DE69815038T2

DE69815038T2 - Universales testsystem und verfahren zu seiner verwendung zur identifizierung diverse familien von mikroorganismen

Info

Publication number: DE69815038T2
Application number: DE69815038T
Authority: DE
Inventors: H. James GODSEY; M. Daniel NOTHAFT
Original assignee: Dade MicroScan Inc
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 1997-04-10
Filing date: 1998-03-16
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2018-03-17
Also published as: DE69815038T3; JP2000512508A; CA2257609A1; US5888760A; WO1998045469A1; ES2200321T3; CN1228125A; ES2200321T5; AU6467098A; EP0925369B1; EP1293575A2; EP0925369B2; DE69815038D1; EP0925369A1; IL127402A0; EP1293575A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft universelle Testsysteme und -verfahren zu ihrer Verwendung, um die Identität eines Mikroorganismus, welcher zu irgendeiner von mehreren auseinander liegenden Gruppen von Mikroorganismen, z. B. anaeroben Mikroorganismen, Hefe, Fastidien (fastidious bacteria), enterischen Mikroorganismen, Staphylokokke, Streptokokke und Enterokokke gehören kann, unter Mikroorganismen aus verschiedenen Familien oder Gruppen zu bestimmen. Die Testsysteme der vorliegenden Erfindung umfassen eine einzige Serie von vorbestimmten Tests, um die Gegenwart von Enzymen, die einzigartig für eine Familie oder Gruppen, Gattung und/oder Spezies von Mikroorganismen sind, nachzuweisen.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Die Entwicklung von Verfahren zur Klassifizierung oder Identifizierung von Bakterien war ein andauerndes Ziel der Mikrobiologiegemeinschaft seit den ersten Anfängen der Disziplin der Mikrobiologie. Frühe Klassifizierungsverfahren basierten auf der mikroskopischen Untersuchung der Mikroorganismen und anschließenden Beschreibung ihrer Zellmorphologie, d. h. kokkenförmige Zellen, stäbchen(bazillen)-förmige Zellen, kokken-basillenförmige Zellen, knospende Hefen und Sphirochyten. Die Mikrobiologen beschrieben ihre mikroskopischen Beobachtungen von Mikrozellenanordnungen auch als ein zusätzliches Mittel für die Kategorisierung der Mikroorganismen, d. h. Streptokokke bezog sich auf eine Kette von kokkenförmigen Zellen, welche einer Perlenkette ähneln, Staphylokokke bezog sich auf eine Gruppe von kokkenförmigen Zellen, welche einer Weintraube ähneln, usw. Später wurden Farbstoffe entwickelt, um die Unterscheidungsfähigkeiten des Mikroskops zu verbessern. Der bedeutendste davon war der Gram-Farbstoff, welcher die Mikroorganismen in zwei Gruppen unterteilte: gramnegative Mikroorganismen, welche sich Rosa bis Rot färben, und grampositive Organismen, welche sich Hellblau bis Blau färbten. Anschließend wurde beobachtet, dass unter den Mikroorganismen, welche menschliche Krankheiten verursachen, die meisten gramnegativen Mikroorganismen stäbchenförmig waren und die meisten grampositiven Mikroorganismen kokkenförmig waren. Ein anderes frühes Mittel zur Unterscheidung eines Mikroorganismus war, die Fähigkeit des Mikroorganismus, in Gegenwart oder Abwesenheit von Sauerstoff zu wachsen, zu beobachten. Mikroorganismen, welche in Gegenwart von Sauerstoff wachsen, werden aerob genannt und jene, welche in Abwesenheit von Sauerstoff wachsen, werden anaerob genannt.
Eine der bedeutenderen frühen Entdeckungen in der. diagnostischen Mikrobiologie war die Fähigkeit, Bakterien in Kulturröhrchen oder in Petrischalen zu züchten, wobei verschiedene Arten von flüssigen oder festen bakteriologischen Wachstumsmedien verwendet werden. Die Mikrobiologen begannen daraufhin, den Wachstumsmedien verschiedene Chemikalien hinzuzufügen, um weitere Mittel zur Unterscheidung unter Mikroorganismen zu entwickeln, wie beispielsweise Wachstumstests oder Wachstumshemmungstests,z. B. hemmen 6,5% NaCl das Wachstum von Streptokokken, aber nicht von Enterokokken, oder biochemische Tests,z. B. fermentieren enterische Bakterien die Glucose, um Säureendprodukte zu erzeugen, während nichtfermentative Bakterien dies nicht tun.
Die Verbindung all der zuvor erwähnten morphologischen, Wachstums/Hemmungs- und biochemischen Tests zu einer Serie von Tests, welche den Mikrobiologen zum Klassifizieren von Bakterien zur Verfügung stehen, führte zur Entwicklung von Mitteln zum Klassifizieren von Bakterien in die traditionellen taxanomischen Einheiten von Familie, Gattung und Spezies, welche verwendet werden, um alle Lebewesen zu klassifizieren. Historisch gesehen war das Vorgehen der Mikrobiologen, Serien von Klassifizierungstests zu entwickeln, welche auf nur eine Gruppe oder Familie von Mikroorganismen anwendbar sind,z. B. das Schema von Facklam zur Identifizierung von Viridans-Streptokokken (Bezugsquelle 3), das Schema von Kloos und Schleifer zur Identifizierung von koagulase-negativen Staphylokokken (Bezugsquelle 2), das Schema von Edwards und Ewing zur Identifizierung von gramnegativen enterischen Mikroorganismen (Bezugsquelle 1) usw. Jedes dieser Schemata verwendet Testformulierungen, welche speziell für die Stoffwechsel- und Wachstumscharakteristiken der Familie von Mikroorganismen entworfen wurden, für welche das Schema bestimmt ist. Daher ist ein Glucosefermentierungstest für Streptokokken anders als ein Glucosefermentierungstest für Staphylokokken und für enterische Mikroorganismen formuliert. Tatsächlich stellen die kommerziellen Anbieter von angesetzten bakteriologischen Medien die zuvor erwähnten familienspezifischen Formulierungen im Handel zur Verfügung. Der Katalog Nr. 103 (Januar 1994) von Remel (12076 Santa Fe Drive, Lenexa, Kansas 66215–3594) bietet den Mikrobiologen eine große Auswahl von herkömmlichen biochemischen Formulierungen in Röhrchen, um damit die zuvor erwähnten Identifizierungsschemata durchzuführen. Der Remel-Katalog bietet insbesondere acht (8) verschiedene Formulierungen von Medien zum Nachweis von Kohlehydratfermentierung durch sieben (7) verschiedene Familien von Mikroorganismen an. Sie sind wie folgt: Eine Purpurbouillon wird zum Testen von enterischen Mikroorganismen verwendet (siehe Seite 40–41), eine Phenolrotbouillon wird zum Testen von Streptokokken verwendet (siehe Seite 38–39), ein P.R.A.S.-Medium und ein CHO-Medium werden zum Testen von anaeroben Mikroorganismen verwendet (siehe Seite 29–30 und 40), ein CTA-Medium und eine Herzinfusionsbouillon werden zum Testen von Fastidien (fastidious microorganisms) verwendet (siehe Seite 30–31 und 33), ein OF-Medium wird zum Testen von nichtfermentativen gramnegativen Bazillen und enterischen Mikroorganismen verwendet (siehe Seite 37–38) und eine Hefefermentierungsbouillon wird zum Testen von Hefe verwendet (siehe Seite 47–48).
Bezugsguellen:

1. Ewing, W. H., 1986, „Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae", 4. Ausgabe, Elsevier Science Publishing Co., New York.
2. Kloose, W. E, und K. H. Schleifer, 1975, „Simplified scheme for routine identification of human Staphylococcus species", J. Clin. Microbiol., 1 : 82-88.
3. Facklam, R. R., und J. A. Washington II, 1991, „Streptococcus and related catalase-negative grampositive cocci", S. 238–257, in A. Barlows, W. J. Hausler, Jr., K. L. Hermann, H. D. Isenberg und H. J. Shadome (Ed.), Manual of Clinical Microbiology, 5. Ausgabe, American Society for Microbiology, Washington DC.

Nachdem es in den späten 60ern mit der Einführung des Enterotube-Identifizierungssystems für enterische Bakterien durch Roche Diagnostic (1447 York Court, Burlington, NC 27215) begonnen hatte, worauf kurz später die Herausgabe des enterischen Identifizierungssystems 20E durch API (595 Anglum Drive, Hazelwood, MO 63042–2395) folgte, begannen die Diagnoseunternehmen dieselbe logische Grundlage für die Entwicklung und Herstellung von kommerziellen bakteriellen Identifizierungssets zu übernehmen. Vitek, MicroScan, IDS (Innovative Diagnostic Systems, 2797 Peterson Place, Norcross, GA 30071) und API bieten jeweils familienspezifische Produkte an, um jede Familie oder Gruppe von Bakterien zu identifizieren (siehe folgende Tabelle I).
TABELLE I
Die Geschichte hat die Mikrobiologen gelehrt, dass die Identifizierung von klinischen Isolaten oder Stämmen von Mikroorganismen, welche zu verschiedenen Familien von Bakterien gehören, die Verwendung von verschiedenen herkömmlichen biochemischen Schemata mit Röhrchen oder verschiedenen kommerziellen Produkten erfordert. Alle traditionellen biochemischen Tests bauen auf das Wachstum als ein Mittel zum Erweitern der Anzahl von Zellen und Stimulieren von bestimmten Enzymen. Die Notwendigkeit, die Testformeln zu den Wachstumscharakteristiken einzelner Familien von Bakterien zu optimieren, ist die Basis für die historische Konzentration auf familienspezifische Tests (traditionelle biochemische oder kommerzielle Röhrchensets). Zum Beispiel gibt es in der vorstehenden Erörterung von herkömmlichen biochemischen Tests acht verschiedene Formulierungen für Glucosefermentierung, welche formuliert sind, um mit sieben verschiedenen Familien von Mikroorganismen speziell reaktionsfähig zu sein. Da herkömmliche biochemische Tests größtenteils wachstumsabhängig sind, wurde jede Glucosefermentierungsreaktion für das Wachstum einer bestimmten Familie von Mikroorganismen und den Nachweis von Glucosefermentierung durch diese Familie von Mikroorganismen optimiert. Diese Technik wurde durch kommerzielle biochemische Identifizierungssysteme weitergeführt, indem es verschiedene biochemische Identifizierungsprodukte (siehe vorstehende Liste) für jede der verschiedenen Familien oder Gruppen von Mikroorganismen gibt. Die Entwicklung von gruppenspezifischen Produktklassen spiegelt die Notwendigkeit wider, sowohl Formulierungen zu entwickeln, um familien- oder gruppenspezifische Wachstumscharakteristiken zu fördern, als auch die Reaktionsfähigkeit von Substraten für den Stoffwechsel jeder Familie oder Gruppe von Mikroorganismen zu optimieren. Als die Diagnoseunternehmen mit der Ent- Wicklung von schnellen Identifizierungstests, welche chromogenische, fluorogenische oder schnelle herkömmliche Tests verwendeten, wobei der Nachweis colorimetrisch oder fluorometrisch erfolgte, dauerte das familienspezifischen Produktformat an, auch wenn die Abhängigkeit vom Wachstum stark reduziert war. Diese neuen schnellen ID-Systeme waren eher wachstumsunabhängig als wachstumsabhängig. Sie prüfen auf präformierte Enzyme, welche in dichteren Suspensionen von Bakterien, als in Systemen auf Wachstumsbasis verwendet wurden, vorhanden sind.
EP-A 0 018 825 offenbart einen Prozess zur Identifizierung von Bakterien, insbesondere Escherichia, Klebsiella spp., Proteus und Pseudomonas spp., wobei der Prozess umfasst, die Bakterien einer Kombination von Tests zur Bestimmung von bakteriellen Enzymen, insbesondere saure Phosphatase, Betagalactosidase, Glutamatdecarboxylase, Phenylalanindesaminase, Cytochromoxidase, Diacetyl erzeugende Enzyme und Urease, zu unterziehen.
Demgemäß wäre es wünschenswert, über ein universelles Testsystem zu verfügen, um einen Mikroorganismus, welcher zu einer von jeder Anzahl von mehreren auseinander liegenden Gruppen von Mikroorganismen gehört, zu klassifizieren und/oder zu identifizieren, wie beispielsweise durch Verwenden einer einzigen Serie von biochemischen Tests und infolgedessen Vermeiden der Verwendung von mehreren Serien von Tests oder kommerziellen Testsets, bei welchen jede Testserie oder -kombination auf spezifische Gruppen oder Familien von Mikroorganismen zugeschnitten ist.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die aktuelle Erfindung schafft zum ersten Mal die Möglichkeit, einen Mikroorganismus, welcher zu irgendeiner von weit auseinander liegenden Gruppen von Mikroorganismen gehört, unter Verwendung einer einzigen Serie von biochemischen Tests, jeder mit einer einzigen universellen Formulierung, zu identifizieren. Dieses „universelle" Format stellt universelle biochemische Identifizierungssysteme bereit, welche Identifizierungsresultate in einer so kurzen Inkubationszeit wie 15 Minuten oder bis zu acht Stunden (eine einzige Arbeitsschicht) hervorbringen. Diese Tests können von chromogenischer/colorimetrischer oder fluorogenischer/fluorometrischer Beschaffenheit sein und visuell oder automatisch gelesen werden. Eine Datenbank (Wahrscheinlichkeitsmatrix), welche verwendet wird, um die Mikroorganismen zu klassifizieren und zu identifizieren, umfasst entweder eine einzige Datenbank, welche Mitglieder von allen zu identifizierenden Familien umfasst, oder eine Reihe von Unterdatenbanken, welche auf jede Familie zutreffen. Diese Wahrscheinlichkeitsmatrix wird hierin im Folgenden manchmal als vorbestimmter Standard bezeichnet. Ein Vorteil des vorliegenden Systems für die Benutzer ist, dass sie nur lernen müssen, wie eine einzige Testmethodologie für die Mehrheit ihrer Mikroorganismusidentifizierungserfordernisse zu verwenden ist. Zweitens brauchen die Benutzer für die Mehrheit ihrer Mikroorganismusidentifizierungserfordernisse eher nur einen einzigen Test zu ordnen und zu inventarisieren, als das Inventar von mehreren Produkten zu verwalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft einzige (universelle) Serien von biochemischen Tests, d. h. Testsystemen, zur Identifizierung eines Mikroorganismus, welcher zu irgendeiner von einer Anzahl von weit auseinander liegenden Gruppen von Mikroorganismen gehört. Die Klassifizierung eines bestimmten Mikroorganismus in einer dieser weit auseinander liegenden Gruppen basiert zum größten Teil auf den Wachstumsanforderungen für diese bestimmten Mikroorganismen. Zum Beispiel weisen Staphylokokken, Streptokokken und Enterokokken ähnliche Wachstumsanforderungen wie enterische und nichtfermentierende Mikroorganismen auf. In der Vergangenheit wurden auseinander liegende Gruppen von Mikroorganismen durch Beobachten des Wachstums bei wohl bekannten biochemischen Formulierungen, welche auf jede Familie oder Gruppe zugeschnitten waren (z. B. wachstumsmedienspezifische für Hefe, anaerobe Bakterien oder Fastidien (fastidious bacteria) usw.), nachgewiesen. Beispiele für weit auseinander liegende Gruppen oder Familien von Mikroorganismen umfassen (i) Hefe und anaerobe Bakterien; (ii) Hefen und Staphylococcus sp., Streptococcus sp. und/oder Enterococcus sp.; (iii) Hefen und enterische Bakterien; (iv) Hefen, anaerobe Bakterien und Fastidien (fastidious bacteria), (v) Fastidien (fastidious bacteria) und Hefe und (vi) anaerobe Bakterien und Fastidien (fastidious bacteria). Beispiele für nicht auseinander gehende Gruppen oder Familien von Mikroorganismen umfassen z. B. (i) enterische Bakterien und nichtfermentierende Mikroorganismen; (ii) Staphylococcus sp., Streptococcus sp. und Enterococcus sp. und (iii) Neisseria und Haemophilus.
Die Erfindung stellt daher ein Testsystem zur Identifizierung eines Mikroorganismus in einer Probe bereit, wobei das Testsystem in der Lage ist, diesen Mikroorganismus aus Gruppen von weit auseinander liegenden Mikroorganismen zu identifizieren, umfassend Hefe und wenigstens eines der folgenden:

i) anaerobe Bakterien,
ii) enterische Bakterien,
iii) grampositive Gruppe von Bakterien,
iv) Neisseria und Haemophilus oder
v) Fastidien (fastidous bacteria),

Beispiele für Mikroorganismen, welche zu jeder dieser weit auseinander liegenden Gruppen gehören, können in den nachstehenden Tabellen II bis V vorgefunden werden. Von Zeit zu Zeit werden Mikroorganismen zu solchen Gruppen hinzugefügt und daraus gestrichen, sowie von einer Gruppe in eine andere gewechselt, oder sie erhalten einen neuen Namen. Die Testsysteme der vorliegenden Erfindung sind auf alle derartigen Gruppen anwendbar.
TABELLE II HNID-Gruppe
TABELLE III HEFE-Gruppe
TABELLE IV grampositive Gruppe
TABELLE V Anaerobe Gruppe
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen den Schritt, eine Probe einer einzigen Serie von vorbestimmten biochemischen Tests zu unterziehen, um die Gegenwart von wenigstens einem Enzym und/oder Gruppen von Enzymen in einem Stoffwechselweg nachzuweisen, welche einzigartig für eine Familie, Gattung und/oder Spezies von Mikroorganismen sind, um den Mikroorganismus zu identifizieren. Eine Serie von Tests wird hierin im Folgenden manchmal als eine Kombination von Tests oder ein Testsystem bezeichnet. Die Proben, welche hierin verwendet werden, umfassen eine Mikroorganismussuspension, welche von einer Kolonie abgeleitet ist, welche auf selektiven oder nichtselektiven Medien gezüchtet wurde, insbesondere eine Suspension einer im Wesentlichen reinen Kultur.
Die Testsysteme der vorliegenden Erfindung umfassen eine Mehrzahl von Reaktionskammern zum Durchführen der biochemischen Tests, wobei jede Reaktionskammer ein Substrat für wenigstens ein Enzym umfasst, wobei das Substrat, wenn das oder die Enzyme darauf einwirken, in der Formation eines nachweisbaren Produkts in der Reaktionskammer resultiert und wobei die nachweisbaren Produkte in der Kombination von Tests mit der Identität eines Mikroorganismus in einer Probe in Beziehung stehen.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Reaktionskammern in einem einzigen Gehäuse,z. B. einem Mikrotitergefäß, hierin nachstehend als ein „Panel" bezeichnet, angeordnet. Die Anzahl von Reaktionskammern im Panel kann in Abhängigkeit von der konkreten Anwendung variieren. Die Reaktionskammern sind je nach Wunsch offen oder abgedeckt.
Daher stellt die vorliegenden Erfindung in einem Aspekt ein universelles Testsystem und Testverfahren zur Verwendung des Testsystems bereit, um eine einzige Serie von vorbestimmten biochemischen Tests zur Identifizierung eines Mikroorganismus, welcher zu irgendeiner von weit auseinander liegenden Gruppen von Mikroorganismen gehört, bereitzustellen. Der Mikroorganismus wird vorzugsweise als diskrete Gattungen und insbesondere als diskrete Spezies klassifiziert.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das universelle Testsystem wenigstens ein Panel mit einer Mehrzahl von Reaktionskammern,z. B. Becken, darin angeordnet, welche ein Substrat für wenigstens ein Enzym und andere Komponenten für den Test enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die einzige Kombination von vorbestimmten biochemischen Tests durch die Verwendung eines einzigen universellen Testpanels, welches ein Maximum von bis zu etwa 60 und insbesondere etwa 36 bis 48 Reaktionskammern enthält, durchgeführt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Becken auf dem Testpanel in einer linearen Gruppe angeordnet, um die Verwendung von bevorzugten halb- oder vollautomatischen Verfahren zur Stichprobenentnahme, Visualisierung und Datenverarbeitung zu erleichtern.
Im Allgemeinen wird eine Serie von biochemischen Tests, welche zur Verwendung in dem universellen Testsystem der vorliegenden Erfindung geeignet ist, durch Verwenden bekannter statistischer Techniken ausgewählt, um eine Serie von Tests zu identifizieren, welche zur Identifizierung der gewünschten Familien von Mikroorganismen in der Lage ist. Verschiedene Datenbanken werden dann aufgebaut. Die verschiedenen Datenbanksätze werden dann unter Verwendung wohl bekannter statistischer Techniken ausgewertet. Eine derartige statistische Technik wird hierin später in Beispiel 3 beschrieben. Die Datenbank (Wahrscheinlichkeitsmatrix) oder der vorbestimmte Standard, welche verwendet werden, um die Mikroorganismen zu identifizieren, umfassen entweder eine einzige Datenbank, welche Mitglieder von allen zu identifizierenden Gruppen umfasst, oder eine Reihe von Unterdatenbanken, welche auf jede Gruppe zutreffen. Wie bereits erwähnt, sind die Hauptvorteile dieses Systems für die Benutzer, dass sie nur lernen müssen, wie eine einzige Testmethodologie für die Mehrheit ihrer Mikroorganismusidentifizierungserfordernisse zu verwenden ist, und für die Mehrheit ihrer Mikroorganismusidentifizierungserfordernisse eher nur einen einzigen Diagnosetest ordnen und inventarisieren als das Inventar von mehreren Produkten verwalten müssen.
In der zuvor beschriebenen Ausführungsform wird die einzige Datenbank oder Reihe von Unterdatenbanken, d. h. die Wahrscheinlichkeitsmatrix, als der vorbestimmte Standard verwendet, mit dem die Resultate des Testsystems (Panel) einer Probe verglichen werden, um den Mikroorganismus zu identifizieren. Siehe Beispiel 3. Vorzugsweise wird der vorbestimmte Standard aus Daten erzeugt, welche unter Verwendung von spektroskopischen oder fluorometrischen Techniken erhalten werden. Der vorbestimmte Standard kann jedoch ebenso gut unter Verwendung von Daten, welche durch visuelle Prüfung von colorimetrischen Tests erhalten werden, entwickelt werden.
Eine Vielfalt von biochemischen Tests zur Identifizierung von mikrobiellen Enzymen ist auf dem Fachgebiet bekannt. Die meisten solcher Tests können zur Verwendung in dem universellen Testsystem der vorliegenden Erfindung angepasst werden.
Die universellen Testsysteme der vorliegenden Erfindung umfassen Tests auf Fluoreszenzbasis oder Tests auf colorimetrischer Basis oder eine Kombination davon. Zum Beispiel werden im universellen Testsystem der vorliegenden Erfindung für einige Tests auf Grund der größeren Empfindlichkeit und Geschwindigkeit Tests auf Fluoreszenzbasis gegenüber Tests auf colorimetrischer (chromogenischer) Basis vorgezogen. In anderen Tests in dem universellen Testsystem werden jedoch Tests auf colorimetrischer Basis auf Grund der besseren Zweckmäßigkeit, wie beispielsweise visuelle Testinterpretation, bevorzugt.
Daher ist in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das universelle Testsystem in der Lage, einen Mikroorganismus bei Verwenden einer einzigen Serie von vorbestimmten biochemischen Tests aus mehreren Gruppen von Mikroorganismen zu identifizieren, wobei die Mehrheit von Tests in einem Format auf Fluoreszenzbasis sind. In dieser Ausführungsform wird die Gegenwart von Enzymen und/oder Gruppen von Enzymen in einem Stoffwechselweg durch Bestimmen der Gegenwart eines nachweisbaren fluoreszierenden Produkts nachgewiesen. In manchen Fällen ist die Formation des fluoreszierenden Produkts ein Resultat eines pH-Wechsels, welcher durch die Reaktion des Enzyms mit einem Substrat verursacht wird (fluorometrischer Test). In anderen Fällen begleitet die Formation des fluoreszierenden Produkts die Abspaltung eines fluorogenischen Substrats (z. B. durch Hydrolyse), um ein nachweisbares Derivatfluorophor zu bilden, welches für gewöhnlich eine erhöhter Fluoreszenz an den Tag legt (fluorogenischer Test). In noch anderen Fällen wird ein chromogenisches Produkt gebildet, welches einen Fluoreszenzindikator auslöscht.
Die Resultate der Serie von vorbestimmten Tests werden verschiedenen statistischen Methodologien unterzogen, um die Mikroorganismen in der Probe zu identifizieren, d. h., mit wenigstens einem vorbestimmten Standard verglichen. Siehe Beispiel 3.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das nachweisbare Fluoreszenzprodukt in einer oder mehreren der vorbestimmten Serien von Tests durch Abspalten wenigstens eines fluorogenischen Substrats (z. B. durch Hydrolyse) gebildet, um ein Derivatfluorophor mit erhöhter Fluoreszenz zu bilden. In einer besonders bevorzugten Aus führungsform des universellen Testsystems werden Esterase-, Peptidase- und Glycosidase-Tests vorzugsweise in einem fluorogenischen Format durchgeführt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das nachweisbare fluoreszierende Produkt in einem oder mehreren der biochemischen Tests durch einen fluorometrischen Indikator in Gegenwart einer Enzymreaktion gebildet. Im Allgemeinen ist der fluorometrische Indikator ein pH-empfindliches Gemisch, welches in der Lage ist, einen Fluoreszenzwechsel aufzuzeigen. Konkret erfährt der fluorometrische Indikator eine Erhöhung der Fluoreszenz in Gegenwart einer Zunahme (Alkalisierung) oder Abnahme (Säuerung) des pH-Werts. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des universellen Testsystems werden die Tests für ein Zuckerfermentierungsenzym, Urease, Decarboxylase und Kohlenstoff benötigendes Enzym in einem fluorometrischen Format durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch zum ersten Mal Tests für ein Kohlenstoff benötigendes Enzym in einem fluorometrischen Format bereit. In dieser Ausführungsform umfasst der Enzymtest wenigstens ein Substrat für ein Kohlenstoff benötigendes Enzym und wenigstens einen fluorometrischen Indikator. Das Kohlenstoff benötigende Enzym, falls vorhanden, wirkt auf das Substrat und bewirkt einen ph-Wechsel, welcher ein fluoreszierendes Produkt von dem fluorometrischen Indikator bildet.
In einigen Ausführungsformen umfasst das universelle Testsystem der vorliegenden Erfindung wenigstens einen biochemischen Test auf colorimetrischer Basis. Der colorimetrische Test kann zusätzlich zu einem oder anstelle eines Tests, welcher in einem Fluoreszenzformat durchgeführt wird, erfolgen. In manchen Fällen ist die Formation des chromogenischen Produkts ein Resultat eines ph-Wechsels, welcher durch die Reaktion eines Enzyms mit dem Substrat verursacht wird (colorimetrischer Test). Im Allgemeinen ist der colorimetrische Indikator ein phempfindliches Gemisch, welches in der Lage ist, einen Farbwechsel aufzuzeigen. Konkret erfährt der chromogenische Indikator einen Farbwechsel in Gegenwart einer Zunahme (Alkalisierung) oder Abnahme (Säuerung) des ph-Werts. In anderen Fällen begleitet die Formation des chromogenischen Produkts die Abspaltung eines chromogenischen Substrats (z. B. durch Hydrolyse), um ein nachweisbares Derivatchromophor zu bilden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das universelle Testsystem wenigstens einen Test zum Nachweisen einer Peptidase und einer Glycosidase. In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Testsystem ferner einen Zuckerfermentierungsenzym-Test. In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Testsystem ferner wenigstens einen Test für eine Urease, eine Decarboxylase, eine Esterase, Tryptophanase (Indol-Test) oder ein Kohlenstoff benötigendes Enzym. In einer Ausführungsform in Panelformat weist jedes einer vorbestimmten Anzahl von Becken auf dem universellen Testpanel wenigstens ein Substrat für jedes der Enzyme, sowie andere für den Test notwendige Komponenten darin angeordnet auf. Bei Gebrauch wird die Probe jedem Becken hinzugefügt, und das Enzym oder die Gruppe von Enzymen, falls in der Probe vorhanden, wirken auf das Substrat, um ein nachweisbares Produkt zu bilden. Die Gegenwart des Enzyms oder der Gruppe von Enzymen in jedem der Tests, falls vorhanden, wird durch die Identifizierung des nachweisbaren Produkts in jedem Becken bestimmt, wobei die nachweisbaren Produkte aus der Kombination von Tests mit der Gegenwart des Mikroorganismus in der Probe durch Vergleich mit einem vorbestimmten Standard in Beziehung stehen.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfassen die zusätzlichen Tests einen Phosphatase-Test. Der Test für das zusätzliche Enzym wird je nach Wunsch in einem chromogenischen oder fluorogenischen Format durchgeführt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das universelle Testpanel eine einzige Serie von vorbestimmten biochemischen Tests, bei welchen die Tests Fluoreszenztests für jede von einer Peptidase, Glycosidase, Zuckerfermentierungsenzym, Esterase und ein Kohlenstoff benötigendes Enzym und wenigstens einen colorimetrischen Test für Urease, Phosphatase, Tryptophanase und eine Decarboxylase umfassen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das universelle Testsystem eine einzige Serie von vorbestimmten biochemischen Tests, welche innerhalb von etwa 10 Minuten bis etwa 8 Stunden und vorzugsweise von etwa 10 Minuten bis etwa zweieinhalb Stunden abgeschlossen sind. Obwohl die meisten biochemischen Tests gemäß den vorliegenden Verfahren innerhalb von 2 Stunden durchgeführt werden können, ist es in manchen Fällen wünschenswert, die Testzeiten auf mehr als drei Stunden und bis auf etwa 8 Stunden auszudehnen. Zum Beispiel werden in manchen Fällen Testperioden von mehr als 2 Stunden verwendet, um den Nachweis geringer Konzentrationen von Enzymen, welche langsame Katalysegeschwindigkeiten aufweisen, zu verbessern. In anderen Fällen werden Testperioden von weniger als 2 Stunden eingesetzt, um reichliche Enzyme oder Enzyme mit hohen Katalysegeschwindigkeiten nachzuweisen.
In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Tests auf Fluoreszenzbasis bereit, welche zum schnellen Nachweisen und Identifizieren einer Vielfalt von Hefen in einer Probe, wie beispielsweise Hefen, welche Krankheiten verursachen (z. B. Candida), zweckdienlich sind.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Tests auf Fluoreszenzbasis für ein Kohlenstoff be nötigendes Enzym bereit.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das universelle Testsystem der vorliegenden Erfindung ist zweckmäßigerweise als ein Panel mit einer vorbestimmten Anzahl von Reaktionskammern oder Becken konfiguriert. Eine derartige Konfiguration wird verwendet, um die Testsysteme der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen. Dies soll das universelle Testsystem nicht beschränken, da es in einer großen Vielfalt von geeigneten Formaten konfiguriert werden kann, um der beabsichtigten Verwendung zu entsprechen.
Die Testsysteme der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, einen Mikroorganismus in einer Probe aus einer von mehreren und weit auseinander liegenden Gruppen von Mikroorganismen zu identifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Testsystem:
eine vorbestimmte Serie von nicht-redundanten biochemischen Tests, welche in eine vorbestimmte Anzahl von Reaktionskammern geleert werden, wobei jeder biochemische Test ein Substrat für ein Enzym oder eine Gruppe von Enzymen umfasst, und wobei ferner das Substrat, wenn das Enzym oder die Gruppe von Enzymen darauf einwirken, in der Formation eines nachweisbaren Produkts in der Reaktionskammer resultiert; und
wobei die nachweisbaren Produkte der Kombination von Tests verwendet werden, um den Mikroorganismus in der Probe zu identifizieren.
Unter nicht-redundant, wie hierin in Verbindung mit dem universellen Testsystem der vorliegenden Erfindung verwendet, ist zu verstehen, dass die einzige Serie von vorbestimmten biochemischen Tests nicht auf familienspezifischen oder gruppenspezifischen Formulierungen für jede Familie und/oder Gruppe basiert, wie auf dem Fachgebiet bekannt. Vielmehr ist jeder biochemische Test der vorliegenden Erfindung familien- und gruppenunabhängig. Vorzugsweise wird ein Substrat nicht öfter als einmal auf einem Panel benutzt. In manchen Fällen jedoch kann es wünschenswert sein, dasselbe Substrat eine Anzahl von Malen, aber z. B. in einem anderen Puffersystem einzubeziehen.
Die Entdeckung, dass gruppenspezifische Formulierungen nicht erforderlich sind, um einen Mikroorganismus z. B. in einer klinischen Probe, welche einen Mikroorganismus aus einer von einer Anzahl von weit auseinander liegenden Gruppen enthalten kann, zu identifizieren, ist ein gewaltiger Sprung nach vorne und führt zu den Testsystemen und -verfahren der vorliegenden Erfindung.
Die Formation eines nachweisbaren Produkts, wie hierin verwendet, umfasst vorzugsweise die Formation eines fluoreszierenden Produkts oder eines chromogenischen Produkts oder eines Farb- oder Fluoreszenzwechsels in einer Reaktionskammer. Andere nachweisbare Produkte, z. B. durch einen Strahlungs- oder Lumineszenzwechsel nachweisbare, können in der Technik der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden.
Die Anzahl von Tests, welche auf einem universellen Testpanel der vorliegenden Erfindung angeordnet werden, reicht aus, um einen einzigen Mikroorganismus, welcher zu irgendeiner von einer Anzahl von weit auseinander liegenden Gruppen gehört, in einer Probe zu identifizieren. Wenn zum Beispiel gewünscht wird, ein universelles Testpanel herzustellen, das in der Lage ist, einen Mikroorganismus aus irgendeiner der folgenden Gruppen: enterische, nichtfermentierende, anaerobe Bakterien und Fastidien (fastidious bacteria) zu identifizieren, wird die geeignete Kombination von Tests zum Beispiel durch Befolgen der Prozedur, welche in Beispiel 3 umrissen ist, problemlos bestimmt. Die Testauswahlprozedur ist wiederholend, d. h., eine Serie von Tests wird ausgewählt, durchgeführt und dann angeregt. Wenn die Serie auf die Anregung nicht anspricht, wird die Serie von Tests modifiziert,z. B. kann eine andere Substratkonzentration gewählt werden, ein Test kann hinzugefügt oder gestrichen werden usw., wieder durchgeführt und erneut angeregt und so weiter. Um eher auf Spezies- als auf Gattungsebene zu identifizieren, hat die Anzahl von Tests im Allgemeinen größer zu sein. Die Mindest- und/oder bestmögliche Anzahl von Tests für eine bestimmte Verwendung kann unter Verwendung bekannter statistischer Techniken in Übereinstimmung mit den Lehren hierin problemlos bestimmt werden. Ein Beispiel einer solchen Technik ist nachstehend in Beispiel 3 vorzufinden.
In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Testsysteme der vorliegenden Erfindung wenigstens einen Test zum Nachweisen einer Peptidase, Glycosidase, eines Zuckerfermentierungsenzyms, einer Urease, einer Decarboxylase, einer Esterase, eines Kohlenstoff benötigenden Enzyms, einer Phosphatase oder einer Tryptophanase. In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfassen solche Tests einen Test für wenigstens eine Peptidase und wenigstens eine Glycosidase.
Derartige Testsysteme können ferner einen Test für wenigstens ein Zuckerfermentierungsenzym; wenigstens eine Urease, wenigstens eine Decarboxylase, einen Test für wenigstens eine Esterase und wenigstens ein Kohlenstoffassimilationsenzym und verschiedene Kombinationen davon umfassen. In anderen bevorzugten Testsystemen gemäß der vorliegenden Erfindung ist die vorbestimmte Kombination von nicht-redundanten von biochemischen Tests zur Identifizierung des Mikroorganismus unter wenigstens zwei von enterischen Bakterien, nichtfermentierenden Bakterien, anaeroben Bakterien, Hefe, Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Enterococcus sp. und Fastidien (fastidious bacteria) in der Lage. Ein anderes bevorzugtes Testsystem ist zur Identifizierung eines Mikroorganismus unter wenigstens einem von Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Enterococcus sp., Corynebacteria sp., Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Leuconostoccus sp., Alloicoccus sp., Vagococcus sp., Kluyvera sp., Leminorella sp., Hameophilus sp., Neisseria sp., Moraxella sp., Salmonella sp., Clostridia sp. und Listeria sp. in der Lage.
In noch einem anderen bevorzugten Testsystem der vorliegenden Erfindung ist die Kombination von nichtredundanten biochemischen Tests zur Identifizierung des Mikroorganismus unter wenigstens einem von anaeroben Mikroorganismen, Hefe oder Fastidien (fastidious bacteria); unter anaeroben Mikroorganismen und Hefe oder Fastidien (fastidious bacteria); oder unter Hefe und Fastidien (fastidious bacteria) in der Lage.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die Testsysteme der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung der Mikroorganismen unter wenigstens einer von Staphylokokke, Streptokokke oder Enterokokke und wenigstens einem von anaeroben Mikroorganismen, Hefe, enterischen Mikroorganismen, nichtfermentierenden Mikroorganismen oder Fastidien (fastidious bacteria) oder Kombinationen davon; unter Staphylokokke, Streptokokke und Enterokokke; unter Hefe, anaeroben Bakterien und Fastidien (fastidious bacteria) oder unter Enterokokke, Staphylokokken, Streptokokken, anaeroben Mikroorganismen, Hefe und Fastidien (fastidious bacteria) in der Lage.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung eines Mikroorganismus in einer Probe unter wenigstens zwei Gruppen von weit auseinander liegenden Mikroorganismen, welche in einer solchen Probe gegenwärtig sein können, durch Verwendung eines Testsystems umfassen:

a) Hinzufügen der Probe zu jeder Reaktionskammer, welche ein Substrat umfasst;
b) es dem Enzym, falls vorhanden, zu ermöglichen, mit dem Substrat zu reagieren;
C) Bestimmung des Vorhandenseins des Enzyms in der Probe durch Nachweis des nachweisbaren Produkts in einem Test; und
d) Vergleich der Resultate der Kombination von vorbestimmten Tests mit mindestens einem vorbestimmten Standard zur Identifizierung des Mikroorganismus in der Probe.

Tests zum Nachweis des Kohlenstoffverbrauchs eines Mikroorganismus werden durch die vorliegende Erfindung ebenfalls bereitgestellt, wobei der Test wenigstens eine Kohlenstoffquelle und wenigstens einen fluorometrischen Indikator umfasst, wobei der Mikroorganismus auf die Kohlenstoffquelle wirkt, um einen pH-Wechsel zu erzeugen, welcher einen Fluoreszenzwechsel des Indikators verursacht, wobei der Fluoreszenzwechsel den Kohlenstoffverbrauch des Mikroorganismus anzeigt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das universelle Testpanel zur Identifizierung eines Mikroorganismus aus irgendeiner (i) der Familien von Enterobacteriaceae, Staphylokokken, Enterokokken und Streptokokken und (ii) der Gruppen von anaeroben Mikroorganismen, Hefe und Fastidien (fastidious bacteria) auf der gewünschten Identifizierungsebene, z. B., Gattung und/oder Spezies, in der Lage.
Normalerweise wird das Volumen der Reaktionskammer nach Zweckmäßigkeit und Kostenwirksamkeit ausgewählt.
Geeignete Materialien zur Verwendung bei der Herstellung von solchen Panels sollten im Wesentlichen mit den Komponenten der Enzymtests nicht reaktionsfähig sein und umfassen Kunststoffe, wie beispielsweise Polystyrol, PVC und andere.
In einer Ausführungsform werden die universellen Testpanels zur Identifizierung eines Mikroorganismus, welcher zu einer von einer Anzahl von mehreren Gruppen von Mikroorganismen gehört, verwendet. Der Mikroorganismus wird identifiziert, um Gattungen und/oder Spezies, vorzugsweise auf Speziesebene, zu trennen.
Die universellen Testpanels der vorliegenden Erfindung können konfiguriert werden, um Bakterien und Hefe,z. B. Bakterien aus weit auseinander liegenden Gruppen, wie beispielsweise enterischen und nichtfermentierenden Mikroorganismen; anaeroben Mikroorganismen; Staphylokokken, Streptokokken und Enterokokken, sowie Fastidien (fastidious bacteria), zu identifizieren.
In einer Ausführungsform umfassen die universellen Testpanels mehrere Becken mit verschiedenen biochemischen Tests. In einer anderen Ausführungsform umfasst das universelle Testpanel jedoch wenigstens einen biochemischen Test, in welchem der Test in getrennten Becken mit demselben Substrat, aber in verschiedenen Puffern, wie beispielsweise TRIS, HEPES, MOPS, PIPES, Histidin, Phosphat, Citrat, Acetat oder Carbonat, durchgeführt wird. Zum Beispiel umfasst eine Ausführungsform des universellen Testpanels der vorliegenden Erfindung Peptidase-Tests, wobei das Substrat (d. h. Glycyl-glycin 7-AMC) in Tris in einem Becken und Hepes im anderen Becken verwendet wird.
Im Allgemeinen ist der ph in jedem Becken des universellen Testpanels zwischen etwa 5 und etwa 9. Zum Beispiel werden Peptidase- und Glycosidase-Tests normaler weise bei einem ph von etwa 7 bis 9 beziehungsweise etwa 7 bis 8, Zuckerfermentierungsenzymtests bei einem ph von etwa 7 bis 8 und Tests für Kohlenstoff benötigende Enzyme normalerweise bei einem ph von etwa 5,0 bis 6,0 durchgeführt.
In anderen Fällen umfasst das universelle Testpanel wenigstens einen biochemischen Test, in welchem der Test in getrennten Becken mit Isomeren von Enzymsubstraten durchgeführt wird. In diesem Ausführungsform kann das Isomer z. B. ein Enantiomer, Diastereomer oder cis-trans-Diastereomer sein. Alternativerweise kann das Substrat eine Mischung von Isomeren sein. Zum Beispiel sind α- und β-Isomere von Galactose geeignete Isomere zur Verwendung beim Zuckerfermentierungsenzym-Test. Siehe vorstehende Tabelle VI.
Die Probe, die auf dem universellen Testpanel zu testen ist, ist eine Mikroorganismussuspension, welche aus einem im Wesentlichen reinen Isolat des Mikroorganismus erhalten wird.
Das im Wesentlichen reine Isolat wird durch mehrere wohl bekannte Verfahren erhalten. Zum Beispiel wird bei einem Verfahren die Probe mit flüssigen, festen oder halbfesten Medien, welche zur Förderung des Wachstums einer gewünschten Gruppe von Mikroorganismen in der Lage sind, vorkultiviert. Insbesondere kann die Probe auf selektiven festen oder halbfesten Medien vorkultiviert werden, um Kolonien zu erhalten, aus welchen das im Wesentlichen reine Isolat des Mikroorganismus erhalten wird. Falls gewünscht, kann das im Wesentlichen reine Isolat ferner ausgewählt werden, um Anzahlen von gewünschten Mikroorganismen zu erhöhen. In jedem Fall wird das Isolat in einer Surfactantenlösung suspendiert, um eine Suspension zu bilden, welche zur Verwendung mit dem universellen Testpanel geeignet ist. Normalerweise weist die Suspension eine Dichte von etwa 0,1 bis 5 McFarland-Einheiten und vorzugsweise 0,5 McFarland-Einheiten auf. Höhere Suspensionsdichten innerhalb dieses Bereichs sind in manchen Fällen zu bevorzugen, um schnellere Resultate auf dem universellen Testpanel zu erhalten. Verfahren zum Vorkultivieren von Proben eines Mikroorganismus sind wohl bekannt.
Beim Auswählen der Tests für ein universelles Testsystem der vorliegenden Erfindung wird eine Serie dieser Tests ausgewählt, auf einem geeigneten Panel angeordnet und getestet, wie im Folgenden beschrieben, um bei einem vorbestimmten Standard (Wahrscheinlichkeitsmatrix) zur Verwendung bei der Identifizierung eines Mikroorganismus, welcher zu irgendeiner von einer unterschiedlichen Gruppe von Mikroorganismen gehört, anzugelangen.
Wie bereits erwähnt, kann eine große Vielfalt von fluoreszierenden (z. B. fluorogenischen, fluorometrischen), colorimetrischen und fluoreszenzauslöschenden Tests in den universellen Testsystemen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Ferner ist eine Vielfalt von Substraten zur Verwendung mit jedem dieser Tests geeignet. Zum Beispiel werden in bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fluorogenische und/oder fluorometrische Tests zur Verwendung mit dem universellen Testsystem gewählt. In diesen Ausführungsformen umfasst der fluorogenische Test wenigstens ein fluorogenisches Substrat, und zwar vorzugsweise ein fluorogenisches Substrat, welches enzymatisch abgespaltet wird, um ein nachweisbares fluoreszierendes Produkt zu bilden. In besonders bevorzugten Ausführungsformen besteht das fluorogenische Substrat aus einem Substrat, welches zu einem Fluorogen konjugiert wird. Der fluorometrische Test umfasst wenigstens ein Substrat, und zwar vorzugsweise ein Substrat, welches mit wenigstens einem Enzym in der Probe zur Reaktion gebracht wird, um einen pH-Wechsel zu erreichen, welcher durch einen fluorometrischen Indikator nachgewiesen wird. Eine grofle Vielfalt von geeigneten fluorogenischen und fluorometrischen Indikatoren wurde offenbart. Siehe z. B. nachstehende Tabelle VII und Haugland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, sechste Ausgabe (1996) von Molecular Probes, Inc.; Bascomb, S., (1987), Methods in Microbiol., 19, 106; Manafi, M., et al. (1991) Microbiological Rev., 335.
Beispielhafte Substrate zur Verwendung in den universellen Testsystemen der vorliegenden Erfindung sind in der folgenden Tabelle V2 aufgelistet. Die Substrate 1 bis 25 sind fluorogenische Substrate für Peptidase-Tests. Die Substrate 26 bis 34 sind fluorogenische Substrate für Glycosidase-Tests. Die Substrate 35 und 37 bis 54 sind Substrate für Zuckerfermentierungstests unter Verwendung des fluorometrischen Indikator 4-Methylumbelliferon. Die Substrate 55 bis 60 sind Kohlenstoffsimulationssubstrate. Die Substrate 61–2, 64–65, 73–78, 88–89 und 92 sind Substrate für Zuckerfermentierungstests. Das Substrat 63 ist ein Substrat für einen Urease-Test. Die Substrate 66-70, 79–80 und 90–91 sind Substrate für Flycosidase-Tests. Die Substrate 71, 81 bis 83 und 93 bis 95 sind Substrate für Peptidase-Tests. Die Substrate 72 und 84 sind Substrate für Phosphatase-Tests. Die Substrate 85 bis 87 sind Substrate für Decarboxylase-Tests. Das Substrat 96 ist ein Substrat für den Indol-Test.
TABELLE VI
Beispielhafte fluorogenische Substrate für Peptidasen, welche in der Technik der vorliegenden Erfindung zweckdienlich sind, umfassen eine Aminosäure oder ein Poly peptid, konjugiert zu einem Fluorogen. Beispiele für geeignete Fluorogene sind in nachstehender Tabelle VI dargestellt und umfassen insbesondere β-Naphthylamin und 7-Aminomethylcumarin (7-AMC). Eine besonders bevorzugtes Fluorogen zur Verwendung in den Peptidase-Tests ist 7-AMC. Verfahren zur Herstellung und Verwendung von fluorogenischen Substraten sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z. B. GB-Patent Nr. 1,547,747 und EPO-Patent Nr. 0,000,063).
TABELLE VII
Geeignete Peptide und Polypeptide zur Verwendung in der Peptidase-Prüfung weisen eine Länge zwischen etwa 2 und 20 Aminosäuren auf und sind in einer einzigen Rette, verzweigten Rette oder einem zyklischen Format angeordnet. Geeignete Aminosäuren umfassen die 20 gewöhnlichen Aminosäuren: Alanin, Cystein; Asparaginsäure; Glutaminsäure; Phenylalanin; Glycin; Histidin; Isoleucin; Lysin; Leucin; Methionin; Asparagin; Prolin; Glutamin; Arginin; Serin; Theronin; Valin; Trytpophan und Tyrosin. Andere geeignete Aminosäuren umfassen ungewöhnliche oder eiweißfreie Aminosäuren, wie beispielsweise jene, welche in Faserproteinen und gewissen Pilz- und Pflanzengiften vorkommen, wie beispielsweise 4-Hydroxyprolin; 5-Hydroxylysin; ∈-N-Methyllysin; 3-Methylhistidin; Desmosin; Isodesmosin; β-Alanin; γ-Aminobuttersäure; Homocystein; Homoserin; Canavanin; Djenkolsäure und β-Cyanoalanin. Die Aminosäuren können je nach Wunsch in einem D- oder L-Format sein. Beispielhafte, Substrate zur Verwendung in der Peptidase-Untersuchung sind in vorstehender Tabelle VI dargestellt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das universelle Testpanel der vorliegenden Erfindung wenigstens einen Glycosidase-Test, welcher vorzugsweise in einem fluorogenischen Format durchgeführt wird. In dieser Ausführungsform umfasst der Glycosidase-Test wenigstens ein fluorogenisches Substrat, und zwar vorzugsweise ein fluorogenisches Substrat, welches in der Gegenwart der Glycosidase in der Probe abgespaltet wird. Geeignete fluorogenische Substrate zur Verwendung im Glycosidase-Test umfassen Konjugate zwischen einem Kohlenhydrat, normalerweise einem Zucker, und einem geeigneten Fluorogen. Beispiele für geeignete Fluorogene wurden in vorstehender Tabelle VII beschrieben. Ein besonders bevorzugtes Fluorogen ist 4-MeU. Geeignete Zucker zur Verwendung im Glycosidase-Test umfassen etwa 3 bis 8 Kohlenstoffe (z. B. eine Tetrose, Pentose, Hexose oder Heptose), sowie Saccharide und Disaccharide, welche etwa 2 bis 10 kovalent verbundene Zuckereinheiten umfassen und eine relative Molekülmasse von zwischen 350 und 4000 Dalton aufweisen. Beispielhafte fluorogenische Substrate zur Verwendung im Glycosidase-Test sind in vorstehender Tabelle VI dargestellt.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das universelle Testpanel der vorliegenden Erfindung wenigstens einen Test für ein Zuckerfermentierungsenzym, welcher in einem fluorometrischen Format durchgeführt wird. In dieser Ausführungsform umfasst der Zuckerfermentierungstest wenigstens einen Zucker oder ein Saccharid, wie beispielsweise jene, welche zuvor für den Glycosidase-Test beschrieben wurden, und wenigstens einen fluorometrischen Indikator. Beispiel für geeignete fluorometrische Sub strate sind in vorstehender Tabelle VII dargestellt und umfassen 4-MeU. Vorzugsweise ist der fluorometrische Indikator in der Lage, in einem pH-Bereich von etwa 6 bis 8 zu fluoreszieren. Ein besonders bevorzugter fluorometrischer Indikator ist 4-MeU. Zusätzliche Substrate zur Verwendung im Test umfassen Polysaccharide, wie beispielsweise Stärke und Glycogen, mit einer relativen Molekülmasse von zwischen etwa 10⁴ bis 10⁶. Beispielhafte Substrate zur Verwendung im Zuckerfermentierungsenzym-Test sind in vorstehender Tabelle VI dargestellt.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das universelle Testpanel wenigstens einen Kohlenstoffverbrauchstest, welcher in einem fluorometrischen Format durchgeführt wird. In dieser Ausführungsform umfasst der Kohlenstoffverbrauchstest wenigstens eine Kohlenstoffquelle, und zwar vorzugsweise eine Kohlenstoffquelle, und wenigstens einen geeigneten fluorometrischen Indikator, und zwar vorzugsweise einen fluorometrischen Indikator. Fluorometrische Indikatoren, welche zur Verwendung geeignet sind, sind in vorstehender Tabelle VII dargestellt und umfassen 4-MeU und andere Komponenten. Ein besonders bevorzugter fluorometrischer Indikator ist β-Methyläsculetin, welches in der Lage ist, in einem pH-Bereich von etwa 5 bis 7 zu fluoreszieren.
Eine geeignete Kohlenstoffquelle zur Verwendung im Kohlenstoffverbrauchstest umfasst ein Alken, Alkin, Alkohol, Ether, Ester, Nitril, Sulfid, Sulfon, Thiol, Keton, Sulfoxid, Aldehyd, Amid, Amin, Carbonsäure oder Benzoesäure. Die Kohlenstoffquelle umfasst im Allgemeinen etwa 2 bis 10 Kohlenstoffatome, welche in einer geraden Kette, verzweigten oder zyklischen Format angeordnet sind und eine relative Molekülmasse von zwischen etwa 40 und 500 aufweisen. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind in wässrigen Lösungen (z. B. physiologischen Kochsalz- und Pufferlösungen, welche Tris oder Hepes umfassen) mischbar und sind nichtflüchtig. Vorstehende Tabelle VI stellt Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen bereit.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Substrate des Testsystems Lysin (AMC), Leucin (AMC), Methionin (AMC), Glycylprolin (AMC), Isoleucin (AMC), Trehalose, Maltose, L-Tryptophan (7-AMC), 4-MeU-Phosphat, β-D-xylosid-4-MeU, Hydroxy-prolin-AMC, β-D-glucuronid-4-MeU, Tyrosin (AMC), 4-MeU-β-Dgalactosid, Mannose, Sucrose und Prolin (AMC). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Substrate ferner Fructose, Glycerol, L-Histidin 7-AMC, Pyroglutaminsäure (AMC) und 4-MeU-β-D-glucosid. In noch einer anderen Ausführungsform umfassen die Substrate ferner L-Serin 7-AMC, Cellobiose, Arginin (AM) und 4-MeU-N-Acetyl-β-D-galactosaminid.
Die zuvor beschriebenen Fluoreszenztests bilden Produkte, welche durch herkömmliche zerstörungsfreie instrumentelle fluorometrische und fluoroskopische Verfahren nachgewiesen werden, um ein fluoreszierendes Produkt in den Tests zu quantifizieren. Zum Beispiel ist ein besonders bevorzugtes bei automatisierten Instrumenten ein MicroScan-Walkaway-System, welches im Handel von der MircoScan Inc. erhältlich ist. Die universellen Testsysteme der vorliegenden Erfindung könnten jedoch zur Verwendung bei anderen im Handel erhältlichen Instrumenten angepasst werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das universelle Testpanel wenigstens einen Test, welcher in einem colorimetrischen (chromogenischen) Format durchgeführt wird. Zum Beispiel können die Tests für die Peptidase, Glycosidase, das Zuckerfermentierungsenzym oder das Kohlenstoff benötigende Enzym, welche hierin offenbart sind, in einem colorimetrischen (chromogenischen) Format durchgeführt werden. Eine Vielfalt von colorimetrischen Tests zum Nachweis von Peptidasen, wie beispielsweise Pyroglutamylaminopeptidasen, L-Alaninaminopeptidasen, Arylpeptidasen, Arylamidasen; und Glycosidasen, wie beispielsweise β-D-glucuronidase,β-D-galactosidase, 6-Phospho-β-D-galactosid-6-phosphogalactohydrolase, α-D-galactosidase, β-D-glucosidase, Neuroaminindase, α-Amylase, α-Glucosidase und N-Acetyl-(3-D-glucosaminidase, N-Acetyl-α-D-glucosaminidase, α-D-arabinosidase, β-D-fucosidase und β-D-xylosidase, ist bekannt. Ferner sind colorimetrische Tests zum Nachweis von Zuckerfermentierungsenzymen wohl bekannt und werden im Testsystem der vorliegenden Erfindung verwendet. Zusätzliche colorimetrische Tests, welche zur Verwendung mit dem universellen Testpanel geeignet sind, umfassen bekannte Tests zum Nachweis z. B. von Ureasen, Oxidasen, Reduktasen, Hydrolasen, Hydrogenasen, Esterasen, Phosphotasen, Tryptophanasen, Proteasen, wie beispielsweise Chymotrypsin, Decarboxylasen, wie beispielsweise Ornithin- und Lysindecarboxylasen, und Enzymen, welche in der Lage sind, Zitronensäurezyklusintermediate zu assimilieren. Wie bereits erwähnt, können solche Tests zur Verwendung im universellen Testsystem der vorliegenden Erfindung angepasst und unter Verwendung der Wahrscheinlichkeitsanalyse getestet werden.
Ein colorimetrischer Test, welcher zur Verwendung in den vorliegenden Verfahren geeignet ist, kann in einer Vielfalt von Nachweisformaten durchgeführt werden. Zum Beispiel wird in manchen Fällen ein Substrat, welches ein Chromogen umfasst, in einem direkten Nachweisformat verwendet. In diesem Fall kann das chromogenische Substratz. B. Ester von o-Nitrophenol, m-Nitrophenol oder p-Nitrophenol, Ester von Indoxyl oder 5-Brom-4-chlor-3-indolyl oder ein Arylpeptidderivat von p-Nitroanalin umfassen. Die Freisetzung des Chromogens wird im colorimetrischen Test direkt nachgewiesen. In anderen Fällen jedoch ist es wünschenswert, den colorimetrischen Test in einem indirekten Nachweisformat über ein geeignetes Reagens durchzuführen. Beispiele für einen solchen Test umfassen chemische Reaktion von anorganischen Enzymreaktionsprodukten (z. B. Nitrat) mit anorganischen Säuren, wie beispielsweise Sulfanilsäure und α-Naphtylamin. In einem anderen Fall ist es wünschenswert, den colorimetrischen Test in einem indirekten Format unter Verwendung eines pH-empfindlichen Indikatormoleküls durchzuführen, um pH-Wechsel im Test nachzuweisen. Beispiele für derartige Moleküle umfassen Bromthymolblau und Phenolrot. Andere geeignete colorimetrische Tests verwenden p-Dimethylaminocinnamaldehyd, um die Freisetzung von β-Naphthylamin, z. B. chromogenische Peptidase-Tests, von chromogenischen Substraten, welche β-Naphthylamid umfassen, nachzuweisen. In noch einem anderen Fall kann ein geeigneter colometrischer Test die Reaktion von p-Nitroanalinderivaten mit Diazoverbindungen umfassen, um die Untersuchungsempfindlichkeit zu verbessern.
Konkret wurden mehrere colorimetrische Tests zum Nachweisen und Identifizieren von Hefe und hefeähnlichen Mikroorganismen, wie beispielsweise Protheca, sowie Neissea, Haemophilus-Spezies, Branhamella catarrhalis und Gardnerella vaginalis, offenbart.
Die folgende Tabelle VIII stellt Beispiel für Chromogene bereit, welche zur Verwendung in einem colorimetrischen Test geeignet sind.
TABELLE VIII Chromogen, zu Substrat konjugiert durch:
Demgemäß umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das universelle Testpanel biochemische Tests, in welchen die Tests ferner wenigstens einen Test zum Nachweis jeder von einer Peptidase, Glycosidase, Zuckerfermentierung und Rohlenstoffverbrauchstest, vorzugsweise in einem fluoreszierenden Format; und wenigstens einen colorimetrischen Test zum Nachweis jeder von einer Urease, einer Decarboxylase, vorzugsweise Ornithindecarboxylase und Lysindecarboxylase; Esterase und Tryptophanase umfasst. Diese Tests können in Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung des Testsystems auf verschiedene Weisen kombiniert werden.
Ein bevorzugtes Testsystem der vorliegenden Erfindung umfasst einen Test für wenigstens eine Peptidase und wenigstens eine Glycosidase. Ein anderes bevorzugtes Testsystem umfasst einen Test für wenigstens ein Zuckerfermentierungsenzym. Noch ein anderes bevorzugtes Testsystem umfasst wenigstens einen Test für eine Urease, eine Decarboxylase, eine Esterase oder ein Kohlenstoff benötigendes Enzym oder eine Kombination davon.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das universelle Testpanel biochemische Tests, in welchen die Tests einen Test zum Nachweis von Catalase, einer Decarboxylase, wie beispielsweise Glutamsäure- oder Arginindecarboxylase, einer Aminosäuredeamidase, wie beispielsweise Arginindeamidase, Lipidase, Pyrophosphatdiesterase, DNAse, einer Oxidase, einer Arylsulfatase oder eines Acetoin/Diacetyl erzeugenden Enzyms umfassen. In dieser Ausführungsform werden die Tests je nach Wunsch in einem colorimetrischen oder fluoreszierenden Nachweisformat durchgeführt.
Unter dem Begriff „vorbestimmt" , wie hierin verwendet, ist zu verstehen, dass ein biochemischer Test gemäß bekannten statistischen Techniken, wie beispielsweise DFA oder lineare Regression, ausgewählt wurde. Ein Beispiel für bevorzugte statistische Techniken wird in Beispiel 3 bereitgestellt. Demgemäß ist eine „Serie oder Kombination von vorbestimmten biochemischen Tests", wie hierin verwendet, eine Gruppe von biochemischen Tests, welche durch geeignete statistische Techniken ausgewählt wurde.
Die folgenden nicht beschränkenden Beispiele sind zur Veranschaulichung der Erfindung.
BEISPIEL 1
Universelles Testsystem
Substrate zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung können auf mannigfaltige Weise hergestellt werden. Im Allgemeinen sind die Substratformulierungen zur Verwendung in einem zweckdienlichen Puffer, z. B. TRIS oder HEPES, in einem pH-Bereich von zwischen 5 und 9 ausgelegt. Bestimmte Mengen oder Konzentrationen von Substratoder Puffersystemen werden ausgewählt, um die V_max eines konkreten biochemischen Tests zu optimieren.
Insbesondere werden die Peptidase-Testsubstrate ausgewählt, um eine Endkonzentration von zwischen etwa 0,01 bis 1,0 mM aufzuweisen. In einem geeigneten Puffer, wie beispielsweise Tris (zum Beispiel Trisphosphat) bei einer Triskonzentration von zwischen etwa 0,1 bis 1,0 M. Vorzugsweise ist der pH-Bereich für Peptidase-Tests zwischen etwa 7,5 und 8,5. Die Substrate werden nach Bedarf in akzeptablen Lösungen, wie beispielsweise Wasser, Puffer oder Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgelöst. Substratformulierungen für Glycosidase-Tests sind auf eine ähnliche Weise ausgelegt, mit der Ausnahme, dass die Substratkonzentration im Allgemeinen zwischen etwa 0,1 und 3,0 mM ist und einen pH von zwischen etwa 7 und 8 aufweist. Für die Kohlenstoffverbrauch- und Decarboxylase-Tests wird die Durchführung des Tests in einem Decarboxylasepuffer bevorzugt, obwohl andere Puffer, wie beispielsweise Tris oder Hepes, verwendet werden können, falls gewünscht. Der Decarboxylasepuffer wird durch Kombinieren von Hefeextrakt (etwa 0,1 bis 1,0% (w/v)); Pepton (etwa 0,1 bis 1,0%(w/v)); Pyridol-5-PO₄ (etwa 0,01 bis 0,1 mM); 10% (w/v) Glycerolansatz (etwa 0,5 bis 2% (w/v)); 0,02 M 4-β-Methyläsculetin (etwa 0,1 bis 1 mM); phallischer Säure (etwa 1,0 bis 10,0 mM) und einem ph von 5 bis 6 formuliert, wobei die Aminosäure oder Kohlenstoffquelle zwischen etwa 0,5 und 5%(w/v) ist.
Zucker (Säuererzeugung)-Tests werden normalerweise in Hepespuffern oder anderen geeigneten Puffern (etwa 0,5 bis 2,5 mM) bei einem pH von zwischen etwa 7 bis 8 durchgeführt. Andere Komponenten des Tests umfassen 4-MeU (etwa 0,01 bis 0,25 mM); Pepton (etwa 0,01 bis 0,5% (m/v)); Zucker (etwa 0,05 bis 2% (w/v)) in etwa 1 Liter von destilliertem entionisiertem Wasser.
Tabelle VI listet beispielhafte Substrate zur Verwendung im universellen Testsystem auf. Die folgenden Abschnitte (A bis D) beschreiben die Formulierung von besonders bevorzugten Substraten der vorliegenden Erfindung.
In einer Ausführungsform werden die Substrate in einem Testpanel angeordnet, wie beispielsweise einem Mikrotitergefäß mit Becken (Reaktionskammern), welche z. B. in linearen Reihen angeordnet sind. Jede Reaktionskammer war etwa 0,3 ml.
Jedes der Substrate wurde in einem biochemischen Test verwendet, welcher in einem fluoreszierenden oder colorimetrischen Format durchgeführt wurde. Die Resultate jedes Tests wurden gemäß statistischen Standardtechniken zusammengestellt und mit einer Datenbank verglichen, um unter Verwendung von mikrobiologischen Standardkulturtechniken mehrere Gruppen von Mikroorganismen zu identifizieren. Im Allgemeinen war die Datenbank, welche verwendet wurde, eine Wahrscheinlichkeitsmatrix, welche z. B. als eine einzige Datenbank mit Mitgliedern von allen Gruppen oder Familien der in der Probe zu identifizierenden Mikroorganismen konfiguriert war. Alternativerweise (oder zusätzlich) ist die Datenbank eine Wahrscheinlichkeitsmatrix, welche als eine Reihe von Unterdatenbanken, welche auf eine bestimmte Gruppe oder Familie von Mikroorganismus in der Probe zutreffen, konfiguriert ist. Wohl bekannte statistische Verfahren wurden beim Aufbau der Datenbanken zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet (Siehe z. B. nach stehendes Beispiel 3).
Im Allgemeinen wurden Substratformulierungen zum Abfüllen in den Becken des universellen Testpanels in jedem Becken eines Testpanels auf ein geeignetes Endvolumen angesetzt, wonach die Lösung im Becken bei Umgebungstemperatur getrocknet wurde. Durch Verdünnen oder Konzentrieren der Bestandteile der Testformel kann das Abfüllvolumen proportional verkleinert oder vergrößert werden. In den meisten Fällen waren die Formulierungen Filter, welche vor dem Abfüllen sterilisiert und abgekühlt wurden.
A - Fluoroaenischer Peptidase-Test:
Ein Peptidase-Trispuffer (pH 8,0) wurde angesetzt. Die Lösung wurde auf einen pH von zwischen 7 und 9 eingestellt.
Für die Substrate 1 bis 13 vorstehender Tabelle II wurden die folgenden Substratlösungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) als Lösungen von etwa 0,1 bis 0,3 mM hergestellt: Die Substrate wurden von Sigma oder Biosynth erhalten. Etwa 5 ml jeder Lösung wurden in ein Abfüllröhrchen gegeben. Die Lösung wurde mit dem Peptidase-Trispuffer auf 500 ml gebracht. Für das Substrat 95 wurde durch Einmischen von etwa 0,01 bis 0,02 g Tyrosin (AMC) in 5 ml DMSO ein TYR-Konzentrat hergestellt. Für das Substrat 83 wurden etwa 8 bis 10 mg Prolin (AMC) zu etwa 5 ml DMSO hinzugefügt. Jedes Abfüllröhrchen wurde zugestöpselt, mehrere Male gewendet und dann abgefüllt.
Die Substrate 14 bis 25 vorstehender Tabelle VI wurden im Wesentlichen gleich angesetzt wie die Substrate 1 bis 13, mit der Ausnahme, dass die Substrate in einem Peptidase-Hepespuffer (pH 8,0) verdünnt wurden. Nach dem Auflösen der Pufferkomponenten wurde die Lösung auf einen pH von zwischen etwa 7 bis 9 gebracht.
B - Fluoroσenischer Glycosidase-Test:
Die Substrate 26 bis 34 vorstehender Tabelle V2 wurden als Lösungen von etwa 0,9 mM bis etwa 1,8 mM in DMSO angesetzt: Jedes dieser Substrate wurde von Sigma erhalten.
Etwa 5 ml jeder Substratlösung wurden zusammen mit 10 ml Glycosidasepuffer einem Abfüllröhrchen hinzugefügt (siehe unten). Der Glycosidasekaliumphosphat-Puffer wurde durch Hinzufügen von Trizmabasis und Monokaliumphosphat zu entionisiertem. Wasser hergestellt. Die Lösung wurde gemischt und auf einen pH von zwischen etwa 7 bis 7,8 eingestellt. Etwa 5 ml Konzentrat wurde mit dem Puffer auf etwa 500 ml gebracht.
Für das Substrat 70 wurde ein BGAL-Konzentrat durch Hinzufügen von etwa 0,3 bis 0,5 g MeU-β-D-galactosid zu etwa 5 ml DMSO angesetzt. Für das Substrat 70 wurden etwa 2 bis 3 ml der Lösung hinzugefügt und mit dem Glycosidasepuffer auf ein Endvolumen von etwa 500 ml gebracht. Für die Substrate 76 und 77 wurden Zuckerausgangslösungen durch Hinzufügen von etwa 3 bis 5 g Mannose oder Sucrose zu etwa 1 Liter Wasser angesetzt.
C - Fluorometrischer Zuckerfermentierungsenzym-Test:
Für das Substrat 35 vorstehender Tabelle VI wurde eine 2×-Arbutinausgangslösung durch Einmischen von etwa 1 bis 2 g Arbutin (Sigma) in 40 ml entionisiertes Wasser (ARB-Ansatz) angesetzt. Etwa 20 ml des ARB-Ansatzes wurden in ein Abfüllröhrchen gegeben, in welches etwa 12,5 ml eines Zuckerpuffers zusammen mit 2 ml einer 4-MeU-Ausgangslösung dazugegeben wurden. Die Lösung wurde mit autoklaviertem entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von etwa 500 ml gebracht. Der Zuckerpuffer wurde durch Mischen von Monokaliumphosphat, Dikaliumphosphat und Pep tonwasser in 1 Liter von entionisiertem Wasser angesetzt. Die Komponenten wurden gemischt und auf einen pH von zwischen etwa 7 bis 8 gebracht. Die Peptonwasserlösung wurde durch Einmischen von 1 g Peptonwasser in etwa 10 ml entionisiertes Wasser hergestellt. Der MeU-Ansatz wurde durch Einmischen von etwa 0, 1 g Na⁺Methylumbelliferon-4 in 20 ml entionisiertes Wasser angesetzt. Das Substrat 36 ist eine AMC-Kontrollbahn.
Für die Substrate 37 bis 54 vorstehender Tabelle VI wurden die folgenden 2×-Zuckerausgangslösungen durch einzelnes Einmischen von etwa 1 bis 2 g der folgenden Zucker in 40 ml destilliertes entionisiertes Wasser hergestellt: Dulcit, Erythritol, Fructose, Galactose, Glycerol, Inulin, Lactose, Maltose, Melicitose, Thamnose, Ribose, Trehalose, Turanose, Xylose oder Palatinose: Jeder der Zucker wurde von Sigma erhalten.
Das Substrat 37 vorstehender Tabelle VI wurde durch Einmischen von etwa 1 bis 2 g Mucinsäure in etwa 400 ml entionisiertes Wasser und etwa 2 ml 5 N NaOH angesetzt. Für das Substrat 50 wurde ein 2×-Stärke-(STA)-Ansatz durch Einmischen von etwa 0,5 bis 1 g Stärke (Baker) mit Pluronic P-104 (10% Lösung) in etwa 445 ml Wasser angesetzt.
Mit Ausnahme der Substrate 47 und 50 vorstehender Tabelle VI wurden dem Abfüllröhrchen etwa 20 ml jeder 2×-Zuckerausgangslösung, gefolgt von etwa 12,5 ml des Zuckerbasisansatzes, gefolgt von 2 ml MeU-Ansatz in destilliertem entionisiertem Wasser auf etwa 500 ml hinzugefügt. Für das Substrat 47 wurden dem Abfüllröhrchen etwa 400 ml der MUC-Ausgangslösung, gefolgt von etwa 12,5 ml Zuckerpufferansatz und 2 ml MeU-Ansatz hinzugefügt. Die Lösung wurde mit dem autoklavierten und destillierten entionisierten Wasser auf etwa 500 ml gebracht. Für das Substrat 50 wurden dem Abfüllröhrchen etwa 452,5 ml des STA-Ansatzes, gefolgt von etwa 12,5 ml der Zuckerpuffer lösung und etwa 2 ml MeU-Ansatz hinzugefügt. Die Lösung wurde mit dem autoklavierten destillierten entionisierten Wasser auf etwa 500 ml gebracht.
D - Fluorometrischer Kohlenstoffverbrauchstest:
Die Substrate 55 bis 60 vorstehender Tabelle V2 wurden durch Herstellen einer Ausgangslösung der geeigneten Kohlenstoffquelle angesetzt. Jede Ausgangslösung wurde durch Hinzufügen von etwa 12 g der folgenden Kohlenstoffquellen in etwa 600 ml Decarboxylasebasispuffer angesetzt: Acetamid, Benzoesäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Pyruvinsäure du Malonsäure. Jede der Kohlenstoffquellen wurde von Sigma erhalten. Eine Decarboxylasebasislösung wurde durch Herstellen einer Ausgangslösung, in welcher etwa 9 bis 10 g Hefeextrakt, etwa 70 ml einer 2×-Ausgangslösung von β-Methyläsculetin, etwa 10 bis 20 g Proteasepepton-3, etwa 300 ml von 10%igem Glycerol und etwa 2 bis 4 g Phthalsäure (Kaliumsalz) in etwa 2700 ml entionisiertes Wasser eingemischt wurden, angesetzt. Die 2×-β-Methyläsculetinausgangslösung wurde durch Einmischen von etwa 3 bis 4 g 4-Methyläsculetin in etwa 400 ml 2-Methoxyletahnol und etwa 600 ml entionisiertes Wasser angesetzt. Die Komponenten wurden aufgelöst und auf einen pH von zwischen 5 und 6 eingestellt. Für die Substrate 55 bis 60 wurden 500 ml der geeigneten Lösung einem Abfüllröhrchen hinzugefügt und abgefüllt.
E - Zusätzliche Tests:
Es wurde über eine große Vielfalt von biochemischen Tests berichtet (siehe z. B. Bascomb, S., supra, und Manafi et al., supra). Tests, welche zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden durch Durchführen der hierin beschriebenen Verfahren ausgewählt. Siehe Beispiel 3. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die zusätzlichen Tests die folgenden Tests:

i) Urease – Es wurde über eine Vielfalt von Verfahren zum Nachweis von Urease berichtet, welche Messen von pH-Wechseln und Ammoniakerzeugung umfassen. Siehe z. B. Godsey et al., (1981) J. Clin. Microbiol., 13, 483, und Bascomb, S., supra.
ii) Tryptophanase (Indol-Test) – Es wurde über mehrere Verfahren zum Nachweis von Tryptophanase bereichtet, welche colorimetrische Tests und Tests auf der Basis von Fluoreszenzauslöschung umfassen. Zum Beispiel wurde zuvor ein bevorzugter Tryptophanase-Test beschrieben. Siehe z. B. Morris et al., US-Patent Nr. 5,173,434, welches hierin durch Bezugnahme voll-ständig aufgenommen wird. Siehe auch Bacomb, S., supra .
iii) Esterase und Decarboxylase – Esterase-Tests können in mehreren Formaten durchgeführt werden, einschließlich Fluoreszenztests (siehe z. B. Manafi et al., supra). Eine Vielfalt von Tests für Decarboxylasen wurde beschrieben (siehe z. B. Bascomb, S., supra). In einer bevorzugten Ausführungsform werden Ornithin- und Lysindecarboxylase-Tests durch Prüfen der Formation von basischen Aminen, welche den pH erhöhen und durch einen fluorometrischen pH-Indikator, wie beispielsweise 4-Methyläsculetin, nachgewiesen werden, durchgeführt. In einer anderen Ausführungsform werden die Decarboxylase-Tests in wohl bekannten colorimetrischen Formaten durchgeführt (siehe z. B. MacFaddin, J. F., (1980) Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2. Ausgabe, Williams and Wilkins, Baltimore und London).

Bei Gebrauch wird das universelle Testpanel mit etwa 10⁴ bis 10⁸ CFU/ml der zu testenden Probe beimpft und bei 35°C in einem Walkaway (W/A)-Instrument angeordnet. Die Probendaten werden unter Verwendung der Forschungssoftware WADEV mit Lesezeiten bei 40 Minuten (Basislinie), 120 Minuten und 140 Minuten gesammelt. Die Impfkulturdichte wird auf 0,08 ± 0,01 Artel eingestellt, wobei nach dem Beimpfen der Becken auf dem Panel mit einem RENOK^®-Hydrator/Impfgerät abgelesen wird. Die Resultate jedes Enzymtests werden unter Verwendung von statistischen Techniken durch eine ID-Matrix durchgelassen, um die Mikroorganismen in der Probe nachzuweisen und zu identifizieren. Eine bevorzugte statistische Technik ist die Bayesche Wahrscheinlichkeitsanalyse. In den Beispielen, welche folgen, basieren der Nachweis und die Identifizierung von Proben auf einer zuvor erzeugten Datenbank, wobei reine Kulturen von ausgewählten Hefeund Bakterienspezies verwendet werden.
F) Qualitätskontrolle
Die Qualitätskontrolltests (QC nach engl. quality control) am universellen Testpanel erfolgten wöchentlich und in einigen Fällen täglich. Alle Subkulturschalen, welche für Datenbankisolate verwendet wurden, wurden rigoros auf Reinheit geprüft, und jede verunreinigte Schale wurde rekultiviert. Während der Tests wurde alles unternommen, um die Qualität der Datenbank sicherzustellen, so dass die Rohdaten rigoros nachgeprüft und alle problematischen Resultate,z. B. Mangel an Beckenfluoreszenz, kein Reagens hinzugefügt, Reaktionsgeschwindigkeit eines bestimmten Stamms unterscheidet sich radikal von allen anderen derselben Spezies, vor ihrer Aufnahme in die Datenbank wiederholt und bestätigt wurden.
Das universelle Testpanel wird mit einer Vielfalt von geeigneten QC-Isolaten, welche die Panels von MicroSan RNID2, RPID, HNID und Rapid-Testpanels für anaerobe Mikroorganismen und Hefe umfassen, getestet. Nachstehende Tabelle IX listet Beispiele für geeignete QC-Organismen zur Verwendung mit dem universellen Testpanel auf. Zusätzliche Beispiele für geeignete QC-Organismen umfassen K. oxytoca; A. baumannii; Sh. putrefaciens; E. coli; A. hydrophila; P. vulgaris; Ps. fluorescens und Ps. aeruginosa. Eine Kochsalzlösungskontrolle wird normalerweise auf dem universellen Testpanel einbezogen, um Basislinien zum Auswerten der Testresultate festzulegen.
TABELLE IX
BEISPIEL 2
Aufbau einer Datenbank
Eine Vielfalt von Mikroorganismen, wie beispielsweise Hefe und Bakterien, kann verwendet werden, um eine Datenbank aufzubauen, welche zur Verwendung mit dem universellen Testpanel geeignet ist. Zum Beispiel wurden die folgenden Gruppen von Mikroorganismen verwendet, um eine geeignete Datenbank aufzubauen:
HNID-GRUPPE: Gardnerella vaginalis; Haemophilus haemolyticus; H. influ Grp I; H. influ Grp II; H. influ Grp III; X. influ Grp IV; H. influ Grp V; H. influ Grp VI; H. influ Grp VII; H. p influ Grp I; H. p influ Grp II; H. p influ Grp III; H. p influ Grp IV; H. para/ aphro; H. segnis; Branhamella catarrhalis; Neisseria cinerea; N. flavescens; N. gonorrhoeae; N. lactamica; N. meningitidis; N. mucosa; N. sp; N. sicca; HEFE-GRUPPE: Blastoschizomyces capitatus; Candida albicans; C. catenulata; C. guilliermondii; C. humicola; C. krusei; C. limbica; C. lipolytica; C. lusitaniae; C. parapsilosis; C. pseudotropical; C. rugosa; C. stellatoidea; C. tropicalis; C. tropicalis (sn); C. zeylanoides; Cryptococcus albidus; Cr. Iaurentii; Cr. neoformans; Cr. uniguttulatus; Hansenula anomala; H. polymorpha; Prototheca wickerhamii; Rhodotorula glutinis; R. rubra; Saccharomyces cerevisiae; Torulopsis candida; T. glabrata; T. inconspicua; Tricosporou beigelii;
GRAMPOSITIVE GRUPPE: Listeria monocytogenes; Micrococcus kristinae; M. luteus; M. lylae; M. roseus; M. sedentarius; M. varians; Pediococcus sp; Staphylococcus arlettae; S. auricularis; S. capitis; S. caprae; S.
carnosus; S. caseolyticus; S. chromogenes; S. cohnii; S. epidermidis; S. equorum; S. gallinarum; S. haemolyticus; S. hominis; S. hyicus/chromo; S. hyicus hyicus; S. intermedius; S. kloosii; S. lentus; S. lugdunensis; S. saprophyticus; S. schleiferi; S. sciuri; S. simluans; S. warneri; S. xylosus; G. morbillorum; Streptococcus agalact-Gp B; St. anginosus grp; St. bovis; St. equinus; St. equisimilis; St. mitis grp; St. mutans; St. pneumoniae; St. pyogenes; St. salivarius; St. sanguis I; St. zooepidemicus; Enterococcus casseliflavus; Ec. avium; Ec. faecalis; Ec. facecium; Ec. gallinarum; Ec. hirae; Ec. mundtii; Ec. raffinosus; Ec. soitarius; GRUPPE ANAEROBE MIKROORGANISMEN: Bacteroides distasonis; Peptostreptococcus anaerobicus; Bac. fragilis; Bac. ovatus; Bac. uniformis; Bac. ureolyticus; Bac. vulgatis; Bac. splanchnicus; Bifidobacterium dentium; Fusobacterium mortiferum; Fuso. necrophorum; Fuso. nucleatum; Fuso. varium; Porphyromonas asaccharolyt; Prevotella bivia; Pre. buccae; Pre. corporis; Pre. melaninogen; C. innocuum; C. perfringens; C. sordellii; C. sporogens; Bifidobacterium dentium; Eubacterium lentum; Eub. limosum; Propionibacterium acnes; Ps. magnus; Veillonella parvula; Ps. asaccharolyt.
Eine Aufgliederung dieser konkreten Datenbank ist wie folgt- ANAEROBE MIKROORGANISMEN (54 Spezies), Fastidien (fastidious bacteria) (21 Spezies), ENTEROKOKKEN (10 Spezies), STAPHYLOKOKKEN (28 Spezies), STREPTOKOKKEN (14 Spezies) und HEFE (42 Spezies).
Um eine Datenbank unter Verwendung der zuvor erwähnten Spezies von Hefe und Bakterien aufzubauen, werden etwa 30 Isolate von jeder Spezies (≈ 338 Isolate) mit einer Serie von biochemischen Tests, welche durch wohl bekannte statistische Techniken identifiziert werden, wie beispielsweise jene, die in Beispiel 3 offenbart werden, getestet. Die Resultate der Tests werden dann in eine Datenbank formatiert (Wahrscheinlichkeitsmatrix), welche entweder aus einer einzigen Datenbank, welche die Mitglieder von allen zu identifizierenden Familien umfasst, oder eine Reihe von Unterdatenbanken, welche auf jede Familie zutreffen, besteht.
BEISPIEL 3
Beispielhafte Verfahren zum Auswählen von Testkombinationen für das universelle Testpanel
Die 96 nicht-redundanten Substrate von Tabelle VI wurden verwendet, um eine Wahrscheinlichkeitsmatrix zu erzeugen, wie im Folgenden beschrieben.
Die Auswahl von Enzymtests für eine einzige Gruppe von Mikroorganismen,z. B. gramnegativen, wird im Folgenden beschrieben, um diesen Prozess zu veranschaulichen. Derselbe Prozess wurde auf fermentierende und nichtfermentierende Mikroorganismen, sowie andere durch gewöhnliche klinische Spezies vertretene Gruppen angewendet.
A) Bakterielle Isolate und Erzeugung: Es wurden Bakterien mit herkömmlichem IDS von MicroScan-Ausgangskulturen getestet.
Ausgangsstämme wurden vor dem Testen zweimal nachgeimpft, um Reinheit und Lebensfähigkeit sicherzustellen. Die meisten der getesteten Isolate wurden auf einer wachstumsselektiven Agarplatte gezüchtet (z. B. MacConkey agarspezifisch für gramnegative Bakterien) und etwa 18 bis 24 Stunden lang bei 35°C bebrühtet. Die Isolate, welche auf einer Art von wachstumsselektivem Agar nicht wachsen, wurden auf einer anderen gezüchtet (z. B. Trypticase-Sojaagar, ergänzt mit einer Platte mit 5% Schafsblut 18 bis 24 Stunden lang in einem nicht-CO₂ Inkubator bei 35°C für gramnegative Bakterien).
Bakterielle Suspensionen wurden in einzelnen Röhrchen angesetzt, welche 6,5 ml von 0,4%iger Kochsalzlösung mit Pluronic^® entsprechend einem Standard von 0,5 McFarland enthielten, wobei ein MicroScan-Trübungsmesser verwendet wurde. Vier getrennte Röhrchen, welche dasselbe Isolat enthielten, wurden in ein einziges Renok^®-Gefäß zusammengelegt und bei Verwenden eines Renok^®-Rehydrator-Impfgeräts von MicroScan beimpft. Nach der Verteilung der Impfkulturen im Panel wurden den ausgewählten Tests 3 Tropfen Mineralöl hinzugefügt. Die Panels wurden dann innerhalb von 30 Minuten ab der Anfangsbeimpfung in Röhrchen zur Inkubation bei 35°C in das Walkaway-System gegeben.
b) Datensammlung und -analvse: Zwei MicroScan^®-WalkAway Classic-Systeme, vier WalkAway^®-96-Systeme und ein WalkAway^® 40 wurden verwendet, um diese Panels bei allen vier Tests zu bebrühten und abzulesen. Die Daten wurden gesammelt, wobei MicroScan-Software zur Forschungsdatenerfassung verwendet wurde, welche mehr Datenpunkte, d.h. 0 Minuten, 40 Minuten, 120 Minuten und 140 Minuten, zu sammeln erlaubt als die auf dem WalkAway^® vorhandene Datenmanagementsystem (DMS)-Software. Jedes Instrument wurde 2- bis 3-mal wöchentlich geeicht, wobei ein MicroScan-Eichpanel verwendet wurde. Rohdaten, welche als künstliche Fluoreszenzeinheiten (AFU nach engl. Artificial Fluroescence Units) in der Forschungssoftware gesammelt wurden, wurden dann unter Verwendung von herkömmlichen Magnetdisketten in einem ASCI-Dateienformat auf die Statistikanalysesoftware (SAS) übertragen.
Die zuvor beschriebenen biochemischen Tests wurden verwendet, um eine genaue vollständige und zuverlässige Datenbank gemäß der Bayeschen Standardwahrscheinlichkeitsanalyse zu erzeugen.
c) Aufbau von Wahrscheinlichkeitsmatrizen: Die Identifizierungsübereinstimmung erfolgt, wenn die Kombination von Enzymtests auf Spezies (oder kombinierter Spezies)-Ebene mit einer normalisierten Wahrscheinlichkeit von ≥85% (vorzugsweise 90% oder 95%) korrekt identifiziert und diese Identifizierung mit der Bezugsidentifizierung übereinstimmt. Dies gilt als „Speziesübereinstimmung, hohe Wahrscheinlichkeit". Wenn die Identifizierung auf Spezies (oder kombinierter Spezies)-Ebene nicht mit einer Wahrscheinlichkeit von ≥85% erhalten wird, aber die korrekte Spezies als eine der möglichen Identifizierungen (2 bis 5 Taxa) bei geringer Wahrscheinlichkeit erscheint, gilt dies als „Speziesübereinstimmung, geringe. Wahrscheinlichkeit" und zusätzliche Tests sind erforderlich, um die Identifizierung der Spezies zu bestätigen. In diesem Fall werden zusätzliche Enzymtests durchgeführt, um die Spezies, die getestet werden, noch besser zu unterscheiden.
„Inkorrekte Identifizierungen" erfüllten diese Kriterien nicht. Ein „sehr ungewöhnlicher Biotyp" wird erhalten, wenn die Kombination von Tests 61 bis 96 übermäßige Abweichungen von erwarteten Resultaten für das höchstwahrscheinliche Taxon an den Tag legt. Eine „Gattungsgruppenidentifizierung, hohe Wahrscheinlichkeit" wird erhalten, wenn die Enzymtests keine Identifizierung auf Speziesebene bei ≥85% ergeben, aber die Summe der Wahrscheinlichkeiten für Mitglieder derselben Gattung/Gruppe >85% war.
Alle Daten wurden unter Verwendung der SAS-Software verarbeitet und analysiert. Die Rohdaten, welche während des Datenbanktestens gesammelt wurden, wurden in Geschwindigkeitswerte für alle Tests umgewandelt, mit Ausnahme der Indol- und Decarboxylaste-Tests, welche die folgende Gleichung verwenden: Geschwindigkeit = Endfluoreszenz – Anfangsfluoreszenz dividiert durch Zeit und multipliziert mit 100.
Für die Decarboxylase-Tests wurde dieselbe Gleichung verwendet, um die Anfangsgeschwindigkeiten zu berechnen. Um jedoch die Endgeschwindigkeit für Ornithin und Lysin zu berechnen, wurde die Geschwindigkeit der Decarboxylasebasis abgezogen. Für Indol-Tests wurde Dimethylcinnamaldehyd (DMCA) sowohl dem Indol-Test und einem Fluoreszenzkontrollbecken bei 2 Stunden hinzugefügt, und eine Ablesung erfolgte bei 2 Stunden und 20 Minuten. Eine Geschwindigkeit wurde für diesen Test zugeordnet, wobei die folgende Gleichung verwendet wurde: Indolgeschwindigkeit = Fluoreszenzkontrollbecken – Fluoreszenz im Indolbecken.
Alle Roh- und Reaktionsgeschwindigkeitsdaten wurden auf Fehler, d. h. doppelte Eingaben, typographische Fehler oder unregelmäßige Resultate, welche mikrobiologische Verunreinigung nahe legen, überprüft. Wenn Fehler auftraten, wurden vor der Aufnahme in die Datenbank Wiederholungs- oder Bestätigungstests durchgeführt.
Einzelne Reaktionsgeschwindigkeiten wurden dann für jedes Isolat in der Datenbank ausgewertet. Diese quantitativen Geschwindigkeitsdaten wurden in qualitative Daten umgewandelt, um die Auswirkung der Inter- und Intraveränderlichkeit des Isolats zu reduzieren. Im Allgemeinen war das Reaktionsgeschwindigkeitsprofil entweder zweigipflig oder dreigipflig für einen bestimmten Test, d. h. manche Taxa weisen keine oder niedrige Reaktionsgeschwindigkeiten auf, während andere Taxa mäßige oder hohe Re aktionsgeschwindigkeitswerte aufweisen. Unter Verwendung einer Anzahl von statistischen Techniken und der SAS-Programmiersprache wurden die Reaktionsgeschwindigkeiten für einzelne Tests ausgewertet und ein numerischer Geschwindigkeitswert (Fixpunkt) zugeordnet, um zwischen positiven und negativen Resultaten zu unterscheiden. Für jeden Test wurde die „Trennzahl" (Gyllenberg, 1963; Rypka et al., 1967; Lapage & Bascomb, 1968; Lapage et al., 1970) bei verschiedenen Fixpunktwerten, wenn für die Geschwindigkeiten der Gesamtheit oder eines Teils der Datenbanktaxa, sowie die bei kochsalzlösungsbeimpften Panels beobachteten Geschwindigkeiten betrachtet, für die Auswahl des Fixpunkts in Betracht gezogen. Wenn die Reaktionsgeschwindigkeit eines Isolats diesen Wert überschritt, wurde dieser Wert für zweigipflige Testresultate als positiv gezählt oder, wenn die Reaktionsgeschwindigkeit unter diesem Wert war, wurde der Test als negativ gezählt.
Nach Zuordnen der Fixpunkte für die einzelnen Tests wurden die Resultate von der Kombination von Tests für grampositive Mikroorganismen von einem quantitativen in einen qualitativen positiven oder negativen Wert umgewandelt. Durch Verwenden verschiedener Kombinationen von Tests wurden dann verschiedene Sätze von Wahrscheinlichkeitsmatrizen (Bascomb et al., 1973) aufgebaut. Die verschiedenen Sätze von Wahrscheinlichkeitsmatrizen wurden unter Verwendung des Bayeschen Wahrscheinlichkeitsidentifizierungsmodells (Wilicox et al. 1973) für ihre Fähigkeit bewertet, alle getesteten Isolate korrekt zu identifizieren, und dafür, wie einzelne Tests innerhalb jeder Wahrscheinlichkeitsmatrix zur Trennfähigkeit, d. h., der Fähigkeit, Spezies zu unterscheiden, beitragen. Ferner wurden die Tests auch für die Leichtigkeit der Herstellung, langer Lebensdauer, der Fähigkeit, Ver änderungen im Panelaufbau zu tolerieren, und Eliminierung von Ölbelag bewertet. Unter Verwendung all dieser Kriterien wurden 36 Tests ausgewählt, welche den zuvor erwähnten Übereinstimmungspunkten entsprachen (siehe z. B. 61 bis 69, Tabelle VI).
Als Nächstes wurde die Genauigkeit der Kombinationstests bewertet. Bei Verwenden einer normalisierten Wahrscheinlichkeitsgrenze von 85% für die Identifizierungsakzeptanz („Identifizierung mit hoher Wahrscheinlichkeit") wies das System in 2 Stunden und 20 Minuten insgesamt eine kombinierte Genauigkeit von 98,8% (93,9% korrekt hinsichtlich Spezies, 1,2% korrekt hinsichtlich Gattung und 3,6% korrekt hinsichtlich Spezies mit zusätzlichen Tests) auf. Die Untersuchung derselben Daten bei Verwenden einer normalisierten Wahrscheinlichkeitsgrenze von 90% anstelle der 85% führte zu einer geringeren Anzahl von Isolaten, welche auf Speziesebene korrekt identifiziert wurden (30 Isolate - 0,9%), bei einer begleitenden Zunahme in der Anzahl von Isolaten, welche auf Speziesebene mit der Erfordernis von zusätzlichen Tests identifiziert wurden (33 Isolate - 1,1%), verringerte aber die Anzahl von inkorrekten Identifizierungen (vier Isolate - 0,1%) nicht wesentlich. Aus diesem Grund wurde die normalisierte Wahrscheinlichkeit von 85% als der Grenzwert für die Identifizierungsakzeptanz gewählt.
Für klinisch bedeutende Isolate (einschließlich 24 häufig auftretende Spezies) weisen die Rombinationsenzymtests 61 bis 96 eine kombinierte Genauigkeit von 99,4% (97,5% korrekt hinsichtlich Spezies ohne zusätzliche Tests, 1,0% korrekt hinsichtlich Gattung und 0,9% korrekt hinsichtlich Spezies mit zusätzlichen Tests) auf.
Ferner zeigten die Datenbankresultate für alle gramnegativen fermentierenden Spezies, welche mit der Kombination von Tests getestet wurden, eine kombinierte Genauigkeit von 98,8% (96,5% korrekt hinsichtlich Spezies ohne zusätzliche Tests, 1,1% korrekt hinsichtlich Gattung und 1,2% korrekt hinsichtlich Spezies mit zusätzlichen Tests). Insgesamt wies das System eine kombinierte Genauigkeit von 98,1% (86,5% korrekt auf Spezies-, 1,4% korrekt auf Gattungsebene und 10,2% korrekt hinsichtlich Spezies mit zusätzlichen Tests).
Die Kombination von Tests identifiziert 119 Taxa (85 fermentative Spezies und 34 nichtfermentative Spezies) in 2 Stunden und 20 Minuten, einschließlich 24 klinisch bedeutender Spezies. Ferner benötigten nur 0,9% aller klinisch bedeutenden Taxa (weniger als 1 von 100 Isolaten, welche üblicherweise im klinischen Laboratorium vorgefunden werden) und 3,7% aller Isolate in der Datenbank zusätzliche Tests für eine aktuelle Endidentifizierung.

Claims

Ein Testsystem zur Identifizierung eines Mikroorganismus in einer Probe, wobei das Testsystem in der Lage ist, diesen Mikroorganismus aus Gruppen von weit auseinander liegenden Mikroorganismen zu identifizieren, umfassend Hefe und mindestens eines der folgenden: i) anaerobe Bakterien, ii) enterische Bakterien, iii) gram-positive Gruppe der Bakterien, iv) Neisseria und Haemophilus oder v) Fastidien (fastidious bacteria), welche in solch einer Probe vorhanden sein können, und worin das Testsystem umfasst: eine vorbestimmte Kombination von nicht-redundanten biochemischen Tests, welche in eine vorbestimmte Nummer von Reaktionskammern entleert werden, wobei jeder biochemische Test ein Substrat für ein Enzym oder eine Gruppe von Enzymen umfasst und wobei ferner das Substrat, wenn das Enzym oder die Gruppe von Enzymen darauf einwirken, in der Formation eines nachweisbaren Produktes in der Reaktionskammer resultiert und wobei die nachweisbaren Produkte der Kombination von biochemischen Tests benutzt werden, um den Mikroorganismus durch Gebrauch einer Wahrscheinlichkeits-Matrix in der Probe zu identifizieren.
Ein Testsystem nach Anspruch 1, wobei das Identifizieren eines Mikroorganismus das Klassifizieren des Mikroorganismus als Gattung oder als Spezies oder beides umfasst.
Ein Testsystem nach Anspruch 1, wobei die vorbestimmte Kombination von nicht-redundanten Tests Fluoreszenztests, colorimetrische Tests oder eine Kombination derselben umfasst.
Ein Testsystem nach Anspruch 3, wobei die Fluoreszenztests in einem fluorogenischen oder fluorometrischen Format durchgeführt werden.
Ein Testsystem nach Anspruch 3, wobei die vorbestimmte Kombination von nicht-redundanten Tests innerhalb von etwa 15 Minuten bis zu etwa 8 Stunden durchgeführt werden.
Ein Testsystem nach Anspruch 1, wobei die vorbestimmten nicht-redundanten Tests bei einer Temperatur zwischen etwa 25 bis etwa 37°C durchgeführt werden.
Ein Testsystem nach Anspruch 6, wobei die colorimetrischen Tests visuell oder durch einen Colorimeter gelesen werden.
Ein Testsystem nach Anspruch 4, wobei die Fluoreszenztests durch Benutzung eines Fluorometers gelesen werden.
Ein Testsystem nach Anspruch 1, welches mindestens einen Test zum Nachweis einer Peptidase, einer Glycosidase, eines Zuckerfermentierungsenzyms, einer Urease, einer Decarboxylase, einer Esterase, eines Kohlenstoff benötigenden Enzyms, einer Phosphatase oder einer Tryptophanase umfasst.
Ein Testsystem nach Anspruch 9, welches einen Test für mindestens eine Peptidase und mindestens eine Glycosidase umfasst.
Ein Testsystem nach Anspruch 10, welches ferner einen Test für mindestens ein Zuckerfermentierungsenzym umfasst.
Ein Testsystem nach Anspruch 11, welches ferner einen Test für mindestens eine Urease umfasst.
Ein Testsystem nach Anspruch 12, welches ferner einen Test für mindestens eine Decarboxylase umfasst.
Ein Testsystem nach Anspruch 13, welches ferner einen Test für mindestens eine Esterase umfasst.
Ein Testsystem nach Anspruch 14, welches ferner einen Test für mindestens ein Kohlenstoffassimilationsenzym umfasst.
Ein Testsystem nach Anspruch 1, wobei die vorbestimmte Kombination von nicht-redundanten biochemischen Tests in der Lage ist, den Mikroorganismus unter mindestens zwei der folgenden zu identifizieren: enterische und nicht-fermentierende Bakterien; anaerobe Bakterien; Hefe; Staphylococcus sp., Streptococcus sp. und Enterococcus sp.; und Fastidien (fastidious bacteria).
Ein Testsystem nach Anspruch 1, wobei die vorbestimmte Kombination von nicht-redundanten biochemischen Tests in der Lage ist, den Mikroorganismus unter mindestens einem der folgenden zu identifizieren: Staphylococcus sp., Streptococcus sp. und Enterococcus sp.; Corynebacteria, sp.; Lactobacillus sp.; Pediococcus sp.; Leuconostoccus sp.; Alloicoccus sp.; Vagococcus sp.; Kluyvera sp.; Leminorella sp.; Haemophilus sp. und Neisseria sp.; Moraxella sp.; Salmonella sp.; Clostridia sp.; Listeria sp..
Ein Testsystem nach Anspruch 1, wobei die vorbestimmte Kombination von nicht-redundanten biochemischen Tests in der Lage ist, die Mikroorganismen unter mindestens einem von Anaeroben, Hefe oder Fastidien (fastidious bacteria) zu identifizieren.
Ein Testsystem nach Anspruch 18, wobei die vorbestimmte Kombination von nicht-redundanten biochemischen Tests in der Lage ist, den Mikroorganismus unter Anaeroben und Hefe oder Fastidien (fastidious bacteria) zu identifizieren.
Ein Testsystem nach Anspruch 19, wobei die vorbestimmte Kombination von nicht-redundanten biochemischen Tests in der Lage ist, den Mikroorganismus unter Hefe und Fastidien (fastidious bacteria) zu identifizieren.
Ein Testsystem nach Anspruch 1, wobei die vorbestimmte Kombination von nicht-redundanten biochemischen Tests in der Lage ist, den Mikroorganismus unter mindestens einem von Staphylococcus, Streptococcus oder Enterococcus und mindestens einem von Anaeroben, Hefe, Enteromikroorganismen und Nichtfermentierenden oder Fastidien (fastidious bacteria) oder einer Kombination derselben zu identifizieren.
Ein Testsystem nach Anspruch 1, wobei das Testsystem in der Lage ist, unter Hefe, anaeroben Bakterein und Fastidien (fastidious bacteria) zu identifizieren.
Ein Testsystem nach Anspruch 1, wobei das Testsystem in der Lage ist, Enterococcus, Staphylococcus, oder Streptococcus, Anaerobe, Hefe und Fastidien (fastidious bacteria) zu identifizieren.
Ein Testsystem nach Anspruch 1, wobei die Substrate Lysin (AMC), Leucin (AMC), Methionin (AMC), Glycyl-Prolin (AMC), Isoleucin (AMC), Trehalose, Maltose, L-Tryptophan (7-AMC), 4-MeU-Phosphat, β-D-xylosid-4MeU, Hydroxy-Prolin-AMC, β-Dglucuron-4MeU, Tyrosin (AMC), 4-MeU-β-D-galactosid, Mannose, Sucrose und Prolin umfassen.
Ein Testsystem nach Anspruch 24, wobei die Substrate ferner Fructose, Glycerol, L-Histidin 7-RMC, Pyroglutamsäure (AMC) und 4-MeU-β-D-glucosid umfassen.
Ein Testsystem nach Anspruch 25, wobei die Substrate ferner L-serin 7-AMC, Cellobiose, Arginin (RMC) und 4-MeU-N-Acetyl-β-D-galactosaminid umfassen.
Eine Methode zur Identifizierung eines Mikroorganismus in einer Probe unter mindestens zwei Gruppen weit auseinander liegender Mikroorganismen, umfassend Hefe und mindestens eines der folgenden: i) anaerobe Bakterien, ii) enterische Bakterien, iii) gram-positive Gruppe der Bakterien, iv) Neisseria und Haemophilus oder v) Fastidien (fastidious bacteria), welche in solch einer Probe durch Gebrauch eines Testsystems nach Anspruch 1 vorhanden sein können, wobei die Methode folgendes umfasst: a) Hinzufügen der Probe zu jeder Reaktionskammer, welche ein Substrat umfasst; b) es dem Enzym, falls vorhanden, zu ermöglichen, mit dem Substrat zu reagieren; c) Bestimmung des Vorhandenseins des Enzyms in der Probe durch Nachweis der nachweisbaren Produkte in einem Test; und d) Vergleich der Resultate der Kombination von vorbestimmten Tests mit mindestens einem vorbestimmten Standard zur Identifizierung des Mikroorganismus in der Probe.
Ein Test nach Anspruch 1 zum Nachweis von Kohlenstoffverbrauch eines Mikroorganismus, umfassend Hefe und mindestens eines der folgenden: i) anaerobe Bakterien, ii) enterische Bakterien, iii) gram-positive Gruppe der Bakterien, iv) Neisseria und Haemophilus oder v) Fastidien (fastidious bacteria), wobei der Test mindestens eine Kohlenstoffquelle und mindestens einen fluorometrischen Indikator umfasst, wobei der Mikroorganismus auf die Kohlenstoffquelle einwirkt, um einen pH-Wechsel zu produzieren, welcher einen Fluoreszenzwechsel des Indikators verursacht, wobei der Fluoreszenzwechsel den Kohlenstoffverbrauch des Mikroorganismus anzeigt.