CN104673679B - 一株马利亚霉菌及其在金纳米材料合成中的应用 - Google Patents
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Abstract
一株马利亚霉菌及其在金纳米材料合成中的应用，属于生物技术领域。该菌株分离自本溪钢铁焦化厂的活性污泥，于2014年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 10030。该菌株经26S rRNA基因序列测定，与Mariannaeasp.具有较高的相似性，因此鉴定其为马利亚霉菌，命名为Mariannaeasp. HJ。该菌株可以在含0.05 g/L四环素的改良马丁培养基中生长，其最适生长温度为30℃，最适pH为7。菌株HJ具有合成金纳米材料的能力，0.2 g湿菌丝体可在2 mL反应体系中催化1.0 mmol/L HAuCl4溶液合成不同粒径、形状的金纳米颗粒。该菌株扩展了真菌在纳米材料绿色合成中的应用，也为金纳米材料的生物制备提供了一种新的微生物资源。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株马利亚霉菌 (Mariannaea sp. HJ) 及其在金纳米材料合成中的应用。
背景技术
金纳米颗粒 (AuNPs) 具有高度的稳定性和独特的光电、光热性能，在信息存储、化学传感、医学成像、药物运输以及生物标记等领域得到广泛应用。传统物理合成方法需要复杂的仪器及高能耗的实验条件，化学合成方法中使用的封端剂和有机溶剂则不利于金纳米颗粒在生物医学领域的应用，并且对环境造成负面的影响。微生物在自然界分布广泛、生长繁殖迅速，且易分离培养，合成金纳米颗粒过程相对温和、环境友好、绿色低毒，被誉为“纳米材料加工厂”。
真菌是一类重要的微生物资源，相比较细菌而言，可以大量分泌合成纳米颗粒相关的胞外酶、多肽类物质及次级代谢产物等，合成的纳米颗粒产量高、易与真菌分离，可用于纳米颗粒的大规模生产。目前已有研究表明真菌及其代谢产物还原Au3+/Au+合成金纳米颗粒。如Verticillium sp.能还原Au3+，在细胞表面形成尺寸均一、单分散性良好的金纳米颗粒。从尾矿池中分离出的酵母菌Pichia jadinii和HAuCl4反应后能生成紫色的金纳米颗粒。Penicillium sp.细胞滤出液和HAuCl4反应细胞外合成金纳米颗粒仅用1 min，全细胞反应胞内合成金纳米颗粒也仅需8 h。Yarrowia lipolytica NCIM 3589在pH 7和pH 9下合成的金纳米颗粒平均粒径约为15 nm且形状不规则，而在pH 2条件下颗粒尺寸增大并在胞外不断聚集，最终形成规则的球形和六边形结构。本专利涉及的马利亚霉菌 (Mariannaea)是一种广泛存在的真菌，通常从土壤、腐烂的植物以及水底沉积物等环境中分离得到，而关于马利亚霉菌合成金属纳米颗粒的研究至今还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株马利亚霉菌，以及采用该菌株催化HAuCl4合成金纳米颗粒的方法，该菌株在生物合成纳米材料领域具有应用价值。
本发明涉及一株马利亚霉菌 (拉丁文分类命名为：Mariannaeasp. HJ)，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其登记入册编号为CGMCC No. 10030，保藏日期为2014年12月04日；菌株的26S rRNA基因序列在GenBank数据库中的登录号为KP330204。
该菌株分离自本溪钢铁焦化厂的活性污泥，生长采用的培养基为改良马丁液体培养基，液体培养基的组成为：葡萄糖1 g/L，(NH4)2SO4 1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，K2HPO4 1 g/L，四环素0.05 g/L；pH 7。在30℃，150 r/min条件振荡培养54 h生长至稳定期，稳定期菌丝体聚集成白色小球状。所述固体培养基为对应液体培养基中加入2% (W/V) 琼脂；液体培养基和固体培养基均在115℃湿热灭菌20 min后使用。
所述菌株能催化HAuCl4合成球形或六边形形态的金纳米颗粒。该菌株具有合成金纳米颗粒的能力：将0.2 g湿菌丝体加入到2 mL的1.0 mmol/L HAuCl4溶液中，在30℃，150r/min条件共孵育24 h后可生成球形、六边形等不同形态的金纳米颗粒。
本发明的有益效果是：菌株HJ分离自本溪钢铁焦化厂的活性污泥，在改良马丁培养基中生长的最适温度为30℃，最适pH为7，该菌株可催化HAuCl4合成不同形态的金纳米颗粒。该菌株扩展了真菌在纳米材料绿色合成中的应用，为金纳米材料的生物制备提供一种新的微生物资源，在生物合成纳米材料领域中具有应用价值。
附图说明
图1马利亚霉菌HJ 26S rRNA基因序列系统发育树。
图2马利亚霉菌HJ生长曲线。
图3马利亚霉菌HJ的SEM扫描图。
图4不同pH对马利亚霉菌HJ生长的影响。
图5不同温度对马利亚霉菌HJ生长的影响。
图6马利亚霉菌HJ合成金纳米颗粒紫外-可见光全波长扫描。
图7马利亚霉菌HJ合成金纳米颗粒的TEM表征。
具体实施方式
实施例1：本发明菌株的获得
本发明涉及的马利亚霉菌分离自本溪钢铁焦化厂的活性污泥。前期先将所取泥样置于微生物反应器中驯化培养，培养基为KH2PO4 0.02 g/L，NH4Cl 0.09 g/L，NaCl 0.01 g/L，MgSO4·7H2O 0.0125 g/L，CaCl2 0.012 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，葡萄糖0.05 g/L，四环素0.04 g/L。60天后取2 mL反应器泥水混合物，采用平板稀释涂布法，将泥水混合物梯度稀释后涂布在固体改良马丁培养基 (葡萄糖1 g/L，(NH4)2SO4 1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，K2HPO4 1 g/L，四环素0.05 g/L，pH 7，琼脂2%) 上，于30℃ 下培养3-4天。培养皿长出菌落后，挑取少量菌落于含有25 mL液体改良马丁培养基的50 mL锥形瓶中，于30℃，150 r/min下振荡培养，待菌株生长至稳定期，取少量菌液稀释进行平板涂布。重复上述操作，直至得到纯化的菌株。
该菌株于2014年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No. 10030。
实施例2：菌株的26S rRNA基因序列分析
以26S rRNA通用引物对所获得的菌株进行PCR扩增，将得到的基因序列进行BLAST同源对比，发现其与Mariannaeasp.具有较高的相似性，因此判定该菌株为马利亚霉菌菌属，命名为Mariannaeasp. HJ。图1为菌株HJ的26S rRNA基因序列系统发育树，其26S rRNA序列已登录GenBank数据库，登录号为KP330204，具体序列如下。
>HJ 26S rRNA gene sequence
CAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCCCTCGGGTCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTTGGTGAGGTGCCTTCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCATAGAGGGTGAGAGCCCCGTCTGGTCGGACACCAATCCTATGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCTAAATGGGAGGTATATGTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTCATGACCAGACTTGGGCTTGGTTGATCAACCTGGGTTCTCCCGGGTGCACTCTTCCTCGTCCAGGCCAGCATCAGTTCGCTGCGGGGGATAAAGGTTTCGGGAATGTGGCTCCCTCGGGAGTGTTATAGCCCGTTGCGTAATACCCTGCGGTGGACTGAGGTCCGCGTTCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAGCGAC
实施例3：马利亚霉菌HJ的生长曲线
100 mL液体改良马丁培养基加入250 mL锥形瓶中，115℃ 湿热灭菌20 min，体系加入实施例1中的菌液3 mL，于30℃，150 r/min振荡培养。采用干重法，每隔6 h取100 mL菌液，滤纸过滤，去离子水洗涤2-3次，随后放入烘箱105℃ 烘干至恒重，称重记录。菌株HJ的生长曲线如图2所示。结果表明，菌株0-24 h处于适应期，24-54 h生长旺盛，处于对数期，54h以后进入稳定期。
实施例4：菌株HJ的SEM扫描
取2 mL实施例3培养54 h的菌液于2 mL管，12000 r/min，离心10 min，弃去上清液。用50 mmol/L磷酸盐缓冲液清洗菌体2次，然后用1.5 mL 5%戊二醛溶液重悬菌体，置于4℃冰箱孵化1-2 h，于12000 r/min、4℃下离心15 min，弃去上清液。再依次用1.5 mL 30%、50%、75%、90%、95%乙醇溶液悬起菌体，12000 r/min、4℃，离心15 min，弃去上清液，最后用1.5 mL 100%乙醇重悬菌体。样品用导电胶粘附在样品台上，真空离子溅射喷镀铂金膜后使扫描电子显微镜 (SEM) 观察，菌株HJ的细胞形态如图3a所示，为丝状，图3b为孢子的形貌。
实施例5：不同pH对菌株HJ生长的影响
采用液体改良马丁培养基，每100 mL培养基加入到250 mL锥形瓶中，用KOH和H2SO4溶液调节培养基pH分别为4、5、6、7、8和9，接种实施例3中生长54 h的菌液，接种量3%，培养菌株至54 h取样，采用干重法测定生物量，如图4所示。结果表明，菌株HJ在pH 4-9的条件下均能生长，pH为7时生长量最大，干重为0.555 mg/mL。
实施例6：不同温度对菌株HJ生长的影响
采用液体改良马丁培养基，每100 mL培养基加入到250 mL锥形瓶中，温度分别设置为20、25、30、35、40℃，接种实施例3中生长54 h的菌液，接种量3%，培养菌株至54 h取样，采用干重法测定生物量，如图5所示。结果表明，菌株HJ在20℃和40℃条件下生长量很少，25℃条件下生长受到明显抑制，30℃和35℃条件下生长良好，其中30℃时生长量最大，干重为0.552 mg/mL。
实施例7：菌株HJ合成金纳米颗粒的紫外-可见光全波长扫描
取实施例3中培养至54 h的菌液100 mL，滤纸过滤，超纯水洗涤2-3次，把截留的菌丝体转移到培养皿中。在5 mL管中加入0.2 g湿重菌丝体，1960 μL超纯水和40 μL HAuCl4母液 (50.0 mmol/L)，制成HAuCl4终浓度为1.0 mmol/L的2 mL反应体系。将该体系置于150r/min，30℃ 摇床振荡孵育。分别在0 h、24 h时刻取样，超声破碎30 min，3000 r/min离心5min，取上清液进行紫外-可见光全波长扫描。结果显示，经过24 h，菌株HJ可催化HAuCl4生成明显的紫色物质，全波长扫描显示，该紫色物质在545 nm出现明显的吸收峰，证实有金纳米颗粒生成 (金纳米颗粒在500 nm-600 nm有特征吸收峰)，如图6所示。
实施例8：菌株HJ合成金纳米颗粒的TEM表征
将实施例7中最后得到的紫色溶液进行透射电子显微镜 (TEM) 表征，如图7所示。结果显示，菌株HJ可催化HAuCl4合成不同粒径 (5-120 nm) 和不同形状 (球形、六边形、三角形) 的金纳米颗粒。
<110>大连理工大学
<120>一株马利亚霉菌及其在金纳米材料合成中的应用
<210> 1
<211> 521
<212> DNA
<213> 马利亚霉菌(Mariannaea sp.)
<400> 1
CAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCCCTCGGGTCCGAGTTGTAATTTGCA50
GAGGATGCTTTTGGTGAGGTGCCTTCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCA100
TAGAGGGTGAGAGCCCCGTCTGGTCGGACACCAATCCTATGTAAAGCTCC150
TTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCTAAATGGGAGGTATATG200
TCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTG250
ATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGTACGTGAAAT300
TGTTGAAAGGGAAGCGCTCATGACCAGACTTGGGCTTGGTTGATCAACCT350
GGGTTCTCCCGGGTGCACTCTTCCTCGTCCAGGCCAGCATCAGTTCGCTG400
CGGGGGATAAAGGTTTCGGGAATGTGGCTCCCTCGGGAGTGTTATAGCCC450
GTTGCGTAATACCCTGCGGTGGACTGAGGTCCGCGTTCTGCAAGGATGCT500
GGCGTAATGGTCATCAGCGAC521
Claims (2)
1.一株马利亚霉菌 (Mariannaea sp. ) HJ，其特征在于：所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其登记入册编号为CGMCC No. 10030，保藏日期为2014年12月04日。
2.根据权利要求1所述的一种马利亚霉菌在金纳米材料合成中的应用，其特征在于：所述菌株能催化HAuCl4合成球形或六边形形态的金纳米颗粒。
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