CN112029677B - 一种高产生物纳米磁颗粒的gkrz弧菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌，该高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌的保藏编号为CGMCC No.19304；该GKRZ弧菌可以大规模工业发酵培养，生长周期短，具体为48小时，高产生物纳米磁颗粒，每1g菌体产生物纳米磁颗粒25‑30mg，产出的生物纳米磁颗粒可用于体内外诊断试剂及药物载体等用途。

Description

一种高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌及其应用。
背景技术
生物纳米磁颗粒一般具有超强的顺磁性，在磁场中能够迅速聚集，其次，粒径大小均匀，保证了足够强的磁响应性又不会沉降，再次，具有丰富的表面活性集团，可以与生化物质偶联，被广泛用于免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定等多个领域。
目前，生物纳米磁颗粒绝大部分来源为趋磁细菌，但趋磁细菌大部分生长缓慢，生存环境模拟困难，培养难度大，生产周期长，难以进行大规模的培养。
发明内容
本发明的目的是克服生物纳米磁颗粒生长缓慢、培养时间长、难以进行大规模培养的问题，筛选培育出新的生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌，并提供相应的生物纳米磁颗粒的提取方法以及生物纳米磁颗粒载药方面的研究。
本发明的具体技术方案如下：
本发明提供了一种高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌，该高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌的保藏编号为CGMCC No.19304，该菌株于2020年1月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株名称为GKRZ，拉丁文名称为Vibrio.sp。
该菌株革兰氏染色呈阴性，厌氧，嗜酸，弧杆状，大小为(0.4-0.6μm)x(1-3μm)，能够以硅酸盐为主要能源物质，在液体培养基和固体培养基中均能生长，菌液呈黑色，菌落为乳白色光滑菌落。
本发明的技术方案培养基包括以下几种：
本发明还提供了一种高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌液体培养基，包含以下组分：
每升含有3g的丙酮酸钠、0.1g的KH2PO4、0.15g的MgSO4.7H2O、0.34g的NaNO3、2.38g的羟乙基哌嗪乙硫磺酸、3g的豆饼粉、0.1g的酵母粉，调节pH值至6.0-7.0；培养温度为28℃。
本发明提供的菌株分离自京密引水渠的水样中并经过筛选传代获得。
本发明提供的菌株是从京密引水渠的水样中分离获得GKRZ弧菌，以5％-10％(v/v)的接种量将其接种于液体培养基中，在28℃条件下120rpm摇床培养18h至对数期备用，使用液体磁泳分离法筛选获得高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌。
上述高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌在生产重组生物纳米磁颗粒晶体中的应用。
上述高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌在载药中的应用。
上述高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌在制备体内外诊断试剂或试剂盒中的应用。
一种上述高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌的培育方法，该培育方法是将GKRZ弧菌接种于液体培养基中进行发酵培养。
进一步地，将GKRZ弧菌接种于液体培养基中进行发酵培养方法为：将GKRZ弧菌以(5)％-(10)％(v/v)的接种量将其接种于液体培养基中，在(28)℃条件下(120)rpm摇床培养至对数期。
本发明还提供了一种生产生物纳米磁颗粒的方法，该方法包括以下步骤：(1)培养权利要求1或2所述GKRZ弧菌；(2)离心收集菌体；(3)加入缓冲液均质破碎菌体，收集生物纳米磁颗粒；(4)加入缓冲液超声清洗，磁分离得到纯化的生物纳米磁颗粒。
进一步地，步骤(2)的离心速度为5000rpm，时间为10min，步骤(3)的缓冲液为PBS，缓冲液的加入量与GKRZ弧菌的质量比为10:1，步骤(4)的缓冲液为PBS，超声清洗的条件为40KHz，30min。
本发明还提供了一种制备生物纳米磁颗粒载药的方法，该方法包括以下步骤：S1培养权利所述GKRZ弧菌；S2用GKRZ弧菌制备生物纳米磁颗粒；S3将生物纳米磁颗粒与药品偶联。
进一步地，药品为妥珠单抗，步骤S3的具体操作为：取质量比为1:1的生物纳米磁颗粒与SPDP超声偶联，每次超声1min，重复30次，用pH为7.4的PBS清洗三遍；加入与生物纳米磁颗粒和SPDP等量的重组SPA超声偶联，每次超声1min，重复30次，用pH为7.4的PBS清洗三遍；再加入与生物纳米磁颗粒和SPDP等量的曲妥珠单抗进行偶联，置于37℃的摇床中混合2h，即得。
其中，SPDP为3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。
本发明还提供了一种筛选上述高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌的方法，该方法是使用液体磁泳分离法筛选获得高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌。
具体的，可以使用Race-track液体磁泳分离，分离时间为20min，
本发明提供的高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌可以大规模工业发酵培养，生长周期短，具体为48小时，高产生物纳米磁颗粒，每1g菌体产生物纳米磁颗粒25-30mg，产出的生物纳米磁颗粒可用于体内外诊断试剂及药物载体等用途。
附图说明
图1.示出了高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌(放大倍率为30000x)显微镜照片；
图2.示出了高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌(放大倍率为80000x)显微镜照片。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌及其应用，利用液体磁泳分离法筛选得到的，可以大规模工业发酵培养，具有生长周期短、易于培养等优点，生长周期为48小时，每1g菌体产生物纳米磁颗粒25-30mg，产出的生物纳米磁颗粒可用于体内外诊断试剂及药物载体等用途。
本实施例的高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19304，
本实施例的高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌从京密引水渠的水样中分离获得。
以5％-10％(v/v)的接种量将其接种于液体培养基中，在28℃条件下120rpm摇床培养18小时至对数期，使用液体磁泳分离法筛选获得高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌，其中，液体培养基的成分如下：每升含有3g的丙酮酸钠、0.1g的KH2PO4、0.15g的MgSO4.7H2O、0.34g的NaNO3、2.38g的羟乙基哌嗪乙硫磺酸、3g的豆饼粉、0.1g的酵母粉，调节pH值至6.0-7.0；培养温度为28℃。
实施例2高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌液体磁泳分离
取实施例1中培养的对数增长期的菌液，用微孔滤膜过滤(孔径为0.22μm)，得到高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌；
本发明通过液体磁泳分离的方法，经67代筛选，最终得到了高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌。
本发明高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌已于2020年1月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.19304。
以上的高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌，经鉴定，具有如下特征：
革兰氏染色呈阴性，厌氧，嗜酸，弧杆状，大小为(0.4-0.6μm)x(1-3μm)，能够以硅酸盐为主要能源物质，在液体培养基和固体培养基中均能生长，菌液呈黑色，菌落为乳白色光滑菌落，生长最适温度为28℃，生长最适pH值为6.5。
实施例3
本实施例提供了一种生物纳米磁颗粒的提取方法，该方法包括以下步骤：
(1)通过实施例1的方法培养GKRZ弧菌；
(2)以5000rpm的速度离心10min，收集菌体；
(3)加入PBS缓冲液均质破碎菌体，缓冲液的加入量与GKRZ弧菌的质量比为10:1，收集生物纳米磁颗粒；
(4)加入PBS缓冲液超声清洗，超声清洗的条件为40KHz，30min，磁分离得到纯化的生物纳米磁颗粒。
实施例4
本实施例提供了一种将生物纳米磁颗粒与药品偶联的方法，该药品为为妥珠单抗，该方法包括以下步骤：取1mg实施例1制备的生物纳米磁颗粒与1mgSPDP超声偶联，每次超声1min，重复30次，用pH为7.4的PBS清洗三遍；加入1mg重组SPA超声偶联，每次超声1min，重复30次，用pH为7.4的PBS清洗三遍；再加入1mg曲妥珠单抗进行偶联，置于37℃的摇床中混合2h，即得。
使用本实施例的方法偶联妥珠单抗，包封率达到90％，较标准包封率提高了30％，载药量达到90％，较标准载药量提高了50％。
实施例5
本实施例收集实施例1培养至对数增长期的GKRZ弧菌，并观察菌体内部生物纳米磁颗粒含量，同时观察普通的GKRZ弧菌内的生物纳米磁颗粒含量，结果发现，实施例1的GKRZ弧菌内含有30-50个生物纳米磁颗粒，而普通的GKRZ弧菌内含有10-25个生物纳米磁颗粒，由此可以证明，本发明提供的GKRZ弧菌的生物纳米磁颗粒产量较普通的GKRZ弧菌具有显著提高。
综上，仅为本发明之较佳实施例，不以此限定本发明的保护范围，凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆为本发明专利涵盖的范围之内。

Claims (7)

1.一种高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌，其特征在于，所述高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌的保藏编号为CGMCC No.19304。
2.如权利要求1所述的高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌，其特征在于，革兰氏染色呈阴性，厌氧，嗜酸，弧杆状，大小为(0.4-0.6μm)x(1-3μm)，能够以硅酸盐为主要能源物质，在液体培养基和固体培养基中均能生长，菌液呈黑色，菌落为乳白色光滑菌落。
3.权利要求1或2所述高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌在生产重组生物纳米磁颗粒晶体中的应用。
4.权利要求1或2所述高产生物纳米磁颗粒的GKRZ弧菌的培育方法，其特征在于，所述培育方法是将GKRZ弧菌接种于液体培养基中进行发酵培养。
5.一种生产生物纳米磁颗粒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)培养权利要求1或2所述GKRZ弧菌；(2)离心收集菌体；(3)加入缓冲液均质破碎菌体，收集生物纳米磁颗粒；(4)加入缓冲液超声清洗，磁分离得到纯化的生物纳米磁颗粒。
6.一种制备生物纳米磁颗粒载药的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1培养权利要求1或2所述GKRZ弧菌；S2用GKRZ弧菌制备生物纳米磁颗粒；S3将生物纳米磁颗粒与药品偶联。
7.根据权利要求6所述制备生物纳米磁颗粒载药的方法，其特征在于，所述药品为妥珠单抗，步骤S3的具体操作为：取质量比为1:1的生物纳米磁颗粒与SPDP超声偶联，每次超声1min，重复30次，用pH为7.4的PBS清洗三遍；加入与生物纳米磁颗粒和SPDP等量的重组SPA超声偶联，每次超声1min，重复30次，用pH为7.4的PBS清洗三遍；再加入与生物纳米磁颗粒和SPDP等量的曲妥珠单抗进行偶联，置于37℃的摇床中混合2h，即得。
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