CN104450564B - 一株可制备Ag/AgCl纳米颗粒的硫酸盐还原菌 - Google Patents
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Abstract
一株可制备Ag/AgCl纳米颗粒的硫酸盐还原菌,涉及一株硫酸盐还原菌。本发明提供一株硫酸盐还原菌,可以制备Ag/AgCl纳米颗粒,为Ag/AgCl纳米颗粒的生产和应用提供重要菌源。该菌株为Garciella sp.wxz01,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址是北京市朝阳区北辰路1号院3号,保藏日期为2014年7月3日,保藏编号为CGMCC No:9410。本发明Garciella sp.wxz01在含有硝酸银的改良的Starkey培养基中生长并合成Ag/AgCl纳米颗粒,为生产Ag/AgCl纳米颗粒提供菌源。用于制备Ag/AgCl纳米颗粒。
Description
技术领域
本发明涉及一株硫酸盐还原菌。
背景技术
AgCl是一种很重要的光敏材料,当AgCl表面掺杂金属银时,由于其独特的等离子效应,这种复合纳米粒子具有优异的可见光催化性能,提高了处理废水、废气中有机污染物的效率。
Ag/AgCl纳米颗粒主要由化学方法合成,不足之处在于需要严格的反应条件和复杂的实验步骤,合成的纳米颗粒粒径很大,稳定性差,形貌也很难控制。而生物法因其成本低廉、条件温和环境友好等优势引起了人们广泛的关注。
据报道一些细菌、真菌或植物粉末能够合成Ag/AgCl纳米颗粒。硫酸盐还原菌在生长过程中能够异化硫酸盐缓慢释放还原物质,生成的纳米粒子粒径小,稳定性好,而且硫酸盐还原菌可以反复使用,有利于工业化连续生产。因此,寻找能合成Ag/AgCl纳米颗粒的菌株并应用于生产Ag/AgCl纳米颗粒具有重要的研究价值。
发明内容
本发明提供一株硫酸盐还原菌,可以制备Ag/AgCl纳米颗粒,为Ag/AgCl纳米颗粒的生产和应用提供重要菌源。
本发明可制备Ag/AgCl纳米颗粒的硫酸盐还原菌为Garciella sp.wxz01,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址是北京市朝阳区北辰路1号院3号,保藏日期为2014年7月3日,保藏编号为CGMCC No:9410。
本发明Garciella sp.wxz01为短杆菌,菌体长1.0~2.2μm,宽0.4~0.9μm,无鞭毛和芽孢,生长菌落为黑色,多为椭圆形,少量星状,接触空气一段时间后,菌落变为白色,菌体大部分死亡。
本发明Garciella sp.wxz01为革兰氏阴性菌,接触酶阴性,明胶液化阳性,淀粉水解阴性,甲基红实验、吲哚实验阳性,伏普实验阴性,硝酸盐还原和柠檬酸盐还原为阳性。可利用蛋白胨、酵母膏、乳酸钠、甲酸钠、葡萄糖、苹果酸、琥珀酸为碳源生长,在酵母膏和蛋白胨中生长最好。Garciella sp.wxz01能以硫酸氨和尿素作为氮源。菌株在pH 5.0~pH10.0的条件下生长,最适pH为7.8;10℃以下菌株停止生长,60℃以上不生长,最适生长温度为37℃,属于嗜中温菌。
本发明Garciella sp.wxz01通过16S rDNA序列比对分析,与其最相近的种属是Garciella sp.EMZY-1,相似性为99%。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定,该菌属于梭菌科中的一个新属Garciella sp.。
本发明Garciella sp.wxz01在含有硝酸银的改良的Starkey培养基中生长并合成Ag/AgCl纳米颗粒,为生产Ag/AgCl纳米颗粒提供菌源。
本发明Garciella sp.wxz01,属于Garciella sp.属,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址是北京市朝阳区北辰路1号院3号,保藏日期为2014年7月3日,保藏编号为CGMCC No:9410。
附图说明
图1为本发明菌株Garciella sp.wxz01的PCR扩增电泳图;图2为本发明菌株Garciella sp.wxz01与GenBank中收录的相近菌株的16S rDNA序列进行同源性比对所构建的系统进化树;图3为菌株Garciella sp.wxz01合成的Ag/AgCl纳米颗粒透射电子显微镜图;图4为菌株Garciella sp.wxz01合成的Ag/AgCl纳米颗粒的X射线衍射图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式,还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一:本实施方式可制备Ag/AgCl纳米颗粒的硫酸盐还原菌为Garciella sp.wxz01,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址是北京市朝阳区北辰路1号院3号,保藏日期为2014年7月3日,保藏编号为CGMCC No:9410。
本实施方式Garciella sp.wxz01为短杆菌,菌体长1.0~2.2μm,宽0.4~0.9μm,无鞭毛和芽孢,生长菌落为黑色,多为椭圆形,少量星状,接触空气一段时间后,菌落变为白色,菌体大部分死亡。
本实施方式Garciella sp.wxz01为革兰氏阴性菌,接触酶阴性,明胶液化阳性,淀粉水解阴性,甲基红实验、吲哚实验阳性,伏普实验阴性,硝酸盐还原和柠檬酸盐还原为阳性。可利用蛋白胨、酵母膏、乳酸钠、甲酸钠、葡萄糖、苹果酸、琥珀酸为碳源生长,在酵母膏和蛋白胨中生长最好。Garciella sp.wxz01能以硫酸氨和尿素作为氮源。菌株在pH5.0~pH10.0的条件下生长,最适pH为7.8;10℃以下菌株停止生长,60℃以上不生长,最适生长温度为37℃,属于嗜中温菌。
本实施方式Garciella sp.wxz01是从大庆油田采油厂含油污水中分离得到的,分离方法按以下步骤进行:
取1mL大庆油田采油厂含油污水水样加入到19mL改良的Starkey培养基中,35℃恒温厌氧富集培养至培养基变黑且瓶口处散发出硫化氢的臭鸡蛋味,用润湿的醋酸铅试纸检测有大量H2S生成,得富集培养液。向富集培养液中加入0.5mmol/L的AgNO3避光培养5天,取1mL该培养液接种于含有1.0mmol/L AgNO3的改良的Starkey培养基中避光培养5天,取1mL培养液接种于含有1.5mmol/L AgNO3的改良Starkey培养基中避光培养5天,依据此方法,将AgNO3的浓度逐步提高到3mmol/L。将含有3mmol/L AgNO3的培养液涂布于固体夹层平板,石蜡封口,35℃恒温培养。当夹层中间出现使周围固体培养基变黑的单菌落时,将这些单菌落挑入改良的Starkey培养基中培养。从中挑取长势良好、浓黑色的单菌落,接种于100mL改良的Starkey培养基中,培养至液体培养基变黑,将变黑的菌液继续平板划线,挑取单菌落,作进一步的纯化,得到了菌株Garciella sp.wxz01。
改良的Starkey培养基成分:0.5g K2HPO4、1.0g NH4Cl、0.08g无水CaCl2、2.0gNaNO3、2.0g Mg(NO3)2·6H2O、1.0g酵母膏、体积浓度60%的乳酸钠溶液5mL,将上述试剂溶解在1000mL水中,调节pH值为8.0,加入500μL刃天青溶液(购买得到),培养基煮沸后,加入0.5g L-半胱氨酸,通入高纯氮气驱氧,121℃高压灭菌15min。冷却后再加入经过滤除菌的硫酸亚铁铵1g。
对分离筛选得到的菌株Garciella sp.wxz01进行分子鉴定,取对数生长期新鲜菌液,离心收集菌体,用试剂盒(购买自北京庄盟生物)按说明书提取菌株DNA,采用细菌通用引物进行PCR扩增,16S rDNA序列的引物为F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’,引物由上海生物工程有限公司合成。PCR扩增体系:2μL dNTP(10mmol·L-1),2μL 10×PCR buffer(含15mmol/L MgCl2),0.4μL Taq酶,1.0μL DNA,两个引物各1.0μL(10pmol·μL-1),ddH2O 12.6μL。扩增程序:94℃预热3min,94℃变性2min,56℃复性1min,72℃延伸2min,循环次数为30次,最后72℃延伸8min,4℃保存。PCR扩增产物用1.0%的琼脂糖检测。电泳后胶回收PCR产物,如图1所示,将产物连接到T载体后转入E.coliDH-5α,得到带有细菌16S rDNA的转化子,将转化子大肠杆菌送华大基因公司进行测序。利用BLAST将所测得的序列与GenBank数据库中已登录的序列进行同源性序列比对,从数据库中得到相关种属16S rDNA序列信息,利用MEGA5.2进行系统发育分析并构建系统进化树,如图2所示。
鉴定结果:菌株Garciella sp.wxz01的16S rDNA序列长度为1390bp,其序列提交至GenBank获得的注册号是KM044264,利用BLAST搜索与所得到的序列相似性高的序列,该菌的序列与Garciella sp.EMZY-1的相似性达到99%,通过MEGA软件构建系统进化树,结合其形态鉴定及生理生化实验结果,确定该菌是硫酸盐还原菌,属于梭菌科中的一个新属Garciella sp.。
为验证本实施方式Garciella sp.wxz01的功能,进行以下实验:
用注射器吸取10mL菌液接种在含有改良的Starkey培养基的厌氧瓶里,在37℃的恒温培养箱中静置培养5天,然后加入1mL 0.1MAgNO3溶液避光培养15天,将培养液在5000rpm的条件下离心收集菌体,利用HITACHI H-7650仪器在80kV下进行成像;结果如图3所示,该细菌合成了Ag/AgCl纳米颗粒,大部分呈球形,小部分有团聚现象,由此可见本实施方式筛选出的菌株,是一株可制备Ag/AgCl纳米颗粒的硫酸盐还原菌。
用注射器吸取10mL菌液接种在含有改良的Starkey培养基的厌氧瓶里,在37℃的恒温培养箱中静置培养5天,然后加入1mL 0.1MAgNO3溶液避光培养15天,将培养液在5000rpm的条件下离心收集菌体沉淀,然后在真空烘箱中烘干24h,干燥后产物放入马弗炉,400℃煅烧1h,得到粒径为10~40nm的Ag/AgCl纳米颗粒。将得到的Ag/AgCl纳米颗粒直接装载在XRD样品载片上,进行XRD分析。X-射线由功率为1.6KW(40KV,40mM)的铜X-射线管产生。在2θ为20-80度之间进行测量。如图4所示,所得光谱2θ值峰值在27.831°,32.243°,46.233°,54.478°,57.478°,67.471°,74.471°和76.734°对应(111)、(200)、(220)、(311)、(222)、(400)、(311)和(420)面观察到Ag/AgCl衍射峰的存在。
Claims (1)
1.一株制备Ag/AgCl纳米颗粒的硫酸盐还原菌,其特征在于该菌株为Garciellasp.wxz01,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址是北京市朝阳区北辰路1号院3号,保藏日期为2014年7月3日,保藏编号为CGMCC No:9410。
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