CN115141760A - 一种桦褐孔菌发酵提取液及其制备方法和在制备化妆品中的应用 - Google Patents

一种桦褐孔菌发酵提取液及其制备方法和在制备化妆品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种桦褐孔菌发酵提取液及其制备方法和在制备化妆品中的应用，属于生物化工领域。上述桦褐孔菌(Inonotus obliquus)，保藏编号为CGMCC No.23897。上述制备方法包括：(1)利用所述的桦褐孔菌发酵培养，获取桦褐孔菌发酵液；其中，发酵培养基包括以下组分：葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、透明质酸和水；(2)将所述桦褐孔菌发酵液复配二元醇后，加热，冷却后离心，收集上清液；(3)将所述上清液复配二元醇后，过滤，得到桦褐孔菌发酵提取液。该方法生产工艺简单，成本低，易于工业化生产。所制备的桦褐孔菌发酵提取物具有保湿、抗衰修复和美白功能，能够应用到化妆品中。

Description

一种桦褐孔菌发酵提取液及其制备方法和在制备化妆品中的 应用
技术领域
本发明涉及生物化工领域，特别是涉及一种桦褐孔菌发酵提取液及其制备方法和在制备化妆品中的应用。
背景技术
桦褐孔菌(Inonotus obliquus)是一种生于桦树上的药用型真菌，其子实体呈现类似于碳的黑色块状形态，野生的桦褐孔菌主要生长在俄罗斯的西伯利亚地区、日本北海道、芬兰和我国吉林长白山地区和黑龙江大、小兴安岭地区。
桦褐孔菌成分复杂，主要成分有多糖、三萜类化合物、甾醇类、生物碱等，大量药理实验表明其具有抗氧化、调节血脂、抗癌症、治疗糖尿病、抗病毒、抗衰老和增强免疫力等作用。此外，桦褐孔菌对呕吐、腹泻、胃肠功能紊乱、胃及十二指肠溃疡、肝炎、胃炎和肾炎有一定的治疗作用。对因不合理的饮食而导致的骨质方面的疾病有一定的预防和治疗作用。
然而，随着人们对于桦褐孔菌的认知，桦褐孔菌的需求量逐年上升，野生桦褐孔菌供不应求。因此，人们寄希望于通过桦褐孔菌的人工培养来满足桦褐孔菌日益增长的需求，其中，液体发酵技术生产桦褐孔菌因与人工种植相比较为易于实现规模化生产而在近年较受关注。
桦褐孔菌在食品、保健品和药品中都已经有一定的应用，但在日化用品领域，桦褐孔菌主要来源是通过物理和化学法提取得到桦褐孔菌提取物，例如：中国专利CN112888425A介绍了天然的桦褐孔菌的水提取物用于眼周出现黑眼圈和增加皮肤光泽度的特性。专利CN110430865 A介绍了非发酵来源的的桦褐孔菌能够改善皮肤外观。但是上述专利中存在主要缺点在于：天然野生的桦褐孔菌属于稀有资源，价格昂贵，来源不稳定，提取物颜色较深，脱色困难，在化妆品中应用受到限制；化学提取过程中会有部分有机溶剂的残留，对皮肤和人体有害，同时对环境可能造成污染。目前桦褐孔菌液体发酵产品多应用于食品和保健品领域，在化妆品领域研究报道很少。例如：中国专利CN110527702A公开了一种利用诱变获得的桦褐孔菌菌株生产桦褐孔菌多糖的方法，该方法虽然原料成本低，但是生产过程中工艺复杂，能耗和生产成本高，产品中可能会有重金属和工艺中的溶剂残留风险。专利CN104099385B公开了一种深层液态发酵生产桦褐孔菌胞外多糖的方法，如果该产品应用于化妆品，缺点在于：培养基中的蚕蛹粉味道腥臭，发酵液难于直接涂抹皮肤，若发酵液经过醇沉浓缩等工艺处理，使用了大量有机溶剂，并且产生大量废液，导致产品成本大大增加。
鉴于目前以桦褐孔菌发酵提取物开发原料主要有以下不足：(1)桦褐孔菌发酵提取物主要应用于保健品和药品，并无化妆品应用的相关专利报道。(2)现有桦褐孔菌发酵时间长，发酵产物气味大，无法应用于化妆品，或者后处理工艺复杂，用于化妆品原料开发成本高。亟需开发一种非天然桦褐孔菌来源的发酵提取物，以解决目前生物发酵存在的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种桦褐孔菌，该菌株通过分离筛选得到，并且经过发酵提取得到的发酵提取物应用到化妆品制备中。
本发明还有一个目的是提供桦褐孔菌发酵提取物的制备方法，该方法生产工艺简单，成本低，易于工业化生产。
本发明还有一个目的是提供桦褐孔菌或其发酵提取物在化妆品中的应用，该桦褐孔菌发酵提取物经过实验验证具有保湿和抗衰修复功能，能够应用到化妆品中。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种桦褐孔菌(Inonotus obliquus)，所述桦褐孔菌的保藏编号为CGMCC No.23897，保藏时间为2021年12月28日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明还提供一种桦褐孔菌发酵提取液的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用所述的桦褐孔菌发酵培养，获取桦褐孔菌发酵液；其中，发酵培养基包括以下组分：葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、透明质酸和水；
(2)将所述桦褐孔菌发酵液加入二元醇I后，加热，冷却后离心，收集上清液；
(3)将所述上清液加入二元醇II后，过滤，得到桦褐孔菌发酵提取液。
优选的是，步骤(1)中，所述发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖20-50g/L、酵母提取物1-5g/L、蛋白胨0-5g/L、磷酸二氢钾0.2-1g/L，硫酸镁0.1-0.5g/L、透明质酸0.1-0.3g/L和水1L。
优选的是，步骤(1)中，发酵培养条件为：培养温度为25-34℃，培养时间为3-8天，转速为200-400转/分钟，通气量为0.5-3vvm，pH值为6-7。
优选的是，步骤(1)中，发酵培养之前，先利用所述桦褐孔菌制备种子液，具体包括以下步骤：
将所述桦褐孔菌按照接种量2％-5％接种于种子培养基，25-34℃培养2-4天，得到种子液；所述种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖20-50g/L、酵母提取物1-5g/L、蛋白胨0-5g/L、磷酸二氢钾0.2-2g/L，硫酸镁0.1-1g/L和水1L。
优选的是，步骤(2)中，所述二元醇I的添加量为所述桦褐孔菌发酵液总质量的6wt％-18wt％，所述二元醇I包括1,3-丙二醇或1,3丁二醇中的至少一种。二元醇I的作用是助提取和稳定剂；
优选的是，步骤(2)中，加热条件为：90℃下加热1-2h。
优选的是，步骤(3)中，所述二元醇II的添加量为所述桦褐孔菌发酵液总质量的2wt％-4wt％，所述二元醇II包括1,2-戊二醇和1,2-己二醇中的至少一种。二元醇II的作用是防腐剂。
本发明还提供所述的制备方法制备的桦褐孔菌发酵提取液。
本发明还提供所述的桦褐孔菌，或所述的制备方法，或所述的桦褐孔菌发酵提取液在制备具有保湿、抗衰修复和美白功能的化妆品中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过分离筛选得到一株新的桦褐孔菌，利用该桦褐孔菌进行发酵提取，相比于种植或者野生的桦褐孔菌，该方法得到的桦褐孔菌发酵提取液更绿色、污染少，也不存在农药或溶剂残留等问题，安全性高。
与现有的桦褐孔菌发酵工艺相比，本发明制备发酵提取液的生产周期短、工艺简单、成本低。还可以直接应用于化妆品添加剂中，使桦褐孔菌发酵产物得到充分利用。
经过实验验证，本发明制备的发酵提取液具有保湿、抗衰修复和美白等化妆品功效，这为作为化妆品添加剂使用奠定理论基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为桦褐孔菌在发酵48h下的镜检图(40倍镜)；
图2为桦褐孔菌发酵提取液处理前的细胞状态；
图3为无血清培养基培养后的细胞状态；
图4为5％桦褐孔菌发酵提取液处理后的细胞状态；
图5为10％桦褐孔菌发酵提取液处理后的细胞状态。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1桦褐孔菌菌种分离鉴定
1.分离纯化
选取产自吉林省白山市长白山谷地的干净新鲜的桦褐孔菌子实体，用干燥氮气吹去表面的灰尘等杂物。在无菌操作台的酒精灯火焰的无菌区域内，用消毒后的手术刀切取子实体内部约麦粒大小子实体块若干，接种到装有PDA培养基斜面试管，且要将子实体块尽量埋入培养基表层之下，每个子实体分离5支试管并逐一编号。将试管置于25℃恒温培养箱中培养，观察其萌发情况和生长特性，选取无杂菌污染，菌丝生长粗壮旺盛的试管进行转接培养，连续几代后得到长势较好的4株纯化菌株。
2.菌株筛选
配制包括以下质量浓度的组分的培养基：葡萄糖20g/L、酵母提取物1g/L、磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L和水1L。将分离得到的4株桦褐孔菌菌株分别按照2％接种于5个装有培养基的三角瓶中，在摇床转速150rpm、25℃下培养。10天后检查三角瓶内菌落外观，取菌丝球浓密、健壮、均匀、无污染的菌株进行交叉复配，并再次筛选得到生长量最优的菌株。
3.菌种鉴定
将筛选后的菌株用CTAB法提取DNA，并用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增，经凝胶成像系统检测后将PCR反应产物进行测序。采用GenBank对测得的ITS区段DNA序列在DNA序列数据库中搜索并进行比较分析，其结果显示，菌株与Inonotus obliquus相对比的Per.Ident分别达到99.31％，结合其形态学特征判断该菌株为桦褐孔菌。
如图1所示，桦褐孔菌发酵培养48h，用40倍镜显微镜观察其形态特征。
本发明分离筛选得到的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)菌株已于2021年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23897。
实施例2桦褐孔菌发酵提取物的制备方法
(1)种子液的制备
将实施例1分离得到的桦褐孔菌按照接种2％接种于种子培养基，摇床转速150rpm，在25℃下培养2天，得到种子液；上述种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖20g/L、酵母提取物1g/L、磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L和水1L。
(2)发酵液的制备
将上述种子液按照接种量8％接种于含有无菌发酵培养基的发酵罐中，搅拌转速200rpm，通气量为0.5vvm，pH控制在6(优选精氨酸微调pH)，25℃下培养3天，得到桦褐孔菌发酵液(发酵终点为酶电极法测定发酵液中的葡萄糖含量小于2g/L；镜检无杂菌)；发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖20g/L、酵母提取物1g/L、磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L、透明质酸0.1g/L和水1L。
(3)第一次复配
按照1，3-丁二醇的添加量为桦褐孔菌发酵液总质量的6wt％，将两者进行复配，90℃加热1h，冷却后，4000rpm离心20min，得到上清液。
(4)第二次复配
按照1,2-己二醇的添加量为桦褐孔菌发酵液总质量2wt％，将1,2-乙二醇和上清液复配，之后用0.22μm的滤膜过滤，得到桦褐孔菌发酵提取液S1。
实施例3桦褐孔菌发酵提取物的制备方法
(1)种子液的制备
将实施例1分离得到的桦褐孔菌按照接种2％接种于种子培养基，摇床转速150rpm，在31℃下培养3天，得到种子液；上述种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖20g/L、酵母提取物4g/L、磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L和水1L。
(2)发酵液的制备
将上述种子液按照接种量10％接种于含有无菌发酵培养基的发酵罐中，搅拌转速200rpm，通气量为1vvm，pH控制在6.5，31℃下培养4天，得到桦褐孔菌发酵液(发酵终点为酶电极法测定发酵液中的葡萄糖含量小于2g/L；镜检无杂菌)；发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖40g/L、酵母提取物4g/L、磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L、透明质酸0.1g/L和水1L。
(3)第一次复配
按照1,3-丁二醇的添加量为桦褐孔菌发酵液总质量的10wt％，将两者进行复配，90℃加热1h，冷却后，4000rpm离心20min，得到上清液。
(4)第二次复配
按照1,2-己二醇和1,2-戊二醇(1,2-己二醇和1,2-戊二醇体积比为1:1)的添加量为桦褐孔菌发酵液总质量2wt％，将1,2-乙二醇、1,2-戊二醇和上清液复配，之后用0.22μm的滤膜过滤，得到桦褐孔菌发酵提取液S2。
实施例4桦褐孔菌发酵提取物的制备方法
(1)种子液的制备
将实施例1分离得到的桦褐孔菌按照接种2％接种于种子培养基，摇床转速150rpm，在31℃下培养3天，得到种子液；上述种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖30g/L、酵母提取物2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L和水1L。
(2)发酵液的制备
将上述种子液按照接种量10％接种于含有无菌发酵培养基的发酵罐中，搅拌转速200rpm，通气量为1vvm，pH控制在6.5，31℃下培养4天，得到桦褐孔菌发酵液(发酵终点为酶电极法测定发酵液中的葡萄糖含量小于2g/L；镜检无杂菌)；发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖30g/L、酵母提取物2g/L、磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.3g/L、透明质酸0.2g/L和水1L。
(3)第一次复配
按照1，3-丁二醇的添加量为桦褐孔菌发酵液总质量的12wt％，将两者进行复配，90℃加热1h，冷却后，4000rpm离心20min，得到上清液。
(4)第二次复配
按照1,2-己二醇和1,2-戊二醇(1,2-己二醇和1,2-戊二醇体积比为1:1)的添加量为桦褐孔菌发酵液总质量2.5wt％，将1,2-乙二醇、1,2-戊二醇和上清液复配，之后用0.22μm的滤膜过滤，得到桦褐孔菌发酵提取液S3。
实施例5桦褐孔菌发酵提取物的制备方法
(1)种子液的制备
将实施例1分离得到的桦褐孔菌按照接种2％接种于种子培养基，摇床转速180rpm，在25℃下培养3天，得到种子液；上述种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖40g/L、酵母提取物3g/L、磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L和水1L。
(2)发酵液的制备
将上述种子液按照接种量10％接种于含有无菌发酵培养基的发酵罐中，搅拌转速300rpm，通气量为2vvm，pH控制在6.5，25℃下培养8天，得到桦褐孔菌发酵液(发酵终点为酶电极法测定发酵液中的葡萄糖含量小于2g/L；镜检无杂菌)；发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖40g/L、酵母提取物3g/L、磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.4g/L、透明质酸0.2g/L和水1L。
(3)第一次复配
按照1，3-丁二醇的添加量为桦褐孔菌发酵液总质量的15wt％，将两者进行复配，90℃加热1h，冷却后，4000rpm离心20min，得到上清液。
(4)第二次复配
按照1,2-己二醇和1,2-戊二醇(1,2-己二醇和1,2-戊二醇体积比为1:1)的添加量为桦褐孔菌发酵液总质量2.5wt％，将1,2-乙二醇、1,2-戊二醇和上清液复配，之后用0.22μm的滤膜过滤，得到桦褐孔菌发酵提取液S4。
实施例6桦褐孔菌发酵提取物的制备方法
(1)种子液的制备
将实施例1分离得到的桦褐孔菌按照接种2％接种于种子培养基，摇床转速180rpm，在25℃下培养3天，得到种子液；上述种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖45g/L、酵母提取物4g/L、磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L和水1L。
(2)发酵液的制备
将上述种子液按照接种量10％接种于含有无菌发酵培养基的发酵罐中，搅拌转速350rpm，通气量为2.5vvm，pH控制在6.5，31℃下培养3天，得到桦褐孔菌发酵液(发酵终点为酶电极法测定发酵液中的葡萄糖含量小于2g/L；镜检无杂菌)；发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖45g/L、酵母提取物4g/L、磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L、透明质酸0.2g/L和水1L。
(3)第一次复配
按照1，3-丁二醇的添加量为桦褐孔菌发酵液总质量的12wt％，将两者进行复配，90℃加热2h，冷却后，4000rpm离心20min，得到上清液。
(4)第二次复配
按照1,2-己二醇和1,2-戊二醇(1,2-己二醇和1,2-戊二醇体积比为1:1)的添加量为桦褐孔菌发酵液总质量3wt％，将1,2-乙二醇、1,2-戊二醇和上清液复配，之后用0.22μm的滤膜过滤，得到桦褐孔菌发酵提取液S5。
实施例7桦褐孔菌发酵提取物的制备方法
(1)种子液的制备
将实施例1分离得到的桦褐孔菌按照接种2％接种于种子培养基，摇床转速180rpm，在34℃下培养4天，得到种子液；上述种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖50g/L、酵母提取物4g/L、蛋白胨5g/L、磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1g/L和水1L。
(2)发酵液的制备
将上述种子液按照接种量10％接种于含有无菌发酵培养基的发酵罐中，搅拌转速400rpm，通气量为3vvm，pH控制在7，34℃下培养8天，得到桦褐孔菌发酵液(发酵终点为酶电极法测定发酵液中的葡萄糖含量小于2g/L；镜检无杂菌)；发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖50g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨5g/L、磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L、透明质酸0.3g/L和水1L。
(3)第一次复配
按照1，3-丁二醇的添加量为桦褐孔菌发酵液总质量的18wt％，将两者进行复配，90℃加热2h，冷却后，4000rpm离心20min，得到上清液。
(4)第二次复配
按照1,2-己二醇和1,2-戊二醇(1,2-己二醇和1,2-戊二醇体积比为1:1)的添加量为桦褐孔菌发酵液总质量4wt％，将1,2-乙二醇、1,2-戊二醇和上清液复配，之后用0.22μm的滤膜过滤，得到桦褐孔菌发酵提取液S6。
实施例8桦褐孔菌发酵提取物的制备方法
与实施例4的区别在于：第一次复配时用1,3-丙二醇替换1,3丁二醇，其他步骤均相同。最终得到桦褐孔菌发酵提取液S7。
实施例9桦褐孔菌发酵提取物的制备方法
与实施例4的区别在于：第一次复配时用1,3-丙二醇和1,3丁二醇按照体积比1:1混合后替换1,3丁二醇，其他步骤均相同。最终得到桦褐孔菌发酵提取液S8。
实施例10桦褐孔菌发酵提取物的制备方法
与实施例4的区别在于：第二次复配时用1,2-戊二醇替换1，2-戊二醇和1,2-己二醇，其他步骤均相同。最终得到桦褐孔菌发酵提取液S9。
实施例11桦褐孔菌发酵提取物的制备方法
与实施例4的区别在于：第二次复配时用1,2-己二醇替换1,2-戊二醇和1,2-己二醇，其他步骤均相同。最终得到桦褐孔菌发酵提取液S9。
实施例12桦褐孔菌发酵提取液理化性质测定
外观和气味采用直接观测法。多糖含量为总糖含量-发酵液中葡萄糖含量，其中总糖含量测试方法为苯酚-硫酸法，葡萄糖含量用酶电极法，测试仪器为SBA生物传感分析仪(山东省科学院微生物研究所)。
结果如表1所示，桦褐孔菌发酵提取液外观呈现淡黄色、黄色或者深黄色，均无特殊气味，多糖含量在2.00-4.52mg/ml；其中桦褐孔菌发酵提取液S4的多糖含量最高，桦褐孔菌发酵提取液S6的多糖含量最最低。
表1桦褐孔菌发酵提取液理化性质测定结果
Figure BDA0003810587960000091
Figure BDA0003810587960000101
实施例13桦褐孔菌发酵提取物对Hacat细胞的增殖作用
培养人永生化角质形成细胞(HaCaT)汇聚到70％-80％时(处于指数生长期)，用0.25％胰蛋白酶消化，从细胞培养皿壁上消化下的游离细胞离心后加入培养基制成悬浊液，用细胞计数板计数所得细胞悬液细胞数量，然后稀释到8×106个/mL的浓度，在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)，置于37℃，5％CO2条件下培养。24h后换液，向每个孔加入100μL含有不同浓度待测桦褐孔菌发酵提取物S4溶液的培养基继续培养24h。培养结束后，弃去原有培养基，加入含有10％的CCK-8培养4h，用酶标仪在450nm处测定OD值。增值率按以下公式计算：
增值率＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100％ 公式(1)
其中，A(加药)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的OD值；A(0加药)：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的OD值；A(空白)：没有细胞的孔的OD值。
表2增殖率
Figure BDA0003810587960000102
实施例14桦褐孔菌发酵提取物对Hacat细胞的修复作用
细胞划痕法是简捷测定细胞修复能力的方法，类似于体外伤口愈合模型，在6孔板中接种Hacat细胞，待细胞贴壁后使用10μl的枪头进行划痕处理，使用无血清配制的待测样品培养24h，拍照，划线，观察周边细胞的生长迁移能力，设定处理前，对照组：无血清培养基；实验组：5％和10％桦褐孔菌发酵提取液S4，判断各组分对细胞的修复能力。
表3桦褐孔菌发酵提取液对细胞的修复能力
Figure BDA0003810587960000111
如表3以及图2-5可以看出，桦褐孔菌发酵提取液对Hacat细胞具有修复能力。
实施例15桦褐孔菌发酵提取液的保湿功效
HaCaT细胞：在超净工作台中，复苏HaCaT细胞，在细胞培养皿中达到80％以上融合时进行消化、然后混匀计数之后，以8000个/孔接种96孔板，共处理3*3个孔，分为3组并标记为A组、B组和C组，三组均以每孔100μL的10％FBS的DMEM培养液，37℃，5％CO2培养细胞。
A组为HaCaT细胞组；
B组为失水损伤细胞组：取B组在超净工作台中，使用真空泵或移液枪吸出上一步培养基，用10％无菌NaCl配制的新鲜DMEM培养液，其中每孔100μl培养液，NaCl体系浓度控制在3％，37℃，5％CO2培养0.5h，得到失水损伤细胞。
C组为修复细胞：使用不用的保湿原料作为待测样品(阳性对照：0.05％透明质酸钠溶液和0.1％透明质酸钠溶液；实验样品：5％桦褐孔菌发酵提取液S4和10％桦褐孔菌发酵提取液S4)，对HaCaT细胞进行防护；取C组在超净工作台中，使用真空泵或移液枪吸出HaCaT细胞铺板中的培养基，换成90μl的DMEM培养液+10μl的待测样品的培养基，37℃，5％CO2培养16h，后真空泵或移液枪吸出培养基，加入10％无菌NaCl配制的新鲜MEM培养液，其中培养液每孔100μl，NaCl体系浓度控制在3％，37℃，5％CO2培养0.5h，得到修复细胞。
通过CCK8法在波长450nm下，分别测试HaCaT细胞、失水损伤细胞和修复细胞的吸光度(OD)值，通过下述公式计算保湿功效：
保湿功效＝(OD修复细胞-OD失水损伤细胞)×ODHaCaT细胞×100％ 公式(2)
表4阳性样品对细胞活力影响的测定结果
Figure BDA0003810587960000112
Figure BDA0003810587960000121
表5桦褐孔菌发酵提取液对细胞活力影响的测定结果
Figure BDA0003810587960000122
表6不同样品保湿功效的测定结果
Figure BDA0003810587960000123
从表4-6可以看出，本发明制备的桦褐孔菌发酵提取液具有良好的抗衰和保湿功能。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种桦褐孔菌(Inonotus obliquus)，其特征在于，所述桦褐孔菌的保藏编号为CGMCC No.23897。
2.一种桦褐孔菌发酵提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用权利要求1所述的桦褐孔菌发酵培养，获取桦褐孔菌发酵液；其中，发酵培养基包括以下组分：葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、透明质酸和水；
(2)将所述桦褐孔菌发酵液加入二元醇I后，加热，冷却后离心，收集上清液；
(3)将所述上清液加入二元醇II后，过滤，得到桦褐孔菌发酵提取液。
3.如权利要求2所述的桦褐孔菌发酵提取液的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖20-50g/L、酵母提取物1-5g/L、蛋白胨0-5g/L、磷酸二氢钾0.2-1g/L、硫酸镁0.1-0.5g/L、透明质酸0.1-0.3g/L和水1L。
4.如权利要求2所述的桦褐孔菌发酵提取液的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，发酵培养条件为：培养温度为25-34℃，培养时间为3-8天，转速为200-400转/分钟，通气量为0.5-3vvm，pH值为6-7。
5.如权利要求2所述的桦褐孔菌发酵提取液的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，发酵培养之前，先利用所述桦褐孔菌制备种子液，具体包括以下步骤：
将所述桦褐孔菌按照接种量2％-5％接种于种子培养基，25-34℃培养2-4天，得到种子液；所述种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖20-50g/L、酵母提取物1-5g/L、蛋白胨0-5g/L、磷酸二氢钾0.2-2g/L、硫酸镁0.1-1g/L和水1L。
6.如权利要求2所述的桦褐孔菌发酵提取液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述二元醇的添加量为所述桦褐孔菌发酵液总质量的6wt％-18wt％，所述二元醇I包括1,3-丙二醇或1,3丁二醇中的至少一种。
7.如权利要求2所述的桦褐孔菌发酵提取液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，加热条件为：90℃下加热1-2h。
8.如权利要求2所述的桦褐孔菌发酵提取液的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述二元醇的添加量为所述桦褐孔菌发酵液总质量的2wt％-4wt％，所述二元醇II包括1,2-戊二醇和1,2-己二醇中的至少一种。
9.如权利要求1-8任一项所述的制备方法制备的桦褐孔菌发酵提取液。
10.如权利要求1所述的桦褐孔菌，或权利要求1-8任一项所述的桦褐孔菌发酵提取液的制备方法，或权利要求9所述的桦褐孔菌发酵提取液在制备具有保湿和抗衰修复功能的化妆品中的应用。
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