KR20060099935A

KR20060099935A - 잔나비불로초 균사체의 대량 생산방법

Info

Publication number: KR20060099935A
Application number: KR1020050021487A
Authority: KR
Inventors: 이위영; 안진권; 박소영; 박영기; 가강현
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 산림청 국립산림과학원장)
Priority date: 2005-03-15
Filing date: 2005-03-15
Publication date: 2006-09-20
Also published as: KR100693493B1

Abstract

본 발명은 잔나비불로초 균사체의 대량 생산방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 잔나비불로초로부티 분리된 균사체를 재료로 하고 액체 배양 및 생물반응기를 이용한 생산방법에 의해 잔나비불로초 균사체를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 잔나비불로초 균사체의 생산방법은

잔나비불로초로부터 액체 배양용 잔나비불로초 균사체를 얻는 단계,

잔나비불로초 균사체를 액체 배양하는 단계,

액채 배양된 잔나비불로초 균사체를 생물반응기를 이용하여 배양시키는 단계를 포함한다.

본 발명은 잔나비불로초를 대량 배양하여 생산함으로써 배양균사체로부터 단백 다당체 및/또는 잔나비불로초 배양액으로부터 높은 면역활성 효과가 있는 세포외 다당체를 경제적으로 생산할 수 있다.

Description

잔나비불로초 균사체의 대량 생산방법{Mass culturing method of mycelium of Ganoderma applanatum}

도 1은 본 발명의 시료로 사용한 잔나비불로초를 나타낸 사진이다.

도 2는 생물반응기에서 잔나비불로초 균사체 배양 광경을 나타낸 사진이다.

도 3은 생물반응기에서 생산, 건조된 잔나비불로초 균사체를 나타낸 사진이다.

도 4a는 본 발명의 잔나비불로초 균사체 배양시 균사체로부터 추출된 단백 다당체를 나타낸 사진이다.

도 4b는 본 발명의 잔나비불로초 균사체 배양시 배양액으로부터 추출된 세포외 다당체를 나타낸 사진이다.

도 5는 시험예 1의 탄소원 종류에 따른 잔나비불로초 균사체의 생산량을 나타낸 그래프이다.

도 6은 시험예 2의 질소원 종류에 따른 잔나비불로초 균사체의 생산량을 나타낸 그래프이다.

도 7은 시험예 3의 비타민 종류에 따른 잔나비불로초 균사체의 생산량을 나타낸 그래프이다.

도 8은 시험예 4의 공기 주입량에 따른 잔나비불로초 균사체의 부피 생장량을 나타낸 그래프이다.

도 9는 시험예 5의 생물반응기 종류에 따른 잔나비불로초 균사체의 생산량을 나타낸 그래프이다.

도 10은 시험예 6의 탄소원 종류에 따른 잔나비불로초 균사체로부터 단백 다당체 생산을 나타낸 그래프이다.

도 11은 시험예 7의 잔나비불로초 균사체 단백 다당체의 면역 증강을 나타낸 그래프이다.

도 12는 시험예 8의 글루코오스 농도별 단백 다당체 및 세포외 다당체 생산 비교를 나타낸 그래프이다.

도 13은 시험예 9의 배양온도에 따른 단백 다당체 및 세포외 다당체 생산 비교를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 잔나비불로초 균사체의 대량 생산방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 잔나비불로초로부티 분리된 균사체를 재료로 하고 액체 배양 및 생물반응기를 이용한 배양방법에 의해 잔나비불로초 균사체를 대량으로 생산하는 방법, 생산한 잔나비불로초 균사체로부터 얻을 수 있는 다당체 및 이러한 잔나비불로초 균사 체로부터 얻은 다당체를 포함하는 식품, 약품 및 화장품에 관한 것이다.

잔나비불로초(Ganoderma applanatum)는 일명 잔나비걸상버섯이라고도 하며, 구멍장이버섯과(Polyporaceae)에 속하는 버섯으로 활엽수의 고목에서 부착 생장하는 다년생의 부후균의 일종이다.

잔나비불로초는 우리나라를 비롯하여 세계적으로 분포되어 있으며, 우리나라, 중국 등에서 항암치료 등의 목적으로 전통적 민간요법 및 한약제로 사용되어 왔다.

잔나비불로초의 약리작용은 항암작용, 다당체의 면역조절효과, 항인플루엔자바이러스 효과 등이 알려져 있으며, 열수추출물의 생쥐에 대한 급성독성 시험결과 투여 가능량 최대용량에서 치사예나 혈액생화학적, 병리조직학적 병변을 보이지 않았음이 보고된 바가 있다.

이와 같이 잔나비불로초의 자실체를 대상으로 한 다수의 연구와 효과가 알려져 있으나, 균사체를 대상으로 한 배양법, 효과 등에 대한 연구는 거의 전무한 상태에 있다.

특히 균사체와 관련한 균사체 대량배양 방법과 인공적으로 배양된 균사체나 배양액으로부터 면역 증강작용이 탁월한 다당체의 생산에 대한 내용은 전혀 알려진 바가 없다.

본 발명에 의한 방법으로 잔나비불로초의 균사체를 대량생산할 경우 면역활성작용이 높은 다당체의 생산할 수 있다.

본 발명에 의해 얻을 수 있는 다당체는 약품, 식품 및/또는 화장품에 첨가되어 사용할 수 있다.

한편, 본 발명과 관련된 종래기술로서 한국공개특허공보 제2002-0083246호에 잔나비불로초버섯을 저급알콜, 물, 아세톤 중 어느 하나의 유기용매로 추출하여 얻어지는 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 또는 당뇨합병증 치료용 약학적 조성물에 대한 내용이 있다.

또한 한국공개특허공보 제2004-0069416호에 당뇨 질환의 예방 및 치료 활성을 갖는 잔나비걸상버섯(Ganoderma Applanatum)으로부터 분리된 신규 구조의 아플아나산 (Applanatic acid) 유도체 화합물을 함유하는 조성물에 관한 내용이 있다.

그러나 상기 선행기술들은 본 발명의 잔나비불로초 균사체의 대량 생산방법과는 기술적 구성을 달리한다.

본 발명의 목적은 잔나비불로초로부터 분리된 균사체의 최적배양을 위한 균사체 배양배지의 조성을 개발하고, 개발된 배양배지를 사용하여 균사체 대량배양을 위한 적정 생물반응기의 형태, 생산방법 및 배양조건을 밝혀 생물반응기에서 균사체를 신속하게 대량으로 배양하는 방법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 잔나비불로초의 대량 생산방법에 의해 얻은 잔나비불 로초 균사체로부터 얻을 수 있는 단백 다당체 및 잔나비불로초 대량 생산방법에 의해 얻은 잔나비불로초 균사체 배양액으로부터 얻을 수 있는 세포외 다당체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 생산방법에 의해 잔나비불로초로부터 얻을 수 있는 다당체를 포함하는 약품, 식품 또는 화장품을 제공하는 것이다.

본 발명의 잔나비불로초 균사체의 대량 생산방법은 잔나비불로초의 생산방법에 있어서, 잔나비불로초로부터 액체 배양용 잔나비불로초 균사체를 얻는 단계,

잔나비불로초 균사체를 액체 배양하는 단계,

액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 생물반응기를 이용하여 배양시키는 단계를 포함한다.

이하 본 발명의 잔나비불로초 균사체의 생산방법을 각각의 단계에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다.

(1)잔나비불로초로부터 액체 배양용 잔나비불로초 균사체를 얻는 단계

액체 배양용 잔나비불로초 균사체는 잔나비불로초로부터 얻을 수 있다. 이때 잔나비불로초 균사체를 얻는 일예로서 잔나비불로초의 조직을 PDA 배지(정제수 L당 감자추출물(patato extract) 4g, 글루코오스(glucose) 20g 및 아가(agar) 15g 첨가)에 치상하고 20∼25℃에서 20∼30일 동안 배양하고, PDA 배지에서 배양한 잔나비불로초 균사체를 PDB 배지(정제수 L에 감자추출물(patato extract) 4g 및 glucose 20g 첨가)에서 100∼300rpm으로 10∼15일간 진탕배양하여 얻을 수 있다.

본 발명에서 잔나비불로초로부터 액체 배양용 잔나비불로초 균사체를 얻기 위해 다양한 조건으로 실험한바, 잔나비불로초 조직을 상기에서 언급한 조건에 의해 PDA 배지에서 배양한 후, PDB 배지에서 진탕배양하여 얻는 것이 좋다.

(2)잔나비불로초 균사체를 액체 배양하는 단계

상기 (1)단계에 의해 얻은 잔나비불로초 균사체를 액체 배양용 배양액에 접종하여 잔나비불로초 균사체를 액체 배양하여 얻을 수 있다.

액체 배양용 배양액은 정제수에 탄소원, 효모추출물, 질소원, 비타민, 무기물을 포함하도록 하여 pH가 4.5∼6.5으로 조정할 수 있다.

그런 다음 pH가 조절된 배양액에 잔나비불로초 균사체를 배양액 부피 대비 5∼10％으로 배양액에 첨가하고, 10∼25℃에서 10∼15일 동안 액체 배양할 수 있다.

상기에서 탄소원은 말토오스, 글루코오스, 락토오스, 전분, 덱스트린, 수크로스, 프럭토스 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기에서 질소원은 글루타민산, 글리신, 펩톤, 알라닌 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기에서 비타민은 피리독신, 아스코브산, 티아민, 이노시톨, 폴릭산, 니코틴산, 리보플라빈, 바이오틴 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기에서 무기물은 KH₂PO₄, MgSO₄, Fe-EDTA, MnSO₄ 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명은 잔나비불로초 균사체를 액체 배양하기 위한 다양한 구성성분의 배양액을 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 이러한 잔나비불로초 균사체를 액체 배양하기 위한 액체 배양액의 일예로서 정제수 1L에 대하여 말토오스, 글루코오스, 락토오스, 전분, 덱스트린, 수크로스, 프럭토스 중에서 선택된 어느 하나 이상의 탄소원 25∼40g, 효모 추출물 1∼5g, 글루타민산, 글리신, 펩톤, 알라닌 중에서 선택된 어느 하나 이상의 질소원 1∼5g, 피리독신, 아스코브산, 티아민, 이노시톨, 폴릭산, 니코틴산, 리보플라빈, 바이오틴 중에서 선택된 어느 하나 이상의 비타민 0.5∼5mg, 무기물로서 KH₂PO₄ 1∼5g, MgSO₄ 0.2∼1.5g, 0.1∼0.5M Fe-EDTA 5∼10ml, 0.1∼0.5M MnSO₄ 5∼10ml로 이루어져 pH가 4.5∼6.5인 배양액을 얻을 수 있다.

본 발명에서 다양한 조건에 의해 잔나비불로초 균사체의 함량, 배양온도, 배양시간을 측정한바, 본 발명의 목적을 위해서는 전술한 수치 범위의 조건으로 잔나비불로초 균사체를 액체 배양하는 것이 좋다.

(3)생물반응기를 이용해 액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 배양시키는 단계

상기 (2)단계에 의해 액체 배양된 잔나비불로초 균사체는 생물반응기 내의 배양액에 접종하고 배양하여 잔나비불로초 균사체를 생산할 수 있다.

생물반응기 내부의 배양액은 정제수에 탄소원, 효모추출물, 질소원, 비타민, 무기물을 포함하도록 하여 pH가 4.5∼6.5으로 조정할 수 있다.

그런 다음 액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 배양액 부피 대비 3∼10％으로 생물반응기 내의 배양액에 접종한 후, 0.025∼0.2vvm의 공기를 생물반응기 내부로 공급하여 10∼25℃에서 10∼15일 동안 배양하여 잔나비불로초 균사체를 생산할 수 있다.

상기 생물반응기 내부의 배양액에 있어서, 탄소원은 말토오스, 글루코오스, 락토오스, 전분, 덱스트린, 수크로스, 프럭토스 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기 생물반응기 내부의 배양액에 있어서, 질소원은 글루타민산, 글리신, 펩톤, 알라닌 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기 생물반응기 내부의 배양액에 있어서, 비타민은 피리독신, 아스코브산, 티아민, 이노시톨, 폴릭산, 니코틴산, 리보플라빈, 바이오틴 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기 생물반응기 내부의 배양액에 있어서, 무기물은 KH₂PO₄, MgSO₄, Fe-EDTA, MnSO₄ 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명은 액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 생물반응기 내부에서 대량으로 배양하기 위해 다양한 구성성분을 함유하는 배양액을 사용할 수 있다.

본 발명에서 이러한 잔나비불로초 균사체를 생물반응기 내부에서 대량으로 배양하기 위한 배양액의 일예로서 정제수 1L에 대하여 말토오스, 글루코오스, 락토오스, 전분, 덱스트린, 수크로스, 프럭토스 중에서 선택된 어느 하나 이상의 탄소 원 40∼60g, 효모 추출물 1∼5g, 글루타민산, 글리신, 펩톤, 알라닌 중에서 선택된 어느 하나 이상의 질소원 1∼5g, 피리독신, 아스코브산, 티아민, 이노시톨, 폴릭산, 니코틴산, 리보플라빈, 바이오틴 중에서 선택된 어느 하나 이상의 비타민 0.5∼5mg, 무기물로서 KH₂PO₄ 1∼5g, MgSO₄ 0.2∼1.5g, 0.1∼0.5M Fe-EDTA 5∼10ml, 0.1∼0.5M MnSO₄ 5∼10ml로 이루어져 pH가 4.5∼6.5인 배양액을 사용할 수 있다.

본 발명에서 다양한 조건에 의해 잔나비불로초 균사체의 함량, 배양온도, 배양시간을 측정한바, 본 발명의 목적을 위해 전술한 수치 범위의 조건으로 액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 대량으로 배양하는 것이 좋다.

한편, 본 발명은 단백 다당체를 생산하기 위한 잔나비불로초 균사체의 생물배양기 배양은 정제수 1L에 대하여 말토오스, 글루코오스, 락토오스, 전분, 덱스트린, 수크로스, 프럭토스 중에서 선택된 어느 하나 이상의 탄소원, 효모 추출물 그리고 글루타민산, 글리신, 펩톤, 알라닌 중에서 선택된 어느 하나 이상의 질소원을 각각 10∼25:1∼2:1∼2(w/w/w)로 하고, 피리독신, 아스코브산, 티아민, 이노시톨, 폴릭산, 니코틴산, 리보플라빈, 바이오틴 중에서 선택된 어느 하나 이상의 비타민 0.5∼5mg, 무기물로서 KH₂PO₄ 1∼5g, MgSO₄ 0.2∼1.5g, 0.1∼0.5M Fe-EDTA 5∼10ml, 0.1∼0.5M MnSO₄ 5∼10ml으로 이루어진 배양액을 생물반응기에 넣고, 액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 배양액 부피 대비 3∼10％으로 생물반응기내의 배양액에 접종한 후, 0.025∼0.2vvm의 공기를 생물반응기 내부로 공급하여 10∼25℃에서 10∼15일 동안 실시할 수 있다.

또한 본 발명은 세포외 다당체를 생산하기 위한 잔나비불로초 균사체의 생물배양기 배양은 정제수 1L에 대하여 말토오스, 글루코오스, 락토오스 중에서 선택된 어느 하나 이상의 탄소원, 효모, 글루타민산의 질소원이 각각 50∼80:1∼2:1∼2(w/w/w)로 하고, 피리독신, 아스코브산, 티아민, 이노시톨, 폴릭산, 니코틴산, 리보플라빈, 바이오틴 중에서 선택된 어느 하나 이상의 비타민 0.5∼5g, 무기물로서 KH₂PO₄ 1∼5g, MgSO₄ 0.2∼1.5g, 0.1∼0.5M Fe-EDTA 5∼10ml, 0.1∼0.5M MnSO₄ 5∼10ml으로 이루어진 배양액을 생물반응기에 넣고, 액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 배양액 부피 대비 3∼10％으로 생물반응기 내부의 배양액에 접종한 후, 0.025∼0.2vvm의 공기를 생물반응기 내부로 공급하여 20∼25℃에서 10∼15일 동안 실시할 수 있다.

본 발명에서 잔나비불로초 균사체의 대량 배양용 생물반응기로는 본원 관련 분야에서 통상적으로 사용하며, 공기를 주입할 수 있는 생물반응기라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 본 발명에서 이러한 생물반응기의 일예로서 순환형(기포통기형) 공기부양식 생물반응기, 풍선형 공기부양식 생물반응기, 컬럼형 공기부양식 생물반응기, 교반식 생물반응기 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.

한편, 본 발명은 상기에서 언급한 잔나비불로초 균사체를 대량으로 생산하는 방법에 의해 얻은 잔나비불로초 균사체로부터 얻을 수 있는 단백 다당체를 포함한다. 그리고, 상기에서 언급한 잔나비불로초 균사체를 대량으로 생산하는 방법에 의 해 얻은 잔나비불로초 균사체 배양액으로부터 얻을 수 있는 세포외 다당체를 포함한다.

또한 본 발명은 상기의 다당체를 포함하는 약품, 식품, 화장품을 포한한다. 이때 상기의 다당체를 함유하는 약품은 당뇨병 관련 약품에 사용할 수 있다.

상기에서 다당체를 함유하는 식품은 식품학적으로 허용하는 고상의 부형제를 포함하여 분말, 환(丸), 정제(tablet), 산제, 캡슐(capsule)과 같은 고상 형태로 제형화 될 수 있다. 또한 다당체를 함유하는 식품은 식품학적으로 허용하는 액상의 부형제를 포함하여 음료, 드링크제, 페이스트와 같은 액상 형태로 제형화 될 수 있다.

상기에서 다당체를 함유하는 화장품은 통상적으로 사용하는 화장품 재료에 첨가되어 액상, 페이스트 또는 고상 제형의 화장품으로 제공될 수 있다. 이때 화장품은 스킨, 로션, 파운데이션을 예로 들 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 액체 배양용 균사체 조제

본 발명에 사용한 잔나비불로초 균사체는 도 1의 강원도 홍천에서 약 10년생의 잔나비불로초로부터 무균적으로 조직을 떼어내어 PDA배지에 치상하여 균사체를 분리 배양하는 방법으로 순수분리 배양한 것을 이용하였다.

최초 액체 배양용 재료로 사용하기 위해 PDA 고체배지에 배양중인 균사체를 무균적으로 잘게 잘라 250ml의 삼각플라스크에 넣고, PDB 배지나 잔나비불로초 균사체 배양용 배지액(정제수 1L당 전분25g, 효모 추출물 2g, 글루타민산 1g, 바이오틴0.5mg, KH₂PO₄ 2g, MgSO₄ 0.5g, 0.1M Fe-EDTA 10ml, 0.1M MnSO₄ 10ml를 첨가, pH를 4.5로 조절) 100ml을 첨가하여, 100rpm으로 15일 동안 진탕배양하였다.

배양된 균사체는 호모게나이져로 갈아 접종용 균사체로 이용하였다.

<실시예 2> 잔나비불로초 균사체의 액체 배양

삼각플라스크 수준에서의 액체 배양용 적정 배지조성은 글루코오스(glucose), 효모 추출액(yeast extract), 글루타민산(glutamic acid), KH₂PO₄, MgSO₄, Fe-EDTA, MnSO₄을 포함되도록 하여 구성하였다.

이들의 배지조성은 정제수 1L당 글루코오스 25g, 효모 추출액 2g, 글루타민산 1g, 바이오틴(biotine) 0.5mg, 티아민(thiamine) 0.1g, KH₂PO₄ 2g, MgSO₄ 0.5g, 5ml-0.1M Fe-EDTA, 5ml-0.1M MnSO₄으로 배지 배양액을 조성하였으며, 이때 배지 배양액의 pH는 4.5가 되도록 유지하였다.

상기의 배지 배양액에 실시예 1에서 얻은 잔나비불로초 균사체를 배양액 부피 대비 5％ 첨가하고, 20℃에서 15일 동안 배양하였다.

<실시예 3> 생물반응기를 이용한 잔나비불로초 균사체 대량 배양

상기 실시예 2에서 얻은 액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 대량 배양하기 위해 배지조성을 하였다. 이때 배지 조성 중 탄소원으로는 글루코오스, 질소원으로는 글루타민산, 비타민으로는 바이오틴, 티아민을 사용하였다.

상기에서 액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 생물반응기 내애서 대량 배양하기 위한 배양액은 정제수 1L당 글루코오스 60g, 효모 추출액 2g, 글루타민산 1g, 바이오틴 1.2mg, 티아민 0.3g, KH₂PO₄ 4g, MgSO₄ 1g, 10ml 0.1M Fe-EDTA, 10ml 0.1M MnSO₄으로 조성하고 이 배양액의 pH를 4.5로 일정하게 유지하였다.

상기의 배양액을 도 2와 같은 공기부양식의 풍선형 생물배양기에 첨가하고, 실시예 2에서 얻은 액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 배양액 중량 대비 5％를 배양액에 접종한 후 공기 공급량은 0.025∼0.2vvm으로 하여 7일 동안 배양하여 배양액 1L당 18∼20g의 건조 균사체를 생산하였다(도 3 참조).

<실시예 4> 면역활성이 있는 수용성 다당체 생산

균사체로부터 면역 증강작용이 있는 단백다당체를 생산하기 위해 배지 조성성분중 glucose : yeast extract : glutamic acid 비율은 25 : 2 : 1 (w/w/w)으로 하는 것을 제외하고는 동일한 배지조성 성분을 사용하여 배양액을 제조하였다.

상기의 배양액을 도 2와 같은 공기부양식의 풍선형 생물배양기에 첨가하고, 실시예 2에서 얻은 액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 배양액 중량 대비 5％를 배양액에 접종한 후 공기 공급량은 0.05∼0.1vvm, 배양온도는 10℃로 하여 12일 동안 배양하여 잔나비불로초 균사체를 생산하였다.

위와 같이 생산된 잔나비불로초 균사체를 건중 1g당 정제수를 40ml 비율로 첨가하여 105℃에서 1시간동안 고압 추출하여 냉각 후 추출액을 분리하고, 4배 부피의 95％-에탄올을 첨가하여 추출액 내의 다당체를 침전, 분리하고, 침전물을 정제수에 녹여 원심분리하여 상등액을 취하고 동결건조하여 5∼7％의 수용성 단백 다당체를 얻었다(도 4a 참조).

한편, 잔나비불로초 균사체로부터 면역 증강작용이 있는 단백 다당체를 생산하기 위해 배양액 중에 다양한 탄소원을 사용한바, 고분자인 전분(starch) 보다는 1-2탄당에 해당하는 말토오스(maltose), 락토오스(lactose), 또는 글루코오스(glucose)를 탄소원으로 하는 배양액으로 배양시킨 균사체로부터 얻은 단백 다당체가 전분을 탄소원으로 하는 배양액으로 배양시킨 균사체로부터 얻은 단백 다당체 보다 활성이 우수하였다.

<실시예 5> 면역활성이 있는 세포외 다당체 생산

균사체을 배양한 배양액으로부터 세포외 다당체(EPS)를 생산하기 위해 배지 조성성분 중 glucose : yeast extract : glutamic acid 비율은 60 : 2 : 1 (w/w/w)으로 하는 것을 제외하고는 동일한 배지조성 성분을 사용하여 배양액을 제조하였다.

상기의 배양액을 도 2와 같은 공기부양식의 풍선형 생물배양기에 첨가하고, 실시예 2에서 얻은 액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 배양액 중량 대비 5％를 배양액에 접종한 후 공기 공급량은 0.05vvm, 배양온도는 25℃로 하여 12일 동안 배양하여 잔나비불로초 균사체를 생산하였다.

잔나비불로초 균사체를 생산한 후 잔나비불로초 균사체의 배양액에 4배 부피의 95％-에탄올을 첨가하여 배양액 내의 다당체를 침전, 분리하고, 침전물을 정제수에 녹여 원심분리하여 상등액을 취하고 동결건조하여 세포외 다당체을 얻는 방법으로 배양액 L 당 2∼4g의 세포외 수용성 다당체를 얻을 수 있었다(도 4b 참조).

<시험예 1> 탄소원 종류에 따른 잔나비불로초 균사체의 생산량

상기 실시예 3에서 생물반응기를 이용하여 잔나비불로초 균사체를 대량 배양시 질소원으로 락토오스, 전분, 덱스트린, 수크로스, 프럭토스, 말토오스, 글루코오스를 사용한 배양액을 사용하여 탄소원 종류별에 따른 잔나비불로초 균사체의 생산량을 측정하고 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서처럼 배양액 중에서 탄소원에 대해서는 프럭토스를 제외한 나머지 탄소원에 대해서 우수한 잔나비불로초 균사체를 얻을 수 있었으며, 특히 탄소원 중에서 락토오스, 덱스트린, 말토오스, 글루코오스를 이용할 때 잔나비불로초 균사체의 생산량이 우수함을 알 수 있었다.

<시험예 2> 질소원 종류에 따른 잔나비불로초 균사체의 생산량

상기 실시예 3에서 생물반응기를 이용하여 잔나비불로초 균사체를 대량 배양시 질소원으로 글루타민, 글루타민산, 글리신, 세린, 알라닌, 칼슘 나이트레이트, 소디움 라이트레이트, 포타지움 나이트레이트, 암모니움 타이테이트, 암모니움 클로라이드, 암모니움 포스페이스, 히스티딘, 암모니움 설페이트, 암모니움 나이트레이트, 펩톤, 효모 추출물로 하는 배양액을 사용하여 질소원 종류별에 따른 잔나비불로초 균사체의 생산량을 측정하고 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서처럼 배양액 중에서 질소원에 대해서는 글루타민산, 글리신, 펩톤, 효모 추출물을 제외한 나머지 질소원에 대해서는 잔나비불로초 균사체의 생산량이 저조함을 알 수 있었다.

<시험예 3> 비타민 종류에 따른 잔나비불로초 균사체의 생산량

상기 실시예 3에서 생물반응기를 이용하여 잔나비불로초 균사체를 대량 배양시 비타민으로 피리독신, 아스코르브산, 티아민, 이노시톨, 폴릭산, 니코틴산, 리포블라빈, 바이오틴으로 하는 배양액을 사용하여 비타민 종류별에 따른 잔나비불로초 균사체의 생산량을 측정하고 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에서처럼 배양액 중에서 비타민에 대해서 바이오틴이 가장 우수하고, 기타 리보플라빈, 니코틴산, 티아민, 피리독신, 아스코르브산 등을 사용시 잔나비불로초 균사체의 생산량이 우수함을 알 수 있었다.

<시험예 4> 공기 주입량에 따른 잔나비불로초 균사체의 부피 생장량

상기 실시예 3에서 생물반응기를 이용하여 잔나비불로초 균사체를 대량 배양시 공기 주입량을 0.025vvm, 0.05vvm, 0.1vvm, 0.2vvm, 0.3vvm, 0.4vvm, 0.5vvm 으로 하였을 때 각각의 공기 주입량에 따른 잔나비불로초 균사체의 부피 생장량을 측정하고 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에서처럼 공기 주입량이 0.025vvm, 0.05vvm, 0.1vvm, 0.2vvm 까지는 잔나비불로초 균사체의 부피 생장량이 우수하나, 공기 주입량이 0.3vvm, 0.4vvm, 0.5vvm 에서는 잔나비불로초 균사체의 부피 생장량이 저조함을 알 수 있어, 본 발명에서 잔나비불로초 균사체를 배양함에 있어 0.025vvm∼0.2vvm으로 공기 주입시 잔나비불로초 균사체의 생산이 우수함을 알 수 있었다.

<시험예 5> 생물반응기 종류에 따른 잔나비불로초 균사체의 생산량

상기 실시예 3에서 생물반응기를 이용하여 잔나비불로초 균사체를 대량 배양시 생물반응기를 각각 풍선형 공기부양식 생물반응기, 컬럼형 공기부양식 생물반응기, 순환형(기포통기형) 생물반응기 및 교반식 생물반응기를 사용에 따른 잔나비불로초 균사체의 생장량을 측정하고 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에서처럼 풍선형, 컬럼형, 기포통기형 생물반응기 모두 잔나비불로초 균사체 생장량이 우수하나, 특히 풍선형과 기포통기형이 컬럼형 및 교반식 보다 잔나비불로초 균사체 배양에 효과가 좋음을 알 수 있었다.

<시험예 6> 탄소원 종류에 따른 잔나비불로초 균사체로부터 단백 다당체 생 산

상기 실시예 4에서 생물반응기를 이용하여 잔나비불로초 균사체를 대량 배양시킨 후 잔나비불로초 균사체로부터 단백 다당체 생산시 탄소원 종류에 따라 배양한 잔나비불로초 균사체로부터 얻은 단백 다당체 생산량을 측정하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.

상기에서 탄소원은 말토오스, 글루코오스, 락토오스, 덱스트린, 프럭토스, 수크로스를 각각 사용하였다.

도 10에서처럼 탄소원으로 말토오스, 글루코오스, 락토오스를 사용한 배양액으로 잔나비불로초 균사체를 배양시키고, 이 균사체로부터 얻은 단백 다당체의 생산량이 우수함을 알 수 있었다.

<시험예 6> 잔나비불로초 균사체 다당체의 면역 증강 효과

상기 실시예 4에서 생물반응기를 이용하여 잔나비불로초 균사체를 대량 배양시 탄소원으로 글루코오스와 전분을 사용에 따른 잔나비불로초 균사체 다당체의 면역증강효과를 비교한 것이다. 면역증강 측정방법은 사람의 말초혈액에서 단핵세포구(PBMC)를 분리하여 각 다당체 100ug/ml에 100 ug/ml씩 처리하여 24시간 동안 반응시킨 뒤 세포배양액을 얻어 면역계 cytokine 중 TNF-alpha의 발현량을 ELISA kit(ChemiKine^TM)을 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11의 균사체 추출물 중에서 열수 추출한 단백 다당체는 잔나비불로초 균 사체를 건중 1g당 정제수를 40ml 비율로 첨가하여 105℃에서 1시간동안 고압 추출하여 냉각 후 추출액을 분리하고, 4배 부피의 95％-에탄올을 첨가하여 추출액 내의 다당체를 침전, 분리하고, 침전물을 정제수에 녹여 원심분리하여 상등액을 취하고 동결건조하여 얻은 단백 다당체이다.

도 11의 균사체 추출물 중에서 효소 추출한 단백 다당체는 잔나비불로초 균사체에 정제수를 첨가하고 고온안정성 알파-아밀라아제(BAN 240L, Sigma)와 소디움아세테이트 완충용액(pH 5.0)을 첨가하여 100℃에서 1시간 반응 후, 냉각 시켜 알파-아밀로글루코시다아제(Sigma)를 첨가하여 60℃에서 4시간 반응시킨 다음 원심분리하고 추출액을 분리하였다. 이 추출액에 4배 부피의 95％-에탄올을 첨가하여 추출액 내의 다당체를 침전, 분리하고, 침전물을 정제수에 녹여 원심분리하여 상등액을 취하고 동결건조하는 방법으로 얻은 단백 다당체이다.

도 11의 균사체 추출물 중에서 수용성 추출물은 잔나비불로초 균사체를 정제수를 첨가하여 100℃에서 추출한 것이다.

도 11에서 보면 탄소원으로 글루코오스를 사용하여 배양한 잔나비불로초 균사체로부터 얻은 단백 다당체의 면역 증강 효과가 우수함을 알 수 있으며, 특히 잔나비불로초 균사체를 열수 추출하여 얻은 단백 다당체는 전분 보다는 글루코오스를 이용하여 배양시킨 잔나비불로초 균사체의 면역 증강 효과가 우수함을 알 수 있었다.

<시험예 7> 글루코오스 농도별 단백 다당체 및 세포외 다당체 생산 비교

상기 실시예 4 및 실시예 5에서 탄소원으로 사용하는 글루코오스 농도에 따라 배양한 잔나비불로초 균사체로부터 얻은 단백 다당체와 잔나비불로초 균사체를 배양시킨 배양액으로부터 얻은 세포외 다당체의 생산량을 각각 측정하고 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에서처럼 잔나비불로초 균사체로부터 얻은 단백 다당체의 생산량는 글루코오스의 농도가 10, 20g/L일 때 우수하고, 잔나비불로초 균사체를 배양시킨 배양액으로부터 얻은 세포외 다당체의 생산량은 글루코오스의 농도가 60, 80g/L일 때 우수함을 알 수 있었다.

이와 같은 결과로 볼 때 잔나비불로초 균사체로부터 얻은 단백 다당체는 탄소원의 농도가 상대적으로 낮을 때 생산량이 우수하고, 잔나비불로초 균사체를 배양시킨 배양액으로부터 얻은 세포외 다당체는 탄소원의 농도가 상대적으로 높을 때 생산량이 우수함을 유추할 수 있다.

<시험예 8> 배양온도에 따른 단백 다당체 및 세포외 다당체 생산 비교

상기 실시예 4 및 실시예 5에서 배양온도에 따라 배양한 잔나비불로초 균사체로부터 얻은 단백 다당체와 잔나비불로초 균사체를 배양시킨 배양액으로부터 얻은 세포외 다당체의 생산량을 각각 측정하고 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에서처럼 잔나비불로초 균사체로부터 얻은 단백 다당체의 생산량은 배양온도가 10℃, 15℃일 때 우수하고, 잔나비불로초 균사체를 배양시킨 배양액으로 부터 얻은 세포외 다당체의 생산량은 배양온도가 20℃, 25℃일 때 우수함을 알 수 있었다.

이와 같은 결과로 볼 때 잔나비불로초 균사체로부터 얻은 단백 다당체는 잔나비불로초 균사체의 배양온도가 상대적으로 낮을 때 생산량이 우수하고, 잔나비불로초 균사체를 배양시킨 배양액으로부터 얻은 세포외 다당체는 잔나비불로초 균사체의 배양온도가 상대적으로 높을 때 생산량이 우수함을 유추할 수 있다.

본 발명의 생물반응기를 이용하여 잔나비불로초 균사체를 대량으로 배양할 수 있어, 잔나비불로초 균사체를 대량으로 생산할 수 있다.

본 발명에 의해 잔나비불로초 자실체에서 생산되는 양보다도 잔나비불로초 균사체나 잔나비불로초 균사체의 배양액으로부터 면역 증강작용이 높은 단백 다당체 또는 세포외 다당체를 경제적으로 연중 생산함으로서 이들을 제약원료, 기능성 음료 등 식품, 화장품 원료 등으로 이용할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예, 시험예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

잔나비불로초 균사체의 생산방법에 있어서,

잔나비불로초로부터 액체 배양용 잔나비불로초 균사체를 얻는 단계,

잔나비불로초 균사체를 액체 배양하는 단계,

액채 배양된 잔나비불로초 균사체를 생물반응기를 이용하여 배양시키는 단계를 포함하는 잔나비불로초 균사체의 대량 생산방법.
제1항에 있어서, 잔나비불로초 균사체는 잔나비불로초의 조직을 PDA 고체배지에서 배양하고,

PDA 고체배지에서 배양한 잔나비불로초 균사체를 PDB 배지에서 100∼120rpm으로 10∼15일간 진탕배양하여 얻는 것을 특징으로 하는 생산방법.
제1항에 있어서, 정제수 1L에 대하여 말토오스, 글루코오스, 락토오스, 전분, 덱스트린, 수크로스, 프럭토스 중에서 선택된 어느 하나 이상의 탄소원 25∼40g, 효모 추출물 1∼5g, 글루타민산, 글리신, 펩톤, 알라닌 중에서 선택된 어느 하나 이상의 질소원 1∼5g, 피리독신, 아스코브산, 티아민, 이노시톨, 폴릭산, 니코틴산, 리보플라빈, 바이오틴 중에서 선택된 어느 하나 이상의 비타민 0.5∼5mg, 무기물로서 KH₂PO₄ 1∼5g, MgSO₄ 0.2∼1.5g, 0.1∼0.5M Fe-EDTA 5∼10ml, 0.1∼0.5M MnSO₄ 5∼10ml로 이루어져 pH가 4.5∼6.5인 배양액에 잔나비불로초 균사체를 배양액 부피 대비 5∼10％로 배양액에 첨가하고, 10∼25℃에서 10∼15일 동안 액체 배양함을 특징으로 하는 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 정제수 1L에 대하여 말토오스, 글루코오스, 락토오스, 전분, 덱스트린, 수크로스, 프럭토스 중에서 선택된 어느 하나 이상의 탄소원 10∼80g, 효모 추출물 1∼5g, 글루타민산, 글리신, 펩톤, 알라닌 중에서 선택된 어느 하나 이상의 질소원 1∼5g, 피리독신, 아스코브산, 티아민, 이노시톨, 폴릭산, 니코틴산, 리보플라빈, 바이오틴 중에서 선택된 어느 하나 이상의 비타민 0.5∼5mg, 무기물로서 KH₂PO₄ 1∼5g, MgSO₄ 0.2∼1.5g, 0.1∼0.5M Fe-EDTA 5∼10ml, 0.1∼0.5M MnSO₄ 5∼10ml으로 이루어져 pH가 4.5∼6.5인 배양액을 생물반응기에 넣고, 액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 배양액 부피 대비 3∼10％로 생물반응기 내의 배양액에 접종한 후, 0.025∼0.2vvm의 공기를 생물반응기 내부로 공급하여 10∼25℃에서 10∼15일 동안 배양함을 특징으로 하는 생산방법.
제1항에 있어서, 단백 다당체를 생산하기 위한 잔나비불로초 균사체의 생물배양기 배양은 정제수 1L에 대하여 말토오스, 글루코오스, 락토오스, 전분, 덱스트린, 수크로스, 프럭토스 중에서 선택된 어느 하나 이상의 탄소원, 효모 추출물, 글루타민산, 글리신, 펩톤, 알라닌 중에서 선택된 어느 하나 이상의 질소원을 각각 10∼25:1∼2:1∼2(w/w/w)로 하고, 피리독신, 아스코브산, 티아민, 이노시톨, 폴릭산, 니코틴산, 리보플라빈, 바이오틴 중에서 선택된 어느 하나 이상의 비타민 0.5∼5mg, 무기물로서 KH₂PO₄ 1∼5g, MgSO₄ 0.2∼1.5g, 0.1∼0.5M Fe-EDTA 5∼10ml, 0.1∼0.5M MnSO₄ 5∼10ml으로 이루어진 배양액을 생물반응기에 넣고, 액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 배양액 부피 대비 3∼10％으로 생물반응기내의 배양액에 접종한 후, 0.025∼0.2vvm의 공기를 생물반응기 내부로 공급하여 10∼25℃에서 10∼15일 동안 실시함을 특징으로 하는 생산방법.
제1항에 있어서, 세포외 다당체를 생산하기 위한 잔나비불로초 균사체의 생물배양기 배양은 정제수 1L에 대하여 말토오스, 글루코오스, 덱스트린 중에서 선택된 어느 하나 이상의 탄소원, 효모, 글루타민산의 질소원이 각각 40∼80:1∼2:1∼2(w/w/w)로 하고, 피리독신, 아스코브산, 티아민, 이노시톨, 폴릭산, 니코틴산, 리보플라빈, 바이오틴 중에서 선택된 어느 하나 이상의 비타민 0.5∼5g, 무기물로서 KH₂PO₄ 1∼5g, MgSO₄ 0.2∼1.5g, 0.1∼0.5M Fe-EDTA 5∼10ml, 0.1∼0.5M MnSO₄ 5∼10ml으로 이루어진 배양액을 생물반응기에 넣고, 액체 배양된 잔나비불로초 균사체를 배양액 부피 대비 3∼10％으로 생물반응기 내부의 배양액에 접종한 후, 0.025∼0.2vvm의 공기를 생물반응기 내부로 공급하여 20∼25℃에서 7∼15일 동안 실시함을 특징으로 하는 생산방법.
특허청구범위 제1항 또는 제6항의 방법에 의해 생산한 잔나비불로초 균사체로부터 얻을 수 있는 단백 다당체.
특허청구범위 제1항 또는 제7항의 방법에 의해 생산한 잔나비불로초 균사체 배양액으로부터 얻을 수 있는 세포외 다당체.
특허청구범위 제8항 또는 제9항의 다당체를 포함하는 약품.
특허청구범위 제8항 또는 제9항의 다당체를 포함하는 식품.
특허청구범위 제8항 또는 제9항의 다당체를 포함하는 화장품.