CN101506371A - 制备金属纳米颗粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过将金属或金属化合物与细菌接触制备含有金属(包括银、金、锌、汞、铜、钯、铂或铋)胶体纳米颗粒的组合物的方法。本发明的一个实施方式包含将益生菌与含有至少4mM银或金盐的水溶液孵育的步骤。所得到的含纳米银的组合物，例如浸渍到载体上时，可用作高效抗微生物剂、灭藻剂或除草剂。

Description

制备金属纳米颗粒的方法
发明领域
本发明涉及在细菌膜上制备胶体金属化合物。本发明也涉及通过生物过程制备银或金纳米颗粒的方法。具体的，本发明涉及使用益生菌，如乳杆菌(Lactobacillus)，在特定条件下产生金属纳米沉淀，尤其是银或金纳米颗粒以提高其抗微生物效率。本发明还涉及一种包含载体的消毒产品，该载体是用含有所述方法制备的胶体纳米银或纳米金的组合物浸渍的。
发明背景
在处理大量包含微生物的污染材料，如水，特别是家庭或工业循环水，以及污水(如在食品加工业产生的污水)过程中需要有效的消毒过程，因为卫生、操作或环境原因，这些污水在未处理前不能排放或重复利用。在处理例如建筑物、设备、容器、空调系统的表面时也需要有效的消毒过程。与环境相容的消毒过程主要基于活性氧化合物，如过氧化氢或季铵化合物单体。
过氧化氢时一种具有杀菌特性的活性适当的温和抗菌剂。已知过氧化氢浓度为25mg/l时能抑制一些细菌的生长，然而，即便是在更高浓度的过氧化氢作用下，微生物计数的有效减少也需要数小时或者还需要紫外照射。而产生紫外线需要昂贵的设备和大量的电消耗。因此当对大量污染材料如水进行消毒时，例如污水处理厂处理污水并排放时，此类方法缺乏可行性和/或不经济。因此，本领域已尝试不同方法以克服这些劣势。
本领域已知银离子或基于银的化合物对于微生物具有高度毒性，因而对许多常见细菌种类包括大肠杆菌显示了强效抗菌作用。已显示银纳米颗粒和高度分支的两亲大分子的杂交体具有有效的抗微生物表面涂层。发现无毒的银元素水溶胶形式的银纳米颗粒的稳定水分散体对大肠杆菌具有强杀菌作用，50μg/cm3浓度能100％抑制细菌生长。发现银纳米颗粒可蓄积于细菌膜，以某种方式与细菌膜的某些结构元件发生作用，因此导致其结构变化、降解，最终引起细胞死亡。报道称，由于膜中过量的羧基和其它基团解离，在生物学pH值下细菌表面总体上带负电。已表明，因为包埋进膜碳基质的银纳米颗粒在基质内的运动和摩擦使其表面带电，因此静电力也许是纳米颗粒和细菌之间相互作用的原因。此外，银趋于具有更高的亲和力，与细菌膜及DNA中含磷和硫的化合物反应。第三种可能的作用模式是释放可能产生银纳米颗粒的杀菌效应的银离子。
已报道数种微生物，例如乳杆菌、真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)能将Ag(I)生物吸附到其细胞表面，并通过还原酶作用或电子穿梭醌或两者同时作用来还原成Ag(0)，从而对该离子进行解毒。
本领域已知一种包含大小范围1-100nm生物学稳定的银纳米颗粒，以及含有所述生物学稳定的纳米颗粒且浓度为1-6ppm的载体的无细胞毒性的抗微生物制剂。
也已知一种制备胶体银-生物分子复合物的方法，该方法包括：
-在单一溶液里提供生物分子、银盐和卤离子来源的混合物；以及
-以可见区波长的光照射该混合物，其中银盐和卤离子来源为水溶性的；生物分子、银盐、卤离子来源的含量可使照射步骤得到胶体银-生物分子复合物。
已公开一种制备纳米大小的胶体金属颗粒的方法，所述方法包括在15-40℃的温度范围内用金属离子的溶液处理湿的真菌或真菌提取物2-120小时，并分离生物物质以获取纳米尺寸的胶体金属颗粒。
常规制备银纳米颗粒的生产方法有很多劣势，如高生产成本、产生显著比例的副产品或存在获取纳米颗粒浓度的上限。例如，后一种生产方法需要很长的生产时间并利用有致病可能的真菌。因此本领域需要一种可靠、廉价并减少或避免副产品产生的制备银纳米颗粒的方法。
已研究过，乳杆菌的Ag(I)生物吸附过程、该过程在pH范围2-6中的pH依赖性、在温度范围10-60℃中的温度依赖性、以及乳杆菌将Ag+还原为Ag0的机制。
本领域还已知一种通过生物还原制备银纳米颗粒的方法，即利用气单胞菌(Aeromonassp.)与银离子、氨及氢氧化钠混和，60℃反应数小时。
上述方法的缺陷是需要高温、酸性pH和/或长孵育时间，或由其产生的银纳米颗粒的杀菌活性不足。
因此本领域需要通过不存在这些劣势的方法来制备银或金纳米颗粒。
本领域还需要简单、环境友好的、可重复的制备具有高抗微生物特性的银或金纳米颗粒的方法。
本领域还需要制备已知可用于某些医疗应用的金或银纳米颗粒的相应方法。
本领域还了解，除金或银之外的金属和所述金属的化合物的胶体形式具有有价值的特性和应用。例如，胶体次枸橼酸铋为水溶性，尤其在pH范围为3-8时，几十年来，它与抗生素联合用于治疗胃和十二指肠溃疡和幽门螺杆菌感染。外用胶体形式的汞、无机汞化合物和金属汞油膏剂具有各种治疗应用，包括治疗感染性湿疹或脓疱病(汞盐)、治疗梅毒(甘汞)、治疗牛皮癣(氧化汞或氨化汞)。使用钯和铂的胶体形式催化多种化学反应，包括有机还原和氢解等。胶体形式的铂纳米颗粒也用作抗癌药。任选与水杨酸螯合的胶体铜是强效消炎剂，并且已知胶体铜或胶体锌的舌下(给药)形式可对抗感冒和流感。此外，胶体锌在抗病毒方面尤其有效。在所有这些不同的领域，长期需要提供不同形式的胶体金属或胶体金属化合物，用以提高其在相关应用领域的功效。
发明概述
广义上讲，本发明涉及使用细菌在细菌膜上制备胶体金属化合物，和包被的细菌作为抗微生物剂的后续应用。具体来说本发明涉及：
·通过在受控pH下将所述细菌与金属盐或其它盐的混合物接触，在细菌膜上制备胶体金属化合物，以便使用细菌制备胶体金属化合物，和
·使用上述膜上包被金属化合物的细菌作为抗微生物剂。
在一个实施方式中，本发明涉及利用益生菌和其它细菌制备金属纳米沉淀，所述金属纳米沉淀可用作饮用水、表面涂料和其它材料的抗微生物剂。
更具体来说，一些细菌能够将Ag(I)盐还原为沉淀于细胞表面形成纳米Ag颗粒的胶体Ag(0)。胶体银或其它金属纳米沉淀包被的生物物质易于通过过滤或离心从水相收集，并可进行冲洗、漂洗和其它处理，且在(稀释的)悬液中或加工为涂料时形成具有强抗微生物特性的胶体产物。
有趣的是，多种益生菌，即工业生产的、当出现于人消化道时有益人体健康的细菌，显示了其在细胞表面产生Ag纳米沉淀的能力。此类细菌包括但不限于：益生型发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)菌株。
通过在浓缩细菌细胞培养物中加入特定盐的组合(AgNO3、NH4Cl、NaOH等)并控制pH，形成具有强抗微生物特性的胶体银产物，将其它金属盐和某些细菌菌株组合得到具有类似特性的纳米沉淀，这也是本发明的一部分。
通过调节“银物质”和“生物细胞物质”比例(Ag:CDW，其中CDW＝细胞干重)，最终胶体银产物的反应性和特性可能不同，这涉及胶体粒度、胶体颗粒分布和其它特性。
细菌表面产生的胶体银化合物具有很广泛的应用，包括但不限于：水消毒、用作清洁产品中的消毒剂、用作清洁剂、配制成抗微生物涂料、医疗应用、人消费品，用于纺织品、油膏剂和润滑剂，用作催化剂等。
生产过程简单明了、成本经济、产量高、易于规模化，颗粒的尺寸和分布可控，所产纳米银在极低(ppb)浓度下的抗微生物活性优于其它胶体银产品。而且，该产物可加工成不同形式：干燥形式、悬浮形式或“湿的”团块，可配制成不同的应用。因为可用纯水漂洗而不丧失活性，所以最终产物中不出现化学试剂残留。
使用益生菌开创了保健和食品工业中的许多应用。包被Ag的细菌产品尤其适合下列应用：
●配制成消毒清洁产品(医院、实验室、动物生产场地等)
●用于水消毒的陶瓷过滤器及其它过滤器，包括饮用水、游泳池水、动物生产用水、水产业饲养用水等
●用于消毒涂料：聚合物、纺织纤维和金属
●适合配制成消毒皮肤的油膏剂、润滑剂
●用于饮用水的消毒：发展中国家、背包族、飞机和许多其它方面(简易方法)(easy-drop method)，以及
●对抗病原体：军团菌(Legionella)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、肝炎病毒(Hepatitis)、疱疹病毒(Herpes)、假单胞菌(Pseudomonas)、葡萄球菌(Staphylococcus)，不同类型的细菌、真菌和病毒。
本发明的一个目的是提供高品质的金或银纳米颗粒。本发明的第一个方面是提供改进的制备包含胶体银或金纳米颗粒的组合物的生物学方法，，所述方法包括使用益生菌，尤其是乳杆菌种类，如发酵乳杆菌，并将所述生物物质与银(I)盐或金(III)盐的水溶液接触。本发明基于意想不到的发现：生物还原制备银或金纳米颗粒的某些具体程序参数极大影响生产效率和得到纳米颗粒的属性。具体来说本发明的特定方法极大影响所得含银纳米颗粒组合物的抗微生物活性。
本发明的另一方面是在这些具体条件下通过生物还原获得的银或金纳米颗粒组合物还可进行加工，如从生物物质中分离而保持甚至提高其活性或其它相关特性，如储存稳定性。此外，通过氧化物质如过氧化物或过氧酸盐对这些具体条件下通过生物还原获得的银或金纳米颗粒组合物进行后期化学处理甚至可以增强所得纳米颗粒组合物的特性。
本发明过程的还有一个优势是所得银或金纳米颗粒的尺寸和分布重复可控。
本发明的另一个优势是所述方法通过减少对具有潜在毒性和/或昂贵化学品的需求，在明显较短的时间内，以低成本和环境友好的方式，得到高度可信的结果。很大程度上本发明使用的生物物质来自于无害的微生物，如益生菌，因而本发明方法得到的组合物中无有害化学品残留。因此本发明的一个优势是该方法提供了一种组合物，该组合物在应用于真核有机体后，基本不影响此类有机体。在一个具体实施方式中，本发明提供了具有高抗微生物活性的组合物，该组合物同样可抗海洋病原体，而基本不影响真核有机体。本发明的另一个优势是，本发明可制备含高浓度纳米银或纳米金的组合物，所包含的纳米银或纳米金基本由其各自的金属态组成，例如，分别的，全部银成分中包含超过约95％的Ag0或全部金成分包含超过约95％的Au0。
本发明的另一优势是，所得产物或组合物可简单安全的加工并保持甚至提高其活性。组合物可被干燥，或保持为悬浮状态或湿的团块，可被制备成不同形式的制剂，如气溶胶制剂或浸渍到载体上，而因为纳米银颗粒的稳定性可不影响其抗微生物活性。
在又一实施方式中，本发明涉及使用按照上述方法制备的胶体银组合物作为灭藻剂或除草剂。
定义
根据本发明目的，本文所用术语“纳米银”或“纳米Ag”指金属银(Ag0)的纳米颗粒。本发明的含义之内，所述纳米颗粒可以或可以不沉积于生物物质上。这些纳米颗粒尺寸范围为约0.1nm-约100nm，例如范围为约0.5nm-约5nm。这些纳米颗粒大小在其平均尺寸附近分布。
根据本发明目的，本文所用术语“纳米金”或“纳米-Au”指金属金(Au0)的纳米颗粒。本发明的含义之内，所述纳米颗粒可以或可以不沉淀于生物物质上。这些纳米颗粒尺寸范围为约0.1nm-约100nm，例如范围为约0.5nm-约5nm。
根据本发明目的，本文所用术语“生物物质”指包含或起源于用于制备“纳米银”或“纳米金”的细菌种类的有机材料。
根据本发明目的，本文所用术语“益生菌”指细菌，该细菌在给予足够量到宿主如哺乳动物、海洋动物(如鱼)或人时，能够对所述宿主健康产生有益效应。
根据本发明目的，本文所用术语“银(I)”或“Ag(I)”指单价带正电的银离子或Ag+。
根据本发明目的，本文所用术语“金(I)”或“金(III)”分别指单价和三价带正电金离子。
附图简要说明
图1显示根据本发明实施方式利用不同浓度纳米银颗粒处理对总细胞计数和大肠杆菌存活的抗微生物效应。
图2显示根据本发明实施方式纳米银颗粒的X-射线衍射分析图。
图3显示根据本发明实施方式在制备纳米银颗粒的过程中银与细胞干重比例对所述颗粒对抗鼠伤寒沙门菌(Salmonellaty phimurium)的抗菌活性的影响。
图4显示根据本发明的另一实施方式纳米银颗粒的X-射线衍射分析图。
发明详述
本发明的第一个方面是提供一种制备包含胶体纳米银或纳米金的组合物的简单方法，该方法包括将益生菌与包含至少4mM银或金盐的水溶液一起孵育的步骤。
根据本发明，合适的益生菌包括但不限于乳杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌、肠球菌、酵母和杆菌。益生菌可属于但不限于下述种：清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，乳酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)，卷曲乳杆菌(Lactobacillus cripatus)，保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillusdelbrueckii subspecies bulgaricus)，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，格氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)，约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)，婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)，长双岐杆菌(Bifidobacterium longum)，乳酸双岐杆菌(Bifidobacterium lactis)，青春双岐杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)，大肠杆菌(Escherichia coli)Nissle，酵母益生菌(Saccharomycesboulardii)，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，屎肠球菌(Enterococcusfaecium)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，嗜酸芽孢杆菌(Bacillus acidophilus)，矮小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，多发酵芽孢杆菌(Bacillus polyfermenticus)，克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)，侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)，腐败杆菌(Bacillussporogenes)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulas)和多粘杆菌(Bacillus polymyxa)。
根据本发明方法不同实施方式的目的，可使用任意水溶性银盐。本文所用术语“银盐”也包含此类银盐的水合物和其它溶剂合物。通常，本文所定义的水溶性银盐是指，在本发明方法操作的温度下，如室温下，水溶性至少为0.1g/L的银盐。所述银盐包括但不限于无机银盐或有机银盐，如但不限于醋酸银、氯化银、高氯酸银、氯酸银、溴化银、氟化银、乳酸银、硝酸银、硫酸银或酒石酸银。
根据本发明不同实施方式的目的，可使用任意水溶性金盐。本文所用术语“金盐”也包含此类金盐的水合物和其它溶剂合物。通常，本文所定义的水溶性金盐是指，在本发明方法操作的温度下，如室温下，水溶性至少为0.1g/L的金盐。金盐不限于单价或三价。金盐不限于无机金盐或有机金盐或金盐混合物可以是，例如但不限于氯化金(III)、一水合硫代苹果酸金钠、溴化金(III)、碘化金(III)和硝酸金(III)。
根据本发明的一个实施方式，将与之孵育的银或金盐在水溶液中的起始浓度应该为至少4mM，例如至少10mM，或如一个具体的例子至少为50mM。
根据本发明的另一实施方式，所述水溶液还可包括其它易影响行为的组分，这些行为尤其是提高所得组合物特性。出于此，在本发明中需要纳米银的一种实施方式中，该方法可包括将益生菌(如本文前述定义)与含有至少4mM银盐的水溶液孵育的步骤，该水溶液还可包括氨或铵盐。适合此实施方式的铵盐例如但不限于氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵、碳酸铵、甲酸铵和溴化铵。本发明此实施方式中使用的氨和/或铵盐的量优选足以形成大量的银-氨或银-铵复合物，例如但不限于形如Ag(NH2)+和/或{Ag(NH3)2}+的银(I)-氨复合物。根据本发明此实施方式的一个变体，与其孵育的水溶液还可包含合适量的碱金属氢氧化物，例如但不限于氢氧化钠或氢氧化钾。此类合适量可定义为达到合适的pH范围，如下文所释。
根据本发明的另一实施方式，所述方法包括将益生菌(如本文前述定义)与含至少4mM金盐的水溶液孵育的步骤，该水溶液还可包含合适量的碱金属氢氧化物，例如但不限于在不存在氨和/或铵盐时的氢氧化钠或氢氧化钾。
合适的碱金属氢氧化物例如但不限于氢氧化钠或氢氧化钾，可被加入孵育水溶液中，到浓度高至约1M。优选的，在pH至少为8的条件下进行孵育，例如在约8-约12的范围，或在一个更特定的实施方式中范围从约8.5-约11。
根据本发明的一个实施方式，银或金的重量与益生菌细胞干重(下文缩写为CDW)的比例至少约为0.01，例如至少约为0.05或至少约为0.1。根据本发明的另一实施方式，Ag:CDW或Au/CDW重量比不超过约20，优选低于10，例如低于5。
根据本发明的一个实施方式，所述方法的孵育步骤在约5℃-约45℃的条件下进行，优选约15℃-约35℃，例如室温。
作为本发明的另一实施方式，该方法的孵育步骤可在约1秒-30分钟的时间范围内进行，例如约5秒-约20分钟。熟练技术人员可利用有限实验测定孵育的最佳时间，这取决于其它方法参数，例如但不限于，银或金盐浓度、孵育温度、Ag:CDW或Au/CDW重量比、氨或铵盐出现与否等。如本领域所公知，至少在部分培养时间在搅动条件下进行孵育。
本发明的方法还包括进一步处理所得到的含胶体银或金纳米颗粒的组合物的步骤。所述进一步处理可包括一个或多个步骤，例如但不限于，从银或金纳米颗粒中去除至少部分生物物质，或通过机械的、酶学的和/或理化处理如超声的方法将生物物质分离。任意此类去除或分离生物物质的方法为本领域熟练技术人员所知。另外或此外，所述加工还可包括化学处理步骤，该步骤用以稳定或提高所得含胶体银或金纳米颗粒组合物的某些所需特性。作为此类化学处理的一个具体实施方式，根据本发明所得的金或银纳米颗粒组合物可在孵育后处理，任选用过氧化物或过氧酸盐等氧化物质去除生物物质，以产生具有提高的稳定性和/或(与纳米银相比)更高抗微生物活性的银或金纳米颗粒沉淀。在本发明的实施方式范围内，合适的有机和无机过氧化物包括但不限于：过氧化氢，过氧乙酸等。可在本发明的此实施方式中使用的合适过氧酸盐包括但不限于：能够解离后形成过氧化氢的碱性水溶性盐，例如，当此类盐溶解于水时，释放过氧化物离子。合适的例子包括与阳离子如碱金属结合的过碳酸盐、过硼酸盐、过氧硅酸盐和过磷酸盐。尤其优选的是具有经验式2Na2CO3.3H2O2的过氧碳酸钠。为了支持本发明的该实施方式，熟练技术人员了解：
-在消毒能力上，此类过氧酸盐优于过氧化氢，
-过氧化氢是弱消毒剂并对细菌渗透力差，并且
-当过氧酸盐溶于水并释放出过氧化氢时，碱金属从释放的过氧化氢夺取一个质子形成氢过氧化物离子，与过氧化氢相比，该过氧化物离子是强消毒剂并易于渗透进入细菌。
在本发明过程的任意时间，利用任意本领域熟练技术人员所知方法可将含胶体纳米银或纳米金的固体成分与液体成分分离。例如，可通过离心后倾析或通过过滤从液体组分中分离。
在本发明的方法中，通过小心调整一个或多个反应操作条件，例如但不限于pH、孵育温度、盐类型和盐浓度将至少部分金或银盐替换为铜盐。在本发明的方法中，通过小心调整一个或多个反应操作条件，例如但不限于pH、孵育温度、盐类型和(金或银)盐浓度将至少部分益生菌种替换为备选微生物或细菌。此类备选细菌可选自一般认为对环境安全的细菌，更具体是那些已知具有生物还原能力的细菌。
尽管本发明的方法在本文中主要参照银或金加以描述，但并不限制其以最广义的表述应用于其它金属或金属化合物，只要对一个或多个反应操作条件，例如但不限于pH、孵育温度、盐类型和盐浓度，作适当改变。此类改变是熟练技术人员的常规实验范围内，假定常规教导被纳入本文。本发明范围内的尤其感兴趣的的金属包括锌、汞、铜、钯、铂和铋。
基于意想不到的发现：在抗微生物处理中此类纳米银组合物的有效浓度极低，取决于靶细菌，如约0.5ppm或更低，例如0.05ppm或更低，以及另一发现：在有限时间内，如在不多于5小时内观察到不良细菌量的大量减少，本发明的第二个方面是上述方法制备的纳米银组合物的抗微生物用途。本发明此方面的合适细菌靶点包括多数革兰阳性和革兰阴性菌，例如但不限于，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(如CMCM-2-22菌株)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(如ATCC-10031菌株)、大肠杆菌(Eschericia coli)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)(如ATCC-10541菌株)、科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(如IP52154或ATCC-6538菌株)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC-19659菌株)(均为常见医院细菌菌株)、屎肠球菌(Enterococcus facium)、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)、氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)(如ATCC 13661菌株)、乳酸杆菌(Lactobacilli)、嗜热芽孢杆菌(Thermophilic bacilli)、指间发癣菌(Trychophyton interdigitale)(如ATCC-640菌株)、梭状芽孢杆菌(Clostridiumsporogenes)(ATCC-3584菌株)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)(ATCC-13124菌株)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等。本发明的纳米银组合物还具有对抗真菌的活性，包括例如白色念珠菌(Candida albicans)(如APCC-2091菌株)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)(如IP7326菌株)，黑曲霉(Aspergillus niger)(如218IP菌株)、疣孢青霉菌(Penicilliumverrucosum)等，也可具有抗寄生虫活性，对抗如埃及血吸虫(Schistosomahaematobium)和曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)等。
根据本发明的一个特定实施方式，所述抗微生物(或抗真菌或抗寄生虫或抗病毒)用途可以为液体消毒组合物的形式，其中上述方法所产生的纳米银组合物可与第二抗微生物剂或此类试剂混合物组合。第二抗微生物剂的合适例子包括但不限于：过氧化氢、季铵盐、过氧乙酸和过氧酸盐(后者在本文中的本发明第一个方面已经叙述)，及其任意已知比例的混合物。具体说，所述组合可提供抗微生物活性的协同效应。在一个具体实施方式中，所述第二抗微生物剂可为氧化抗微生物剂，例如但不限于，二氧化氯、一氯胺、次氯酸盐、高锰酸钾、碘或氯。根据本发明的该实施方式，液体消毒组合物还可包含一种或多种稳定剂，如磷酸、硝酸、硫酸、氢溴酸或硼酸或其混合物，即为了调整组合物的pH处于适合处理和使用的范围。在无机酸稳定剂中尤其优选磷酸。实践中，所述酸稳定剂通常已经以合适量掺入到市售过氧化氢级别中。本发明任选使用的稳定剂还可为有机羧酸，如酒石酸、柠檬酸(或其水合物)、苯甲酸、皮考啉酸、烟碱酸和异烟碱酸。出于同样目的也考虑使用有机酸和无机酸的混合物。当出现时，所述稳定剂的量优选能有效调整液体消毒组合物的pH和/或长期储存稳定性。本发明的这些消毒液体组合物还可包含至少一种选自：表面活性剂、防腐剂或香料(香水)的成分。
适合用于本发明消毒组合物的表面活性剂包括，例如但不限于阳离子型、非离子型、兼性的、或两性离子表面活性化合物，优选在相关浓度适合接触食品或饮用水的那些化合物及此类化合物的混合物。本文潜在使用的是多种非离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性例子包括，例如，选自聚乙氧基化和/或聚丙氧基化的二醇、C8-C20脂肪酸单酯、失水山梨醇单棕榈酸酯等。合适的兼性表面活性剂的具体例子包括3-十二烷基氨基丙酸钠、3-十二烷基氨基丙磺酸钠、N-烷基牛磺酸和甜菜碱。
获自本发明方法的含纳米银的消毒组合物可在生物基质中稳定，可直接或按照上文所述进一步处理后，用于处理、清洁或消除环境污染。例如纳米银颗粒可分散于必须通过任意合适方法或应用方法去除细菌的地点或其附近。组合物中的纳米银组分可与细菌细胞组分相互作用，从而能有效破坏它们并减少细菌总细胞数至可接受水平。
使用如上述含纳米银的液体组合物可进行固体表面或一定体积的气体或液体的清洁、去污染、消毒或灭菌。当所述本发明液体组合物用于消毒或灭菌组合物时(如分散进入液体或气体中)，常常在合适条件下，包括浓度和应用时间进行应用，本领域熟练技术人员通过灭菌和消毒的标准知识易于确定这些条件。
当在固体表面上应用本发明包含纳米银的消毒液体组合物时，为安全规范起见优选使用即用型稀释配方，该配方通过下述方法获得：将合适量的浓缩组合物与水混和，然后用所获稀释制剂润湿所述固体表面直至固体表面全部变湿(如熟练技术人员所知，取决于表面的孔隙度)。
本领域熟练技术人员将知道，根据固体表面出现的或要处理液体和气体中出现的微生物类型和量的不同，包含纳米银的消毒液体组合物的优选使用量也很大程度不同。
根据本发明上述内容使用包含纳米银的液体组合物作为消毒剂时，更特别推荐下述应用：
-将要处理的产品浸入所述包含纳米银的组合物中，
-将消毒组合物喷雾至要处理的固体表面，及
-将消毒组合物(稀释的或浓缩的)掺入到要处理的水中(尤其是游泳池水、工业处理水、废水等)。
因此，根据本发明的包含纳米银的消毒液体组合物尤其可用于：
(a)医院和实验室场所、工业场所(如牛奶厂，奶酪厂，麦芽作坊，酿酒厂，矿物水、酒、酒精、水果和蔬菜汁的生产场所，温室，牛棚，鸡舍和马厩)；食品、饮料和制药包装生产线、飞机和船的内部)以及所述场所的内容物，尤其时所述场所的设备和仪器的消毒和卫生；
(b)无菌外壳的消毒如未成熟动物或无菌动物生长的培养箱；
(c)空调系统中军团菌的处理；
(d)储存容器(尤其是筒仓)和传送液体或固体产品如食品(糖、茶、咖啡、谷物、饮料)和动物饲料的管线的消毒和卫生；
(e)游泳池和其它淋浴设备的消毒和卫生，这时优选无表面活性剂的组合物；
(f)饮用水的生产、运送和储存系统(例如井或者储存容器)的消毒，这时优选无表面活性剂的组合物；及
(g)保护户外作物(如谷物、番茄、香蕉园、溶液培养物如苣荬菜、种子和块茎等)不受细菌、真菌、病毒和寄生虫的伤害。
除了广泛的工业应用外，本发明方法获取的选择性的高抗微生物活性也具有广泛的家庭用途，例如但不限于水消毒、水中除藻、清洁产品及抗微生物涂层涂料制剂，如用于医疗用途或处理人用或动物用的营养或其它材料(特别因为对于真核细胞或有机体没有影响或影响极小)，用于纺织产品的抗微生物保护，用于防止暴露组织发生感染或微生物污染的外用医疗制剂中，例如，但不限于，乳膏剂、油膏剂或洗剂，或用作化学或其它转化过程的催化剂。通过纳米银悬浮物将纳米银掺入聚合物和/或其它类型涂料中实现上述各种应用。
本发明的第三个方面涉及用益生菌和其它细菌制备金属纳米沉淀，令人惊讶的是，该金属纳米沉淀可作为灭藻剂(抗小球藻(Chlorella vulgaris)，但不限于此)，用于饮用水、鱼池或池塘或游泳池水，淡水或咸水水库，聚合物和油漆，表面涂料和其它需要保护的材料，防止软垢(美观方面)或硬垢(材料退化)。本发明的第四个方面涉及用益生菌和其它细菌制备金属纳米沉淀，令人惊讶的是，该金属纳米沉淀可作为除草剂对抗双子叶或单子叶植物或对抗不同类型的低等植物，如苔藓，可稀释在水中或进一步用机械、酶学和/或物理化学的方法处理。据此目的对相关植物进行的选择并非本发明的关键参数。以此目的的合适植物包括双子叶植物如烟草(Nicotianatabacum)、鸭子草(Lamna sp.)、大豆(Glycine max)、苹果、甜菜、拟南芥、苜蓿、矮牵牛花、棉花、胡萝卜、芹菜、甘蓝、黄瓜、胡椒、卡诺拉(canola)、番茄、马铃薯、扁豆、亚麻、椰菜、大豆、莴苣、油菜、花椰菜、菠菜、抱子甘蓝、菊芋、豌豆、黄秋葵、南瓜、羽衣甘蓝、茶树、咖啡和卷柏(Selaginella lepidophylla)。也可包括单子叶植物，如水稻(rice Oryza sativa)、玉米、大麦、玉蜀黍、向日葵(Helianthus annuus)、小麦、燕麦、粟、高粱、苋菜、洋葱、芦笋和甘蔗。
本发明的上述方面在如下领域尤其有用：
-在以下系统中抑制藻类的生长：鱼池水、动物和人饮用水分布系统、园艺水分布系统、池塘、游泳池、池塘或游泳池的水处理过滤系统、或不同类型洒水系统；
-抑制表面，包括与水接触的表面，如船体的藻类生长；
-用于处理表面防止水藻，包括防止类似植物的高等生物体表面的藻类生长的油漆、聚合物和涂料；
-抑制苔藓或其它不良植物的生长，包括双子叶和单子叶植物，具体是将叶、茎或根系统暴露于胶体银，例如根据上述生产方法由益生菌生产并沉淀其上的胶体银；以及
-通过涂布或其它方式将这些表面暴露于胶体银抑制某些植物或杂草在表面上的生长，所述胶体银包括例如，根据上述生产方法由细菌生产并沉淀其上的胶体银。
下列实施例用以说明本发明方法和消毒组合物的某些实施方式，但不作任何限制。
实施例1--纳米银的制备
发酵乳酸杆菌Beijerinck1901AL(ATCC 11976，LMG 8900，来自8天大母乳喂养婴儿的肠道)培养物在MRS肉汤(购自英国贝辛斯托克的奥科斯得(Oxoid，Basingstoke，United Kingdom))中微好氧性条件下37℃培养15小时。3,000g15℃离心10分钟从MRS中收集细胞，用milliQ水洗涤两次，然后重悬于milliQ水中使其最终光密度在600nm(OD600)为1.5。将1N氢氧化钠母液中加入到细胞悬液中，如终浓度分别为0.05N NaOH和0.10N NaOH。
在50mL milliQ水中制备425mg AgNO3和225mg NH4Cl的Ag(I)母液。将1体积的这种Ag(I)母液分别加入到含0.05和0.10N NaOH的10体积细胞悬液中。25℃将这些混合物在可见光下孵育，温和搅拌(搅拌器上每分钟100转)30分钟。获得5.0mM Ag(0)(535mg Ag(0)/L)沉积于发酵乳杆菌生物物质上的最终溶液，本文称作“纳米银”或“纳米-Ag”。将包被的发酵乳杆菌细胞离心，通过重复离心、倾析并将组合物重悬于新鲜milliQ水用milliQ水洗涤三次去除生长培养基残留和其它添加剂。然后调整最终的纳米Ag浓度。然后根据需要用milliQ水稀释组合物或将其3,000g离心浓缩后重悬于milliQ水中。
实施例2-纳米银XRD分析
将实施例1中所得具有银颗粒的生物物质进一步30℃干燥后，用配备布拉格-布伦特(Bragg-Brentano)光学系统的西门子D5000衍射仪(购自西门子公司，德国慕尼黑市)进行X-射线衍射(XRD)。X-射线由功率为1.6kW(40kV，40mA)的铜X-射线管产生。在25-90度2θ之间进行测量，“tep时间”(tep time)为1.6秒，以0.02度大小步进。所得光谱(未显示)表明了金属银和氧化钠X-射线衍射图样的存在。后者是制备纳米银所使用的氢氧化钠残余。
实施例3-纳米银的EDX分析
将实施例1中所得具有纳米银的干燥生物物质进一步30℃干燥后，用配备对应入射能量20.0keV分辨率的EDX检测器的JSM6100扫描电子显微镜(购自美国焦耳公司(JEOL USA，Inc.))进行能量散射X-射线(EDX)分析。分析结果如表1所示(同时表示为质量％和原子％)，清晰表明主要存在有机物质(因为碳和氧的含量高)和银，其组合总计占干物质重量的91％。剩余干燥物质由痕量元素Ca、Mg、Si、P、S和Cl组成，主要是因为干燥生物基质中的矿物质残余。
表1
 
元素 重量％ 原子％
 
C 55.90±0.28 69.18±0.16
O 26.21±0.08 24.35±0.15
Na 4.97±0.02 3.21±0.00
Mg 0.85±0.06 0.52±0.04
Si 0.19±0.06 0.10±0.03
P 1.64±0.04 0.79±0.02
S 0.22±0.01 0.11±0.01
Cl 0.31±0.03 0.13±0.014
Ag 8.51±0.20 1.17±0.03
Ca 1.22±0.18 0.45±0.07
实施例4-纳米银在大肠杆菌固体生长培养基上的抗微生物活性
形式为实施例1中获得的沉积于发酵乳杆菌生物物质的纳米银的100mL Ag浓度为5mM的银悬液，铺板于固化生长培养基上以培养大肠杆菌(路越-贝尔塔尼(Luria Bertani)琼脂)。作为对照，100mL 0.1N NaOH无菌milliQ水溶液配制的5mM AgNO3铺板于相同的生长培养基上。该设置等同于每块琼脂平板含总量为0.05mg Ag，或11mg Ag/m2总表面积。以两倍的后一浓度重复该实验，即每块琼脂平板0.11mg Ag，或22mg Ag/m2总表面积。
通过将这些银悬液铺板，将均匀的Ag(I)NO3或纳米Ag层施涂于固化生长培养基上。
在照此预处理固化生长培养基后，将100μL生理溶液(8.5g NaCl/L无菌水)配制的2 x 106CFU/mL大肠杆菌悬液铺板于预处理的琼脂板上。然后将平板在30℃孵育24小时并计数菌落。计数结果如图1所示。当纳米Ag浓度为11mg Ag/m2和22mg Ag/m2时，在处理的固体生长培养基上未检测到存活的大肠杆菌细胞(<检测限(detection limit)(D.L.)＝1 x 101CFU/ml)。因此这些浓度的纳米Ag处理导致大肠杆菌细胞从2 x 106CFU/ml减少至少于1 x 101CFU/ml(D.L.)。当Ag(I)NO3浓度为11mg Ag/m2和22mg Ag/m2时，大肠杆菌细胞分别从2 x 106CFU/ml明显减少至4 x 102CFU/ml和1 x 102CFU/ml。
作为对照，浓度为2 x 106CFU/mL的大肠杆菌悬液铺板于未处理，即不含Ag的生长培养基上，并铺板于用100μL仅含发酵乳杆菌ATCC 11976的无菌mQ水处理的同样生长培养基上，其浓度与纳米银处理相同，但不含纳米Ag。未观察到对这些细菌的总体计数的抑制作用。因此，观察到的纳米Ag和Ag(I)抑制作用可归因于Ag处理，而并非处理步骤或实验中所使用的乳杆菌菌株。
实施例5-悬液中对不同病原菌的抗微生物活件
检测含不同浓度(0mg/L、0.10mg/L、1.0mg/L、10mg/L和50mg/L)实施例1中获得的纳米Ag组合物的生理溶液中稀释的致病性大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)培养物的存活。将纳米Ag应用于含一种上述致病细菌的活培养物的生理溶液中。1升水中溶解8.5g NaCl得到的生理溶液与细菌细胞等渗，因此不会因为渗透压杀死细胞。对照处理包括由不含纳米Ag的生理溶液配制的细菌培养物。
制备mQ水中100mg纳米Ag/L的母液，并加入到生理溶液稀释的细菌培养物使其最终纳米Ag浓度如表2所示。
每一上述致病菌种均进行独立的重复处理，“细菌培养物”表示稀释的含指数期生长细菌的液体肉汤，用生理溶液稀释至细胞终浓度为104-105CFU/ml。每一处理以一式两份进行。所有的孵育均在无菌带盖的试管里进行，37℃下震荡培养72小时。孵育后，从每一试管中取100μL铺板于胰酪胨大豆琼脂(TSA)固体生长培养基上并计数菌落。对于不同测试病原体的计数结果如表2所示。
表2
Figure A200780025198D00201
表2显示获自实施例1浓度为1mg/L的纳米Ag在72小时内足以将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门菌的细胞浓度减少至<10CFU/mL(即低于检测限)。在浓度为0.10mg/L已经观察到显著的细胞死亡。至于李斯特菌，10mg/L纳米Ag使活细胞浓度降至检测限下。因此我们得出结论：从实施例1中获得的纳米Ag，在液体细胞悬液的浓度为1.0mg/L或更低时，作为强效抗微生物剂能够显著有效减少液体中的存活病原菌。
实施例6—悬液中纳米Ag与旧金山湾卤虫(Artemia franciscana)联用 的抗微生物活性
通过高压灭菌用milliQ水制备无菌人工海水(Instant OceanR，获自美国水族系统(Aquarium Systems USA))。所有处理在分装有20mL无菌人工海水的50mL Falcon试管中进行。每一处理(一式三份进行操作)含有20mL人工海水配制的20只卤虫无节幼体，其中添加105CFU/mL(菌落形成单位)坎氏弧菌(Vibrio campbellii)LMG21363和/或获自实施例1的纳米Ag，终浓度如表3所示。将致病菌坎氏弧菌与其宿主有机体旧金山湾卤虫一起孵育。
设定如下测试：
-旧金山湾卤虫+105CFU/ml坎氏弧菌
-旧金山湾卤虫+105CFU/ml坎氏弧菌+100mg纳米Ag/L
-旧金山湾卤虫+105CFU/ml坎氏弧菌+10mg纳米Ag/L
-旧金山湾卤虫+105CFU/ml坎氏弧菌+1.0mg纳米Ag/L
-旧金山湾卤虫+105CFU/ml坎氏弧菌+0.1mg纳米Ag/L
-旧金山湾卤虫+0.10mg纳米Ag/L
-旧金山湾卤虫+100mg纳米Ag/L
-旧金山湾卤虫+10mg纳米Ag/L
-旧金山湾卤虫+1.0mg纳米Ag/L，和
-旧金山湾卤虫+0.10mg纳米Ag/L
孵育48小时后，通过铺板于特定弧菌生长培养基测定含旧金山湾卤虫的灭菌人工海水中坎氏弧菌的浓度。下方表3显示了平均处理结果(其中D.L指检测限)。
表3
Figure A200780025198D0021171638QIETU
Figure A200780025198D0022171613QIETU
还值得注意的是与未处理对照相比，浓度为0.10和1.0mg/L纳米Ag对旧金山湾卤虫的存活率没有显著影响(80％)。这表明按照实施例1产生的纳米Ag在这些浓度下对高等有机体没有毒性或抑制作用。
实施例7-测定抗微生物活性的有效接触时间
该测试的目的是测定实施例1中纳米银组合物与稀释于生理溶液中的致病性细菌培养物大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的合适接触时间，以获得浓度为0.1和1mg/LAg时的有效抗微生物活性。
将这些纳米Ag浓度应用于生理溶液(1升水中溶解8.5gNaCl)配制的细菌培养物中，生理溶液与细菌细胞等渗，因此不会因为渗透压杀死细胞。对照处理包括在不含纳米Ag组合物的生理溶液中的细菌培养物。
制备mQ水配制的100mg纳米Ag/L母液并加入合适量的生理溶液中的细菌培养物(与实施例5中意思相同)以提供所需终浓度纳米Ag。
所有的孵育(一式两份)均在无菌带盖的试管里进行，37℃震荡培养，并在不同接触时间进行细胞计数(取样事件)。在每个取样事件时，从每一处理样品中取100μL铺板于胰酪胨大豆琼脂(TSA)固体生长培养基上并计数菌落。15小时、16小时、17小时、18小时和40小时后的结果分别显示于下列表4(其中ND表示未检测到，即低于检测限)。
表4
Figure A200780025198D00231
实施例8-制备不同银与生物物质细胞干重重量比的纳米银组合物
用液氨(水中28％体积的NH3)制备银(I)母液，终浓度为425g AgNO3/L(＝50mM AgNO3)。如实施例1所述制备发酵乳杆菌培养物。
将2.8g(湿重)离心细胞团块重悬于3种不同量(50ml、100ml和1L)的milliQ水中以获得分别称为A、B和C的反应混合物。
将1N MilliQ水配制的NaOH母液加至每一试管中，以在上述悬液中获取常态0.10N NaOH。
接着，如下加入银(I)母液：
-反应混合物A：加入0.24mL银(I)母液获得终浓度1.30g Ag/L(或12mM)Ag。56g/L生物物质(湿重)上几乎立即发生沉淀反应(红褐色沉淀)。假定离心生物物质平均干重比在10—30％之间，因而获得银与细胞干重比在1:4和1:12之间。
-反应混合物B：加入2.4mL银(I)母液获得终浓度5.78g Ag/L(或55mM)Ag。28g/L生物物质(湿重)上几乎立即发生沉淀反应(红褐色沉淀)。由于离心生物物质的干重平均占10—30％，因而获得银与细胞干重之比在2:1和0.7:1之间。此反应中pH为11.6。
-反应混合物C：加入24mL银(I)母液获得终浓度5.78g Ag/L(或55mM)Ag。2.8g/L生物物质(湿重)上几乎立即发生沉淀。由于离心生物物质的干重平均占10—30％，因而获得银与细胞干重之比在20:1和7:1之间。
将反应混合物静置30分钟，然后收集形成的纳米Ag组合物。
所得纳米Ag沉淀与生物物质一起15℃3,000g离心10分钟，然后在milliQ水中冲洗两次去除生产过程中任何残留氨和水溶性组分。然后分析纳米Ag纯化团块产物(实施例9)，或进一步用milliQ水稀释至适合进一步测试的纳米Ag浓度。
实施例9-在银与生物物质细胞干重之比为0.7:1时产生纳米Ag的 XRD分析
按照实施例8在银与生物物质细胞干重之比为0.7:1的条件下制备含纳米银颗粒的生物物质，在100℃烤炉中干燥24小时后，如实施例2所述进行XRD分析。在该XRD谱中仅仅检测到银金属的X-射线衍射图样。因为安全地估算干燥产物中质量少于5％的晶体痕量元素无法在XRD中检出，所以大约估算XRD分析中检测到的银至少95％处于Ag(0)状态。
实施例10-用H 2 Q 2 对纳米银进行后期处理
用含30％(体积)H2O2的水溶液对根据实施例1或实施例8所得到的洗涤的纳米Ag团块进行后期处理。为此将团块悬浮于H2O2得到浓度高至6gAg/L H2O2(30％)。获得更稳定的沉淀。然后用milliQ水进一步稀释所得沉淀的悬液得到用于后续测试的合适浓度的纳米Ag。
实施例11-经过或不经H 2 O 2 后处理纳米Ag的抗微生物特性
按照实施例8所述以不同银和生物物质细胞干重比例7:1、1:10和0.7:1分别制备纳米Ag制剂(本文分别称作样品A、B和C)。此外，以银和生物物质细胞干重比例0.7：1获得的纳米Ag制备物进一步用H2O2按照实施例10所述方法处理，从而得到第四个样品D。
为了评定银和生物物质细胞干重比例对纳米银产物抗微生物活性的影响，在无菌生理溶液中准备1 x 104CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌细胞悬液，并分装于不同的试管中。将样品A、B、C和D加入试管直至在每一试管中获取终浓度为0.05mg/L(或50ppb)的纳米Ag。作为对照，将细菌培养物与0.5ppm AgNO3孵育或不与任何银孵育。盖上试管并在37℃一式两份振荡孵育。孵育4.5小时后，取出样品并在生理溶液中进行系列稀释，铺板于TSA培养基上后，37℃孵育过夜，以进行总沙门氏菌计数测定。图3显示了这些计数的结果，以平均细胞计数和两次独立重复的标准差表示。用实施例8所述方法所得0.05ppm纳米银存在条件下，孵育4.5小时后观察到明显的细菌细胞计数减少。图3显示银和细胞干重比例越高，所得纳米Ag的抗微生物活性越弱。同样，利用H2O2处理纳米Ag产物显著增加其抗微生物活性。
实施例12-透射电镜法检测纳米银粒度
为了准备用于TEM分析的切片，用含2.5％戊二醛和2％甲醛的0.1M卡可酸盐缓冲液(pH 7.4)固定细菌团块，并包埋于3％低熔点琼脂糖中(来自的菲克实验室(Difco Laboratories)，美国密歇根州底特律)。在1％四氧化锇中对样品进行后固定。在固定步骤之间或之后，用蒸馏水洗涤样品。然后，在增加浓度的乙醇和无水环氧丙烷中对样品进行脱水。在环氧树脂介质(Epon-Spurr medium)中进行包埋后，样品块在TM60修块单元中进行修块(来自日池特-江公司(Reichert-Jung A.G)，奥地利维也纳)以获取切割面为0.5X1mm2-1 X 2mm2的切片，并用Ultracut切片切割机(来自日池特-江公司(Reichert-Jung A.G)，奥地利维也纳)对金到银黑色交界面颜色范围内的超薄切片进行切割。切片放置于聚乙烯醇缩醛和碳包被的铜网上(200目)。一旦完成，用2％乙酸铀酰对薄切片进行染色，并用柠檬酸铅检测细胞的超微结构。化学品和网购自阿嘎科学公司(Agar Scientific)(英国坦斯特)。利用EM208S透射电镜在80kV进行成像(来自荷兰艾恩德霍芬的FEI公司)。
获取实施例8所述反应混合物A、B和C得到的纳米银颗粒的TEM图像(未显示)。这些图像确认在组合物获得球形纳米银颗粒，其存在形式为细菌细胞表面的沉淀或生物物质间的悬浮物。
-反应混合物A(比值1:10)产生的纳米银粒度：对于测量的35个纳米颗粒，直径范围3.3nm-72nm，平均值为14nm，颗粒表面积范围6.4-2,996nm2，因此球度范围0.14-0.97；
-反应混合物B(比值1:1)产生的纳米银粒度：对于测量的202个纳米颗粒，直径范围3nm-116nm，平均值为15nm，颗粒表面积范围6-4,805nm2，因此球度范围0.12-0.96；
-反应混合物C(比值1:10)产生的纳米银粒度：对于测量的56个纳米颗粒，直径范围3.3nm-56nm，平均值为16nm，颗粒表面积范围6.4-1,841nm2，因此球度范围0.15-0.95。
实施例13-制备胶体纳米金
用milliQ水制备金(III)母液，终浓度浓度为7.5g AuCl3/L。按照实施例1获取发酵乳杆菌培养物。
将湿重2.5g的离心细胞团块加入到100mL milliQ水中。
将1N milliQ水配制的氢氧化钠母液加入上述悬液中获得常规终浓度为0.10N NaOH。
然后在此悬液中加入10mL金(III)母液获得终浓度为75mg Au(III)/100mL，存在形式为AuCl3-Au(3.8mM Au)。4小时内Au(0)完成沉淀到2.5g/100mL生物物质(-湿重)上。既然离心生物物质干重平均占10-30％，因此获得金和细胞干重比例在1:3和1:10间。
允许反应持续进行4小时，然后收集纳米金颗粒。将此紫色沉淀3,000g15℃离心10分钟并用milliQ水冲洗2次去除来自生产过程中的水溶性组分。
实施例14-纳米金的XRD分析
含有实施例13的含金颗粒的生物物质在100℃烤炉中干燥24小时后，用配备布拉格-布伦特(Bragg-Brentano)光学系统的西门子D5000衍射仪如实施例2所述进行进行XRD分析。所得谱图如图4所示，表明仅存在Au0的X-射线衍射峰。
实施例15-不同银与生物物质细胞干重比例下生物沉淀效率和生物物 质的回收
为了评估生物物质对Ag(I)生物还原为Ag(0)纳米颗粒的影响，检测不同Ag：CDW比例下生物还原后在生物物质上和溶液中的回收。
如实施例8所述制备不同Ag:CDW比例纳米银制剂。在生物物质与Ag(I)孵育4小时，7,000g离心10分钟分离可溶相(溶液中)和沉淀相(生物物质上)后测定银的回收百分率。本研究结果如下表8所示。
表8
 
样品(Ag:CDW比例) 溶液中mg Ag/L 生物物质上mg Ag/L 总回收
A(1:10) 76 1,295 100％
B(1:1) 819 5,308 100％
C:Ag:CDW＝10:1 1,612 4,844 100％
这些结果清楚表明，当Ag:CDW比例较低时，生物物质相关颗粒形式的银回收较高。例如Ag:CDW比例为1:10得到从生物还原方法处理的Ag(I)溶液中回收可接受的Ag0(约95％)。
实施例16-无过氧化氢后处理的纳米银制剂的灭藻特性
按照实施例8所述方法以银与生物物质细胞干重比例1:4制备纳米银制剂。
为了评估该制剂的灭藻效果，在含10mL BG11培养基(如Stanier等，Bacteriol.Rev.(1971)35：171-205所述)的试管中接种入0.5mL液体BG11快速生长小球藻培养物，在20℃、65％相对湿度和1000Lux(16小时/天)培养。2周后利用分光光度法评价生长。通过试管中的剂量，检测不同浓度的纳米银制剂，范围从20mg Ag/L-0.01mg Ag/L。在观察到完全有机体生长被完全抑制时的最低测试浓度是MIC值。该纳米银制剂抗小球藻生长的MIC值测定为0.125mg Ag/L。

Claims (21)

1.一种制备含有胶体纳米银或纳米金的组合物的方法，所述方法包括将益生菌与含有至少4mM银盐或金盐的水溶液一起培育的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水溶液含有至少4mM银盐，还含有氨和/或铵盐，以及碱金属氢氧化物。
3.一种制备含有胶体纳米银的组合物的方法，所述方法包括在5-45℃的温度下使益生菌与一种水溶液相接触的步骤，该水溶液含有银盐、氨和/或铵盐以及碱金属氢氧化物的混合物。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述氨和/或铵盐的含量足以形成大量Ag(NH3)+或{Ag(NH3)2}+复合物。
5.一种制备含有胶体纳米金的组合物的方法，所述方法包括在5-45℃的温度下使益生菌与一种水溶液相接触的步骤，该水溶液含有金盐和碱金属氢氧化物的混合物，不存在氨或铵盐。
6.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述碱金属氢氧化物选自氢氧化钠或氢氧化钾。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述银或金与细菌细胞干重的重量比为0.05-20。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述培育或接触的时间为1秒—30分钟。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述盐是硝酸银、氯化银或氯化金。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述培育在pH8-12的范围内进行。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述益生菌是乳杆菌。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，还包括通过机械、酶学或理化处理手段去除所述培育混合物中的至少一部分所述益生菌的步骤。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
—离心所述培育混合物，形成固体部分和液体部分，所述固体部分包含含有胶体纳米银或纳米金的组合物，和
—从所述液体部分中分离所述固体部分。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，还包括用过氧化物或过氧酸盐处理所述含有胶体纳米银或纳米金的组合物的步骤。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述过氧化物是过氧化氢。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述胶体纳米银是作为抗-微生物剂的组分引入的。
17.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述胶体纳米银是作为灭藻剂的组分引入的。
18.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述胶体纳米银是作为除草剂的组分引入的。
19.细菌在细菌膜上产生胶体金属或胶体金属化合物中的应用，包括使所述细菌与所述金属或金属化合物在受控pH下相接触。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述金属或金属化合物的金属是银。
21.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述金属或金属化合物的金属选自金、锌、汞、铜、钯、铂或铋。
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