CN114456943A - 一株桦褐孔菌及其提取物及其应用 - Google Patents

一株桦褐孔菌及其提取物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株桦褐孔菌及其提取物及用途。该桦褐孔菌的保藏号为CGMCC No.20206，保藏日期为2020年6月17日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。本发明的桦褐孔菌具有生物量高和多糖产量高的优点，并且该桦褐孔菌的发酵液和胞内多糖能够高效清除自由基，具有显著的抗氧化活性。因此，本发明的桦褐孔菌表现出良好的美容、治疗或预防与自由基(例如羟基自由基和/或DPPH自由基)相关的皮肤症状的功效，可用于护肤品原料的开发，具有良好的应用前景。此外，本发明的桦褐孔菌还具有降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗衰老等活性，具有重要临床价值。

Description

一株桦褐孔菌及其提取物及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株桦褐孔菌及其提取物及其用途。
背景技术
桦褐孔菌(Inonotus obliquus)俗称白桦茸，属担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属。桦褐孔菌是一种珍稀的药用真菌，主要分布于俄罗斯、芬兰、波兰、日本以及中国黑龙江省和吉林省等北纬40°-50°的高寒地带。
野生桦褐孔菌常出现在极寒地区的白桦树上，生长周期长达十余年，数量少，优质的桦褐孔菌资源较难获得。
发明内容
发明人经大量研发工作，获得了一株桦褐孔菌及其提取物。该桦褐孔菌具有生物量高和多糖产量高的优点，该桦褐孔菌的提取物具有增强的自由基清除效果。
在一些方面，本公开提供一株桦褐孔菌，其保藏号为CGMCC No.20206，保藏日期为2020年6月17日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
在一些方面，本公开提供一株桦褐孔菌，其ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明桦褐孔菌具有高生物量。在一些实施方案中，通过液体深层发酵培养，本发明桦褐孔菌的生物量为40-50g/L，例如40-48g/L，40-46g/L，42-48g/L，或42-46g/L。在一些实施方案中，通过液体深层发酵培养，本发明菌株所得菌丝体生物量干重可达45g/L。在一些实施方案中，所述生物量通过实施例1中所述的方法测定。
本发明桦褐孔菌具有高多糖产量，特别是高胞内多糖产量。在一些实施方案中，通过液体深层发酵培养，本发明桦褐孔菌的胞内多糖产量为14-20g/L，例如14-19g/L，14-18g/L，15-19g/L，16-20g/L，或16-19g/L。在一些实施方案中，通过液体深层发酵培养，本发明菌株所得胞内多糖含量可达18g/L。在一些实施方案中，所述胞内多糖产量通过实施例1中所述的方法测定。
本发明桦褐孔菌(例如其发酵液或胞内多糖)能够高效清除自由基。在一些实施方案中，本发明桦褐孔菌的胞内多糖对DPPH自由基清除率的IC50为0.3-0.4mg/mL。在一些实施方案中，本发明桦褐孔菌的胞内多糖对DPPH自由基清除率的IC50为0.38mg/mL。在一些实施方案中，所述DPPH自由基清除率的IC50通过实施例2中所述的方法测定。在一些实施方案中，在使用浓度为0.5mg/mL时，本发明桦褐孔菌的胞内多糖对DPPH自由基清除率为60-80％，例如70-80％。在一些实施方案中，本发明桦褐孔菌的胞内多糖对DPPH自由基清除率为77.81±2.03％。在一些实施方案中，所述DPPH自由基清除率通过实施例2中所述的方法测定。
在一些方面，本公开提供上述任一项所述的桦褐孔菌或其后代的细胞或部分。在一些实施方案中，所述部分选自所述桦褐孔菌或其后代的营养体、繁殖体或其任意组合。在一些实施方案中，所述部分选自所述桦褐孔菌或其后代的菌丝体、菌核、孢子、子实体或其任意组合。在一些实施方案中，所述部分是所述桦褐孔菌或其后代的菌丝体。
在一些方面，本公开提供一种桦褐孔菌培养物，其包含：上述任一方面所述的桦褐孔菌或其后代、或所述桦褐孔菌或其后代的细胞或部分；以及培养基。所述培养物可以通过在培养基中且在培养条件下培养本发明的菌株或其后代、或其细胞或部分(例如营养体和/或繁殖体，例如菌丝体)来获得，并且本领域技术人员已知如何根据菌株性质选择合适的培养基及培养条件。在一些实施方案中，所述桦褐孔菌培养物是发酵液。
在一些实施方案中，所述培养基是液体培养基。在一些实施方案中，所述液体培养基含有如下成分：葡萄糖0-20g/L，麦芽糖0-15g/L，马铃薯淀粉10-40g/L，酵母浸粉(例如Nucel 845MG)5-15g/L，蛋白胨0-15g/L，磷酸二氢钾0.3-2g/L，硫酸镁0.1-1g/L，pH5.0-7.0。
在一些方面，本公开提供一种桦褐孔菌提取物，其来自上述任一方面所述的桦褐孔菌或其后代、或所述桦褐孔菌或其后代的细胞或部分。
在一些实施方案中，所述桦褐孔菌提取物包含上述任一方面所述的桦褐孔菌或其后代、或其细胞或部分、或前述任一项的处理物中分离的碳水化合物部分。
在一些实施方案中，所述碳水化合物部分包含多糖。
在一些实施方案中，所述碳水化合物部分含有至少80重量％(例如至少85重量％，至少90重量％，或至少95重量％)的单糖和/或多糖(优选多糖)。在一些实施方案中，所述碳水化合物部分含有至少80重量％(例如至少85重量％，至少90重量％，或至少95重量％)的多糖。
在一些实施方案中，多糖是指通过糖苷键彼此键合的至少两个单糖的链。
在一些实施方案中，多糖可具有直链或支链结构。
在一些实施方案中，多糖可包含含有4至6个碳原子的亚单位，例如选自包含以下的组的亚单位：甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖和果糖。
在一些实施方案中，多糖的分子量为5kDa至200kDa。
在一些实施方案中，多糖的分子量为约10kDa至约150kDa。
在一些实施方案中，所述碳水化合物部分包含桦褐孔菌的细胞内多糖。在一些实施方案中，所述碳水化合物部分基本上包含或者仅包含细胞内多糖。在此类实施方案中，所述碳水化合物部分优选地来自所述桦褐孔菌的菌丝体。在一些实施方案中，所述碳水化合物部分也可以包含细胞外多糖和/或细胞膜多糖。
在一些实施方案中，所述碳水化合物部分包含桦褐孔菌的细胞外多糖。在一些实施方案中，所述碳水化合物部分基本上包含或者仅包含细胞外多糖。在此类实施方案中，所述碳水化合物部分优选地来自所述桦褐孔菌的发酵液。
在一些实施方案中，所述碳水化合物部分不含氨基酸，肽，蛋白质，脂肪酸，脂质，核苷酸，核苷，核酸，合成中间体，代谢中间体及其混合物。
在一些实施方案中，所述分离是指浸泡提取。
在一些实施方案中，所述分离是指水浸泡提取。
在一些实施方案中，水浸泡提取是指以含水液体浸泡提取，含水液体的含水量为50wt％以上，例如60wt％以上，例如70wt％以上，例如80wt％以上，例如90wt％以上，例如95wt％以上，例如100wt％。
在一些实施方案中，所述桦褐孔菌或其后代、或所述桦褐孔菌或其后代的细胞或部分在培养基中经过培养(例如培养1天以上，例如5～10天)。在一些实施方案中，所述培养为液体深层发酵培养。
在一些实施方案中，所述提取物通过在培养基中培养本发明的桦褐孔菌或其后代、或其细胞或部分并分离培养产物而获得。在一些实施方案中，所述培养为液体深层发酵培养。
在一些实施方案中，所述培养基为液体培养基。在一些实施方案中，所述液体培养基含有如下成分：葡萄糖0-30g/L，麦芽糖0-15g/L，马铃薯淀粉10-40g/L，酵母浸粉(例如Nucel 845MG)5-15g/L，蛋白胨0-15g/L，磷酸二氢钾0.3-2g/L，硫酸镁0.1-1g/L，pH5.0-7.0。
在一些方面，本公开提供一种组合物，其在生理学上可接受的介质中包含上述任一项所述的提取物。
在一些实施方案中，组合物中提取物的含量为0.1～99.9wt％，例如0.1～10wt％，例如0.1～1wt％，例如0.5wt％。
在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。
在一些实施方案中，所述组合物是皮肤外用组合物。
在一些实施方案中，所述皮肤外用组合物是护肤化妆品组合物或抗衰老化妆品组合物。
在一些实施方案中，组合物还包含至少一种常用于美容和/或皮肤病学中的成分。
在一些实施方案中，生理学上可接受的介质是指与人角蛋白物质，特别是与皮肤相容的介质。
在一些实施方案中，组合物可以是水性，水性-醇或油性溶液，洗剂或血清类型的溶液或分散液，乳液类型(milktype)的液体或半液体稠度的乳液，通过将脂肪相分散在水相中(O/W)或反之亦然(W/O)而获得，或乳膏类型的软、半固体或固体稠度的悬浮液或乳液，水性或无水凝胶，微乳液，微胶囊，微粒或离子和/或非离子类型的泡囊分散体。
在一些实施方案中，生理学上可接受的介质是水。
在一些实施方案中，相对于组合物的总重量，水的含量的范围可以为5至99重量％，优选范围为20至95重量％，优选范围为40至95重量％。
在一些实施方案中，组合物可特别构成清洁，保护，治疗或护理霜，乳液，凝胶或摩丝。
本发明的组合物(例如皮肤外用组合物)可以用于局部或经皮施用，且可以任何固态、液态或半固态制剂产生。所述制剂包括但不限于，乳膏剂、乳剂(例如多重乳液，如水包油和/或水包聚硅氧烷乳剂、油包水和/或聚硅氧烷包水乳剂、水/油/水或水/聚硅氧烷/水型乳剂、或油/水/油或聚硅氧烷/水/聚硅氧烷型乳剂)、液晶、无水组合物、含水分散体、油、乳、香脂、泡沫、水性或油性洗液、水性或油性凝胶、膏霜、溶液、水醇溶液、水二醇溶液、水凝胶、搽剂、皂、洗发剂、调理剂、面膜、喷发剂、精华(serum)、多糖膜、软膏、摩丝、润发油、糊剂、脂粉、棒、笔、喷雾剂或气溶胶。
可以使用本领域技术人员已知的技术，将这些局部或经皮施加制剂并入不同类型的固态配件中，如且不限于绷带、纱布、T恤衫、袜子、紧身衣、内衣、腰带、手套、尿布、卫生巾、修整用物、床罩、抹布、黏性贴剂、非黏性贴剂、闭塞性贴剂、微电贴剂和/或面罩，或可以将它们并入不同的美容产品如美容粉底，如液体粉底和压缩粉底、卸妆洗液、卸妆乳、暗黑眼圈遮暇膏、眼影、唇膏、护唇用品、唇彩和香粉等。
本发明的组合物(例如皮肤外用组合物)还可以包含美容和/或皮肤病学中可接受的赋形剂、辅助剂和/或成分，例如湿润剂(如丙三醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、辛酰二醇、乳酸、脲、透明质酸钠)、柔润剂或皮肤调理剂(如聚二甲基硅氧烷、硬脂酸甘油酯、辛酸/癸酸甘油三酯、鲸蜡硬脂醇、卵磷脂、C12-15烷基苯甲酸酯、角鲨烷、羊毛脂、山嵛醇、醋酸生育酚、泛醇、牛油果脂、视黄醇棕榈酸酯、视黄醇)、表面活性剂(如黄原胶、月桂醇聚醚硫酸钠、硬脂酸、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、硬脂醇、鲸蜡醇、硬脂醇聚醚-2、鲸蜡硬脂醇醚-20、椰油酰胺丙基甜菜碱)，等等。
本发明的组合物(例如皮肤外用组合物)还可以包含增加本发明的桦褐孔菌提取物的经皮吸收的物质，例如且不限于二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、表面活性剂、氮酮(1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮)、醇、脲、乙氧基二甘醇、丙酮、丙二醇或聚乙二醇等。另外，本发明的组合物(例如皮肤外用组合物)可以借助离子导入、超声导入(sonophoresis)、电穿孔、微电贴剂、机械压力、渗透压梯度、闭锁性治疗、借助压力的微量注射或无针注射，如通过氧压力注射，或其任意组合，施加至待处理的局部区域以实现本发明提取物的更大穿透。施加区域将由待处理和/或防止的病状、病症和/或疾病的性质决定。
本发明的桦褐孔菌提取物可以掺入美容和/或皮肤病学中可接受的递送系统或持续释放系统，所述递送系统或持续释放系统选自脂质体、混合型脂质体、油质体(oleosomes)、囊泡(niosomes)、含醇脂质体(ethosomes)、毫米级粒子、微粒子、纳米粒子、固态脂质纳米粒子、海绵、环糊精、胶束、毫米球、微球和纳米球、脂质球、毫米胶囊、微胶囊和纳米囊、微乳液和纳米乳液；或者吸附在固态有机聚合物或固态无机支持物上，所述固态有机聚合物或固态无机支持物选自滑石、膨润土、二氧化硅、淀粉或麦芽糖糊精。
本发明的组合物还可以用于口服施用。用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂、酏剂等。用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、锭剂、粉剂、颗粒剂等。
在一些方面，本公开提供上述任一项所述的桦褐孔菌或其后代、所述桦褐孔菌或其后代的细胞或部分、上述任一项所述的提取物或上述任一项所述的组合物的用途，其用于与自由基(例如羟基自由基和/或DPPH自由基)相关的皮肤症状的美容、预防或治疗。
在一些方面，本公开提供上述任一项所述的桦褐孔菌或其后代、所述桦褐孔菌或其后代的细胞或部分、上述任一项所述的提取物或上述任一项所述的组合物用于制备药物(例如皮肤外用制品)的用途，所述药物是用于与自由基(例如羟基自由基和/或DPPH自由基)相关的皮肤症状的美容、预防或治疗的制品。在一些方面，本公开还提供用于美容、预防或治疗与自由基(例如羟基自由基和/或DPPH自由基)相关的皮肤症状的方法，其包括向由此需要的受试者施用本发明的提取物或组合物。在一些实施方案中，所述施用是经皮或局部施用。在一些实施方案中，向所述受试者的皮肤、粘膜、毛发或指甲施用本发明的提取物或组合物。
在一些实施方案中，与自由基(例如羟基自由基和/或DPPH自由基)相关的皮肤症状包括以下一种或多种：衰老、炎症等。
在一些实施方案中，本发明的提取物/组合物用于美容目的(纯美学目的)。
在一些实施方案中，“美容目的”不包括用于医学目的的治疗。
应理解，本领域已发现桦褐孔菌的多种生物学活性，包括降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗衰老等等。因此，本领域技术人员能够合理预期本发明的桦褐孔菌用于这些已知用途的技术效果。
因此，在一些方面，本公开还提供了上述任一项所述的桦褐孔菌或其后代、所述桦褐孔菌或其后代的细胞或部分、上述任一项所述的提取物或上述任一项所述的组合物(例如药物组合物)在制备药物中的用途，所述药物选自：降低血糖或治疗糖尿病(例如2型糖尿病)的药物、抗肿瘤(例如卵巢癌或肉瘤)药物、提高免疫力药物、镇咳和/或祛痰药物、抗炎药物(例如治疗肾炎的药物)、抗氧化药物或抗衰老药物。在一些实施方案中，所述药物包括本发明的桦褐孔菌提取物。在一些实施方案中，所述桦褐孔菌提取物包含细胞内多糖，所述细胞内多糖例如来自菌丝体。在一些实施方案中，所述桦褐孔菌提取物包含细胞外多糖，所述细胞外多糖例如来自发酵液。在一些方面，本公开还提供了一种方法，其用于：降低血糖或治疗糖尿病(例如2型糖尿病)、抗肿瘤(例如卵巢癌或肉瘤)、提高免疫力药物、镇咳和/或祛痰、抗炎(例如治疗与抗炎有关的疾病，例如治疗肾炎)、抗氧化(例如治疗与抗氧化有关的疾病)、或抗衰老(例如治疗与抗衰老有关的疾病)。所述方法包括向由此需要的受试者施用本发明的提取物或组合物(例如药物组合物)。在一些实施方案中，所述施用是口服施用。
在一些方面，本公开提供一种制备本发明的桦褐孔菌提取物的方法，包括以下步骤：
(1)提供本发明的桦褐孔菌或其后代、或其细胞或部分、或前述任一项的处理物；
(2)从步骤(1)所提供的物质中分离的碳水化合物部分。
在一些实施方案中，在步骤(1)中提供桦褐孔菌的菌丝体、或包含菌丝体的处理物。
在一些实施方案中，步骤(1)包括按照以下操作：
1a)将桦褐孔菌接种物接入液体培养基中，发酵培养，获得发酵液；
1b)从上一步的发酵液中分离桦褐孔菌或其细胞或部分(例如营养体和/或繁殖体，如菌丝体、菌核、孢子、子实体或其任意组合)。
在一些实施方案中，所述桦褐孔菌接种物包含桦褐孔菌细胞。在一些实施方案中，所述桦褐孔菌接种物包含本发明的桦褐孔菌或其后代、或其细胞或部分。在一些实施方案中，所述桦褐孔菌接种物包含桦褐孔菌的菌丝体。
在一些实施方案中，发酵采用的工艺为液体深层发酵培养。
在一些实施方案中，所述液体培养基含有如下成分：葡萄糖0-30g/L，麦芽糖0-15g/L，马铃薯淀粉10-40g/L，酵母浸粉(例如Nucel 845MG)5-15g/L，蛋白胨0-15g/L，磷酸二氢钾0.3-2g/L，硫酸镁0.1-1g/L，pH5.0-7.0。
在一些实施方案中，发酵的温度为25～35℃(例如30℃)。
在一些实施方案中，发酵过程中搅拌发酵液和/或向发酵液通气，通气量优选为0.8～1.2vvm(例如1vvm)。
在一些实施方案中，发酵的时间为5～10天(例如7天)。
在一些实施方案中，可以通过分子生物学、生物工程学、基因工程学领域中公知的一般方法进行制造菌体或其处理物。
在一些实施方案中，培养基是能够培养，并因此根据情况，使细胞生长的载体。原则上，细胞在这种培养基中寻得大量用于其快速繁殖的必要成分，有时也会寻得使特定菌属的真菌的生长受到青睐的元素，在这种情况下，真菌属于桦褐孔菌。
在一些实施方案中，培养基具有以下一项或多项特征：
-满足矿物离子和生长因子的需求并提供碳和能量源；
-pH值接近最佳pH值；
-具有最佳离子强度(培养基可以是等渗的，但这不是强制性的)。
在一些实施方案中，种子培养基或发酵培养基含有以下一种或多种成分：
-碳和能量源，通常由糖代表，优选地是葡萄糖；
-钾和磷源，就像例如K2HPO4；
-氮和硫源，其可以由化合物(NH4)2SO4代表；
-镁源，例如，MgCl2；
-钙源，例如CaCl2；
-铁源，更具体地是柠檬酸铁，柠檬酸盐具有将铁保持在溶液中的作用；
-微量元素源，尤其选自Cu，Zn，Co，Ni，B或Ti盐；
-水源，通常是无菌的，对所有生命形态都是必不可少的；以及
-pH缓冲剂，可以用KH2PO4代表。
在一些实施方案中，通过举例说明适合于根据本发明的微生物生长的发酵培养基，尤其可以提及下文实施例1中所示的培养基。
在一些实施方案中，步骤(2)包括以下操作：对步骤(1)所提供的物质进行浸泡提取，获得浸提液，再从浸提液中分离的碳水化合物部分。
在一些实施方案中，步骤(2)包括以下操作：
2a)对步骤(1)所提供的物质进行水浸泡提取，获得浸提液；
2b)在浸提液中加入醇(例如乙醇)，收集析出的沉淀物。
在一些实施方案中，浸泡提取的温度为40～60℃，例如55℃。
在一些实施方案中，步骤2a)和2b)之间还包括对浸提液进行浓缩的步骤。浓缩的方式可以是旋转蒸发浓缩。浓缩的温度可以是40～60℃。
在一些实施方案中，采用水提醇沉法从步骤(1)所提供的物质中分离提取物。
术语说明：
在本文中，“菌体”与“菌丝体”具有相同的含义，并且可互换使用。菌体可理解为存在于培养基的全菌体或从培养基中分离的全菌体。
桦褐孔菌的“浸提液”可以理解为桦褐孔菌或其细胞或部分(例如营养体和/或繁殖体)经浸提后获得的浸提液，也可以理解为含有桦褐孔菌或其细胞或部分(例如营养体和/或繁殖体)的液体培养基。在某些优选的实施方案中，浸提液是指菌体的浸提液。
桦褐孔菌的“处理物”可理解为对桦褐孔菌或其细胞或部分(例如营养体和/或繁殖体)进行以下一项或多项处理所得的产物：磨碎、粉碎、抽提、浓缩、糊化、干燥(喷雾干燥、冷冻干燥、真空干燥、滚筒干燥等)、稀释。在某些优选的实施方案中，处理物是指对全菌体进行处理后所得的产物。
桦褐孔菌的“培养产物”或“培养物”是指，将桦褐孔菌或其细胞或部分(例如营养体和/或繁殖体)在培养基中培养后获得的产物。在某些优选的实施方案中，培养产物是指对菌体进行培养后所得的产物。
桦褐孔菌的“提取物”是指从桦褐孔菌获得的任何级份，例如菌丝体、菌核、孢子、子实体、细胞上清液、细胞、细胞碎片、细胞壁、DNA提取物、酶或酶制备物，或通过化学、物理和/或酶处理从菌体产生的任何制备物，其基本上不含活菌。
桦褐孔菌的“接种物”是指包含桦褐孔菌细胞(例如桦褐孔菌的营养体和/或繁殖体，如菌丝体、菌核、孢子和/或子实体)的组合物，当条件(例如，温度、湿度、营养素可利用性、pH等)有利于萌发和/或生长时，该组合物能够在合适的生长培养基或基质上或其中繁殖/萌发。
真菌核糖体基因转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)，又叫内转录间隔区，是位于真菌核糖体DNA(rDNA)上18S和28S基因之间的区域片段，主要包括内转录间隔区1(ITS1)、5.8S rDNA、内转录间隔区2(ITS2)，其两侧分别是18S RNA基因和28S RNA基因。真菌ITS基因测序鉴定方法是本领域已知的。
在任一实施方案中，“包含”“包括”“含有”可以是指含量大于零，例如1％以上，例如10％以上，例如20％以上，例如30％以上，例如40％以上，例如50％以上，例如60％以上，例如70％以上，例如80％以上，例如90％以上，例如100％。当含量为100％时，“包含”“包括”“含有”的含义相当于“由…构成”。
有益效果
本公开一项或多项技术方案具有以下一项或多项有益效果：
(1)本发明的桦褐孔菌具有高生物量；
(2)本发明的桦褐孔菌具有高多糖产量(特别是高胞内多糖产量)；
(3)本发明的桦褐孔菌(例如其提取物或培养物)能够有效降低自由基，具有相比于现有技术菌株更高的DPPH自由基清除率和更低的DPPH自由基清除率IC50，显示出良好的抗氧化活性。
附图说明
图1示出桦褐孔菌YST02在PDA平板生长的照片。
图2示出光学显微镜下YST02菌丝体形状的照片。
关于生物材料保藏的说明
本发明涉及下列已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)进行保藏的生物材料：
桦褐孔菌(Inonotus obliquus)菌株YST02，其具有保藏号CGMCC No.20206，且保藏时间为2020年6月17日。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用药品或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
桦褐孔菌的原始野生菌核采集于中国黑龙江省漠河市大兴安岭林区，在实验室进行分离、鉴定、保藏和发酵培养。获得一株桦褐孔菌(Inonotus obliquus)，命名为桦褐孔菌YST02，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.20206。
使用真菌ITS基因测序鉴定方法对该菌株进行鉴定，所测ITS序列信息如SEQ IDNO:1所示。
TGTGCACGGCCTTTCGTGCTCAAATCCAACTCTCAAACCCCTGTGCACCTATACAAGTTGAAGGTCTTAGTAGTTTCTGTAATCGAACGGCAAGTCAAGTACGTCGAGTAATCAAGTACGAGGGTTTCGGCCCTTGGAAAGTGTGAAAGATGGAAAGGCAAGCTTCAGAGACAAGGAGACGAAAAGCTTTTGGCTTCATTACAAACACCAATATAATTGTTATGTGAATGAAATGCTCCTTGTGGGCGATAATAAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTAGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGTTAATCTCAAATCGCTCGTCTATTCTTAATTGGAGTGGCTTTCGATTTGGACTTGGAGGTTTTGCTGGCCCGGGCGACTTTGGTTGCCCTTGGTTTGTCGGCTCCTCTCAAATACATTAGCTGGACTTTGGTTCGCGTTTACGGTGTAATAATGTAATGTTCACTAAGACGCTTGCCTAACAAGTCTGCTTCTAATAG(SEQ ID NO:1)
桦褐孔菌YST02在实验室的保藏方法是，取1cm×1cm的菌块接种于马铃薯-葡萄糖琼脂固体培养基(PDA培养基)平板上，于恒温恒湿培养箱中培养，培养条件是28℃-30℃培养7-10天，而后置于4℃低温保存，每3个月传代1次。该菌在生长初期的菌丝呈白色、致密，后期分泌浅黄色色素，菌丝生长无锁状联合(附图1和附图2)。在PDA平板上培养6天后，菌苔直径达4.2±0.3cm，培养15天后，菌苔直径达8.3±0.4cm。
图1示出桦褐孔菌YST02在PDA平板生长的照片。
图2示出光学显微镜下YST02菌丝体形状的照片。
实施例1：桦褐孔菌YST02的生物量和胞内多糖产量
本实施例考察摇瓶和发酵罐两种发酵条件下，桦褐孔菌YST02的生物量和胞内多糖产量。具体步骤包括：平板培养-一级种子培养-二级种子培养-发酵培养四个阶段。
(1)平板培养：使用PDA培养基培养桦褐孔菌YST02，于恒温恒湿培养箱中，28℃恒温培养7天，菌苔长满；
(2)一级种子培养：将固体平板上的菌苔切割成1cm×1cm小菌块，取10块接入50ml种子培养基中，于摇床连续培养5天得到一级种子，摇床培养条件为28℃和180rpm；
(3)二级种子培养：将一级种子按10％接种量转接到400mL种子培养基中，于摇床连续培养4天获得二级种子，摇床培养条件与一级种子的培养条件相同；
(4)发酵培养：
(4-1)摇瓶发酵培养：将二级种子按照5％接种量接入装有500mL发酵培养基的2L摇瓶中，于摇床中连续发酵7天，发酵培养条件是30℃、150rp，发酵结束后测定生物量和胞内多糖产量；或
(4-2)发酵罐发酵培养：将上述方法制备的二级种子，按照5％接种量，接入装有28.5L发酵培养基的50L发酵罐中，搅拌转速200rpm,通气量1vvm，30℃发酵培养7天，发酵结束后测定生物量和胞内多糖产量。
其中，种子培养基配方为：1000mL去离子水，3％葡萄糖，1％Nucel 845MG(购自LESAFFRE)，0.1％磷酸二氢钾和0.05％无水硫酸镁，自然pH。
发酵培养基配方为：葡萄糖10g/L，麦芽糖5g/L，土豆淀粉40g/L，Nucel 845MG15g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，pH 5.5。
生物量的测定方法是：使用离心机将发酵液离心，离心条件为8000rpm，室温离心30min，弃上清，获得菌丝体；使用去离子水将菌丝体清洗3遍，而后置于热风干燥箱中，55℃烘干，称重，直至干重不再变化。生物量表示为：菌丝体干重(g)/发酵液体积(L)。
胞内多糖的测定方法是：取1g菌丝体研磨粉碎，加入10mL 1M NaOH溶液，在60℃水浴条件下溶解1h，而后将溶解液12000rpm离心10min，取上清，稀释50倍，用苯酚硫酸法测定多糖含量。多糖含量表示为：多糖量(g)/发酵液体积(L)。
测定结果如表1所示，结果显示，本发明的桦褐孔菌YST02具有高生物量，且胞内多糖产量高。
表1：摇瓶和发酵罐发酵桦褐孔菌YST02的生物量和胞内多糖产量
生物量(g/L) 胞内多糖(g/L)
2L摇瓶发酵 44.2±0.8 17.2±0.6
50L罐发酵 45±0.5 18±0.3
实施例2：桦褐孔菌YST02发酵液及胞内多糖的抗氧化活性测定
本实施例考察桦褐孔菌YST02的发酵液及胞内多糖溶液的抗氧化活性。
胞内多糖溶液的制备方法如下：从实施例1的发酵液中制备粉末状菌丝体，对1kg粉末状菌丝体依次以菌丝20倍重量、15倍重量、10倍重量进行3次水浸泡提取，提取温度为室温，每次提取2h，将三次水提液合并，55℃旋蒸浓缩至2L。于浓缩液中加入4倍体积95％乙醇醇沉，充分搅拌，4℃静置24h，使多糖充分沉淀，过滤收集沉淀。将所得沉淀置于真空烘箱中50℃干燥，得多糖固体，随后使用去离子水将所得多糖固体配制成0.5mg/mL的多糖溶液，待用。
取实施例1中制备的发酵液和上述方法制备的胞内多糖溶液各200μL，与200μL 2×10-4moL/L的DPPH乙醇溶液混匀后放在1.5ml离心管中进行反应，在室温下避光反应30min，取200μL至96孔酶标板中利用酶标仪于515nm下测定吸光值Ai，空白组以等体积的无水乙醇代替DPPH溶液，对照组以等体积的无水乙醇代替样品溶液，在515nm下测定吸光值分别为Ao和Aj，清除率按下式计算，平行测定3次。
清除率＝(1-(Ai-Ao)/Aj)×100％
式中：Aj对照组吸光值；Ai为样品组吸光值；Ao为空白组吸光值
测定结果如表2所示，结果显示，本发明的桦褐孔菌YST02，特别是其胞内多糖，能够高效清除DPPH自由基。
表2：桦褐孔菌YST02的发酵液和胞内多糖的DPPH自由基清除率
Figure BDA0002768297460000161
进一步对桦褐孔菌YST02的DPPH自由基清除率IC50进行了测定，方法如下：配制0.002mg/mL～18mg/mL系列浓度的胞内多糖溶液，测定各浓度梯度下的DPPH自由基清除率。以清除率为纵坐标，以多糖溶液浓度为横坐标，建立回归方程，计算出DPPH自由基清除率为50％时的多糖浓度，即为该多糖样品的DPPH自由基清除率IC50。结果显示，桦褐孔菌YST02的DPPH自由基清除率IC50为0.38mg/mL。
以上结果表明，本发明的桦褐孔菌YST02具有良好的抗氧化活性。
对比例1：与现有技术菌株的生物量及胞内多糖产量比较
按照实施例1所述的方法，分别使用摇瓶培养的方法和发酵罐培养的方法发酵桦褐孔菌CFCC83414(购自中国林业微生物菌种保藏管理中心)和桦褐孔菌CFCC6584(购自中国林业微生物菌种保藏管理中心)，所得菌丝体含量和胞内多糖含量与桦褐孔菌YST02进行对比。此外，选择目前文献报道的其他菌株的发酵产量作为参考。
对比结果如表3所示，由此可以看出，本发明的桦褐孔菌YST02的生物量及胞内多糖产量显著优于现有技术的其他桦褐孔菌菌株。
表3：桦褐孔菌YST02与相同发酵条件下其他桦褐孔菌的对比结果
Figure BDA0002768297460000162
Figure BDA0002768297460000171
*文献数据是指该文献所使用的菌种在其优化条件下的发酵产量
文献1：Chen H J,Chen Y S,Liu S L,et al.The Influence of SubmergedFermentation of Inonotus obliquus with Control Atmosphere Treatment onEnhancing Bioactive Ingredient Contents[J].2020.
文献2：Wei Z H,Chen N,Li Y J,et al.Glucose fed-batch integrateddissolved oxygen control strategy enhanced polysaccharide,total triterpenoidsand inotodiol production in fermentation of a newly isolated Inonotusobliquus strain[J].Process Biochemistry,2018,66(MAR.):1-6.
对比例2：与现有技术菌株的抗氧化活性比较
按照实施例2所述的方法，将桦褐孔菌YST02与摇瓶培养的桦褐孔菌CFCC83414(购自中国林业微生物菌种保藏管理中心)和桦褐孔菌CFCC6584(购自中国林业微生物菌种保藏管理中心)的发酵液或胞内多糖溶液进行对比，分别比较DPPH自由基清除率(％)和DPPH自由基清除率IC50。此外选择目前文献报道的其他菌株作为参考。
对比结果如表4-1和表4-2所示，可以看出桦褐孔菌YST02(特别是其胞内多糖)的DPPH自由基清除率相比于其他桦褐孔菌菌株提高了约3倍以上，DPPH自由基清除率IC50更是提高了5倍以上。以上结果表明，本发明的桦褐孔菌YST02的DPPH自由基清除效率显著提升，具有显著更优的抗氧化活性。
表4-1：桦褐孔菌YST02与相同发酵条件下其他桦褐孔菌发酵液和胞内多糖溶液(0.5mg/ml)的DPPH自由基清除率对比结果
Figure BDA0002768297460000172
Figure BDA0002768297460000181
表4-2：桦褐孔菌YST02与相同发酵条件下其他桦褐孔菌胞内多糖的DPPH自由基清除率IC50比较
Figure BDA0002768297460000182
文献3*：TritonX-100T对液体深层发酵桦褐孔菌产活性多糖的影响[J].浙江理工大学学报，2017，37(6)：888-892.
文献4*：液体发酵桦褐孔菌产生具有抑酶活性物质的分离及其抗氧化活性研究.杭州:浙江理工大学，2019
文献5*：Chemical properties and antioxidant activity ofexopolysaccharides fractions from mycelial culture of Inonotus obliquus in aground corn stover medium(2012)
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江养生堂天然药物研究所有限公司
<120> 一株桦褐孔菌及其提取物及其美容用途
<130> IDC200421
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 613
<212> DNA
<213> 桦褐孔菌（Inonotus obliquus）
<400> 1
tgtgcacggc ctttcgtgct caaatccaac tctcaaaccc ctgtgcacct atacaagttg 60
aaggtcttag tagtttctgt aatcgaacgg caagtcaagt acgtcgagta atcaagtacg 120
agggtttcgg cccttggaaa gtgtgaaaga tggaaaggca agcttcagag acaaggagac 180
gaaaagcttt tggcttcatt acaaacacca atataattgt tatgtgaatg aaatgctcct 240
tgtgggcgat aataaataca actttcaaca acggatctct aggctctcgc atcgatgaag 300
aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt 360
gaacgcacct tgcgcccctt ggtattccga ggggcatgcc tgtttgagtg tcatgttaat 420
ctcaaatcgc tcgtctattc ttaattggag tggctttcga tttggacttg gaggttttgc 480
tggcccgggc gactttggtt gcccttggtt tgtcggctcc tctcaaatac attagctgga 540
ctttggttcg cgtttacggt gtaataatgt aatgttcact aagacgcttg cctaacaagt 600
ctgcttctaa tag 613

Claims (12)

1.一株桦褐孔菌或其后代，所述桦褐孔菌或其后代的ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一株桦褐孔菌或其后代，所述桦褐孔菌的保藏号为CGMCC No.20206，保藏日期为2020年6月17日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
3.权利要求1或2所述的桦褐孔菌或其后代的细胞或部分；
优选地，所述部分选自所述桦褐孔菌或其后代的营养体、繁殖体或其任意组合；优选地，所述部分选自所述桦褐孔菌或其后代的菌丝体、菌核、孢子、子实体或其任意组合。
4.桦褐孔菌提取物，其来自权利要求1～2任一项所述的桦褐孔菌或其后代、或权利要求3所述的细胞或部分。
5.权利要求4所述的桦褐孔菌提取物，其包含从权利要求1～2任一项所述的桦褐孔菌或其后代、或权利要求3所述的细胞或部分、或前述任一项的处理物中分离的碳水化合物部分；
优选地，所述碳水化合物部分包含多糖；
优选地，所述碳水化合物部分包含细胞内多糖；
优选地，所述碳水化合物部分任选地还包含细胞外多糖和/或细胞膜多糖；
优选地，所述分离是指浸泡提取；优选地，所述分离是指水浸泡提取。
6.权利要求5所述的桦褐孔菌提取物，其中，所述桦褐孔菌或其后代、或所述桦褐孔菌或其后代的细胞或部分在培养基中经过培养(例如培养1天以上)；
优选地，所述培养为液体深层发酵培养；
优选地，所述液体深层发酵培养的液体培养基含有如下成分：葡萄糖0-30g/L，麦芽糖0-15g/L，马铃薯淀粉10-40g/L，酵母浸粉5-15g/L，蛋白胨0-15g/L，磷酸二氢钾0.3-2g/L，硫酸镁0.1-1g/L，pH5.0-7.0。
7.桦褐孔菌培养物，其包含：权利要求1～2任一项所述的桦褐孔菌或其后代、或权利要求3所述的细胞或部分；以及培养基。
8.一种组合物，其在生理学上可接受的介质中包含根据权利要求4至6中任一项所述的提取物或权利要求7所述的培养物。
9.权利要求8所述的组合物，其中，所述组合物是皮肤外用组合物；
优选地，所述皮肤外用组合物是护肤化妆品组合物或抗衰老化妆品组合物；
优选地，所述组合物存在于选自下列的制剂中：乳膏剂、乳剂(例如多重乳液)、液晶、无水组合物、含水分散体、油、乳、香脂、泡沫、水性或油性洗液、水性或油性凝胶、膏霜、溶液、水醇溶液、水二醇溶液、水凝胶、搽剂、皂、洗发剂、调理剂、面膜、喷发剂、精华(serum)、多糖膜、软膏、摩丝、润发油、糊剂、脂粉、棒、笔、喷雾剂或气溶胶。
10.权利要求1或2所述的桦褐孔菌或其后代、权利要求3所述的细胞或部分、权利要求4-6任一项所述的提取物、权利要求7所述的培养物或权利要求8或9所述的组合物的用途，其用于与自由基(例如羟基自由基和/或DPPH自由基)相关的皮肤症状的美容；
优选地，所述与自由基(例如羟基自由基和/或DPPH自由基)相关的皮肤症状包括以下一种或多种：衰老、炎症。
11.权利要求1或2所述的桦褐孔菌或其后代、权利要求3所述的细胞或部分、权利要求4-6任一项所述的提取物、权利要求7所述的培养物或权利要求8或9所述的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于与自由基(例如羟基自由基和/或DPPH自由基)相关的皮肤症状的美容、预防或治疗；
优选地，所述药物是皮肤外用制品。
12.权利要求1或2所述的桦褐孔菌或其后代、权利要求3所述的细胞或部分、权利要求4-6任一项所述的提取物、权利要求7所述的培养物或权利要求8或9所述的组合物用于制备药物的用途，所述药物选自：降低血糖或治疗糖尿病的药物、抗肿瘤药物、提高免疫力药物、镇咳和/或祛痰药物、抗炎药物、抗氧化药物或抗衰老药物。
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