KR100754821B1

KR100754821B1 - 벌 동충하초 ｊ―201 균주의 균사체와 그 세포외 다당체의대량 생산방법

Info

Publication number: KR100754821B1
Application number: KR1020060023185A
Authority: KR
Inventors: 오정영; 최장원; 윤종원
Original assignee: 학교법인 영광학원
Priority date: 2006-03-13
Filing date: 2006-03-13
Publication date: 2007-09-03

Abstract

본 발명은 벌 동충하초 균주(Cordyceps sphecocephala J-201)의 균사체와 세포외 다당체를 대량 생산하는 방법으로 탄소원, 질소원, 온도, 초기 pH, 교반속도 및 통기량 등의 조건을 다양하게 조정하여 균체와 세포외 다당체를 동시에 대량생산할 수 있는 액체배양 최적조건에 관한 것으로서 벌 동충하초 균주 J-201를 계대배양용 배지에 이식하여 4주 동안 배양시켜 전배양용 액체배지에 접종한 후, 25℃에서 10일 동안 진탕 배양기에 150rpm으로 진탕배양한 후 전배양액으로 사용하는 제1단계; 상기 제1단계 이후, 전배양된 벌 동충하초 균사체를 탄소원, 질소원, 초기 pH, 배양온도의 조건을 설정한 생산용 액체배지를 확립하는 2단계, 2단계 이후에 다시 전배양용배지에서 7일 배양한 후 8%의 농도로 생산용 액체배지에 접종하여 8일 동안 진탕 배양기에 150rpm으로 진탕배양한 후 4%의 농도로 3L의 생산용 배지를 함유한 5L 액체배양장치에 접종하여 25℃에서 11일 동안 150rpm, 2vvm으로 진탕 배양하는 제3단계, 상기 제3단계 이후, 배양액을 10,000rpm에서 20분 원심분리하여 균사체와 배양여액을 분리한 후 배양여액에 4배의 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 방치한 후, 세포외 다당체를 원심분리로 분리하는 4단계, 상기 세포외 다당체를 물에 용해하여 투석한 투석액을 동결건조 함으로써 세포의 다당체를 생산하고 그 단당의 조성을 기체 크로마토그래피로 확인하는 제5단계로 구성함을 특징으로 하는 벌 동충하초 균주를 액체 배양하여 균사체와 세포외 다당체를 동시에 대량 생산하는 방법을 제공하는 매우 뛰어난 효과가 있다.

벌동충하초, 동충하초 균사체, 다당체, 액체배양조건

Description

벌 동충하초 Ｊ―201 균주의 균사체와 그 세포외 다당체의 대량 생산방법{Method of mass production for mycelia and extracellular polysaccharides of the same Cordyceps sphecocephala}

도 1은 벌 동충하초 J-201 균주 균사체의 액체배양에 있어서, 온도가 미치는 영향을 보여주는 막대 그래프.

도 2는 벌 동충하초 J-201 균주 균사체의 액체배양에 있어서, 초기 pH가 미치는 영향을 보여주는 막대 그래프.

도 3은 벌 동충하초 J-201 균주 균사체의 액체배양에 있어서, 탄소원이 미치는 영향을 보여주는 막대그래프.

도 4는 벌 동충하초 J-201 균주 균사체의 액체배양에 있어서, 질소원이 미치는 영향을 보여주는 막대그래프.

도 5는 벌 동충하초 J-201 균주 균사체의 액체배양장치를 통한 액체배양에 있어서, 교반속도가 미치는 영향을 보여주는 그래프.

도 6은 벌 동충하초 J-201 균주 균사체의 액체배양장치를 통한 액체배양에 있어서, 통기량이 미치는 영향을 보여주는 그래프.

도 7은 벌 동충하초 J-201 균주 균사체를 배양한 후 균사체와 세포외 다당체의 분리과정을 보여주는 그림이다.

본 발명은 동충하초 균사체와 그 세포외 다당체의 대량 생산방법에 관한 것이다.

특히, 균사생장이 느려서 지금까지 액체배양이나 자실체배양에 관한 연구실적이 전무한 벌 동충하초(Cordyceps sphecocephala) J-201 균주의 균사체와 세포외 다당류를 동시에 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

동충하초는 자낭균강(子囊菌綱)의 맥각균목(麥角菌目) 동충하초과에 속하는 소형의 버섯류로서 겨울에는 곤충에 기생하다가 여름에는 숙주가 되는 곤충의 시체에서 버섯을 형성한다고 해서 그 명칭이 유래 되었다. 동충하초 버섯의 형성과정을 좀 더 자세히 설명하면 동충하초균이 자낭포자(子囊胞子)나 분생포자(分生胞子)를 형성하여 살아있는 곤충의 호흡기, 소화기, 관절 등 부드러운 부분에 부착 침입한 뒤, 곤충 체내의 영양분을 섭취하면서 균사를 형성하여 곤충을 죽게 한 다음, 여름에 그 기주(寄主)인 곤충의 양분을 이용하여 자실체를 형성하게 된다.

동충하초는 그 종류에 따라 구성성분에 다소 차이가 있지만 일반적으로 수분, 지방, 조단백, 탄수화물 그리고 회분으로 구성되어 있으며, 단백질 중에는 인체에 없어서는 안 될 필수 아미노산이 약 18종이 들어 있다. 또한 동충하초에는 충초다당 (Cordyceps Polysaccharides)과 충초산(Cordycepic Acid) 과 같은 특수한 성분이 함유되어 있어서, 예로부터 폐결핵, 천식, 빈혈, 피로, 고혈압의 치료제뿐 만 아니라 불로장생의 비약으로 알려져 왔다. 최근 들어서 동충하초에는 면역기능을 강화하는 성분과 항암성분이 함유되어 있다는 사실이 증명되어 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 마약중독의 해독제로서의 효과가 우수하고, 곤충에 기생하는 속성 때문에 효과적인 해충방제를 제공하면서도 환경오염을 예방할 수 있는 생물농약으로서의 효용도 매우 크다. 또한 동충하초의 세포외 다당체는 항종양, 면역증강, 저혈당효과 및 저콜레스테롤 효과 등이 보고되어있다.

벌 동충하초(Cordyceps sphecocephala)는 벌을 기주로 하는 동충하초로써 다른 동충하초류에 비하여 환경 조건에 영향을 덜 받아 숲 속에서 쉽게 채집되나 균사생장이 느려 아직까지 배양에 관한 연구가 이루어지지 않고 있는 실정이다. 이에 따라 벌 동충하초 생육에 적합한 액체배양배지를 확립하고 액체배양을 통해 세포외 다당체를 확립하는 방법의 필요성이 대두되고 있다.

종래에도 다양한 동충하초 속 균주의 균사체의 배양방법이 공개특허 제 2000-38315 호, 제 2001-8993 호, 제 2001-27806 호, 제 2002-674 호, 제 2002-1280 호 등에 공지되어 있다. 그러나, 상기 공지기술에는 면역증강, 혈당저하 등 인체생리활성에 유용한 세포외 다당체를 균사체와 동시에 대량 생산하기 위한 연구는 전무한 실정이었다.

본 발명은 동충하초 속 균주 등에서 성장이 가장 늦은 것으로 알려진 J-201 균주(농촌진흥원분양균주)를 액체배양하여 균사체와 균체외 다당체를 동시에 대량 생산하기 위한 최적균 사체배양 및 균체외 다당체의 생합성 조건을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 상기 목적은 벌 동충하초 J-201 균주를 액체배양함에 있어 탄소원, 질소원, 온도 및 초기 pH 등의 환경조건을 최적으로 조정하고 액체배양장치에서의 교반속도 및 통기량을 최적으로 조정하여 배양함으로써, 상기 벌 동충하초 균사체의 대량확보와 동시에 세포외 다당체를 생산할 수 있도록 하여 균사체와 다당체를 이용한 새로운 기능성 식품, 건강식품, 및 의약품 등으로의 개발 가능성을 제공함에 또 다른 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 벌 동충하초 균주 J-201를 계대배양용 배지에 이식하여 4주 동안 배양시켜 전배양용 액체배지에 접종한 후, 25℃에서 7일 동안 진탕 배양기에 150rpm으로 배양한 후 전배양된 벌 동충하초 균사체를 탄소원, 질소원, 온도 및 초기 pH 등의 조건이 설정된 생산용 액체배지에 8%의 농도로 접종하여 25℃에서 8일 동안 배양하는 1단계; 상기 1단계 이후, 생산용 액체배지 3ℓ에 4%의 농도로 접종한 후 150rpm, 2vvm 으로 설정된 5L 액체배양장치에서 11일 동안 배양하는 2단계; 상기 제 2단계 이후, 배양액을 10,000rpm에서 20분 원심 분리하여 균사체와 배양여액을 분리한 후 배양여액에 4배의 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 방치한 후, 세포외 다당체를 원심분리로 분리하는 3단계, 상기 세포외 다당체를 물에 용해하여 투석해 불순물을 제거하고 동결건조 함으로써 세포외 다당체를 생산하고 단당의 조성을 기체크로마토그래피를 통해 확인하는 제4단계로 구성하는 벌 동충하초 균주를 액체배양하여 균사체와 다당체를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 벌 동충하초 균주로부터 균사체와 세포외 다당체의 대량 생산방법에 관한 것으로서, 벌 동충하초 균주를 탄소원, 질소원, 온도, 초기 pH, 교반속도 및 통기량 등의 조건을 조정해 최적의 조건이 설정되도록 함으로써, 균사체와 세포외 다당체의 최적 생산조건의 확립 및 이로 인해 대량 생산이 가능하도록 한다.

이하, 먼저 본 발명에서 사용된 균주 및 최적의 배지조성을 찾기 위해 수행한 각종 실험 방법을 설명한다.

<실험예 1> 공시 균주

본 발명에서 사용한 공시 균주는 Cordyceps sphecocephala J-201이며, 수원 농촌진흥원으로부터 분양받았다. 하기 표1의 PDA (potato dextrose agar) 배지에서 25℃로 4주간 배양한 후 4℃에서 보존하였으며, 4주마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다.

<실험예 2> 배지 조성 및 조제

본 실험에서 사용한 전배양용 배지는 MCM (표1)이다. 121℃에서 15분간 가압살균 후 사용 하였으며, pH는 3N HCl 또는 3N NaOH로 조절하였다.

<실험예 3> 플라스크 배양

접종균의 전배양은 상기 PDA 평판배지에서 생육한 균사체를 8×8mm의 크기로 자른 다음, 4개를 표2의 전 배양 배지 50㎖를 넣은 250㎖ 삼각 플라스크에 접종하였다. 25℃에서 10일간 배양한 다음, 다시 위의 배지 50㎖를 함유한 250㎖의 삼각 플라스크에 4%의 전 배양액을 접종하고 25℃에서 150rpm으로 11일간 회전 진탕 배양하였다.

<표 1> 배지 조성 예

배지	성분	농도%
계대배양용배지 (PDA)	PDA(Potato dextrose broth)	2.4
계대배양용배지 (PDA)	아가(Agar)	1.8
전배양용배지 (MCM)	글루코스	2
	효모 추출액(Yeast extract)	0.2
	미트 펩톤(Meat peptone)	0.2
	K₂HPO₄	0.1
	KH₂PO₄	0.046
	MgSO₄·7H₂O	0.05

이하, 본 발명의 균사체와 세포의 다당체 생산을 극대화하기 위한 최적 배양조건을 규명하기 위하여 배양환경 조건의 영향을 실시예로 들어 설명한다.

<실시예 1> 온도 및 pH의 영향

온도의 영향은 표 1의 배지를 온도 범위가 22∼31℃이 되도록 조절하여 pH 5에서 11일간 회전 진탕 배양하여 조사하였고, 초기 pH의 영향은 초기 pH 범위가 3∼8이 되도록 조절하고 25℃에서 11일간 회전 진탕 배양한 후 각각의 균사체와 세포외 다당체의 건조 중량을 측정하여 조사하였다. 그 외의 다른 배양 조건은 전술한 바와 동일하다.

결과는 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, 25℃의 온도에서 균체생육 및 세포외 다당체의 생산성이 가장 양호하였다.

한편 도 2에서 보는 바와 같이, 균체의 생육은 초기 pH 5에서 가장 좋았고, 세포외 다당체의 생산은 초기 pH 4,5에서 다소 높게 나타났다. 따라서 균체의 생육 및 세포외 다당체의 생산을 위해서는 초기 pH5 에서가 가장 바람직하다.

<실시예 2> 탄소원의 영향

탄소원의 영향은 표 2의 전배양용배지 중에서 탄소원인 글루코스 대신 도3의 각종 탄소원을 2%농도로 첨가하여 25℃에서 11일간 진탕 배양을 행하여 균사체 및 다당체의 건조 중량을 측정하여 조사하였다. 그 결과, 균체의 생장량은 당알콜의 일종인 만니톨에서 가장 좋았으며 다당체의 생산량은 이당류인 수크로스에서 가장 좋았다. 균사체 및 다당체의 대량생산시 원부재료비를 고려하여 산업화를 위한 대규모 발효에서는 수크로스를 사용하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.

수크로스의 농도를 변화시키며 실험한 결과, 균체의 생육 4%까지는 급격히 증가하다가 그 이상의 농도에서는 완만하게 증가하였고, 다당체의 생산량은 크게 변화를 보이지 않았다.

따라서 균사체의 생장과 다당체의 생산량은 수크로스의 농도는 4%가 가장 적당하다고 사료된다.

<실시예 3> 질소원의 영향

질소원의 영향은 표2의 기본 배지 조성 중 상기 실시예 2에서 얻어진 최적 탄소원 농도 하에서 기본 배지의 질소원 대신 도 4에 나타낸 각종의 질소원을 0.4%농도로 첨가하여 탄소원의 영향과 동일하게 조사하였다.

결과를 도 4에 나타내었다.

도 4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 균체 및 세포외 다당체의 생산성은 대조군과 같이 유기질소원인 효모 추출액(yeast extract) 및 폴리펩톤(poly pepton)에서 가장 양호한 생산량을 나타내었으며 효모 추출액(yeast extract) 및 폴리펩톤(poly pepton)을 0.6%와 0.2%의 농도로 혼합하여 첨가하였을 때 균사체와 세포외 다당체의 생장이 가장 양호하였다.

이상으로부터 얻은 균사체와 세포외 다당체 생산용 배지의 조성 결과를 보면 수크로스 4%, 효모 추출액(yeast extract) 0.6%, 폴리펩톤(polypepton) 0.2%, K₂HPO₄ 0.1%, KH₂PO₄0.046%, MgSO₄·7H₂O 0.05%이며 배양조건은 초기 pH 5, 25℃이었다.

<실시예 4> 교반속도의 영향

5L 액체배양장치에서 교반속도의 영향을 알아보기 위하여 25℃에서 7일간 전배양용 배지에서 배양한 다음, 다시 실시예 1~3에서 얻어진 최적 생산용 배지 50㎖를 함유한 250㎖의 삼각 플라스크에 8%의 전 배양액을 접종하고 25℃에서 150rpm으로 8일간 회전 진탕 배양한 후, 다시 생산용 배지 3L를 함유한 5L의 액체배양장치에 4%의 배양액을 접종하고 25℃, pH 5에서 50, 150, 300, 500rpm으로 교반속도를 변화시켜 균사체 및 다당체의 생산량을 조사하였다. 도 5의 결과로부터 알 수 있듯이 균체량은 교반속도가 300rpm 일 때 가장 많았으며 150rpm 일 때도 양호하였으나 낮은 교반속도인 50rpm과 높은 교반속도인 500rpm에서는 균사성장이 저해되는 것을 알 수 있었으며 다당체의 양은 150rpm일 때 그 생산량이 가장 좋았다. 균사체 및 다당체의 대량생산 시 산업화를 위한 대규모 발효에서는 150rpm을 사용하는 것이 가장 바람직할 것으로 판단된다.

<실시예 5> 통기량의 영향

5L 액체배양장치에서의 통기량의 영향은 실시예 4의 조건하에서 통기량을 0.5, 1, 2vvm으로 조정하여 균사체 및 다당체의 생산량을 확인해 보았다. 도6에서 보는바와 같이 균사체 및 세포외 다당체의 최대생산은 통기량이 2vvm일 때 최대균체량 27.03g/L, 최대 다당체량 2.46g/L이 생산되었다.

<실시예 6> 세포외 다당체의 분리 및 조성확인

이상의 실시예 1∼5에서 확립된 최적의 조건하에 벌 동충하초를 11일간 배양하고, 다음과 같이 균사체 및 세포외 다당체를 분리하였다(도 7).

균사체는 배양이 끝난 후 10000rpm에서 20분간 원심 분리하여 균사체를 분리한후 증류수로 수회에 걸쳐 수세한 후 동결건조 하여 흰색의 균사체 분말을 얻었다.

세포외 다당체는 원심분리한 후 4배의 에탄올에 부어 4℃에서 24시간동안 방치한 후 원심분리를 통해 세포외 다당체를 회수하고 상기 세포외 다당체를 물에 용해시킨 후 투석(막의 분자량절단 10,000) 하여 배양 잔존물을 제거하고 투석액을 동결건조 함으로써 세포외 다당체를 분리하였으며 제조된 파우더의 단당조성을 기체크로마토그래피 (GC)를 사용하여 측정한 결과 만노스(mannose) 55%, 갈락토오스(galactose) 39% 글루코스(glucose) 6%의 당조성인 세포외 다당체를 확인할 수 있었다.

본 발명에서는 아직까지 충분히 연구되지 않은 벌 동충하초를 액체배양함에 있어서, 균사체와 세포외 다당체를 동시적으로 대량생산할 수 있도록 탄소원, 질소 원, 온도, pH, 교반속도 및 통기량 등을 다양한 실험을 통해 최적의 조건으로 설정하여 상기 벌 동충하초 균주와 세포외 다당체를 대량생산할 수 있도록 함으로써, 균사체와 세포외 다당체를 이용하여 새로운 기능성 식품, 건강식품 및 의약품을 얻을 수 있으므로 기능성 식품 및 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

벌 동충하초 균주를 액체배양하여 균사체를 생산하는 방법에 있어서, 벌 동충하초 J-201 균주를 계대배양용 배지에 이식하여 4주 동안 배양시켜 전배양용 액체배지에 접종한 후, 25℃에서 7일 동안 진탕배양기에 150rpm으로 배양한 후 전배양된 벌동충하초 균사체를 탄소원, 질소원, 온도 및 초기 pH의 조건이 설정된 생산용 액체배지에 8%의 농도로 접종하여 초기 pH 5, 25℃에서 8일 동안 배양하는 1단계; 상기 1단계 배양 이후, 3L의 생산용 액체배지에 4%의 농도로 접종한 후 150rpm, 2vvm으로 설정된 5L 액체배양장치에서 11일 동안 배양하는 2단계; 상기 제 2단계 배양 후, 배양액을 10000rpm에서 20분 원심분리하여 균사체와 배양여액을 분리한 후 배양여액에 4배의 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 방치한 후, 세포외 다당체를 원심분리로 분리하는 3단계; 및 상기 세포외 다당체를 물에 용해하여 투석해 불순물을 제거한 후 투석액을 동결건조 함으로써 세포외 다당체를 생산하고 단당의 조성을 기체크로마토그래피를 통해 확인하는 제4단계로 구성되는 벌 동충하초 균주를 액체 배양하여 균사체와 세포외 다당체를 동시에 대량생산하는 방법.
제 1항에 있어서, 균사체 및 세포외 다당체 생산용 배지는 수크로스 4%, 효모 추출액(yeast extract) 0.6%, 폴리펩톤(polypepton) 0.2%, K₂HPO₄ 0.1%, KH₂PO₄0.046% 및 MgSO₄·7H₂O 0.05%를 함유함을 특징으로 하는 벌 동충하초 균주를 액체 배양하여 균사체와 세포외 다당체를 동시에 대량생산하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 생산된 세포외 다당체는 만노스 55%, 갈락토오스 39% 및 글루코스 6%의 당조성을 가지는 것을 특징으로 하는 벌 동충하초 균주를 액체 배양하여 균사체와 세포외 다당체를 동시에 대량생산하는 방법.