KR20170114540A - 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법 - Google Patents
세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 세리포리아 락세라타 균사체 배양물의 유효성분인 세포 외 다당체(EPS, exopolysaccharide), 베타-글루칸(β-glucan)의 생산성이 향상된 배양방법으로 일정 농도 이상의 DO(용존산소량, Dissolved oxygen) 농도하에서 교반 및 통기 변화에 따른 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)의 액체배양 시 균사체 양, 건조물의 양, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체, 베타-글루칸의 함량을 향상시킴과 동시에 대량 생산방법에 관한 것이다.
아울러 상기 세리포리아 락세라타를 배양한 균사체 건조물 또는 농축물 및 세포 외 다당체 및 베타글루칸은 배양 단계에서 공기 공급 및 교반을 위해 0.01~10vvm 및 rpm은 0~500 rpm으로 조절하여 배양하는 것을 특징으로 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법에 관한 것이다.
아울러 상기 세리포리아 락세라타를 배양한 균사체 건조물 또는 농축물 및 세포 외 다당체 및 베타글루칸은 배양 단계에서 공기 공급 및 교반을 위해 0.01~10vvm 및 rpm은 0~500 rpm으로 조절하여 배양하는 것을 특징으로 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 세포 외 다당체(EPS, exopolysaccharide), 베타-글루칸(β-glucan)의 생산성이 향상된 배양방법으로 일정 농도 이상의 DO(용존산소량, Dissolved oxygen) 농도하에서 교반및 통기 변화에 따른 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)의 액체배양 시 균사체 양, 건조물의 양, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체, 베타-글루칸의 함량을 향상시킴과 동시에 대량 생산방법에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 교반 속도를 조절하여 일정 농도 이상의 용존산소량을 유지하며, 교반 속도에 의해 용존산소량이 조절되지 않을 경우 2단계로 통기를 조절하여 자 발효조(jar fermenter) 시스템에서 세리포리아 락세라타의 효율적으로 균사체와 건조물, 세포 외 다당체, 베타-글루칸을 생산한다. 아울러 스케일 업(scale-up) 조건을 확립하여 세리포리아 락세라타의 균사체를 대량배양하여 균사체량, 건조물량, 세포 외 다당체 및 베타-글루칸의 생산방법에 관한 것이다.
버섯이란 균류(菌類) 중에서 눈으로 식별할 수 있는 크기의 자실체(子實體)를 형성하는 무리의 총칭이다. 버섯은 예로부터 불로장생의 묘약으로 그 가치와 중요성이 인식되어 왔다. 그 외에도 버섯에는 암예방, 성인병 예방의 건강식품 면에서뿐만 아니라, 맛과 향이 뛰어난 별미요리로서 좋은 먹 거리를 제공해주었다.
세리포리아 락세라타는 구멍장이과 버섯으로 참나무나 백색 부후균의 일종이다. 생태계에서 셀룰로오스(Cellulose), 헤미셀룰로오스(Hemicellulose), 기타 다당류 및 글리세롤(Glycerol) 등의 탄소원을 이용하기 위하여 리그닌(Lignin) 분해라는 공동대사를 수행 및 당뇨병 등에 효과를 나타내는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 생산하는 것으로 알려졌다.
자실체는 완전 배착성(背着性 )이며 기주(寄 主)위에 단단히 부착하여 넓게 퍼진다. 또한, 자실층은 관공으로 형성되어 있고 백색이며 짙은 솔향을 발산한다.
최근 보고된 바에 의하면 세리포리아 락세라타 균사체 배양물의 생리활성 주성분인 세포 외 다당체는 항 당뇨, 간 기능 개선, 지질 대사 관련 개선 등의 각종 약리 작용을 하고 있다.
이러한 균사체 추출물의 경우는 화장료 조성물로 사용 가능한 것으로 밝혀져 산업적인 관심이 고조되고 있다.
특히, 세포 외 다당체를 포함하고 있는 세리포리아 락세라타 건조물은 혈당강하제로서의 개발이 기대되는 등, 점차 각종 기능성 식품소재 및 의약품 소재로서 잠재적 가능성이 매우 크기 때문에 세리포리아 락세라타 균사체의 대량 생산방법이 절실히 필요하다.
일반적으로 버섯은 우수한 기능성 성분을 함유하고 있어서 자실체뿐만 아니라 액체배양을 통한 균사체로도 식용 가능하여 식품 및 의약품으로 소재화하는 다양한 활용 방안이 제시되고 있다. 최근 대부분의 버섯 종균은 액체배지(液體培地)에 함유된 영양성분을 이용한 생물전환을 통해서 다양한 생리활성 물질을 포함하는 균사체 배양이 가능하게 되었다.
그러나 2002년 학계에 처음 보고된 이유로 세리포리아 버섯은 잘 알려졌지 않아 종균을 이용한 액체 배양에 대한 연구가 미비한 실정이다.
균사체를 배양하는 방법으로는 고체 배양법과 액체 배양법이 알려졌었다.
고체배양법은 재배시간이 길고, 오염이 발생할 확률이 높고, 배양이 완료된 후 균사체만을 회수하는 작업을 자동화하기가 어렵다는 단점이 있다. 균사체의 액체 배양법은 고체 배양법에 비하여 오염 가능성이 작고, 비교적 조밀한 공간에서 짧은 시간 동안에 대량 배양할 수 있다는 장점이 있다.
버섯의 균사체와 유용성분을 포함하는 액체 배양물을 대량으로 단기간에 생산하기 위해서는 배지 성분의 최적화 및 경제성이 있는 원료들의 사용이 요구된다. 버섯의 액체배양을 위한 영양성분으로 옥수수 침지액(Corn steep liquor), 효모 추출물(Yeast extract), 펩톤(Peptone) 등의 부산물 유래 탄소원과 고가의 질소원 등이 사용되고 있다.
대부분의 균류는 진탕 배양 시 펠릿(Pellet) 또는 필라멘트(Filament) 균사를 형성하며, 특히 담자균류들은 다양한 크기의 균사응집체를 형성한다. 상기 균사응집체로 인하여 벽면 생육(Wall growth)이 발생하며, 이로 인해 교반 및 통기에 의한 물질전달이 어려워져 균사 생육 및 생성물의 생산도 저해된다. 그동안 상기 문제점으로 인해 에어-리프트 발효조(Air-lift fermenter)가 일부 사용하여 왔으나,
현재 산업적인 생산을 위한 대규모 에어-리프트 발효조의 이용은 미흡한 실정이다. 따라서 자 발효조에서의 배양이 불가피하며, 또한 벽면 생육의 방지수단이 강구되어야 한다.
기존의 세리포리아 락세라타에 대한 배양방법은 에어 리프트(Air lift) 방식의 배양기에서 온도, pH, CO2 농도, 조사되는 빛의 양, 배지 성분에 대한 보고는 있지만, 교반기가 부착되어 있는 생물반응기의 적용이 거의 없으며, 특히 최적 배양 조건으로 세리포리아 락세라타 균사체량, 건조물의 양, 그리과 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸의 함량을 증가시키기 위해 일정 농도 이상의 DO(용존산소량, Dissolved oxygen)를 유지하는 방법인 교반기의 교반속도, 통기량(通氣量)등을 이용한 배양 방법은 전혀 없는 상태이다.
따라서, 천연 소재인 세리포리아 락세라타의 배양 방법의 최적화를 통해 산업적 생산이 가능한 배양방법을 이용하여 당뇨병 예방 및 치료에 효과적인 세포 외 다당체 및 베타-글루칸 등의 생산을 향상시킬 수 있는 개발 방법이 요구되고 있다.
본원과 관계되는 논문 또한 다양하게 기술되어 이를 살펴보면 먼저 세리포리아 락세라타 버섯의 균사체 액체 배양을 통한 세포 외 다당체 생산 및 항 당뇨 효과(김지은 계명대학교 박사학위논문, 2013) 와 특성을 분석하였다. 상기 세리포리아 락세라타 균사체 배양물을 건강 기능성 식품으로 활용을 꽤하고 있다.
더불어 세리포리아 락세라타 균사체 유래 추출물(CL01)의 2형 당뇨동물에서 혈당 강하 장기 효력 시험((주)퓨젠바이오농업회사법인 연구용역,2014)이 진행된바있다.
또한, 세리포리아 락세라타 균사체 배양물은 세포를 증식시켜 인슐린 분비를 촉진하고 혈당을 낮추며 당뇨병 개선 및 효과가 있음을 알 수 있었다
또 다른 논문으로 흰목이 버섯 (Tremella fuciformis)의 균사체 액체배양을 통한 세포 외 다당체를 배양하는 방법(조은재 대구대학교 2007)등이 선행되었다.
이와 같이 버섯 유용 성분으로 생산되는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸은 기능성 물질로서 버섯 곰팡이의 액체배양을 통한 대량생산으로 식품, 화장품 및 기능성 소재로 활용할 수 있다.
특히, 버섯 곰팡이의 액체배양은 생물전환기술을 최적화함으로써 단시간에 효과적으로 유용물질을 생산할 수 있어서 경제성이 높다. 따라서 식용, 약용을 포함한 다양한 버섯 곰팡이 배양에 관한 연구, 특히 차별화된 다양한 기능성 물질의 생산 등이 우수한 종균의 선별 및 이를 이용한 생물전환기술의 최적화기술은 산업적으로 매우 유용하며 본 발명자들은 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 대한민국 등록특허 10-1031605호에서 개시된 세리포리아 락세라타 배양방법에 대해 연구한 결과, 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 균사체 및 건조물의 생산량이 배양조건에 따라 증가한다는 것을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세리포리아 락세라타 균사체의 최적배양을 위한 균사체 배양 배지의 조성을 개발하고, 개발된 배양 배지를 사용하여 균사체 대량배양을 위한 적정 생물반응기의 형태, 생산방법 및 배양조건을 밝혀 생물반응기에서 균사체를 신속하게 대량으로 배양하는 방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 세리포리아 락세라타의 대량 생산방법에 의해 얻은 세리포리아 락세라타 균사체, 건조물 및 배양물로부터 얻을 수 있는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸 등을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 생산방법에 의해 세리포리아 락세라타로부터 얻을 수 있는 배양물, 건조물, 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 포함하는 약품, 식품 및 화장품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 약품, 식품 및 화장품을 제공한다.
또한, 본 발명은 배양방법으로 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 제조 시 초기 및 배양 중의 공기 주입량, 배양 중에 산소 공급 및 배지 성분의 균일하게 하기 위해 배양물을 교반할 수 있는 임펠러(Impeller) 속도에 따라 적정한 용존 산소(D O, Dissolved oxygen)유지 및 배지 성분을 균일한 확산시키는 방법을 최적화하여 산업적으로 대량 생산할 수 있는 방법을 개시하였고 이들 유효성분을 이용하여 약품, 식품 및 화장품을 제조하고자 하는 것이다.
본 발명에 따른 배양방법은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 건조물 및 농축물, 그리고 균사체의 생산성이 향상되어 더욱 생산성이 향상된 유효성분을 이용하여 약품, 식품 및 화장품으로 널리 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 배지 조성으로 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 추출물 제조 시 탄소원, 질소원, 무기염류를 최적화하여 산업적으로 대량 배양할 수 있다.
또한, 본 발명은 배양방법으로 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 추출물에 의하여 제조할 수 있다. 그리고 초기 및 배양 중의 공기 주입량, 배양 중에 산소 공급 및 배지 성분의 균일하게 하기 위해 배양물 교반할 수 있는 임펠러 속도에 따라 적정한 용존 산소유지 및 배지 성분을 균일한 확산시키는 방법을 최적화하여 산업적으로 대량 배양할 수 있다.
더불어 배양중에 영양성분을 첨가함으로써 세리포리아 락세라타 건조물 및 농축물의 양, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸의 함량을 증가시킬 수 있다.
본원의 균사체를 배양하는 방법으로는 고체 배양법과 액체 배양법을 사용할 수 있는데 고체배양법은 재배시간이 길고, 오염이 발생할 확률이 높고, 배양이 완료된 후 균사체만을 회수하는 작업을 자동화하기가 어렵다는 단점이 있는 반면에 균사체의 액체 배양법은 고체 배양법에 비하여 오염가능성이 작고, 비교적 조밀한 공간에서 짧은 시간 동안에 대량 배양할 수 있다는 장점이 있다.
일반적으로 버섯의 균사체와 유용성분을 포함하는 액체 배양물을 대량으로 단기간에 생산하기 위해서는 배지 성분의 최적화 및 경제성이 있는 원료들의 사용이 요구된다. 버섯의 액체배양을 위한 영양성분으로 옥수수 침지액(Corn steep liquor), 효모 추출물(Yeast extract), 펩톤(Peptone) 등의 부산물 유래 탄소원과 고가의 질소원 등이 사용되고 있다.
대부분의 균류는 진탕 배양 시 펠릿(Pellet) 또는 필라멘트(Filament) 균사를 형성하며, 특히 담자균류들은 다양한 크기의 균사응집체를 형성한다. 상기 균사응집체로 인하여 벽면 생육(Wall growth)이 발생하며, 이로 인해 교반 및 통기에 의한 물질 전달이 어려워져 균사 생육 및 생성물의 생산도 저해된다. 그동안 상기 문제점으로 인해 거품 통기형 발효조(bubble column fermenter)가 일부 사용하여 왔으나, 현재 산업적인 생산을 위한 대규모 거품 통기형 발효조의 이용은 미흡한 실정이다.
따라서 발효조에서의 배양이 불가피하며, 또한 벽면 생육의 방지수단이 강구되어야 한다. 기존 세리포리아 락세라타에 대한 배양방법은 거품 통기형 방식의 배양기에서 온도, pH, CO2 농도, 조사되는 빛의 양, 배지 성분에 대한 보고는 있지만, 교반기가 부착되어 있는 생물반응기(Bioreactor)의 적용이 거의 없으며, 특히 최적 배양 조건으로 세리포리아 락세라타 균사체량, 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸의 함량을 증가시키기 위해 일정 농도 이상의 용존산소량을 유지하는 방법인 교반기의 교반 속도, 통기량 등을 이용한 배양 방법은 전무한 상태이다.
따라서, 천연 소재인 세리포리아 락세라타의 배양 방법의 최적화를 통해 산업적 생산이 가능한 배양방법을 이용하여 생산을 향상시킬 수 있는 개발 방법이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 세리포리아 락세라타 균사체 배양액 추출물을 대상으로 예의 연구를 계속한 결과, 세리포리아 락세라타 배양에 있어 배양조건에 따라 유효성분인 세포 외 다당체 및 베타-글루칸의 생산성이 개선됨을 다양한 연구를 통하여 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
도 1은 본원의 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법의 일 실시 예에 있어 세리포리아 락세라타 배양 시 초기 pH에 따른 균사체의 생장성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본원의 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법의 일 실시 예에 있어 배양 시 배양시간에 따른 균사체 생산성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본원의 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법의 일 실시 예에 있어 배양기 종류에 따른 세리포리아 락세라타 배양물의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본원의 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법의 일 실시 예에 있어 700 L 공기 부양식 배양기에서의 배양과 5,000 L 교반형 생물반응기의 최적조건에서 배양한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본원의 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법의 일 실시 예에 있어 세포 외 다당체 (EPS)의 분자량을 측정한 그래프이다.
도 2는 본원의 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법의 일 실시 예에 있어 배양 시 배양시간에 따른 균사체 생산성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본원의 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법의 일 실시 예에 있어 배양기 종류에 따른 세리포리아 락세라타 배양물의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본원의 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법의 일 실시 예에 있어 700 L 공기 부양식 배양기에서의 배양과 5,000 L 교반형 생물반응기의 최적조건에서 배양한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본원의 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법의 일 실시 예에 있어 세포 외 다당체 (EPS)의 분자량을 측정한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 배양방법에 의해 생산되는 유효성분은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 건조물 및 농축물, 그리고 균사체의 생산성이 향상되어 더욱 효과적인 약품, 식품 및 화장품으로 널리 사용될 수 있다.
더불어 교반속도를 조절하여 일정 농도 이상의 용존산소량을 유지하며, 교반속도에 의해 용존산소량이 조절되지 않을 경우 2단계로 통기를 조절하여 자 발효조(Jar fermenter) 시스템에서 세리포리아 락세라타의 효율적으로 균사체와 건조물, 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 생산한다.
본 발명은 이처럼 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물에 포함되어 있는 유효성분의 생산성을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물은 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 추출물을 유효성분으로 함유한다.
본 발명의 세포 외 다당체 및 베타-글루칸은 세리포리아 락세라타 배양물로부터 얻을 수 있다.
바람직하게는 상기 세포 외 다당체 및 베타-글루칸은 (a) 세리포리아 락세라타를 액체 배지에서 배양하여 균사체 배양물을 제조하는 단계, (b) 세리포리아 락세라타 균사체 및 배양물을 건조 시켜 분말화하는 단계, 및 (c) 균사체 배양물 또는 배양물 분말을 용매로 추출하여 이로부터 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 수득하는 단계를 거쳐 제조할 수 있다.
상기 (a) 단계에서의 세리포리아 락세라타 균사체의 액체 배양을 위한 배지는 포도당, 펩톤, 일인산 칼륨(KH2PO4), 황산 마그네슘(MgSO4) 및 물을 포함할 수 있고, 수소이온농도가 pH 4.0~6.0인 것일 수 있다.
바람직한 하나의 일 실시 예로서, 상기 배지는, 0.2~5% 포도당, 0.2~1% 펩톤, 0.05~0.25% 일인산칼륨(KH2PO4), 0.02~0.1% 황산 마그네슘(MgSO4) 및 물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 포도당 3 중량%, 펩톤 0.5 중량%, 일인산칼륨(KH2PO4) 0.1 중량%, 황산마그네슘(MgSO4) 0.05 중량%이다.
이때, 액체 배양은 예를 들어, 20~25℃에서, 수소이온농도(pH) 4.5~6.0, 공기는 0.1~2 vvm으로 주입하고 7~11일간 수행될 수 있다.
상기 (a) 단계에서의 PDA(Potato dextrose agar) 배지 상태로 4℃에 보관중인 우량 균주 1개를 호모제나이징(Homogenizing)하여 PDB(Potato dextrose broth) 배지가 들어 있는 삼각플라스크에 접종하여 진탕 배양기에서 20~25℃의 항온을 유지하며 7~11일간 배양과정을 거친 것을 사용할 수 있다. 이때 접종원으로 투입될 균사체의 양은 배양할 용액의 양을 기준으로 0.3%(w/v) 정도인 것이 바람직하다.
상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 제조된 균사체 배양물을 진공건조 또는 동결건조시켜 분말화할 수 있다. 상기의 건조는 유효물질의 소멸을 방지하기 위해 40℃ 이하의 온도, 보다 구체적으로는 30℃ 이하의 온도에서 48 내지 96시간 동안 수행되는 것이 바람직하다. 그리고 (b) 단계에서의 건조는 증발온도를 상대적으로 높게 설정하는 진공건조기보다 진공동결건조기를 사용하는 것이 유효물질 함량 변화가 최소화되므로 바람직하다.
상기 (c) 단계에서는 (a), (b) 단계에서 얻은 균사체 배양물 혹은 배양물 건조물을 용매로 추출한 후 본 발명에 따른 배양물의 유효성분인 세포 외 다당체 또는 베타-글루칸을 분리 제조한다.
세포 외 다당체를 얻기 위해 건조 분말 1~10g에 증류수 100㎖를 첨가하여 잘 현탁한 후, 10,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 이의 상등액에 그 양의 2 ~ 4배에 해당하는 95% 이상의 순도를 갖는 용매를 첨가하고 2 ~ 6℃의 냉장고에 넣어 12 ~ 18시간 정치시킬 수 있다. 상기의 정치물을 10,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 후, 침전물을 회수 및 동결건조하여 조(crude) 세포 외 다당체를 제조할 수 있다.
상기 세포 외 다당체는 40 ~ 60 중량%의 당과 30 ~ 40 중량%의 단백질, 40 ~ 50 중량%의 당과 32 ~ 38 중량%의 단백질, 또는 43 ~ 47 중량%의 당과 33 ~ 36 중량%의 단백질을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로는 약 45 중량%의 당과 약 34 중량%의 단백질을 포함할 수 있다.
베타-글루칸은 건조 분말 10g에 증류수 50㎖를 가하여 현탁시킨 다음 실온에서 20% 탄산나트륨(Sodium carbonate)을 이용하여 pH를 10.0으로 조정한 후 10시간 정도를 방치하여 분말 시료가 충분히 연화되도록 한다. 이 연화된 시료액에 고온에 안정한 알파아밀레이즈(α-amylase)를 가하여 60℃의 항온수조 내에서 2시간 동안 교반하여 효소처리를 한 후 실온으로 냉각한다. 이 액을 pH 5로 맞춘 다음 아밀로글루코시데이즈(Amyloglucosidase)로 60℃의 항온수조에서 2시간 동안 교반한다.
그 다음 효소를 불활성화시키기 위해서 pH를 4.5로 맞춘 후, 5℃의 항온수조에서 30분간 교반한 후 냉각한다. 냉각한 추출액을 원심분리(30 min, ×8000 rpm)하여 상등액만을 취한 후 40℃의 온도에서 감압 농축하게 되고 이 농축물에 4배량의 에탄올을 가하여 4시간 정도 방치한 다음 원심분리하여 침전물을 얻는다. 이 침전물을 다시 물에 용해한 후 pH를 4.5로 맞춘 다음, 아밀로글루코시데이즈(Amylo -glucosidase)로 58℃에서 2시간 동안 효소를 재처리한다. 처리 후 95℃에서 30분 동안 효소를 불활성 시킨 다음 냉각하고 원심분리하여 상등액을 취한 후 에탄올로 재침전시켜 조(Crude) 베타-글루칸(β-glucan)을 제조할 수 있다.
본 발명의 균사체 배양물의 추출물은, 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물을 당 업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 용매를 사용하여, 통상적으로 이용되는 열수추출, 실온추출, 가온 추출, 초음파추출, 초 임계 추출 등의 방법으로 제조될 수 있다. 이때 각 원료 유기농 식물을 추출 용매를 사용하여 각각 추출한 후 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로는 물, 탄소수 1 내지 6의 글리콜, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출한다. 바람직하게는 35 내지 45%(v/v) 1,3-부틸렌 글리콜을 추출 용매로 사용하여 추출한다. 이때 추출 용매의 사용량은 원료 중량의 10 내지 30배 부피량이며, 보다 바람직하게는 20 배이다.
추출온도와 시간은 추출하고자 하는 시료의 양에 따라 달라질 수 있으며 40 내지 100℃에서 3 내지 100시간 동안 가열하여 추출하거나, 50 내지 70℃에서 1일 내지 5일간 실시하는 것이 바람직하다. 추출결과물을 여과 또는 정제하는 과정을 거칠 수 있다.
또한, 본 발명의 균사체 배양물의 추출물은 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 발명의 세포 외 다당체 및 베타-글루칸은 세리포리아 락세라타 배양물로부터 얻을 수 있으며, 또한, 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 추출물을 생산하기 위한 배지조성 및 배양조건을 제공한다.
본 발명자들은 세리포리아 락세라타 배양물의 대량생산을 위한 액체배양법을 확립하기 위하여, 균사체의 최적화된 배지 조성 및 배양조건을 결정하였다.
본 발명의 세리포리아 락세라타 균사체의 대량 생산방법은 세리포리아 락세라타의 생산방법에서, 세리포리아 락세라타로부터 액체 배양용 세리포리아 락세라타 균사체를 얻는 단계, 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하는 단계, 액체 배양된 세리포리아 락세라타 균사체를 생물반응기를 이용하여 배양시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 세포 외 다당체 및 베타-글루칸은 세리포리아 락세라타 배양물로부터 얻을 수 있으며, 또한, 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포 외 다당체 및 베타-글루칸. 상기 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 포함하는 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물. 또는 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물의 추출물을 생산하기 위한 배지조성 및 배양조건을 제공한다.
본 발명자들은 세리포리아 락세라타 배양물의 대량생산을 위한 액체배양법을 확립하기 위하여, 균사체의 최적화된 배지 조성 및 배양조건을 결정하였다.
본 발명의 세리포리아 락세라타 균사체의 대량 생산방법은 세리포리아 락세라타의 생산방법에서, 세리포리아 락세라타로부터 액체 배양용 세리포리아 락세라타 균사체를 얻는 단계, 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하는 단계, 액체 배양된 세리포리아 락세라타 균사체를 생물반응기를 이용하여 배양시키는 단계를 포함한다.
(1)
세리포리아
락세라타로부터
액체 배양용
세리포리아
락세라타
균사체를 얻는 단계.
액체 배양용 세리포리아 락세라타 균사체는 세리포리아 락세라타로부터 얻을 수 있다. 세리포리아 락세라타를 PDA(Potato dextrose agar) 배지(Culture medium 100 플라스틱 배양 구. Difco, Becton Dickinson and Company)에서 7~11일 정치 배양하였다.
그런 다음 500 배플(Baffle])이 있는 삼각플라스크에 PDB(Potato dextrose broth) 배지(Difco) 200 를 조성한 후, PDA 배양 균주 1개를 넣고 7~11일간 진탕 배양하였다. 이때 접종 원으로 투입될 균사체의 양은 배양할 용액의 양을 기준으로 0.3%(w/v) 정도인 것이 바람직하다.
(2) 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하는 단계.
상기 (1) 단계에 의해 얻은 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양용 배양액에 접종하여 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하여 얻을 수 있다.
액체 배양용 배양액은 물에 탄소원, 질소원, 비타민, 무기물을 포함하도록 하여 pH가 4.06.5로 조정할 수 있다. 그런 다음 pH가 조절된 배양액에 세리포리아 락세라타 균사체를 배양액 부피 대비 0.1∼10％으로 배양액에 첨가하고, 20∼25℃에서 7∼11일 동안 액체 배양할 수 있다.
상기에서 탄소원은 말토오스(Maltose), 글루코오스(Glucose), 락토오스(Lactose), 전분(Starch), 덱스트린(Dextrin), 수크로스(Sucrose), 프럭토스(Fructose), 갈락토오스(Galactose), 만노오스(Mannose), 당분(Oligosaccharide) 중에서 선택된 적어도 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기에서 질소원은 대두분, 면실분, 아미노산(Amino acid), 펩톤(Peptone),
콘 스티프 리쿼 중에서 선택된 적어도 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 무기물은 일인산칼륨(KH2PO4), 이인산칼륨(K2HPO4), 탄산칼슘(CaCO3), 염화칼슘(CaCl2), 황산 마그네슘(MgSO4), 염화나트륨(NaCl), 황산 망간 (Mn SO4)중에서 선택된 적어도 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명은 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하기 위한 다양한 구성성분의 배양액을 제조하여 사용할 수 있으며 바람직한 하나의 일 실시한 예로서, 상기 배지는, 0.2~5% 포도당, 0.2~1% 펩톤, 0.05~0.25% 일인산칼륨(KH2PO4), 0.02~0.1% 황산 마그네슘(MgSO4) 및 물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 포도당 3 중량%, 펩톤 0.5 중량%, 일인산칼륨(KH2PO4) 0.1 중량%, 황산 마그네슘(MgSO4) 0.05 중량%가 바람직하다.
(3) 생물반응기를 이용해 액체 배양된
세리포리아
락세라타
균사체를 배양시키는 단계.
상기 (2) 단계에 의해 액체 배양된 세리포리아 락세라타 균사체는 생물반응기 내의 배양액에 접종하고 배양하여 세리포리아 락세라타 배양물을 제조할 수 도 있다.
그리고 생물반응기 내부의 배양액은 정제 수에 탄소원, 효모추출물, 질소원, 비타민, 무기물을 포함하도록 하여 pH가 4.0~6.5으로 조정할 수 있다.
그런 다음 액체 배양된 세리포리아 락세라타 균사체를 배양액 부피 대비 0.1∼10％으로 생물반응기 내의 배양액에 접종한 후, 0.02∼2vvm(Volume of air added to liquid volume per minute)의 공기를 생물반응기 내부로 공급하여 20∼25℃의 온도에서 7∼11일 동안 배양하여 세리포리아 락세라타 배양물을 제조할 수 있다.
상기 생물반응기 내부의 배양액에서, 탄소원은 말토오스, 글루코오스, 락토오스, 전분, 덱스트린, 수크로스, 프럭토스, 갈락토오스, 만노오스 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 생물반응기 내부의 배양액에서, 질소원은 대두분, 면실분, 아미노산, 펩톤, CSL, 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기에서 무기물은 일인산칼륨(KH2PO4), 이인산칼륨(K2HPO4), 탄산칼슘(CaCO3), 염화칼슘(CaCl2), 황산 마그네슘(MgSO4), 염화나트륨(NaCl), 황산 망간 (MnSO4)중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명은 세리포리아 락세라타 균사체를 액체 배양하기 위한 다양한 구성성분의 배양액을 제조하여 사용할 수 있다.
바람직한 하나의 일 실시 예로서, 상기 배지는, 0.2~5% 포도당, 0.2~1% 펩톤, 0.05~0.25% 일인산칼륨(KH2PO4), 0.02~0.1% 황산 마그네슘(MgSO4) 및 물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 포도당 3 중량%, 펩톤 0.5 중량%, 일인산칼륨(KH2PO4) 0.1 중량%, 황산마그네슘(MgSO4) 0.05 중량% 이다.
본 발명에서 세리포리아 락세라타 균사체의 대량 배양용 생물반응기로는 본원 관련 분야에서 통상적으로 사용하며, 공기를 주입할 수 있는 생물반응기라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 본 발명에서 이러한 생물반응기의 일례로서 순환형(기포 통기형) 공기 부양식 생물반응기, 풍선형 공기 부양식 생물반응기, 칼럼형 공기부양식 생물반응기, 교반식 생물반응기 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
한편, 본 발명은 상기에서 언급한 세리포리아 락세라타 균사체를 대량으로 생산하는 방법에 의해 얻은 세리포리아 락세라타 배양물. 세리포리아 락세라타 배양물의 추출물 혹은 건조물을 포함한다.
(4)
세리포리아
락세라타
배양물로부터 건조물, 추출물, 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 제조하는 단계.
본 발명의 세포 외 다당체 및 베타-글루칸은 세리포리아 락세라타 배양물로부터 얻을 수 있다.
바람직하게는, 상기 세포 외 다당체 및 베타-글루칸은 (a) 세리포리아 락세라타를 액체 배지에서 배양하여 균사체 배양물을 제조하는 단계, (b) 세리포리아 락세라타 균사체 및 배양물을 건조해 분말 화하는 단계, 및 (c) 균사체 배양물 또는 배양물 분말을 용매로 추출하여 이로부터 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 수득하는 단계를 거쳐 제조할 수 있다.
상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 제조된 균사체 배양물을 진공건조 또는 동결건조시켜 분말화 할 수 있다. 상기의 건조는 유효물질의 소멸을 방지하기 위해 40℃ 이하의 온도, 보다 구체적으로는 30℃ 이하의 온도에서 48 내지 96시간 동안 수행되는 것이 바람직하다. 그리고 (b) 단계에서의 건조는 증발온도를 상대적으로 높게 설정하는 진공건조기보다 진공 동결 건조기를 사용하는 것이 유효물질 함량 변화가 최소화됨이 바람직하다.
본 발명의 균사체 배양물의 추출물은, 상기 세리포리아 락세라타의 균사체 배양물을 당 업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 용매를 사용하여, 통상적으로 이용되는 열수추출, 실온추출, 가온 추출, 초음파추출, 초 임계추출 등의 방법으로 제조될 수 있다.
이때 각 원료 유기농 식물을 추출 용매를 사용하여 각각 추출한 후 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.
구체적으로는 물, 탄소수 1 내지 6의 글리콜, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출한다.
더욱 바람직하게는 35 내지 45%(v/v) 1,3-부틸렌 글리콜을 추출 용매로 사용하여 추출한다. 이때 추출 용매의 사용량은 원료 중량의 10 내지 30배 부피량이며, 보다 바람직하게는 20 배이다.
추출온도와 시간은 추출하고자 하는 시료의 양에 따라 달라질 수 있으며 40 내지 100℃에서 3 내지 100시간 동안 가열하여 추출하거나, 50 내지 70℃에서 1일 내지 5일간 실시하는 것이 바람직하며 추출결과물을 여과 또는 정제하는 과정을 거칠 수 있다.
또한, 본 발명의 균사체 배양물의 추출물은 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
상기 (c) 단계에서는 (b) 단계에서 얻은 균사체 배양물 또는 배양물의 건조물을 용매로 추출한 후 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 세포 외 다당체 및 베타-글루칸을 분리, 제조한다.
세포 외 다당체를 얻기 위해 건조 분말 1~10g에 증류수 100㎖를 첨가하여 잘 현탁한 후, 10,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 이의 상등액에 그 양의 2 ~ 4배에 해당하는 95% 이상의 순도를 갖는 용매를 첨가하고 2 ~ 6℃의 냉장고에 넣어 12 ~ 18시간 정치시킬 수 있다.
상기의 정치 물을 10,000 rpm으로 20분 동안 원심분리한 후, 침전물을 회수 및 동결건조하여 조(Crude) 세포 외 다당체를 제조할 수 있다.
상기 세포 외 다당체는 40 ~ 60 중량%의 당과 30 ~ 40 중량%의 단백질, 40 ~ 50 중량%의 당과 32 ~ 38 중량%의 단백질, 또는 43 ~ 47 중량%의 당과 33 ~ 36 중량%의 단백질을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로는 약 45 중량%의 당과 약 34 중량%의 단백질을 더 포함할 수도 있다.
베타-글루칸은 건조 분말 10g에 증류수 50㎖를 가하여 현탁시킨 다음 실온에서 20% 탄산나트륨(Sodium carbonate)을 이용하여 pH를 10.0으로 조정한 후 10시간 정도를 방치하여 분말 시료가 충분히 연화되도록 한다. 이 연화된 시료액에 고온에 안정한 알파아밀레이즈(α-amylase)를 가하여 60℃의 항온수조 내에서 2시간 동안 교반하여 효소처리를 한 후 실온으로 냉각한다. 이 액을 pH 5로 맞춘 다음 아밀로글루코시데이즈(Amyloglucosidase)로 60℃의 항온수조에서 2시간 동안 교반을 한다.
그 다음 효소를 불활성화시키기 위해서 pH를 4.5로 맞춘 후, 5℃의 항온수조에서 30분간 교반한 후 냉각한다. 냉각한 추출액을 원심분리(30 Min, ×8000 rpm)하여 상등액만을 취한 후 40℃의 온도에서 감압 농축하게 되고 이 농축액에 4배량의 에탄올을 가하여 4시간 정도 방치한 다음 원심분리하여 침전물을 얻는다. 이 침전물을 다시 물에 용해한 후 pH를 4.5로 맞춘 다음, 아밀로글루코시데이즈(Amyloglucosidase)로 58℃에서 2시간 동안 효소를 재처리한다. 처리 후 95℃에서 30분 동안 효소를 불활성 시킨 다음 냉각하고 원심분리하여 상등액을 취한 후 에탄올로 재침전시켜 조(Crude) 베타-글루칸(β-glucan)을 제조할 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 실시 예 및 시험 예를 통하여 구체적으로 설명한다.
그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
세리포리아
락세라타
균사체의 고체배양에서 배지 및 생장조건 결정.
세리포리아 락세라타 균사체의 생장성이 가장 우수한 배지를 결정하기 위하여, 하기 표 1에 기재된 다양한 종류의 배지를 이용하여 균사생장과 밀도를 측정함으로써 최적의 생장 배지를 결정하였다.
구체적으로 각각의 종류의 배지는 살균 전 pH 5.5로 조절되어 살균되었다. 정치배양을 위해서 24±2℃로 고정된 배양기에서 세리포리아 락세라타 균사체를 10일간 배양한 후, 그에 따른 세리포리아 락세라타 균사체의 지름 및 균사밀도를 측정하여 생장성을 조사하였고 아래의 표로 나타내었다.
| 배지 | PDA | YM | NU | YMG | LB | MYP | MCM |
| 지름/mm | 76 | 67 | 54 | 70 | 61 | 71 | 67 |
| 균사밀도 | *** | ** | * | *** | ** | ** | * |
균사밀도 : 우수(***), 양호(**), 보통(*)
실험장소 : CL 바이오 기업 부설 연구소.
PDA : Potato 200g, Dextrose 20g, Agar 15g/L
Y M: Yeast extract 3g, Malt extract 3g, Peptone 5g, Dextrose 10g, Agar 15g/L
NU : Peptone 5g, Beef extract 3g, Agar 15g/L
YMG : Yeast extract 4g, Malt extract 10g, Glucose 4g, Agar 15g/L
LB : NaCl 10g, Yeast extract 5g, Tryptone 10g, Agar 15g/L
MYP : Malt extract 30g, Yeast extract 2g, Peptone 1g, Agar 15g/L
MCM : Glucose 20g, Yeast extract 2g, Peptone 3g, MgSO42O 0.5 g, K2HPO4 1g, KH2PO4 0.46 g, Agar 20 g/L
그 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 PDA, YMG, MYP 배지에서 대체로 우수한 생장성을 보였으며, 특히 PDA 배지를 사용하였을 때, 균사체의 생장성이 가장 우수하였다.
세리포리아
락세라타
균사체의 온도에 따른 생장성 측정.
본원의 핵심물진인 세리포리아 락세라타 균사체의 고체 배지 배양온도에 따른 생장성 측정을 위하여, 가장 우수한 생장성을 나타낸 PDA 배지를 사용하여 배양온도를 18℃, 20℃, 22℃, 24℃, 26℃으로 설정한 후, 10일간 배양하여 각 온도에 따른 균사체의 생장성을 조사하였다.
| 온도() | 18 | 20 | 22 | 24 | 26 |
| 지름(mm) | 38 | 64 | 80 | 75 | 70 |
| 균사밀도 | * | ** | *** | *** | *** |
균사밀도 : 우수(***), 양호(**), 보통(*)
실험장소 : CL 바이오 기업 부설 연구소.
그 결과, 위 표 2에서 보는 바와 같이 22℃의 온도까지는 생장성이 증가하였지만, 그 이상의 온도에서는 감소하는 결과를 나타내어, 가장 생장성이 우수한 온도는 22℃로 측정되었다.
세리포리아
락세라타
균사체의 액체 종 배양과
세리포리아
락세라타
균사체의 초기 pH에 따른 생장성 조사.
세리포리아 락세라타 균사체의 생장성이 가장 우수한 배지를 결정하기 위하여, 하기 표 1에 생장성이 우수한 PDA 배지로 이것에 대한 액체배지인 PDB(Potato dextrose broth)에서 초기 pH에 따른 균사체량을 조사하였다.
그 결과 도 1에서 보는 바와 같이 pH 5에서 6 사이에서는 거의 유사한 균사체량을 나타내었으며, pH 5.5에서 가장 우수한 균체 성장을 나타내었다.
세리포리아
락세라타
균사체의 배양시간에 따른 생장성 조사.
세리포리아 락세라타 균사체의 본 배양완료 시점을 조사하기 위하여 배양시간에 따른 균사체량을 조사하였다. 배양을 위해 PDA 고체 배지에서 12일 배양한 균사체를 믹서로 갈아 균질화시킨 후 종 배양 액체배지에 접종하였다. 배양조건은 초기 pH 5.5와 22℃, 그리고 진탕 배양기에서 120 rpm으로 배양하였다.
그 결과 도 2에서 보는 바와 같이 배양 3일 차까지는 균체 성장이 거의 이루어지지 않았지만, 4일 차부터는 급격한 균체가 성장하여 배양 9일 차부터 12일 차까지는 균체량이 유사하였지만 13일 차 이후에는 현저히 감소하였다. 따라서 최적 종 배양 시간은 9일부터 12일까지로 조사되었다.
세리포리아
락세라타
균사체의 액상배양으로 생리활성물질 제조법.
세리포리아 락세라타를 PDA, 배지(100 플라스틱 배양구. Difco, Becton Dickinson and Company)에서 10일 정치 배양하였다. 그런 다음 500㎖ 배플이 있는 삼각플라스크에 PDB,배지(Difco) 200㎖를 조성한 후, PDA 배양 균주 1개를 넣고 10일간 진탕 배양하였다. 그리고 포도당 3 중량%, 펩톤 0.5 중량%, 일인산칼륨(KH2PO4) 0.1 중량%, 황산 마그네슘(MgSO4) 0.05 중량%, 실리콘 거품제 0.2 중량% 및 잔량의 물을 포함하는 2ℓ 액체 배양 배지를 5ℓ 배양기에서 살균한 후, 25℃로 냉각한 상태에서 접종액으로 사용할 PDB 배양 균주 200㎖를 접종하고, 교반속도 300 rpm, 공기를 0.5 vvm으로 통기 시키면서 25℃의 항온에서 7~11일간 액체 배양함으로써 세리포리아 락세라타, 균사체 배양물을 제조하였다.
세리포리아
락세라타
배양물 건조분말(Dried Powder)의 제조.
상기 실시예 1에서 제조된 세리포리아 락세라타 균사체 배양물을 진공동결건조기를 이용하여 35℃ 이하의 저온에서 48시간 동안 동결건조시켜 분말화합으로써 세리포리아 락세라타 균사체 배양물의 건조분말을 제조하였다.
세리포리아
락세라타
배양물로부터 세포 외 다당체
(EPS)의
제조.
상기 실시예 6에서 제조된 건조 분말 2g에 증류수 100㎖를 첨가하여 교반한 후, 원심분리(10,000rpm, 20분)한 다음 상등액에 그 양의 3배에 해당하는 에탄올을 첨가하고 냉장조건(2~8℃)에서 16시간 정치하였다. 상기의 정치 물에서 침전물을 취해 동결건조하여 세리포리아 락세라타 균사체 배양물로부터 세포 외 다당체를 제조하였다.
세리포리아 락세라타 배양물로부터 베타-글루칸의 제조.
상기 실시예 2에서 제조된 건조 분말 10g에 증류수 50㎖를 가하여 현탁시킨 다음 실온에서 20% 탄산나트륨(Sodium carbonate)을 이용하여 pH를 10.0으로 조정한 후 10시간 정도를 방치하여 분말 시료가 충분히 연화되도록 하였다. 이 연화된 시료액에 고온에 안정한 알파아밀레이즈(α-amylase)를 가하여 60℃의 항온수조 내에서 2시간 동안 교반하여 효소처리를 한 후 실온으로 냉각하였다.
이 액을 pH 5로 맞춘 다음 아밀로글루코시데이즈(Amyloglucosidase)로 60℃의 항온수조에서 2시간 동안 교반을 행하였다. 그 다음 효소를 불활성화시키기 위해서 pH를 4.5로 맞춘 후, 95℃의 항온수조에서 30분간 교반한 후 냉각하였다.
냉각한 추출액을 원심분리(30 min ×8000 rpm)하여 상등액만을 취한 후 40℃의 온도에서 감압 농축하였다. 이 농축액에 4배량의 에탄올을 가하여 4시간 정도 방치한 다음 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물을 다시 물에 용해한 후 pH를 4.5로 맞춘 다음, 아밀로글루코시데이즈로 58℃에서 2시간 동안 효소를 재처리하였다.
처리 후 95℃에서 30분 동안 효소를 불활성 시킨 다음 냉각하고 원심분리하여 상등액을 취한 후 에탄올로 재침전시켜 조(Crude) 베타글루칸(β-glucan)을 제조하였다.
생물반응기 형태에 따른
세리포리아
락세라타
균사체 배양.
상기 생물반응기를 이용한 균사체 배양은 생물반응기 형태에 따라 균사체의 생장량에 차이가 있으므로 세리포리아 락세라타 균사체를 대상으로 배양에 적합한 배양기 형태를 선발하기 위하여 교반형과 기포 통기형을 대상으로 균사체의 생장량과 건조물의 양, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸, 함량을 비교하였다. 실시예 5에 나와 있는 배지 조성 및 온도로 수행하였으며, 배양조건은 기포 통기형은 0.5vvm, 교반형은 300 rpm과 0.5 vvm이며 배양온도는 25℃로 수행하였다. 균사체의 생장량 측정하기 위하여 배양물을 8000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 증류수로 세척과 원심분리를 2회 반복하였다. 원심분리한 후 침전된 균사체를 105℃에서 건조한 후 건조된 균사체량(DCW, dry cell weight)를 측정하였다. 또한, 세포 외 다당체와 베타글루칸은 각각 제조된 건조물에 대한 함량으로 측정하였다.
각각의 배양기에서 생성된 건조물, 세포 외 다당체, 디엠씨, 프로토카테츄알데히드는 도 3에 나와 있다. 도 3에서 보는 바와 같이 균사체랑 및 건조물량은 교반형에서 가장 높게 나타났으나, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체와 베타글루칸의 함량은 공기 부양 식의 칼럼형과 교반형에서 유사하게 나타났다.
따라서 세포 외 다당체와 베타글루칸의 생성량은 공기 부양 식의 칼럼형과 교반형이 유사하지만 균사체량 및 건조물의 양이 높은 교반형 배양기가 유리하다.
교반형
생물반응기에서의
세리포리아
락세라타
배양 최적화.
상기 실시예 3의 배지 조성 및 배양조건으로 초기 rpm에 따른 배양액 속에 포함되어 있는 세리포리아 락세라타 균사체 농도, 건조물(Powder)의 농도, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량의 측정 하였다.
배양기 교반 속도는 0, 50, 100, 200, 300, 400, 500rpm으로 배양 초기부터 배양완료 시점까지 유지하면서 배양하였다.
| rpm | 생육정체기 (일) |
균사체량 (g/L) |
건조물의 양 (g/L) |
세포 외 다당체 함량 (mg/g Powder) |
베타글루칸 함량 (mg/g Powder) |
| 0 | 4 | 4.7 | 15.9 | 2.42 | 14.1 |
| 50 | 5 | 6.7 | 26.5 | 3.78 | 20.1 |
| 100 | 7 | 7.9 | 29.9 | 4.55 | 25.5 |
| 200 | 9 | 8.8 | 34.2 | 5.01 | 29.2 |
| 300 | 10 | 8.5 | 31.0 | 4.97 | 28.6 |
| 400 | 8 | 8.3 | 30.7 | 4.95 | 28.7 |
| 500 | 5 | 3.9 | 12.8 | 1.72 | 11.4 |
실험장소 : 계명대학교 식품영양학과 연구실.
그 결과, 위 표 3에서 보는 바와 같이 세리포리아 락세라타 균사체 농도, 건조물의 농도 및 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체와 베타글루칸의 함량은 낮은 rpm인 100 이하에서는 낮게 나타났지만 높은 rpm인 200부터 400까지는 다소 높게 측정되었다.
그러나 높은 rpm인 500에서는 현저히 감소하였다. 생육정체기 측면에서 낮은 rpm은 시기가 빠르게 나타났지만 배양 기간에 비해서는 균사체 농도, 건조물의 농도, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량이 높게 조사되었다. 그러나 200부터 400까지의 rpm에서는 생육정체기 시점이 8일 이상으로 배양 후기까지 지속하는 경향을 나타내었지만, 배양기간을 고려할 경우 낮은 rpm보다는 효율성이 낮게 측정되었다. 따라서 초기 rpm 조절에 따라 세리포리아 락세라타의 배양 성이 변하는 것을 알 수 있었다. 또한, 초기 교반을 하지 않거나, 낮은 rpm으로 시작하여 점차 상승시킬 경우 배양 성이 향상될 것으로 추정되었다.
공기 공급량(Aeration)에 따른 배양.
상기 실시예 3의 배지 조성 및 배양조건으로 초기 공기 공급량에 따른 배양액 속에 포함되어 있는 세리포리아 락세라타 균사체 농도, 건조물(Powder)의 농도, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량을 측정하였다. 배양기 교반 속도는 가장 유리한 조건으로 조사된 rpm 200으로 수행하였으며, 공기 공급량은 0, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 vvm으로 배양 초기부터 완료시점까지 유지하면서 배양하였다.
| 공기 공급량 (vvm) |
생육 정체기 (일) |
균사체량 (g/L) |
건조물의 양 (g/L) |
세포 외 다당체 함량 (mg/g Powder) |
베타글루칸 함량 (mg/g Powder) |
| 0 | 2 | 1.9 | 5.4 | 1.12 | 5.2 |
| 0.01 | 8 | 8.3 | 29.7 | 4.78 | 27.5 |
| 0.02 | 10 | 8.6 | 30.8 | 4.89 | 28.8 |
| 0.05 | 10 | 8.5 | 31.1 | 5.02 | 29.1 |
| 0.1 | 10 | 8.5 | 30.9 | 5.01 | 29.0 |
| 0.2 | 10 | 8.6 | 31.4 | 5.10 | 30.1 |
| 0.5 | 10 | 8.4 | 30.6 | 4.98 | 29.4 |
| 1 | 9 | 8.4 | 30.8 | 5.01 | 28.1 |
| 2 | 3 | 3.7 | 8.9 | 1.89 | 9.5 |
실험장소 : 계명대학교 식품영양학과 연구실.
그 결과, 위 표 4에서 보는 바와 같이 공기가 공급되지 않을 경우 배양이 이루어지지 않았다. 그리고 공기 공급량이 0.01 vvm부터 1 vvm까지는 공기 공급량이 증가함에 따라 배양 결과에 큰 차이를 나타내지 않았지만 2 vvm에서는 세리포리아 락세라타 균사체 농도, 건조물의 농도, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량이 현저히 감소하였다. 따라서 교반형 생물반응기에서 공기 공급량은 0.01 vvm부터 1 vvm까지가 배양에 유리함을 알 수 있었다.
내압에 따른 배양.
실시예의 배지 조성 및 배양조건으로 초기 내압에 따른 배양액 속에 포함되어 있는 세리포리아 락세라타 균사체량, 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량을 측정하였다. 배양기 교반 속도는 상기 실시예에서 가장 유리한 조건으로 조사된 rpm 200으로 수행하였으며, 공기 공급량은 상기 실시예에서 가장 유리한 조건인 0.2 vvm으로 하여 내압을 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 1.5 kg/cm2으로 배양 초기부터 완료시점까지 유지하면서 배양하였다.
| 내압 (kg/cm2) |
생육 정체기 (일) |
균사체량 (g/L) |
건조물의 양 (g/L) |
세포 외 다당체 함량 (mg/g Powder) |
베타글루칸 함량 (mg/g Powder) |
| 0.05 | 10 | 8.5 | 28.9 | 4.95 | 28.1 |
| 0.1 | 10 | 8.6 | 28.5 | 4.88 | 29.1 |
| 0.2 | 10 | 8.5 | 29.1 | 4.89 | 28.7 |
| 0.5 | 10 | 8.4 | 30.1 | 4.91 | 29.2 |
| 1 | 10 | 8.5 | 29.5 | 4.94 | 29.4 |
| 1.5 | 10 | 8.6 | 29.9 | 4.92 | 29.3 |
실험장소 : 계명대학교 식품영양학과 연구실.
그 결과, 위 표 5에서 보는 바와 같이 교반형 생물반응기의 내압이 증가하거나 감소하더라도 배양 성에 거의 영향이 없었다. 따라서 세리포리아 락세라타 균사체 배양에 있어 내압은 거의 영향이 없음을 알 수 있었다.
용존산소량 조절에 따른 배양 성 조사.
상기 실시예 등에서 나타난 것과 같이 세리포리아 락세라타 배양에 있어 중요한 요소로 교반형 생물반응기 배양 시 공기 공급량 혹은 내압보다는 rpm에 의한 영향이 높음을 알 수 있었다.
따라서 rpm에 의한 영향으로 나타나는 것으로 대표적인 것은 균사체에 대한 전단 응력(Shear strees)과 배양액에 대한 용존산소량이 있다.
전단 응력 측면에서는 rpm이 증가함에 따라 균사체의 모양에는 큰 변화를 나타내지 않았기 때문에 영향이 클 것으로 추정되는 용존 산소량에 따른 세리포리아 락세라타 배양 시 균사체 농도, 건조물의 농도, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량을 조사하였다.
초기 배양 조건은 rpm 50, 공기 공급량 0.2 vvm, 내압 0.5kg/cm2이며, 실험에 적용되는 용존산소량은 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 70%로 수행하였다. 배양이 진행됨에 따라 목적으로 하는 용존산소량에 도달되었을 때부터 1차적으로 rpm을 조절하였으며, 목적으로 하는 용존 산소량이 유지되지 않을 경우 공기 공급량과 내압을 조절하여 일정하게 유지하였다.
| DO (%) |
생육정체기 (일) |
균사체량 (g/L) |
건조물의 양 (g/L) |
세포 외 다당체 함량 (mg/g Powder) |
베타글루칸 함량 (mg/g Powder) |
| No control | 4 | 4.3 | 12.6 | 2.13 | 13.3 |
| 5 | 10 | 12.6 | 39.1 | 6.91 | 40.2 |
| 10 | 11 | 12.7 | 40.2 | 7.15 | 39.7 |
| 20 | 12 | 15.2 | 45.3 | 8.22 | 46.1 |
| 30 | 11 | 13.6 | 41.1 | 7.45 | 42.3 |
| 40 | 11 | 13.2 | 41.3 | 7.27 | 40.9 |
| 50 | 9 | 8.9 | 30.2 | 5.23 | 31.1 |
| 70 | 7 | 6.3 | 25.4 | 4.11 | 23.2 |
실험장소 : 계명대학교 식품영양학과 연구실.
그 결과, 위 표 6에서 보는 바와 같이 균체 성장 측면에서 용존산소량 40%까지는 약간의 차이만 보일 뿐 큰 차이를 나타내지 않았으나, 배양에 따른 균사체량, 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량은 현저히 상승하였다.
그리고 용존 산소량 20% 유지 시에는 생육정체기는 12일, 균사체량은 15.2g/L, 건조물의 양은 45.3g/L, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체와 베타글루칸의 함량은 각각 8.22 mg/g Powder와 46.1mg/g Powder로 조사되었다.
용존산소량을 고려하지 않은 경우보다 50% 이상 배양 성이 향상되었다.
따라서 세리포리아 락세라타 배양에 있어 일정농도의 용존산소량을 유지하기 위해 rpm, 공기 공급량, 내압을 조절하는 것이 유리함을 알 있었다.
배양중 영양성분 첨가에 의한 배양 성 조사.
아울러 생물반응기를 이용하여 균사체를 배양할 경우 유용물질의 생산성을 높이기 위해 배양 중에 영양성분을 첨가하기 때문에 균체 성장 및 유용물질의 생산성에 영향을 주는 질소원과 탄소원을 첨가하여 수행하였다.
그 결과 질소원의 첨가는 균체 성장에는 유리하였지만, 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸 함량은 감소하였다.
따라서 유용물질의 생산성을 높이는 방법인 탄소원의 첨가를 수행하였으며, 상기 실시예에서 나와 있는 조건에 따라 초기 조건 및 배지 조성과 배양중에 유지되는 용존 산소량을 20% 이상으로 하여 배양을 12일까지 수행하였다. 배양중에 첨가되는 탄소원으로 포도당(Glucose), 과당(Fructose), 만노오스(Mannose), 탄소원(Sucrose), 엿당(Maltose), 전분(Soluble starch)을 배양 5일 차에 배양액 부피에 대해 3%가 되도록 일시 첨가하였으며, 전분은 20%, 나머지 탄소원은 70%로 조제되었다.
| 탄소원 | 균사체량 (g/L) |
건조물의 양 (g/L) |
세포 외 다당체 함량 (mg/g Powder) |
베타글루칸 함량 (mg/g Powder) |
| 포도당 (Glucose) |
17.7 | 52.1 | 9.12 | 50.9 |
| 과당 (Fructose) |
16.4 | 51.9 | 8.30 | 50.7 |
| 만노오스 (Mannose) |
18.1 | 55.2 | 9.25 | 54.8 |
| 탄소원 (Sucrose) |
18.0 | 57.1 | 9.51 | 59.2 |
| 엿당 (Maltose) |
16.7 | 49.7 | 8.66 | 47.3 |
| 전분 (Starch) |
15.2 | 45.8 | 8.18 | 44.9 |
실험장소 : 계명대학교 식품영양학과 연구실.
그 결과, 위 표 7에서 보는 바와 같이 전체적으로 탄소원을 첨가할 경우 세리포리아 락세라타 배양에 의한 배양 성이 향상되었다. 특히, 만노오스 혹은 탄소원을 첨가할 경우 높은 세리포리아 락세라타 균사체량, 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량이 증가하였다.
따라서 배양중에 탄소원을 첨가할 경우 균사체 및 여러 유용물질의 생산성이 향상되며, 특히 만노오스와 탄소원을 첨가할 경우 더욱 향상됨을 알 수 있었다.
배양중 유지되는
탄소원
농도에 따른 배양 성 조사.
상기 실시예 결과에서 보는 바와 같이 배양중에 첨가되는 탄소원으로 탄소원을 첨가할 경우 배양 성이 향상되었다. 따라서 첨가되는 최적 탄소원의 농도를 조사하기 위해 배양 5일 차에 배양액 부피에 대비 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5%를 일실시예로 첨가하였다.
| 첨가농도 (%) |
균사체량 (g/L) |
건조물의 양 (g/L) |
세포 외 다당체 함량 (mg/g Powder) |
베타글루칸 함량 (mg/g Powder) |
| 0 | 14.7 | 44.2 | 8.16 | 45.1 |
| 0.1 | 15.4 | 47.6 | 8.91 | 48.2 |
| 0.2 | 15.9 | 48.2 | 9.11 | 47.9 |
| 0.5 | 16.7 | 50.7 | 9.23 | 51.5 |
| 1 | 17.6 | 53.2 | 9.39 | 58.7 |
| 2 | 18.2 | 59.2 | 9.78 | 61.3 |
| 3 | 17.9 | 57.4 | 9.56 | 60.1 |
| 5 | 15.1 | 48.1 | 8.92 | 50.8 |
실험장소 : 계명대학교 식품영양학과 연구실.
그 결과, 위 표 8에서 보는 바와 같이 탄소원이 첨가되지 않은 경우보다는 첨가될 경우 배양 성이 향상되었으며, 첨가되는 탄소원의 농도가 2%까지는 증가하다가 그 이상의 농도에서는 감소하는 경향을 나타내었다.
따라서 탄소원 2%를 첨가할 경우 세리포리아 락세라타 균사체량, 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸 함량이 증가함을 알 수 있었다.
배양기 크기에 따른 배양 성 조사.
상기 실시 예에서 수행한 교반형 생물반응기의 크기는 5 L로 산업적인 용도로는 적합하지 않다. 추후 산업적 생산을 위한 세리포리아 락세라타 대량배양을 수행하기 위해서는 배양기 크기에 따른 배양 성 조사가 필요하다.
따라서 상기 실시 예에서 조사된 결과를 토대로 배양기 크기를 5, 10, 30, 100, 500, 5,000 L에서 배양을 수행하였다. 초기 배양 조건은 rpm 0, 공기 공급량 0.2 vvm, 내압 0.5kg/cm2이며, 용존산소량 20%를 유지하기 위해 1차적으로 rpm을 상승시킨 후, rpm이 최대치까지 도달하였을 때 2차적으로 공기 공급량과 내압을 상승시켜 조절하였다. 배양 5일 차에 탄소원을 2%가 되도록 첨가하여 12일까지 배양하였다.
| 배양기 크기 (L) |
균사체량 (g/L) |
건조물의 양 (g/L) |
세포 외 다당체 함량 (mg/g Powder) |
베타글루칸 함량 (mg/g Powder) |
| 5 | 18.3 | 59.5 | 9.53 | 60.2 |
| 10 | 18.5 | 60.1 | 9.51 | 59.3 |
| 30 | 17.9 | 60.3 | 9.47 | 60.7 |
| 100 | 18.2 | 58.9 | 9.60 | 60.7 |
| 500 | 18.5 | 60.5 | 9.52 | 61.5 |
| 5,000 | 18.4 | 60.7 | 9.61 | 61.7 |
실험장소 : 경북 바이오 산업연구원.
그 결과, 표 9에서 보는 바와 같이 배양기 크기에 따라 세리포리아 락세라타의 균사체량, 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량은 큰 차이를 보이지 않았다.
따라서 세리포리아 락세라타 배양에 있어 배양기의 크기에 거의 영향이 없음을 알 수 있었다.
기존 배양과 최적화된 배양 비교.
대한민국 등록특허 10-1031605호에서는 공기 부양식 칼럼형 700 L 배양기를 사용하여 생산을 수행한 바 있다. 본 발명에서 교반형 배양기에서의 최적화된 배양조건을 비교하는 실험을 수행하였다.
실험조건은 공기 부양식 칼럼형 700 L은 특허상에 나와 있는 조건 3 vvm, 25℃이며, 5,000 L 교반형 배양기에서는 25℃, 0 rpm, 공기 공급량 0.5 vvm, 내압 0.5kg/cm2의 초기 조건과 배양중에 용존산소량은 20% 이상 유지하고 배양 5일 차에 탄소원을 2% 첨가하였다.
그 결과 도 4에서처럼 보는 바와 같이 기존 배양 방식인 공기 부양식 700 L에서 보다 세리포리아 락세라타의 균사체량, 건조물의 양, 그리고 건조물에 포함되는 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 함량이 100% 이상 증가하였으며, 특히 균사체의 양은 150%까지 증가하였다.
따라서 공기 부양 식과 비교하여 rpm 등의 조절에 의한 용존 산소량 유지와 배양중에 탄소원 첨가에 의한 교반형 생물반응기에서 배양 성이 향상됨을 알 수 있다.
겔투과
크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography,
GPC
)를 이용한 세포 외 다당체의 분자량 측정.
김지은 세리포리아 락세라타 버섯의 균사체 액체 배양을 통한 세포 외 다당체 생산 및 항 당뇨 효과(계명대학교 박사학위논문, 2013)에 기재된 방법에 따라 세포 외 다당체의 분자량을 측정하였다. 상기 실시 예에서 제조한 세포 외 다당체를 0.1 M Na2SO4/0.05 M NaN3 (빙초산(Glacial acetic acid)으로 pH를 4로 조정) 용액에 1% 가 되도록 녹인 다음, 원심분리 후 상층액 만을 0.45 m 시린지 필터(Syringe filter)로 여과하여 GPC로 분석하였다.
분석조건은 검출기로 굴절지수를 이용하였으며, GPC 칼럼은 OHpak SB 805 HQ(Shodex, Japan)를 이용하여 이동상을 0.1 M Na2SO4/0.05 M NaN3(빙초산으로 pH를 4로 조정)로 유속은 1.0 mL/min의 속도로 흘려주었다. 표준곡선은 각기 다른 분자양(130, 400, 770, 1200 kDa)을 가진 덱스트란(American Polymer Corporation, USA)을 이용하여 작성하였으며, 굴절지수(Refractive index, RI) 측정기 Knauer K-2301(Germany)을 이용하여 위 표 10에 도시된 시스템을 이용하여 EPS의 분자량을 측정하였다. 그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 EPS의 분자량은 약 120 kDa인 것으로 나타났다.
| 분자량의 측정 | |
| HPLC 시스템 | Knauer K-501 시스템 |
| 칼럼 | OHpak SB 805 HQ (Shodex, Japan) |
| 이동상 | 0.1 M Na2SO4/0.05 M NaN3/pH 4 |
| 유속 | 1.0 mL/min |
| 측정기 | RI(Knauer K-2310) |
실험장소 : 계명대학교 식품영양학과 연구실.
세포 외 다당체
의
당 및 단백질 함량 측정.
김지은 세리포리아 락세라타 버섯의 균사체 액체 배양을 통한 세포 외 다당체 생산 및 항 당뇨 효과(계명대학교 박사학위논문, 2013)에 기재된 방법에 따라 세포 외 다당체의 당 및 단백질 함량을 측정하였다. 본원의 세포 외 다당체의 당 함량은 페놀-황산법(Phenol-sulfuric acid method)에 의해 측정하였다. 여러 농도별로 희석한 시료 1mL에 80% 페놀을 25 L 첨가한 후 황산을 2.5 mL 첨가하였다. 그런 다음 30분 동안 실온에서 냉각하고 465nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 단백질 함량은 표준품으로 소혈청 알부민을 사용한 BCA(Bicinchoninic acid) 방법(Smith PK, et al., Analytical Biochemistry, 150(1):76-85 (1985) 참고)에 의해 측정되었다.
그 결과, 아래 표 11과 같이, 당 함량은 45~51%이고 단백질 함량은 33~34%인 것으로 나타났다.
| 수율 (%) | 총 당 함량 (%) | 총 단백질 함량 (%) | |
| 세포 외 다당체 | 1.22 | 45.32 | 34.17 |
| 2차 정제된 세포 외 다당체 | 0.78 | 50.49 | 33.50 |
| 효소 처리된 세포 외 다당체 | 0.24 | 51.39 | 34.61 |
실험장소 : CL 바이오 기업 부설 연구소.
상기 세리포리아 락세라타 배양법은 고체배양과 액체 종 배양을 거친 후 대량 본배양하는 단계를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 세리포리아 락세라타를 배양한 배양법은 교반형 생물반응기를 사용하는 것을 더 포함하며 상기 세리포리아 락세라타를 배양한 균사체 건조물 및 세리포리아 락세라타로부터 유래한 세포 외 다당체 및 베타글루칸은 배양 단계에서 공기 공급 및 교반을 위한 rpm은 0~500rpm으로 조절하는 것을 기술적 구성으로 한다.
더불어 상기 세리포리아 락세라타를 배양한 균사체 건조물 및 세리포리아 락세라타로부터 유래한 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 배양 단계에서 공기 공급량을 0.01~10 vvm으로 조절하게 되고 상기 세리포리아 락세라타를 배양한 균사체 건조물 및 세리포리아 락세라타로부터 유래한 세포 외 다당체 및 베타글루칸은 본 배양 단계에서 내압을 0.5~1.5kg/cm2으로 조절하게한다.
이와같이 본발명은 는 약품 또는 식품에 있어 세리포리아 락세라타 배양물, 이의 건조물과 농축물, 세리포리아 락세라타로부터 유래한 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 생산성을 향상시키는 배양방법을 갖는 것을 특징으로 하게된다.
그리고 상기 세리포리아 락세라타 배양법은 고체배양과 액체 종 배양을 거친 후 대량 본 배양하는 단계를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.
더불어 상기 세리포리아 락세라타를 배양한 배양법은 교반형 생물반응기를 사용하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
더불어 상기 세리포리아 락세라타를 배양한 균사체 건조물 및 세리포리아 락세라타로부터 유래한 세포 외 다당체 및 베타글루칸은 배양 단계에서 공기 공급 및 교반을 위한 rpm은 0~500rpm으로 조절하는 것을 특징으로 한다.
더불어 상기 세리포리아 락세라타를 배양한 균사체 건조물 및 세리포리아 락세라타로부터 유래한 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 배양 단계에서 공기 공급량을 0.01~10 vvm으로 조절하여 완성하게 된다.
또한 상기 세리포리아 락세라타를 배양한 균사체 건조물 및 세리포리아 락세라타로부터 유래한 세포 외 다당체 및 베타글루칸은 본 배양 단계에서 내압을 0.5~1.5kg/cm2으로 조절하여 완성함이 바람직하다.
더불어 본 배양 단계에서 탄소원을 첨가하며 배양액 1 L 당 포도당을 0.1~10% 첨가하여 배양하여 대량 생산할수있게된다,
이와 같이 본원 발명은 본 배양 단계에서 탄소원을 첨가하며 배양액 1 L 당 포도당을 0.1~10% 첨가하여 배양하되. 본원에서는 수치에 대한 한계나 제어를 본원에서는 받지 않음을 밝혀둔다.
이상 설명한 본 발명은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 다양한 변형이나 응용이 가능하며, 본 발명에 따른 기술적 사상의 범위는 아래의 특허청구범위에 의하여 정해져야 할 것이다.
본원은 특히, 버섯 곰팡이의 액체배양은 생물 전환기술을 최적화함으로써 단시간에 효과적으로 유용물질을 생산할 수 있어서 경제성이 높다. 따라서 식용, 약용을 포함한 다양한 버섯 곰팡이 배양에 관한 연구, 특히 차별화된 다양한 기능성 물질의 생산 등이 우수한 종균의 선별 및 이를 이용한 생물전환기술의 최적화기술은 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.
Claims (8)
- 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법에 있어 세리포리아 락세라타 배양물, 이의 건조물과 농축물, 세리포리아 락세라타로부터 유래한 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 생산성을 향상시키는 배양방법을 갖는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법.
- 청구항 제1항에 있어서,
상기 세리포리아 락세라타 배양법은 고체배양과 액체 종 배양을 거친 후 대량 본 배양하는 단계를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법. - 청구항 제1항 또는 2항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세리포리아 락세라타를 배양한 배양법은 교반형 생물반응기를 사용하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법. - 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법에 있어
세리포리아 락세라타를 배양한 균사체 건조물 및 세리포리아 락세라타로부터 유래한 세포 외 다당체 및 베타글루칸은 배양 단계에서 공기 공급 및 교반을 위한 rpm은 0~500 rpm으로 조절하는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법. - 청구항 제1항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세리포리아 락세라타를 배양한 균사체 건조물 및 세리포리아 락세라타로부터 유래한 세포 외 다당체 및 베타글루칸의 배양 단계에서 공기 공급량을 0.01~10 vvm으로 조절하는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법. - 청구항 제5항에 있어서,
상기 세리포리아 락세라타를 배양한 균사체 건조물 및 세리포리아 락세라타로부터 유래한 세포 외 다당체 및 베타글루칸은 본 배양 단계에서 내압을 0.5~1.5kg/cm2으로 조절하는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법. - 청구항 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서,
본 배양 단계에서 탄소원을 첨가하며 배양액 1 L 당 포도당을 0.1~10% 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법에 있어 당뇨병 예방 및 치료 효과를 갖는 약품 또는 식품은 액체 배양한 세리포리아 락세라타 배양물. 세리포리아 락세라타 배양물의 건조물 또는 농축물. 상기 세리포리아 락세라타 배양물의 건조물에 포함되어 있는 세포 외 다당체 또는 베타글루칸 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 세리포리아 락세라타 배양물의 유효물질 생산성이 향상된 제조 방법.
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|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110157753A (zh) * | 2018-02-14 | 2019-08-23 | 陈秀男 | 高产量蘑菇β-葡聚多糖的制造方法及其制品 |
-
2016
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| CN110157753A (zh) * | 2018-02-14 | 2019-08-23 | 陈秀男 | 高产量蘑菇β-葡聚多糖的制造方法及其制品 |
| TWI686480B (zh) * | 2018-02-14 | 2020-03-01 | 陳秀男 | 高產量菇蕈β-葡聚多醣體之製造方法及其製品 |
| CN110157753B (zh) * | 2018-02-14 | 2023-07-21 | 陈秀男 | 高产量蘑菇β-葡聚多糖的制造方法及其制品 |
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