CN105779340A - 降解石油污染物的克雷氏杆菌的最适生长条件及耐受性研究方法 - Google Patents

降解石油污染物的克雷氏杆菌的最适生长条件及耐受性研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株降解石油污染物的克雷氏杆菌的最适生长条件及环境耐受性研究方法。分别配置用于生长情况测定和耐受条件测定的胰蛋白胨大豆肉汤培养基。分装后密封并于121℃高压蒸汽下灭菌20分钟，冷却至室温待用；将菌株加入到用于生长情况测定的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，培养取样通过测OD600的方法测定菌体浓度，并绘制菌株生长曲线；取菌体分别加入到用于不同耐受条件测定的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，每组做3个平行，220rpm摇床培养，稳定期后取样，通过测OD600的方法测定菌体浓度，并绘制菌株耐受曲线。克雷氏杆菌在温度范围20‑40℃、酸碱度范围pH5‑pH8、盐浓度范围0.5％‑3％下有良好的降油效果。

Description

降解石油污染物的克雷氏杆菌的最适生长条件及耐受性研究方法
技术领域
本发明涉及一株降解石油污染物的克雷氏杆菌的最适生长条件及耐受性研究方法。
背景技术
石油污染物是指那些不可控的排泄到环境中的石油及石油产品，石油污染物会对人体以及动植物产生非常严重的影响，并且会污染人类赖以生存的环境，对水体、土壤以及大气环境都造成不同程度的污染。
石油污染物主要含有烷烃、环烷烃、芳香烃等一种或多种石油烃类物质，在油田的开发、各种石油产品的加工等石油工业中的每个环节都有可能产生石油类污染物。工业废水和生活污水构成了环境水中石油污染物的主要来源，且工业废水是水体污染的主要因素。工业石油污染主要指在开采、加工和运输原油以及使用炼制油的过程中而产生的污染。部分石油类碳氢化合物会在水体表面悬浮，阻隔空气与水体界面间氧的交换；另外，如果被水体中的微生物氧化降解，也会消耗溶氧，恶化水质。石油类中所含的芳烃类虽较烷烃类少，但其毒性要大得多。因而，石油污染日渐成为一种污染范围最广、污染程度逐年严重的污染。据2014年4月18日环保部和国土资源部联合发表的《全国土壤污染状况调查公报》显示，全国土壤总超标率为16.1％，其中有机污染物如多环芳烃的超标率高达1.4％。可见石油污染已经严重影响我国的生态环境，急需对石油污染物进行治理。
有毒有害物质如石油烃类不可控地流入土壤或水体当中，日益增多的污染物不断聚集，成为环境生态的巨大威胁，同时也成为人类生存健康不可忽视的毒瘤。同时，由于石油污染物不可控的流动性、潜在的生物毒性以及生物积累效应等，石油中的部分多环芳烃类化合物属强致癌物质，若通过食物链进入人体，对人类健康具有很大的潜在危害。根据统计，每年大约有占到全球石油总产量0.5％的石油(200万吨-1000万吨)通过各种途径泄漏到海洋，因为运输不当而倾泻到海洋水体中的石油污染物超过160万吨，而其中1/3左右都是因为油轮在海上发生事故导致石油泄漏造成的。石油污染物可以直接毒死海洋生物，并且容易黏附在鱼类的体内特别是肺部，使有毒物质大量聚集并致使鱼类窒息死亡。石油污染物若渗入土壤，则会长时间遗留在土壤中难以降解消除。钻井、石油开采、运输、发生事故以及排放不当是污染产生的主要环节。同时，石油污染物也会破坏植物和土壤中微生物的生态平衡，导致土壤微生物群落变化、土壤中酶活降低，破坏土壤微生态环境并造成严重的水体污染环境等环境问题。土壤中的污染物会随着农作物的吸收以及饮用水而进入人类的食物链，产生对人类的身体健康的直接或潜在的危害，导致人类染上很多严重的疾病，比如肺病，肺结核以及癌症等。此外，海洋和土壤中的石油污染物也会通过挥发作用进入大气。石油污染物中的苯类、甲苯类、乙基苯类及多环芳烃类物质对人体健康影响比较大，长期接触这些高浓度物质会引起人体的不适反应；多环芳烃具有毒性，可通过呼吸道、皮肤、消化道等进入人或动物体内，对相应器官如肝、肾等的正常功能带来影响，甚至引发细胞癌变。
目前，处理石油污染物的方法主要有物理法、化学法、生物法。采用生物学的方法处理石油污染物一直被认为是最高效、最环保、最经济的方法之一。微生物法则是生物法治理石油污染物的一种手段。自然界中存在着许多可以降解石油烃类物质的菌种，微 生物法就是通过投加相应的石油烃降解菌，利用降油菌的生长繁殖及新陈代谢作用分解利用石油污染物，使石油烃类物质转化为小分子或气体进而被环境所接受。如今利用微生物降解的方法修复污染环境已经广泛应用于有机工业废水的去毒、减害处理技术中，针对其他领域的进一步应用和研究工作也在逐步进行当中。在自然界中许多微生物都能够利用石油烃类作为碳源进行正常的代谢，这些微生物具有十分广泛的分布，涉及到的微生物多达100余属、200余种。克雷氏杆菌就是这其中的一种高效的石油降解菌。
利用微生物法进行石油污染的原位修复，要求微生物可以在该环境条件下有良好的生长，同时实现石油污染物的高效降解，为我们所用。由于实际的石油污染地域环境十分复杂，且条件十分恶劣，在利用微生物修复污染水域或土壤时，微生物常常不能良好的生长并发挥降解石油的作用。这就需要对微生物的最适生长条件及其对环境的耐受性有一定的了解。因此，基于目前我国石油污染地域的主要环境状况，研究菌种的环境耐受性、了解菌株的最适生长条件是极其必要的。通常，影响菌株生长的环境因素主要有温度、盐浓度和酸碱度，研究降解石油污染物的菌株在温度、盐浓度和酸碱度这三个条件下的最适生长条件是有必要的。同时，由于我国石油污染地域的土壤多呈现盐碱性，即高盐度、高碱性的状况，对降解石油污染物的菌株能否耐受这种极端环境的研究也是有必要的。对菌种的耐受性研究主要基于温度耐受、酸碱度耐受和盐浓度耐受这三方面。
发明内容
本发明的目的是提供关于一株降解石油污染物的克雷氏杆菌的最适生长条件及环境耐受性(温度、酸碱度、盐浓度)研究方法。
本发明所用的菌种为克雷氏杆菌Klebsiella oxytoca strain LF-1(以下简称LF1)。可购买于中国微生物菌种保藏中心，编号为ATCC 49131。
本发明的技术方案如下：
一株降解石油污染物的克雷氏杆菌的最适生长条件及环境耐受性研究方法，按照以下的方法步骤进行耐受环境下降解石油污染物的菌株的生长情况研究：
1)分别配置用于生长情况测定和耐受条件测定的胰蛋白胨大豆肉汤培养基。分装后密封并于121℃高压蒸汽下灭菌20分钟，冷却至室温待用；
2)将菌株加入到用于生长情况测定的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，30℃、220rpm摇床培养，每隔3小时取样，取样后通过测OD600的方法测定菌体浓度，并绘制菌株生长曲线；
3)取等量菌体分别加入到用于不同耐受条件测定的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，每组做3个平行，特定条件下、220rpm摇床培养，待菌株生长到稳定期后取样，通过测OD600的方法测定菌体浓度，并绘制菌株耐受曲线。
步骤(1)中所用到的用于生长情况测定的胰蛋白胨大豆肉汤培养基的配方是：蛋白胨20g/L，葡萄糖2.5g/L，NaCl 5g/L，K2HPO4 2.5g/L，利用2mol/L的NaOH和2mol/L的HCl调节胰蛋白胨大豆肉汤培养基的pH到7.0-7.2。
步骤(1)中所用到的用于耐受条件测定的胰蛋白胨大豆肉汤培养基的配方分别是：(a)温度耐受培养基，蛋白胨20g/L、葡萄糖2.5g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L， 利用2mol/L的氢氧化钠和2mol/L的盐酸调节pH到7；(b)酸碱度耐受培养基，蛋白胨20g/L、葡萄糖2.5g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L，利用2mol/L的氢氧化钠和2mol/L的盐酸分别调节pH到5、6、7、8、9；(c)盐浓度耐受培养基，蛋白胨20g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L，利用2mol/L的氢氧化钠和2mol/L的盐酸调节pH到7，再分别添加氯化钠5g/L、30g/L、60g/L、90g/L、120g/L、150g/L，将培养基的盐浓度依次调节到0.5％、3％、6％、9％、12％、15％。
步骤(3)中所述的特定条件分别为：温度耐受实验的每组实验温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃；酸碱度耐受实验和盐浓度耐受实验的每组实验温度均为30℃。
本发明的所使用的克雷氏杆菌对1％原油的7天降解率为40.41％，生长约20h后达到生长稳定期(图1)，环境耐受效果如图2-4所示，LF可耐受温度25-40℃，耐受酸碱度pH6-8，耐受盐浓度0.5-2％。
附图说明
图1.克雷氏杆菌LF1在30℃、220rpm条件下的生长曲线图；
图2.克雷氏杆菌LF1在20-40℃条件下的温度耐受情况图；
图3.克雷氏杆菌LF1在pH5-pH9条件下的酸碱度耐受情况图；
图4.克雷氏杆菌LF1在盐浓度0.5％-15％条件下的盐浓度耐受情况图。
具体实施方式
通过下面结合具体实例将有助于进一步理解本发明，但本发明的保护范围并不限制于此：
实施例1
克雷氏杆菌生长情况的测定
配置基础胰蛋白胨大豆肉汤培养基，蛋白胨20g/L、葡萄糖2.5g/L、氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，利用2mol/L的氢氧化钠和2mol/L的盐酸调节胰蛋白胨大豆肉汤培养基的pH到7。将100mL的胰蛋白胨大豆肉汤培养基分装在250mL的锥形瓶中，用封口膜密封后于121℃高温高压下灭菌20分钟。待冷却后加入1mL菌液，30℃、220rpm下摇床培养，每隔3h取样测一次OD600值。每次取样前需将锥形瓶摇匀，取样2mL。每组做三个平行。测试时为保证仪器的准确性，控制测量值在0.2-0.8内，如测量值过高，做适当稀释后再行测试。3h时的OD600值分别为0.267、0.263、0.234，6h时分别为0.29、0.32、0.328，9h时分别为0.463、0.483、0.480，12h时分别为0.851、0.852、0.852，15h时分别为1.814、1.840、1.823，18h时分别为2.342、2.460、2.484，21h时分别为3.175、3.216、3.198，24h时分别为3.878、3.709、3.848，27h时分别为4.564、4.534、4.620，30h时分别为5.008、5.236、5.600，36h时分别为7.020、6.872、6.926，43h时分别为7.824、7.582、8.020，51h时分别为5.198、5.048、5.124。克雷氏杆菌 HA1在30℃、220rpm条件下的生长曲线图，如图1所示。结果表明克雷氏杆菌LF1的生长稳定期约从27h开始。
实施例2
克雷氏杆菌温度耐受的测定
配置基础胰蛋白胨大豆肉汤培养基。将100mL的胰蛋白胨大豆肉汤培养基分装在250mL的锥形瓶中，共分装15瓶，封口灭菌后冷却备用。混匀克雷氏杆菌菌液，每瓶培养基内加入1mL菌液，每3瓶为一组，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，220rpm下摇床培养27h后取样测试。取样前混匀摇瓶，每瓶取样2mL测试菌液的OD600值，浓度过高的菌液做适当稀释。每组中剔除有明显误差的测量值后，取平均值，并绘制克雷氏杆菌HA1在20-40℃条件下的温度耐受情况图，如图2所示。结果表明克雷氏杆菌LF1在35℃下有最好的生长，其最适温度在30-35℃间，可以良好耐受的温度范围为20-40℃。
实施例3
克雷氏杆菌酸碱度耐受的测定
配置用于酸碱度耐受测定的特殊胰蛋白胨大豆肉汤培养基，蛋白胨20g/L、葡萄糖2.5g/L、氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L。将100mL的胰蛋白胨大豆肉汤培养基分装在250mL的锥形瓶中，共分装15瓶，每3瓶为一组，分别用2mol/L的氢氧化钠和2mol/L的盐酸调节pH为5、6、7、8、9，用封口膜密封后，在121℃高温高压下灭菌20分钟。混匀克雷氏杆菌菌液，每瓶培养基内加入1mL菌液，在30℃、220rpm下培养27h后取样测试。取样前混匀摇瓶，每瓶取样2mL测试菌液的OD600值，浓度过高的菌液做适当稀释。每组中剔除有明显误差的测量值后，取平均，绘制克雷氏杆菌HA1在pH5-pH9条件下的酸碱度耐受情况图，如图3所示。结果表明克雷氏杆菌LF1在pH7和pH8时均有较好生长，其最适酸碱度在pH7-8间，可以耐受的酸碱度范围为pH5-pH8。
实施例4
克雷氏杆菌盐浓度耐受的测定
配置用于盐浓度耐受测定的特殊胰蛋白胨大豆肉汤培养基，蛋白胨20g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L，将100mL的胰蛋白胨大豆肉汤培养基分装在250mL的锥形瓶中，共分装18瓶，每3瓶为一组，分别加入氯化钠5g/L、30g/L、60g/L、90g/L、120g/L、150g/L，使培养液的盐浓度(氯化钠浓度)，用2mol/L的氢氧化钠和2mol/L的盐酸调节pH至7，封口后于121℃下高温高压灭菌20分钟。混匀克雷氏杆菌菌液，每瓶培养基内加入1mL菌液，在30℃、220rpm下培养27h后取样测试。取样前混匀摇瓶，每瓶取样2mL测试菌液的OD600值，浓度过高的菌液做适当稀释。每组中剔除有明显误差的测量值后，取平均，绘制克雷氏杆菌HA1在盐浓度0.5％-8％条件下的盐浓度耐受情况图，如图4所示。结果表明克雷氏杆菌LF1在盐浓度为0.5％下生长最好，可耐受的盐浓度范围为0.5％-3％。
该克雷氏杆菌Klebsiella oxytoca strain LF-1在温度范围20-40℃、酸碱度范围pH5-pH8、盐浓度范围0.5％-3％下有良好的降油效果。
本发明公开和提出的一株降解石油污染物的克雷氏杆菌的最适生长条件及耐受性研究方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实 现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (9)

1.降解石油污染物的克雷氏杆菌的适宜生长条件及环境耐受性的研究方法，其特征是步骤如下：
1)分别配置用于生长情况测定和耐受条件测定的胰蛋白胨大豆肉汤培养基；分装后密封并于121℃高压蒸汽下灭菌20分钟，冷却至室温待用；
2)将菌株加入到用于生长情况测定的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，30℃、220rpm摇床培养，每隔3小时取样，取样后通过测OD600的方法测定菌体浓度，并绘制菌株生长曲线；
3)取等量菌体分别加入到用于不同耐受条件测定的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，每组做3个平行，特定条件下、220rpm摇床培养，待菌株生长到稳定期后取样，通过测OD600的方法测定菌体浓度，并绘制菌株耐受曲线。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤(1)中所用到的用于生长情况测定的胰蛋白胨大豆肉汤培养基的配方是：蛋白胨20g/L，葡萄糖2.5g/L，NaCl 5g/L，K2HPO4 2.5g/L，利用2mol/L的NaOH和2mol/L的HCl调节胰蛋白胨大豆肉汤培养基的pH到7.0-7.2。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤(1)中所数的耐受条件为温度、酸碱度或盐浓度胰蛋白胨大豆肉汤培养基。
4.如权利要求3所述的方法，其特征是温度耐受培养基为：蛋白胨20g/L、葡萄糖2.5g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L，利用2mol/L的氢氧化钠和2mol/L的盐酸调节pH到7。
5.如权利要求3所述的方法，其特征是酸碱度耐受培养基为：蛋白胨20g/L、葡萄糖2.5g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L，利用2mol/L的氢氧化钠和2mol/L的盐酸分别调节pH到5、6、7、8、9。
6.如权利要求3所述的方法，其特征是盐浓度耐受培养基为：蛋白胨20g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L，利用2mol/L的氢氧化钠和2mol/L的盐酸调节pH到7，再分别添加氯化钠5g/L、30g/L、60g/L、90g/L、120g/L、150g/L，将培养基的盐浓度依次调节到0.5％、3％、6％、9％、12％、15％。
7.如权利要求4所述的方法，其特征是温度耐受实验的每组实验温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。
8.如权利要求5或6所述的方法，其特征是酸碱度耐受实验或盐浓度耐受实验的每组实验温度均为30℃。
9.如权利要求1所述的方法，其特征是降解石油污染物的克雷氏杆菌为Klebsiella oxytoca strain LF-1。
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CN106906158A (zh) * 2017-01-12 2017-06-30 成都理工大学 一株含油污泥降解功能菌及其应用
CN106906158B (zh) * 2017-01-12 2020-07-17 成都理工大学 一株含油污泥降解功能菌及其应用

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