geliermittel, beispielsweise Agar.
Der gewählte pH-Wert ist ein Wert, der sich für den untersuchten Mikroorganismus eignet. Im Fall eines gelierten Mediums ist der pH-Wert vorzugsweise 5 bis 9. Man kann den pH-Wert beispielsweise mit Salzsäure oder Natriumcarbonat einstellen.
Wenn man einem solchen Medium beispielsweise L-Pro-BIA zusetzt und wenn man mit Mikroorganismen beimpft, erhält man je nachdem, ob die Mikroorganismen eine L-Prolinaminopeptidase-Aktivität exprimieren oder nicht, braune oder farblose Kolonien.
Vergleichbare Ergebnisse wurden mit Substraten vom Typ 3-Acylaminoindol erhalten, bei denen das Acyl der Acylrest einer Aminosäure oder eines Peptids ist.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb die Verwendung von mindestens einer Verbindung der Formel (I): X-NH-R (I)in der X eine gegebenenfalls substituierte Indol-3-yl-Gruppe darstellt und R den Acylrest einer Aminosäure oder eines Peptids darstellt, wobei die Aminogruppe oder die Aminogruppen, die in R vorhanden sind, gegebenenfalls in geschützter Form sind, als Entwicklungsmittel bzw. Nachweismittel, wobei dieses Mittel einem Kulturmedium für Mikroorganismen zuzusetzen ist und es gestattet, durch Bildung einer Färbung oder einer Fluoreszenz in diesem Medium entweder eine Peptidaseaktivität in diesem Kulturmedium oder das Vorhandensein eines Mikroorganismus oder einer Gruppe von Mikroorganismen nachzuweisen, die eine solche Aktivität in diesem Medium exprimieren, und zwar mit Ausnahme der Verwendung einer Verbindung der Formel (I), bei der X eine 5-Bromoindol-3-yl-Gruppe darstellt und R einen Leucyl- oder Alanylrest darstellt. Natürlich gestattet die erfindungsgemäße Verwendung gegebenenfalls auch das Fehlen der gesuchten Peptidaseaktivität und/oder das Fehlen des oder der gesuchten Mikroorganismen festzustellen.
Die Aminosäure oder das Peptid, deren bzw. dessen R den Acylrest darstellt, entspricht der Formel RCOOH.
In den Verbindungen der Formel (I) können die in R vorliegenden Aminogruppe oder Aminogruppen und insbesondere die N-terminale Aminogruppe, gewünschtenfalls in geschützter Form sein, und zwar insbesondere mit Hilfe der vorübergehenden Schutzgruppen der Amine, die gewöhnlich in der Chemie der Peptide verwendet werden. Das Vorhandensein oder das Fehlen von solchen Schutzgruppen ist ohne Einfluss auf die Bildung eines farbigen oder fluoreszierenden Produkts, wenn die gesuchte Peptidaseaktivität in dem untersuchten Kulturmedium vorliegt.
Die in der Formel (I) durch X dargestellte Indolylgruppe kann einen oder mehrere Substituenten in mindestens einer der Positionen 1, 4, 5, 6 und 7 umfassen. Diese Substituenten können insbesondere aus den Substituenten Halogen, Niederalkyl, Aryl, Aralkyl, Niederalkoxy und Aralkoxy ausgewählt sein. In der vorliegenden Anmeldung umfassen die Substituenten Niederalkyl und Niederalkoxy sowie die Alkylgruppen der Substituenten Aralkyl und Aralkoxy insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Die Halogensubstituenten können Fluor, Chlor, Brom und Iod, insbesondere Chlor und/oder Brom, sein. Die Arylsubstituenten sind insbesondere Phenylgruppen, die gegebenenfalls beispielsweise mit Niederalkyl-, Halogen- oder Niederalkoxygruppen substituiert sind. Der gegebenenfalls in Position 1 vorhandene Sub stituent ist insbesondere ein Niederalkylsubstituent, beispielsweise mit Methyl. Von den durch X dargestellten substituierten Indol-3-yl-Gruppen kann man insbesondere die Derivate 4-Chloro-, 6-Chloro-, 5-Bromo-, 1-Methyl-, 4-Methyl-, 5-Methyl-, 4,7-Dimethyl-, 4,6-Dichloro-, 6,7-Dichloro-, 4-Chloro-5-bromo-, 4,5,7-Trichloro-, 4,6,7-Trichloro-, 4-Chloro-5-bromo-7-methyl-, 5-Methoxy-, 5-Benzyl-, 5-Benzyloxy- und 5-Phenylindole nennen.
In der Formel (I) handelt es sich, wenn die Gruppe R den Azylrest einer Aminosäure darstellt, beispielsweise um einen Rest Alanyl, Prolyl, Leucyl, Pyroglutamyl oder Arginyl. Wenn die Gruppe R den Acylrest eines Peptids darstellt, kann dieses Peptid bis zu 10 Aminosäurenreste, insbesondere bis zu 5 Aminosäureresten und insbesondere bis zu 3 Aminosäurenreste umfassen. Von den Peptiden, von denen die Gruppe R abgeleitet ist, seien insbesondere diejenigen genannt, deren C-terminaler Aminosäurenrest aus den Resten Leucin, Alanin, Prolin und Arginin ausgewählt ist. Man kann als Peptidbeispiel Alanyl-phenylalanyl-prolin nennen, das Derivate der Formel (I) ergibt, bei denen R Ala-Phe-Pro- darstellt.
Die Verbindungen der Formel (I) sind in wässrigen Medien löslich. Sie können mit Hilfe der gewöhnlich in der Peptidsynthese verwendeten Methoden hergestellt werden. Insbesondere kann man ein Indolamin der Formel X-NH₂, wobei X wie oben definiert ist, mit einem Derivat einer Aminosäure oder eines Peptids reagieren lassen, wobei diese Aminosäure oder dieses Peptid der Formel RH entspricht, wobei R wie oben definiert ist. Dieses Aminosäure- oder Peptidderivat ist ein Derivat mit aktivierter Carboxylgruppe und mit einer oder mehreren Amingruppen, die mit Hilfe einer gebräuchlichen Schutzgruppe der primären Aminfunktionen geschützt ist bzw. sind. Die aktivierte Carboxylgruppe ist ein Derivat der Carboxylgruppe, die die Bildung von Amiden durch Reaktion mit den primären Aminen erleichtert, beispielsweise eine gemischte Anhydridgruppe. Bekanntlich kann man ein gemischtes Anhydrid erhalten, indem man beispielsweise eine Säure mit einem Niederalkylchlorformiat reagieren lässt.
Die Schutzgruppen und ihre Verwendung sind bekannt; vgl. beispielsweise R.A. BOISSONAS, Adv. in Organic Chemistry, Methods and Results, Band 3, Interscience Publishers, 1963, S. 159 und folgende. Im vorliegenden Fall kann man alle insbesondere in der Peptidchemie verwendeten Schutzgruppen der primären Amine verwenden, beispielsweise die Gruppe N-Cbz (N-Benzyloxycarbonyl) oder N-Boc (N-Butyloxycarbonyl), von denen bekannt ist, dass es vorübergehende Schutzgruppen der Amingruppen sind, wobei diese dann gewünschtenfalls durch eine einfache saure Hydrolyse wiederhergestellt werden können. Durch Reaktion des Indolamins der Formel X-NH₂ mit dem Derivat mit aktivierter Carboxylgruppe und mit geschützter Aminogruppe und dann gegebenenfalls Entschützung der Aminogruppe bzw. Aminogruppen erhält man die Verbindung der Formel (I). Das Indolamin der Formel X-NH₂ kann seinerseits insbesondere gemäß einem Verfahren erhalten werden, das zu dem analog ist, das von MADELUNG, Liebigs Annalen der Chemie, Band 405, S. 58–95 (1914), beschrieben wird.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Nachweis einer Peptidaseaktivität in einer Mikroorganismen-Kultur, bei dem man dem Kulturmedium dieser Mikroorganismen ein Nachweismittel der Formel (I), wie es oben definiert ist, zusetzt und bei dem man die eventuelle Bildung einer farbigen Verbindung in dem Kulturmedium sucht, wobei gilt, dass, wenn sich eine farbige Verbindung gebildet hat, die gesuchte Peptidaseaktivität vorhanden ist, und sie abwesend ist, wenn es keine Bildung eines farbigen Produkts gibt. In dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet man natürlich ein Kulturmedium, das zuvor für seine Eignung ausgewählt wurde, die Umwandlung eines Substrats der Formel (I) in ein farbiges Produkt zu gestatten, wenn eine entsprechende Peptidaseaktivität vorhanden ist. Man kann insbesondere ein Medium wie das oben erwähnte verwenden.
In der vorliegenden Anmeldung nennt man "farbiges Produkt" ein Produkt das eine Eigenfarbe hat, wenn es beispielsweise mit weißem Licht beleuchtet wird, oder ein Produkt, das eine Fluoreszenz aussendet, wenn es einer Bestrahlung durch Ultraviolett oder durch sichtbares Licht ausgesetzt wird, und das Wort "Färbung" bezeichnet ebenso das Vorhandensein eines farbigen Produkts, das eine Eigenfarbe besitzt, wenn es mit weißem Licht beleuchtet wird, als auch das Vorhandensein eines Produkts, das unter dem Einfluss einer Bestrahlung von geeigneter Wellenlänge eine Fluoreszenz aussendet.
Der Schritt, in dem man die eventuelle Bildung einer farbigen Verbindung untersucht, wird natürlich gegebenenfalls nach einer solchen Zeit der Kultur ausgeführt, dass die gesuchten Mikroorganismen sich genügend vervielfältigt haben, damit die gesuchte Peptidaseaktivität nachweisbar ist, wenn sie vorhanden ist.
Die Verbindungen der Formel (I) werden in dem Kulturmedium mit einer ausreichenden Konzentration zugesetzt, um die Erfassung der gesuchten Peptidaseaktivität zu gestatten. Für diese Erfassung sucht man entweder mit dem bloßen Auge oder mit Hilfe von geeigneten optischen Mitteln das Auftreten einer Färbung oder gegebenenfalls das Auftreten einer Fluoreszenz unter Bestrahlung mit ultraviolettem Licht oder mit sichtbarem Licht. Diese ausreichende Konzentration kann in jedem Fall zuvor durch Routineuntersuchungen bestimmt werden. Das Kulturmedium kann beispielsweise 25 bis 2000 mg/L der Verbindung der Formel (I) enthalten.
Einer der Vorteile der Verbindungen der Formel (I) ist, dass die farbigen Produkte, die sie in Gegenwart einer Peptidaseaktivität bilden, nicht in die gelierten Kulturmedien diffundieren.
Sie können also in geliertem Medium verwendet werden. Sie können natürlich auch in flüssigem Medium verwendet werden.
Ferner hemmen die Substrate der Formel (I) nicht die Vermehrung der Mikroorganismen in dem Kulturmedium. Man kann sie deshalb verwenden, indem man sie dem Kulturmedium zu jedem Zeitpunkt zusetzt, einschließlich, wenn gewünscht, vor dem Beginn der Kultur, zum Kulturbeginn oder am Ende der Kultur. Im Fall eines gelierten Mediums wird die Verbindung der Formel (I) natürlich bei der Herstellung des Kulturmediums vor der Gelierung dieses Mediums eingeführt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Mikroorganismus oder einer Gruppe von Mikroorganismen in einer Probe, die sie enthält oder sie enthalten kann. Dieses Verfahren umfasst die Schritte, die darin bestehen, dass einem die Probe enthaltenden Kulturmedium mindestens eine Verbindung der Formel (I), wie sie oben definiert ist, zugesetzt wird, die eventuelle Bildung eines farbigen oder fluoreszierenden Produkts in diesem Medium untersucht wird und gegebenenfalls die erhaltene Färbung oder Fluoreszenz mit derjenigen verglichen wird, die mit einer authentischen Probe des gesuchten Mikroorganismus oder der gesuchten Gruppe von Mikroorganismen verglichen wird. In einem solchen Verfahren basiert die Erfassung natürlich auf der Ex pression oder dem Fehlen einer Expression der Peptidaseaktivität durch den gesuchten Mikroorganismus oder durch die gesuchte Gruppe von Mikroorganismen, die das verwendete Nachweismittelmittel der Formel (I) nachweisen kann.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Erfassen von Mikroorganismen kann man der Kultur außerdem mindestens ein zusätzliches Nachweismittel zusetzen, das es gestattet, durch Bildung eines farbigen oder fluoreszierenden Produkts eine enzymatische Aktivität zu erfassen, die dieselbe sein kann wie diejenige, die mit Hilfe der Verbindungen der Formel (I), wie sie oben definiert sind, nachgewiesen wird, die jedoch im Allgemeinen eine andere enzymatische Aktivität als diejenige ist, die mit Hilfe der Verbindungen der Formel (I) nachgewiesen wird. Es kann sich beispielsweise um eine Esterase-, Osidase- oder Peptidaseaktivität handeln. Man kann auch zusätzliche Informationen erhalten in Verbindung mit einem Fehlen von Färbung (oder von Fluoreszenz) oder in Verbindung mit einer Färbung, die gegenüber der Färbung verändert ist, die mit einem einzigen enzymatischen Substrat erhalten wird. Das andere gewählte Nachweismittel hat Eigenschaften, die von denjenigen der Indolaminderivate der Formel (I) verschieden sind: beispielsweise wählt man ein anderes Nachweismittel, das ein Reaktionsprodukt ergeben kann, das eine Farbe hat, die von der durch das Indolamin der Formel (I) erzeugten Farbe verschieden ist. Das andere Nachweismittel (oder zweites Nachweismittel) gestattet also dank seiner eigenen Farbe oder dank seiner Fluoreszenz das Vorhandensein einer enzymatischen Aktivität, für die es spezifisch ist, nachzuweisen. Wenn die durch die Indolaminderivate der Formel (I) nachweisbare Peptidaseaktivität ebenfalls vorhanden ist, erhält man eine geänderte Färbung, die von der Färbung verschieden ist, die von der Verbindung der Formel (I) gegeben wird, wenn sie allein verwendet wird, und auch von der Eigenfarbe verschieden ist, die durch das zweite Nachweismittel gegeben wird. Beispiele der Verwendung von mehreren Substraten sowie die Informationen, die daraus hervorgehen können, sind im Nachstehenden im experimentellen Teil angegeben. Die Ergebnisse können natürlich mit jeder untersuchten Art oder jedem untersuchten Stamm von Mikroorganismen variieren. Jeder Fall, der von Interesse sein kann, muss also Gegenstand von Vorstudien gemäß Routineuntersuchungen sein.
Die Derivate, die zum Nachweis der verschiedenen enzymatischen Aktivitäten dienen und als zusätzliche Nachweismittel verwendbar sind, sind bekannte Nachweismittel oder ihre Analoga. Diese sind insbesondere Derivate von Indoxyl, Cumarin, Resorufin, Naphtol, Naphtylamin, Nitrophenol, Nitroanilin, Rhodamin, Hydroxychinolin, Fluorescein usw.
Von diesen zusätzlichen Nachweismitteln, die in Kombination mit den Indolaminderivaten verwendet werden können, kann man insbesondere nennen 5-Bromo-4-chloro-3-indolyn-β-D-glucuronid, 6-Chloro-3-indolyl-β-D-glucosid, L-Alanin-7-amino-4-methylcumarin, 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-galactosaminid, Resorufin-β-D-galactosid, β-Naphtylsulfat, Naphtol AS-BI β-D-galactosid, L-Alanin-β-naphtylamid, o-Nitrophenol-β-D-galactosid, Carboxyben-zoyl-L-arginin-p-nitroanilid, Rhodamin 110-bis-(L-leuchinamid), Hydroxychinolin-β-D-glucosid und Fluoresceindiacetat.
Die Merkmale und Vorteile der Erfindung werden durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1

Das Kulturmedium enthält, abgesehen von Wasser:

– Fleischpepton ➀	15 g/l
– Caseinpepton ➁	3 g/l
– NaCl	5 g/l
– Trispuffer	0,5 g/l
– Na₂HPO₄	1 g/l
– Natriumcitrat	1 g/l
– Glucose	1 g/l
– Natriumpyruvat	2 g/l
– Agar	13 g/l

➀ vertrieben von: D.I.F.C.O.
➁ vertrieben von: D.I.F.C.O.

Diesem Medium setzt man entweder L-Pro-BIA, oder 7-L-Prolyl-amino-4-methylcumarin (L-Pro-AMC) in einer Konzentration von 200 mg/l zu. Man beimpft die verschiedenen erhaltenen Medien, die in Petrischalen verteilt sind, mit Mikroorganismen. Die Schalen wurden bei 37°C während 48 h zur Inkubation gebracht. Die gebildeten Kolonien wurden visuell bei Umgebungslicht und unter der UV-Lampe (Wellenlänge = 365 nm) nach 24 und 48 h Inkubation untersucht. Die Farbe oder das Vorhandensein von Fluoreszenz wurde notiert. Die untersuchten Mikroorganismen waren: Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans.
Nach 24 h oder 48 h Kultur beobachtet man keine Färbung in dem L-Pro-BIA enthaltenden Kulturen, obwohl diese Kulturen eine L-Pro-Peptidase-Aktivität enthalten, die in dem L-Pro-AMC enthaltenden Kulturen nachgewiesen werden kann: man beobachtet dabei die Aussendung einer Fluoreszenz unter UV-Bestrahlung.
Wenn man dem vorstehenden Medium entweder L-Ala-BIA oder L-Leu-BIA oder L-Alanin-7-amino-4-methylcumarin (L-Ala-AMC) oder L-Leucin-7-amino-4-methylcumarin (L-Leu-AMC) in Konzentrationen von 200 mg/L zusetzt, beobachtet man nach 24 h oder 48 h Kultur keine Färbung im Fall der Bromoindolaminderivate (BIA). Dagegen konnte man mit Aminomethylcumarinderivaten (AMC) das Vorhandensein der L-Alanin-aminopeptidase- und L-Leucin-aminopeptidase-Aktivitäten im Fall von Escherichia coli, Klebsiella Pneumoniae, Citrobacter freundii, P. aeroginosa, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium und Streptococcus pyogenes und ein Fehlen dieser Aktivitäten mit Staphylococcus epidermidis nachweisen.
Beispiel 2
In einem Phosphatpuffer 0,1 M pH 7,3 mit 25°C setzt man entweder L-Pro-BIA oder L-Pro-AMC mit einer Konzentration von 400 mg/L zu. Das erhaltene Medium wird in die Vertiefungen von Mikrotitrierplatten verteilt, die man mit Suspensionen von P. aeruginosa oder C. albicans beimpft. Die Platten werden während 24 h bei 37°C zur Inkubation gebracht. Die Vertiefungen werden visuell bei Umgebungslicht und unter der UV-Lampe nach 24 h bis 48 h Inkubation untersucht.
Keine Färbung wurde notiert mit L-Pro-BIA, obwohl es möglich ist, eine L-Pro-Aminopeptidase-Aktivität in Vertiefungen nachzuweisen, in denen man L-Pro-BIA durch L-Pro-AMC ersetzt hat.
Auf analoge Weise hat der Zusatz von L-Leu-BIA zum oben erwähnten Phosphatpuffer nicht erlaubt, eine L-Leucin-Aminopeptidase-Aktivität in den Kulturen von E. coli, K. pneumoniae, C. freundii, P. aeruginosa, S. agalactiae, E. faecium und S. pyogenes zu erfassen, während diese Aktivität durch Fluoreszenz nach 24 bis 48 h bei eben diesen Bakterien in demselben mit L-Leu-AMC versetzten Puffer erfasst wird.
Beispiel 3
Das Kulturmedium enthält, abgesehen von Wasser:

– Hefeextrakt ➀ 6 g/l

– Gelatinepepton ➁ 5 g/l

– NaCl 8 g/l

– Na₂CO₃ 0,1 g/l

– Agar 13 g/l

➀ vertrieben von BIO MERIEUX
➁ BIO-GELYTONE, vertrieben von BIO MERIEUX

Diesem Medium setzt man entweder L-Pro-BIA oder Pyroglutamyl-BIA (Pyr-BIA) oder Ala-Phe-Pro-BIA zu. Man beimpft diese verschiedenen Medien, die in Petrischalen verteilt sind, mit verschiedenen Mikroorganismen: E. coli, K. pneumoniae, C. freundii, P. aeruginosa, S. agalactiae, E. faecium, S. pyogenes, S. epidermidis, C. albicans und C. tropicalis. Die Schalen werden während 48 h bei 37°C zur Inkubation gebracht und die gebildeten Kolonien werden visuell nach 24 und 48 h Inkubation untersucht. Die Farbe wurde notiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 angeführt:
TABELLE 1

¹: – = Fehlen von Färbung
²: Braun = Farbe der Kolonie
³: NT = Nicht getestet

In dem bei diesem Beispiel verwendeten Medium ist es also möglich, L-Prolin-aminopeptidase-, Pyroglutamyl-aminopeptidase- und Alanin-phenylalanin-prolin-peptidase-Aktivitäten mit L-Pro-BIA, Pyr-BIA bzw. Ala-Phe-Pro-BIA nachzuweisen. Man kann insbesondere die Bakterien der Art E. faecium (farblose Kolonie mit Ala-Phe-Pro-BIA) von den untersuchten Bakterien der Gattung Streptococcus (braune Färbung mit Ala-Phe-Pro-BIA) unterscheiden. Man kann auch die Art P. aeruginosa (braune Kolonien mit L-Pro-BIA) von den anderen untersuchten gramnegativen Bakterien unterscheiden. Man kann außerdem die Hefestämme der Art C. albicans (braune Kolonien mit L-Pro-BIA) von den Zellen der Art C. tropicalis unterscheiden.
Man hat mit einem analogen flüssigen Medium ohne Agar identische Ergebnisse erhalten.
Beispiel 4
In dem Medium von Beispiel 3 hat man entweder L-Pro-BIA oder Pyr-BIA allein oder in Kombination mit entweder 5-Bromo-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucosid (X-Glu) oder 6-Chloro-3-indolyl-β-D-glucosid (Z-Glu) oder 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucosid (MUGl) eingeführt. Man beimpft diese verschiedenen Medien in Petrischalen verteilten Medien mit Mikroorganismen. Die Schalen wurden bei 37°C während 48 h zur Inkubation gebracht und die gebildeten Kolonien wurden visuell bei Umgebungslicht und unter der UV-Lampe (Wellenlänge = 365 nm) untersucht. Die Farben der nach 24 und 48 h Inkubation erhaltenen Kolonien sind in der Tabelle 2 angeführt:
TABELLE 2

N*: Nr. des Mediums
T**: Kulturzeit
–: Fehlen von Färbung
NT: Nicht getestet.

Auf den Medien 2, 3 und 4 ist es möglich, nach 24 h Inkubation E. coli (Fehlen von Färbung) und P. aeruginosa (braune Färbung) von den anderen gramnegativen Bakterien zu unterscheiden. Auf diesen Medien ist es ferner möglich, C. albicans von C. tropicalis zu unterscheiden, wobei diese beiden Arten Kolonien von verschiedenen Farben erzeugen. Die Medien 6, 7 und 8 gestatten die Unterscheidung zwischen S. agalactiae und den Arten E. faecium und S. pyogenes, wobei die Stämme von S. agalactiae farblose Kolonien und die der beiden anderen Arten farbige Kolonien ergeben. Nach 24 h Stunden Inkubation kann man außerdem dank ihrer charakteristischen Farbe (veränderlich je nach dem Medium) die Bakterien E. faecium von den anderen untersuchten Bakterien unterscheiden.

Claims

Verwendung mindestens einer Verbindung der Formel (I): X-NH-R (I)in der X eine gegebenenfalls substituierte Indol-3-yl-Gruppe darstellt und R den Acylrest einer Aminosäure oder eines Peptids darstellt, wobei die Aminogruppe oder die Aminogruppen, die in R vorhanden sind, gegebenenfalls in geschützter Form sind, als Entwicklungsmittel, wobei dieses Entwicklungsmittel einem Kulturmedium zuzusetzen ist und es gestattet, durch Bildung einer Färbung oder einer Fluoreszenz in diesem Medium entweder eine Peptidaseaktivität in einer Kultur von Mikroorganismen oder das Vorhandensein eines Mikroorganismus oder einer Gruppe von Mikroorganismen nachzuweisen, die eine solche Aktivität in diesem Medium exprimieren, und zwar mit Ausnahme der Verwendung einer Verbindung der Formel (I), bei der X eine 5-Bromindol-3-yl-Gruppe darstellt und R einen Leucyl- oder Alanylrest darstellt.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der R den Acylrest einer Aminosäure oder den Acylrest eines Peptids mit bis zu 10 Aminosäurenresten darstellt.
Verwendung nach Anspruch 2, bei der das Peptid bis zu 5 Aminosäurenreste und insbesondere bis zu 3 Aminosäurenreste umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, bei der R den Acylrest des Peptids Ala-Phe-Pro- darstellt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, bei der der C-terminale Aminosäurerest dieses Peptids ein Leucin-, Alanin-, Proline- oder Argininrest ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 und 2, bei der R einen Rest Alanyl, Prolyl, Leucyl, Pyroglutamyl oder Arginyl darstellt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der X eine Indol-3-yl-Gruppe darstellt, die an mindestens einer der Positionen 1, 4, 5, 6 und 7 dieser Indolgruppe substituiert ist.
Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, bei der X eine 5-Bromindol-3-yl-Gruppe darstellt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der das Kulturmedium ein geliertes Medium ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei der das Kulturmedium ein flüssiges Medium ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der man dem Kulturmedium außerdem mindestens ein anderes Entwicklungsmittel zusetzt, das es gestattet, durch Bildung eines farbigen oder fluoreszierenden Produkts eine Enzymaktivität zu erfassen.
Verwendung nach Anspruch 11, bei der das andere Entwicklungsmittel es gestattet, eine andere Enzymaktivität als diejenige, die mit Hilfe des Entwicklungsmittels der Formel (I) nachgewiesen wird, zu erfassen.
Verfahren zum Nachweis einer Peptidaseaktivität in einem Mikroorganismen-Kulturmedium, umfassend die Schritte, die darin bestehen, dass dem Kulturmedium eine Verbindung der Formel (I) X-NH-R (I)zugesetzt wird, in der X eine gegebenenfalls substituierte Indol-3-yl-Gruppe darstellt und R den Acylrest einer Aminosäure oder eines Peptids darstellt, wobei die Aminogruppe oder die Aminogruppen, die in R vorhanden sind, gegebenenfalls in geschützter Form sind, und zwar mit Ausnahme einer Verbindung der Formel (I), bei der X eine 5-Bromindol-3-yl-Gruppe darstellt und R einen Leucyl- oder Alanylrest darstellt, und die eventuelle Bildung eines farbigen oder fluoreszierenden Produkts in diesem Medium gesucht wird, wobei gilt, dass die Bildung oder das Fehlen eines farbigen oder fluoreszierenden Produkts es gestattet, auf das Vorhandensein bzw. das Fehlen dieser Peptidaseaktivität zu schließen.
Verfahren zur Erfassung des Vorhandenseins oder Fehlens eines Mikroorganismus oder einer Gruppe von Mikroorganismen in einer Probe, die diese enthält oder enthalten kann, durch Erfassung der Expression oder des Fehlens einer Expression einer Peptidaseaktivität durch diesen Mikroorganismus oder diese Gruppe von Mikroorganismen, umfassend die Schritte, die darin bestehen, dass dem die Probe enthaltenden Kulturmedium eine Verbindung der Formel (I) X-NH-R (I)zugesetzt wird, in der X eine gegebenenfalls substituierte Indol-3-yl-Gruppe darstellt und R den Acylrest einer Aminosäure oder eines Peptids darstellt, wobei die Aminogruppe oder die Aminogruppen, die in R vorhanden sind, gegebenenfalls in geschützter Form sind, und zwar mit Ausnahme einer Verbindung der Formel (I), bei der X eine 5-Bromindol-3-yl-Gruppe darstellt und R einen Leucyl- oder Alanylrest darstellt, die eventuelle Bildung eines farbigen oder fluoreszierenden Produkts in diesem Kulturmedium gesucht wird und gegebenenfalls die erhaltene Färbung oder Fluoreszenz mit derjenigen verglichen wird, die mit einer authentischen Probe des gesuchten Mikroorganismus oder der gesuchten Gruppe von Mikroorganismen erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, bei dem die Verbindung der Formel (I) so ist, wie sie in einem der Ansprüche 2 bis 8 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 13, 14 oder 15, bei dem man die Verbindung der Formel (I) dem Kulturmedium vor dem Beginn eines Schritts der Kultur oder zu Beginn eines Schritts der Kultur dieses Mikroorganismus oder dieser Gruppe von Mikroorganismen zusetzt, der bzw. die in dieser Probe vorliegen kann.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem das Kulturmedium ein geliertes Medium ist und bei dem man die Verbindung der Formel (I) bei der Zubereitung des Kulturmediums vor der Gelierung dieses Mediums einführt.