CN102308852A - 一种可抑制水中游离或成膜微藻的微生物抑藻剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可抑制水中游离或成膜微藻的微生物抑藻剂Algaelat，它可抑制水中浮游微藻的生长及微藻生物膜的形成；本发明还公开了该微生物抑藻剂Algaelat由侧孢芽孢杆菌VKPM B-10531与膨胀珍珠岩颗粒载体混合组成，其初始质量比为4∶1，干燥制备完成后质量比为3∶2；该微生物抑藻剂Algaelat可抑制浮游微藻生长及微藻生物膜形成，导致水体颜色褪变，直至褪色；显微镜观察发现微藻细胞出现溶解；Algaelat的杀藻活力通过残余光密度值检测发现对Algaelat最为敏感的是浮游状的念珠藻、鱼腥藻和微囊藻，它们属于蓝绿藻(蓝细菌)；Algaelat对生物膜的完全裂解需要更长时间。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学和生物技术，特别是一种用于抑制水体中微藻生长的微生物抑藻剂及该抑藻剂的制备方法。
背景技术
微型藻类(微藻类)大量生长导致严重的经济社会问题。微藻类可以以两种形式存在：悬浮(浮游生物)形式或者生物膜(“垫子”)形式。这两种形式的微藻类的生理生化特征差异很大。工业生产、家庭生活和农业生产产生的污水未经处理即排放导致了自然界的水体污染，引起各类微藻的生长，其中首当其冲就是蓝绿细菌(蓝细菌)的大量生长。水体中大量微藻类生长会导致严重的环境灾难性后果，如形成三维结构的生物膜(“垫子”)，即水华。水华发生后可伴随着大量微藻死亡、毒素积累、氧气消耗方式的改变和腐败气味的出现。微藻类膜的各种成分在分解和腐烂的过程会伴随着一些毒素化合物(例如：酚类、吲哚和粪臭素等)的释放，而大量微藻类死亡可导致水中氧气不足从而引起大量好氧微生物死亡以及鱼类死亡。某些微藻类甚至可产生多种特有的毒素，包括神经毒素和肝毒素，对人和动物健康造成极大危害。目前还没有发现或研究出针对微藻类毒素的解毒剂。
微藻类还会引起诸多过敏性疾病。与全球气候变暖相关的全球性微藻类循环已带来世界性难题。由微藻过度生长引起重大的经济损失和微藻类毒素对环境的影响都迫切要求我们采取措施抑制微藻类过度生长和监测水生生态系统。
目前已有多种物理、化学和生物方法来抑制微藻类生长。
紫外照射、超声和水电解都被用于产生抑制微藻类生长的条件，包括干扰微藻类生长或破坏已形成的微藻类群落(“垫子”)。对有水华的水体进行紫外照射和超声处理相当有效，但它们会导致包括pH降低、水体中总氮、磷的含量减 少和水温升高等不良后果。另外，水电解成本太高，且不宜大规模应用。
化学除草剂(如敌草隆、西玛律、阿特拉嗪等)可减少藻类数量，但对水体和生物共生的负面影响实际上排除了其应用的可能性。这些负面影响包括缺乏选择性、致命、致突变和致畸效应。
利用细菌及其代谢产物开发的生物抑藻剂可抑制水体中的微藻类生长，研究证明这个方法是可行的。现在已发现某些菌株可抑制微藻类生长，但源于细菌的微生物抑藻制剂未见报道。
发明目的：
本发明的目的在于获得一种可以抑制水体中各种形式微藻生长的微生物抑藻剂。
本发明的另一目的在于获得一种由活力因子——侧孢芽孢杆菌VKPMB-10531[拉丁文名称：Brevibacillus laterosporus 16-336；保藏单位：俄罗斯国家工业微生物保藏中心(简称VKPM)；地址：俄罗斯联邦莫斯科多罗日1号胡同1号；保藏日期：2010年2月25日；保藏编号：VKPM B-10531]与膨胀珍珠岩颗粒载体组成的微生物抑藻剂“Algaelat”的制备方法，其初始质量比为4∶1，经干燥制备完成后质量比为3∶2。Algaelat可抑制水环境中浮游微藻生长及微藻生物膜的形成。
发明人经过研究获得了微生物抑藻剂Algaelat制备方法：
首先、对侧孢芽孢杆菌VKPM B-10531进行培养，将侧孢芽孢杆菌VKPM B-10531在NBY培养基中培养；其所用培养基组分(质量比％)为：营养肉汤0.8；酵母提取物0.3；适量的水；制备固体琼脂培养基时，添加2.0％琼脂于NBY液体培养基中。
其次，选择合适的固定活力因子的载体；经过反复研究选用膨胀珍珠岩颗粒为固定Algaelat活力因子(即侧孢芽孢杆菌VKPM B-10531培养物)的载体。珍珠岩颗粒源于经900-1200℃高温加工的天然岩石，具有质轻、多孔、珍珠白等特性，颗粒大小约0.16-0.25mm，堆积密度为75到100-150kg/m3。膨胀珍珠岩颗粒是一种天然材料，具有开发微生物抑藻剂所必须的特性：无菌、化学惰性、质轻、快速处理、不可燃、不被生物分解、无污染。珍珠岩砂不易被分解，透气性、透水性好，吸收能力强，可吸收400％重量的水。膨胀珍珠岩颗粒 具有良好的浮力特性，这使微生物抑藻剂可长期保持在水体表面，从而使其长期保持活力。
第三，微生物抑藻剂Algaelat的组成选用侧孢芽孢杆菌发酵液和固定载体膨胀珍珠岩颗粒组成，发酵液包括芽孢、营养细胞(8×108到1-2×109cfu/ml)和代谢产物。
微生物抑藻剂Algaelat具有易储存、运输、体积稳定、不可压缩使其在水中表现出杀藻活性的优点。
具体实施方式
下面结合实施例进一步详细说明本发明，但不应理解为是对本发明的限制。
实施例1 杀藻菌侧孢芽孢杆菌的培养
将50-100ml NBY培养基(pH7.0)在120℃、0.8个大气压下灭菌30min后，置于750ml无菌细口瓶，冷却至20℃。侧孢芽孢杆菌接种于培养基后30℃、250rpm/min培养16h，获培养物5-10ml。镜检确保无污染，培养产物浓度通过琼脂培养基检查，细胞数目应达到109cfu/ml。
实施例2 微藻培养
对有无固氮能力的微藻均适用。固氮微藻菌株采用Anabaena sp.5781(来自列宁格勒州立大学)和Nostoc sp.A-10(来自IMET菌种保藏中心)。微囊藻Microcystis aeruginosa 562和905菌株购于中科院水生生物研究所(中国武汉)。Anabaena和Nostoc用改良培养基BG-11培养，M.aeruginosa 562和905则用B-12培养基培养。微藻在加有100ml培养基的250ml细口瓶中培养，培养条件：20℃密闭培养、连续光照2周。LBU-30白日光灯提供40μmolm-2s-1PAR的光照。
实施例3 抑藻剂的制备
按照实施例1培养后的侧孢芽孢杆菌发酵液与膨胀珍珠岩颗粒(质量比为25％)混合后在40℃干燥16h。所得粉末在室温储存于密闭容器中，以防吸湿。
实施例4 实验室条件下测定Algaelat的杀藻活力
Algaelat加入到Nostoc、Anabaena或Microcystis的培养物中，室温96h内测定其杀藻活力。Algaelat与培养物比例为1∶5。杀藻活力由残留培养混合物在590nm下吸光度值计算得到：
(ODR)＝(ODT/OD0)×100
OD0：起始时刻的吸光度值；ODT：培养T小时后的吸光度值
由于微藻会产生一些色素(叶绿素、类胡萝卜素、青色素)，杀藻活力也可根据培养混合物颜色的变化来评价。培养混合物褪色表明微藻溶解。微藻溶解也可通过显微镜确认。
表1 实验室条件下Algaelat对不同藻类的杀藻活力
实施例5 检测Algaelat对天然水库中微藻的杀藻活力
样品采自俄罗斯(萨拉托夫和莫斯科)和中国(云南省滇池)的天然水库，水样含有各种类型的藻类微生物。显微镜观察发现，水样含有丝状藻类(念珠藻、鱼腥藻)、单细胞藻类(微囊藻)及其他微藻类。未对这些微藻分类鉴定。在标准试管中，将这些微藻和Algaelat共培养96h后，出现颜色变化。在光学显微镜下发现微藻细胞溶解。在对照组中(未添加Algaelat或仅添加珍珠岩颗粒)未出现颜色变化，即水样保持蓝绿色，光学显微镜观察也未发现微藻细胞溶解。Algaelat是一种含有细菌培养物的珍珠岩颗粒，以1∶5的比例加入到 含有水样的测试管中。在96h培养过程中，培养混合物颜色由浅黄绿色逐渐褪色。在显微镜下观察到微藻细胞的溶解。
表2 Algaelat对天然水样的杀藻活力
a残留吸光度：不同样品中微藻与Algaelat共培养96h测定，与对照组光密度的百分比。
b样品1和2采自滇池不同区域，其中丝状藻类和单细胞藻类的组成和比例不同。
实施例6 生物膜的制备——实验室条件下微藻的三维结构
实验室条件下，样品2中的念珠藻、鱼腥藻和微囊藻在培养瓶中生长两个月，然后将液态样品中浮游微藻转移到培养皿中，于20℃全光照培养4周，直到生物膜形成。
莫斯科、萨拉托夫地区(俄罗斯)和云南滇池(中国)的水样中各种微藻以相同方式形成生物膜。
实施例7 检测Algaelat对微藻生物膜的影响
实施例6中念珠藻、鱼腥藻和微囊藻，无论单独培养还是联合培养形成的生物膜，Algaelat对它们都有影响。
在实验室条件下培养或直接来自天然水样的蓝藻(念珠藻、鱼腥藻和微囊藻)，单独培养或联合培养均可形成生物膜，将Algaelat添加到这些生物膜表面。
Algaelat按扩散到生物膜表面约1∶5的剂量添加到不同微藻生物膜上。
对照组中，以同样方式将等量的仅含有珍珠岩颗粒添加到生物膜上。
在96h培养过程中，处理组出现生物膜颜色变化，初始为浅黄绿色，然后逐渐褪色。在显微镜下观察，发现微藻细胞溶解。对照组中微藻颜色未变化，生物膜保持蓝绿色，镜检发现细胞未溶解。
生物膜是在试管中培养或直接来自天然水样的各种类型的微藻形成的三维结构，以上实验验证了Algaelat对生物膜的破坏性。
Claims (4)
1.一种可抑制水中游离或成膜微藻的微生物抑藻剂，由侧孢芽孢杆菌发酵液与载体膨胀珍珠岩颗粒混合吸附后组成。
2.如权利要求1所述的微生物抑藻剂，其特征在于侧孢芽孢杆菌发酵液与载体膨胀珍珠岩颗粒按照质量比4∶1的比例混合，干燥后质量比为3∶2。
3.如权利要求1所述的微生物抑藻剂的制备方法，其步骤如下：
1)将50-100ml NBY培养基(pH7.0)在120℃、0.8个大气压下灭菌30min后，置于750ml无菌细口瓶，冷却至20℃；侧孢芽孢杆菌接种于培养基后30℃、250rpm/min培养16h，获培养物5-10ml；镜检确保无污染，培养产物浓度通过琼脂培养基检查，细胞数目应达到109cfu/ml；
2)前述培养后的侧孢芽孢杆菌发酵液与膨胀珍珠岩颗粒(质量比为25％)混合后在40℃干燥16h，所得粉末在室温储存于密闭容器中，以防吸湿。
4.如权利要求1所述的微生物抑藻剂，其用于抑制浮游状的蓝绿藻(蓝细菌)中的念珠藻、鱼腥藻和微囊藻的用途。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |