CN103555769A - 枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法，包括以下步骤：1)枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液的制备，其中包括一次振荡培养、一次离心处理、收集菌体、二次振荡培养、二次离心处理；2)纳米银粒子的合成与表征。本发明采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Jaas ed1无细胞滤液，通过胞外合成纳米银粒子。经紫外/可见光分光光度计全波长扫描(UV-vis)、透射电子显微镜扫描(TEM)、X射线粉末衍射分析(XRD)、傅里叶变换红外光谱分析(FT-IR)等方法验证所合成的纳米银粒子粒度在20～50nm之间，形态均一，分散性较好。因此本发明条件温和，既简便快捷，又经济环保，所用试剂环境友好，为纳米银的绿色合成提供了一种新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及纳米材料领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外制备银纳米粒子的方法。
背景技术
以细菌、真菌、病毒等微生物为侵染源的植物病害种类繁多，对现代种植业构成重大威胁。目前，各种有机杀菌剂农药的使用非常普遍与频繁，导致了十分严重的农药污染与病原菌抗药性问题。银作为传统杀菌剂，具有高效、安全无毒、抗菌谱广、无耐药性等优点，但由于银离子化学性质活泼，在光照、受热等作用下容易被氧化，且易与卤族元素阳离子形成卤化银沉淀，从而导致抗菌性能的下降。纳米银与银离子相比，具有比表面积大，抑菌活性强和稳定性高等优点，已广泛应用于医药载体、水质净化、抗菌涂料、催化等领域(Mallic K，2006)。但是纳米银在农业病害防治方面应用的报道较少，Kim(2012)、Marek(2010)和Jo(2009)等分别报道了不同形态纳米银粒子对多种植物病原真菌的拮抗作用，显示了纳米银在植物病害防治领域具有广阔的应用前景。
目前纳米银制备方法主要采用液相化学还原法、光化学还原法、微乳液法等化学方法和高能球磨、激光溅射、激光烧蚀等物理方法(周全法，2008)。物理方法所得产品质量高，但对设备要求和能耗较高，且对纳米银颗粒形貌的调控能力有限，不利于工业化生产；化学方法由于其工艺相对简单，操作相对容易，生产成本较低，是较常采用的方法，但其所用的化学试剂对人体和环境有一定的危害(Andersson M，2005)。采用生物材料或生物体系天然合成纳米材料是解决生态友好及可靠性问题的一种较好的方法。近年来，纳米材料制备过程绿色化的研究日趋活跃，因其具有安全、环保、反应条件温和、所得纳米银粒子稳定性高等优点，微生物还原法成为具有发展前景的纳米银制备新方法(Prasad TN，2011；Krishnan V，2010)。当前用于合成纳米银的微生物主要来自于细菌(Sahar Z，2011；Sintubin L，2009)和真菌(Musarrat J，2010；Kathiresan K，2009)。细菌相对于真菌而言，具有繁殖速度快、遗传转化操作简单等优点，因而更多地被用于合成纳米银粒子。细菌合成纳米银粒子主要采用菌液胞内合成与上清液胞外合成两种方法，由于Ag+具有较强的杀菌作用，只有少数对Ag+有较强抗性的菌株才能采用菌液胞内合成的方法，因此具有较大的局限性，同时菌液合成的纳米银颗粒大多吸附在菌体细胞壁表面或内部，后期分 离困难。而上清液胞外合成法因为选用细菌上清液，所以不存在拮抗Ag+的问题，同时后期分离方便快捷，已成为细菌合成纳米银方法研究的重点。已有报道表明阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)(Shahverdi AR，2007)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniform)(Kalimuthu K，2008)可采用上清液胞外合成法合成纳米银粒子。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种反应条件温和，既简便快捷，又经济环保的枯草芽孢杆菌Jaas ed1胞外合成纳米银粒子制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案为：一种枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法，包括以下步骤：
1)枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液的制备：
一次振荡培养：将枯草芽孢杆菌Jaas ed1放入装有100毫升LB培养基的摇瓶中，30℃振荡培养，振荡培养的转速为150转/分钟，时间为12-24个小时，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液；
一次离心处理：将经过振荡培养的枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液进行离心处理，离心转速为5000转/分钟，时间为15-30分钟；
收集菌体：将经过一次离心处理的枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液中的菌体收集，并将枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体用去离子水荡洗3次，以去除残留的LB培养基；
二次振荡培养：将经过上述收集菌体步骤处理后的枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体重悬于100毫升去离子水中，30℃二次振荡培养，二次振荡培养的转速为150转/分钟，时间为12-36个小时，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体悬液；
二次离心处理：将上述经过二次振荡处理的枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体悬液进行二次离心处理，二次离心处理的转速为12000转/分钟，时间为15-30分钟，以将枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体及其碎片与上清液分离；
收集上清液：将经过上述二次离心处理后产生的上清液收集，然后将收集的上清液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液；
2)纳米银粒子的合成与表征：
首先，取步骤1)中制得的枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液100毫升，加入100-200μl浓度为1mol/L的AgNO3，并在室温放置24-72个小时；接着进行离心处理，离心毫升速为15000转/分钟，时间为30-60分钟；离心结束后，将沉淀物收集，再将收集的 沉淀物用无水乙醇荡洗3次，然后将沉淀物在60℃的温度下烘干成粉末，制得纳米银粒子。
作为本发明进一步改进的技术方案，在步骤2)中，枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液与AgNO3体积比为1毫升：1-2微升。
作为本发明进一步改进的技术方案，在步骤2)中，所述银纳米粒子的粒径在20-50纳米之间。
作为本发明进一步改进的技术方案，步骤1)中，所述一次振荡的时间为12个小时，一次离心处理的时间为15分钟，二次振荡的时间为12个小时，二次离心处理的时间为30分钟；步骤2)中，向枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液中加入的AgNO3为200微升，离心处理的时间为30分钟。
作为本发明进一步改进的技术方案，步骤1)中，所述一次振荡的时间为12个小时，一次离心处理的时间为15分钟，二次振荡的时间为24个小时，二次离心处理的时间为30分钟；步骤2)中，向枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液中加入的AgNO3为100微升，室温放置时间为36个小时，离心处理的时间为50分钟。
作为本发明进一步改进的技术方案，在步骤1)中，所述一次振荡的时间为24个小时，一次离心处理的时间为15分钟，二次振荡的时间为36个小时，二次离心处理的时间为30分钟；步骤2)中，向枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液中加入的AgNO3为150微升，室温放置时间为24个小时，离心处理的时间为30分钟。
作为本发明进一步改进的技术方案，在步骤1)中，所述一次振荡的时间为24个小时，一次离心处理的时间为30分钟，二次振荡的时间为36个小时，二次离心处理的时间为30分钟；步骤2)中，向枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液中加入的AgNO3为200微升，室温放置时间为72个小时，离心处理的时间为60分钟。
本发明采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Jaas ed1无细胞滤液，所用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Jaas ed1菌株为江苏省农科院植保所自棉花茎秆内分离保存，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2005年12月12日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收藏保存，保藏号CGMCC No.1564。通过胞外合成纳米银粒子，因此本发明条件温和，既简便快捷，又经济环保，所用试剂环境友好。为纳米银的绿色合成提供了一种新的思路。
附图说明
图1本发明实施例1所制备的纳米银粒子的紫外-可见光谱图。
图2本发明实施例1所制备的纳米银粒子的透射电镜扫描图。
图3本发明实施例1所制备的纳米银粒子的X射线粉末衍射扫描图。
图4本发明实施例1所制备的纳米银粒子的傅里叶变换红外光谱扫描图。
下面通过实施例对本发明的具体实施方式作进一步说明。
具体实施方式
实施例1
本枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法，包括以下步骤：
1)枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液的制备：
一次振荡培养：将枯草芽孢杆菌Jaas ed1放入装有100毫升LB培养基的摇瓶中，30℃振荡培养，振荡培养的转速为150转/分钟，时间为12个小时，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液；
一次离心处理：将经过振荡培养的枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液进行离心处理，离心转速为5000转/分钟，时间为30分钟；
收集菌体：将经过一次离心处理的枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液中的菌体收集，并将枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体用去离子水荡洗3次，以去除残留的LB培养基；
二次振荡培养：将经过上述收集菌体步骤处理后的枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体重悬于100毫升去离子水中，30℃二次振荡培养，二次振荡培养的转速为150转/分钟，时间为24个小时，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体悬液；
二次离心处理：将上述经过二次振荡处理的枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体悬液进行二次离心处理，二次离心处理的转速为12000转/分钟，时间为30分钟，以将枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体及其碎片与上清液分离；
收集上清液：将经过上述二次离心处理后产生的上清液收集，然后将收集的上清液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液；
2)纳米银粒子的合成与表征：
首先，取步骤1)中制得的枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液100毫升，然后向枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液中加入200μL浓度为1mol/L的AgNO3，并在室温放置24个小时；接着进行离心处理，离心毫升速为15000转/分钟，时间为30分钟；离心结束后，将沉淀物收集，再将收集的沉淀物用无水乙醇荡洗3次，然后将沉淀物在60℃ 的温度下烘干成粉末，制得纳米银粒子。
如图1、图2、图3和图4所示，用透射电镜(TEM)观察本实施例制得的纳米银粒子，其中银纳米颗粒的形貌均为近球形，粒径分布在20-50纳米。本实施例中所用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Jaas ed1菌株为江苏省农科院植保所自棉花茎秆内分离保存，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2005年12月12日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所)收藏保存，保藏号CGMCC No.1564。
实施例2
本枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法，包括以下步骤：
1)枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液的制备：
一次振荡培养：将枯草芽孢杆菌Jaas ed1放入装有100毫升LB培养基的摇瓶中，30℃振荡培养，振荡培养的转速为150转/分钟，时间为12个小时，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液；
一次离心处理：将经过振荡培养的枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液进行离心处理，离心转速为5000转/分钟，时间为15分钟；
收集菌体：将经过一次离心处理的枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液中的菌体收集，并将菌体用去离子水荡洗3次，以去除残留的LB培养基；
二次振荡培养：将经过上述收集菌体步骤处理后的枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体重悬于100毫升去离子水中，30℃二次振荡培养，二次振荡培养的转速为150转/分钟，时间为24个小时，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体悬液；
二次离心处理：将上述经过二次振荡处理的枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体悬液进行二次离心处理，二次离心处理的转速为12000转/分钟，时间为30分钟，以将枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体及其碎片与上清液分离；
收集上清液：将经过上述二次离心处理后产生的上清液收集，然后将收集的上清液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液；
2)纳米银粒子的合成与表征：
首先，取步骤1)中制得的枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液100毫升，加入100μl浓度为1mol/L的AgNO3，并在室温放置36个小时；接着进行离心处理，离心转速为15000转/分钟，时间为30分钟；离心结束后，将沉淀物收集，再将收集的沉淀物用无水乙醇荡洗3次，然后将沉淀物在60℃的温度下烘干成粉末，制得纳米银粒子。
本实施例中所用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Jaas ed1菌株为江苏省农科院植保所自棉花茎秆内分离保存，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2005年12月12日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收藏保存，保藏号CGMCC No.1564。
实施例3
本枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法，包括以下步骤：
1)枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液的制备：
一次振荡培养：将枯草芽孢杆菌Jaas ed1放入装有100毫升LB培养基的摇瓶中，并置于30℃温度，然后进行振荡培养，振荡培养的转速为150转/分钟，时间为24个小时，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液；
一次离心处理：将经过振荡培养的枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液进行离心处理，离心转速为5000转/分钟，时间为15分钟；
收集菌体：将经过一次离心处理的枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液中的菌体收集，并将枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体用去离子水荡洗3次，以去除残留的LB培养基；
二次振荡培养：将经过上述收集菌体步骤处理后的枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体重悬于100毫升去离子水中，30℃二次振荡培养，二次振荡培养的转速为150转/分钟，时间为36个小时，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体悬液；
二次离心处理：将上述经过二次振荡处理的枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体悬液进行二次离心处理，二次离心处理的转速为12000转/分钟，时间为30分钟，以将枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体及其碎片与上清液分离；
收集上清液：将经过上述二次离心处理后产生的上清液收集，然后将收集的上清液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液；
2)纳米银粒子的合成与表征：
首先，取步骤1)中制得的枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液100毫升，然后向枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液中加入150μl浓度为1mol/L的AgNO3，并在室温放置24个小时；接着进行离心处理，离心转速为15000转/分钟，时间为30分钟；离心结束后，将沉淀物收集，再将收集的沉淀物用无水乙醇荡洗3次，然后将沉淀物在60℃的温度下烘干成粉末，制得纳米银粒子。
本实施例中所用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Jaas ed1菌株为江苏省农科院植保所自棉花茎秆内分离保存，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2005 年12月12日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收藏保存，保藏号CGMCC No.1564。
实施例4
本枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法，包括以下步骤：
1)枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液的制备：
一次振荡培养：将枯草芽孢杆菌Jaas ed1放入装有100毫升LB培养基的摇瓶中，30℃振荡培养，振荡培养的转速为150转/分钟，时间为24个小时，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液；
一次离心处理：将经过振荡培养的枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液进行离心处理，离心转速为5000转/分钟，时间为30分钟；
收集菌体：将经过一次离心处理的枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液中的菌体收集，并将枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体用去离子水荡洗3次，以去除残留的LB培养基；
二次振荡培养：将经过上述收集菌体步骤处理后的枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体重悬于100毫升去离子水中，30℃二次振荡培养，二次振荡培养的转速为150转/分钟，时间为36个小时，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体悬液；
二次离心处理：将上述经过二次振荡处理的枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体悬液进行二次离心处理，二次离心处理的转速为12000转/分钟，时间为30分钟，以将枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体及其碎片与上清液分离；
收集上清液：将经过上述二次离心处理后产生的上清液收集，然后将收集的上清液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液；
2)纳米银粒子的合成与表征：
首先，取步骤1)中制得的枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液200毫升，加入150μl浓度为1mol/L的AgNO3，并在室温放置72个小时；接着进行离心处理，离心转速为15000转/分钟，时间为60分钟；离心结束后，将沉淀物收集，再将收集的沉淀物用无水乙醇荡洗3次，然后将沉淀物在60℃的温度下烘干成粉末，制得纳米银粒子。
本实施例中所用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Jaas ed1菌株为江苏省农科院植保所自棉花茎秆内分离保存，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2005年12月12日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收藏保存，保藏号CGMCC No.1564。
Claims (7)
1.一种枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法，包括以下步骤：
1)枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液的制备：
一次振荡培养：将枯草芽孢杆菌Jaas ed1放入装有100毫升LB培养基的摇瓶中，30℃振荡培养，振荡培养转速为150转/分钟，时间为12-24个小时，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液；
一次离心处理：将经过振荡培养的枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液进行离心处理，离心转速为5000转/分钟，时间为15-30分钟；
收集菌体：将经过一次离心处理的枯草芽孢杆菌Jaas ed1培养液中的菌体收集，并将枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体用去离子水荡洗3次，以去除残留的LB培养基；
二次振荡培养：将经过上述收集菌体步骤处理后的枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体重悬于100毫升去离子水中，并置于30℃的温度下，二次振荡培养，二次振荡培养的转速为150转/分钟，时间为12-36个小时，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体悬液；
二次离心处理：将上述经过二次振荡处理的枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体悬液进行二次离心处理，二次离心处理的转速为12000转/分钟，时间为15-30分钟，以将枯草芽孢杆菌Jaas ed1菌体及其碎片与上清液分离；
收集上清液：将经过上述二次离心处理后产生的上清液收集，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，获得枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液；
2)纳米银粒子的合成与表征：
首先，取步骤1)中制得的枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液100毫升，加入100-200μl浓度为1mol/L的AgNO3，并在室温放置24-72个小时；接着进行离心处理，转速为15000转/分钟，时间为30-60分钟；离心结束后，将沉淀物收集，再将收集的沉淀物用无水乙醇荡洗3次，在60℃的温度下烘干成粉末，制得纳米银粒子。经紫外/可见光分光光度计全波长扫描(UV-vis)、透射电子显微镜扫描(TEM)、X射线粉末衍射分析(XRD)、傅里叶变换红外光谱分析(FT-IR)等方法验证所合成的纳米银粒子形态均一，分散性较好。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法，其特征在于：在步骤2)，枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液与AgNO3体积比为1毫升：1-2微升。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法，其特征在于：所述银纳米粒子的粒径在20-50纳米之间。
4.根据权利要求1或2或3所述的枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法，其特征在于：步骤1)中，所述一次振荡的时间为12个小时，一次离心处理的时间为15分钟，二次振荡的时间为12个小时，二次离心处理的时间为30分钟；步骤2)中，向枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液中加入的AgNO3为200微升，离心处理的时间为30分钟。
5.根据权利要求1或2或3所述的枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法，其特征在于：步骤1)中，所述一次振荡的时间为12个小时，一次离心处理的时间为15分钟，二次振荡的时间为24个小时，二次离心处理的时间为30分钟；步骤2)中，向枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液中加入的AgNO3为100微升，室温放置时间为36个小时，离心处理的时间为50分钟。
6.根据权利要求1或2或3所述的枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法，其特征在于：步骤1)中，所述一次振荡的时间为24个小时，一次离心处理的时间为15分钟，二次振荡的时间为36个小时，二次离心处理的时间为30分钟；步骤2)中，向枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液中加入的AgNO3为150微升，室温放置时间为24个小时，离心处理的时间为30分钟。
7.根据权利要求1或2或3所述的枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液胞外合成纳米银粒子的方法，其特征在于：步骤1)中，所述一次振荡的时间为24个小时，一次离心处理的时间为30分钟，二次振荡的时间为36个小时，二次离心处理的时间为30分钟；步骤2)中，向枯草芽孢杆菌Jaas ed1无细胞滤液中加入的AgNO3为200微升，室温放置时间为72个小时，离心处理的时间为60分钟。
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