CN107868805A - 一种通过乳酸菌发酵降解的龙眼多糖及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种通过乳酸菌发酵降解的龙眼多糖的制备方法，所述方法包括以下步骤：S1：取龙眼果肉，加入蒸馏水后打浆并灭菌，得灭菌果浆；S2：取所述步骤S1所述的灭菌果浆接种乳酸菌，发酵后灭菌，得龙眼果肉发酵液；S3：将所述步骤S2所述的龙眼果肉发酵液加热提取，收集提取液，浓缩干燥得提取物；S4：萃取所述步骤S3中所述的提取物，得到萃取液；S5：将所述步骤S4中所得萃取液进行脱蛋白，透析，干燥得龙眼多糖。本发明通过乳酸菌发酵降解制备的龙眼多糖具有得率高、粘度小、溶解性好的特性，且制得的龙眼多糖比常规提取的龙眼多糖具有更好的免疫调节作用，可用于龙眼功能食品的开发，对龙眼的精深加工有重要的意义。

Description

一种通过乳酸菌发酵降解的龙眼多糖及其制备方法

技术领域

本发明涉及功能食品制备领域，特别涉及一种通过乳酸菌发酵降解的龙眼多糖及其制备方法。

背景技术

龙眼(Dimocarpus longan Lour.)俗称桂圆，主要在中国、泰国和越南等国家商业化种植。我国龙眼主产于广东、广西、福建和海南等省，其种质资源、种植面积和产量均居世界首位。龙眼不仅是色、香、味俱佳的水果，也是名贵的补品。作为药食同源水果，龙眼在民间和传统中医中多用于治疗或改善血气不足、失眠健忘、贫血、脾虚泄泻等症状。

多糖是一种天然大分子物质，由10个以上的醛糖或（和）酮糖通过糖苷键连接在一起，同蛋白质、脂类、核酸一起构成生命活动的基本营养物质，具有多种生物活性，是维持生命所必须的物质。多糖广泛存在于高等植物、动物细胞膜和微生物细胞壁中，是作为生命有机体的重要组成成分，构成了生命的四大基本物质之一。多糖与生物体维持自身机能的机制密切相关，因而具有丰富的生物学活性。近年来对糖复合物与多糖的研究得到了空前迅速的发展。从包括生物膜的化学性能、免疫物质的研究以及对新药物资源的寻找等相关研究中，人们发现糖类在生物体中不仅是作为能量资源或结构材料，更重要的是它们常是细胞表面信号识别、抗原抗体反应、细胞间信息的传递和感受的关键因子，因此，这一类具有生物活性的多糖的研究日益受到重视。

研究发现龙眼果肉中水溶性多糖是其主要活性成分，具有抗衰老、抗氧化、免疫调节以及抗肿瘤等多种功效，基于龙眼多糖的多种保健功效，龙眼多糖的提取受到越来越多的重视。

现有技术中，龙眼多糖的提取一般采用传统的水提醇沉法，根据该法制备的龙眼多糖具有得率低、粘度大、杂质多以及溶解性差等缺点，一方面增加了原料成本，造成资源的浪费，另一方面由于纯度低，也一定程度上限制了其相关功能性食品的开发。因此，针对现有技术的缺点，有必要对此进行改进。由于龙眼果肉中含有丰富的果胶和半纤维素等水不溶性成分，这些物质可以通过微生物分泌的半乳糖苷酶、木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶等降解，形成分子量小的水溶性的多糖。因此本发明建立了一种通过乳酸菌发酵降解的龙眼多糖制备方法，获得的龙眼多糖具有得率高、粘度小、溶解性好，且具有很好的免疫调节作用，为龙眼功能食品的开发提供了新途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分子量小、粘度低、溶解性好的龙眼多糖，为了解决上述问题，本发明提供一种通过乳酸菌发酵降解的龙眼多糖的制备方法，所述方法包括以下步骤：

S1：取龙眼干果肉，加入蒸馏水后打浆并灭菌，得灭菌果浆；或取新鲜龙眼果肉，打浆并灭菌，得灭菌果浆；

S2：取所述步骤S1所述的灭菌果浆接种乳酸菌，于发酵12-24h后灭菌，得龙眼果肉发酵液；

S3：将所述步骤S2所述的龙眼果肉发酵液加热提取，收集提取液，浓缩干燥得提取物；

S4：萃取所述步骤S3中所述的提取物，得到萃取液；

S5：将所述步骤S4中所得萃取液进行脱蛋白，透析，干燥得龙眼多糖。

所述步骤S1中，先将龙眼果肉打碎成果肉浆，便于菌类与果肉的充分混合。所述灭菌是为了防止杂菌的生长影响用于发酵的菌类的生长。且杂菌的生长可能会导致果浆变质，因此需要灭菌。

所述步骤S2中，选择乳酸菌按比例接种于果浆中进行发酵。由于龙眼果肉中含有丰富的果胶和半纤维素等水不溶性成分，因此采用生物法需要较长的时间进行降解。本发明采用8~24个小时对果浆进行降解，能达到将不溶性果胶和半纤维等大分子糖降解为小分子可溶性多糖。优选的在12~24小时。在发酵完成之后，为了防止乳酸继续发酵，过度降解水溶性多糖，在发酵完成之后会进行灭菌处理，得到发酵液。

所述步骤S2主要用于降解果浆中的果胶、纤维素等物。所述步骤S3为龙眼多糖的提取步骤，在得到的发酵液中加入水并加热进行提取，提取时间的考虑一方面是产量的最大化，另一方面是节约能源的角度，因此可通过测定不同时间点和不同提取温度下提取得到龙眼多糖的含量，选择最佳的提取时间和提取温度。

提取完成之后进行浓缩，可采用真空浓缩，减少对提取物有效成分的破坏。也可常温直接浓缩，降低生产成本。

由于龙眼多糖为水溶性、醇不溶性物质，所述S4中，可采用两相溶剂对浓缩物进行萃取，能够分离醇溶性成分和水溶性成分，从而达到纯化多糖的目的。由于部分蛋白类成分为水溶性，因此在萃取过程会会和多糖一起萃取出来。为了进一步纯化龙眼多糖，在所述步骤S5中，会对萃取液做进一步去蛋白处理，脱蛋白、透析，最后干燥得到纯度高、溶解度大的龙眼多糖。

进一步的，所述步骤S1中，龙眼干果肉与蒸馏水的质量体积比为1:6~8。

由于新鲜龙眼所含水分较多，因此不需要蒸馏水即可打成果浆，而龙眼干果肉由于缺少水分，因此需要增加蒸馏水进行打浆。加入蒸馏水的量太多，打浆需要的设备体积更大，且更加不容易打碎，打浆的蒸馏水太少又会因为果肉粘度大也不易打碎，因此需要选择合适的蒸馏水的量。且由于加入蒸馏水的量跟加入乳酸的量成正比，因此量多量少都会对生产成本造成影响，因此本发明选用果肉与蒸馏水比例为1:6~8（g/ml），一方面能够使果肉能够快速打碎，另一方面，能够节约生产成本，使资源利用最大化。

进一步的，所述乳酸菌为发酵乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌中的一种或多种。

乳酸菌种类繁多，不同的乳酸菌发挥着不同的作用。

本发明的乳酸菌能分泌半乳糖苷酶、木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶等水解酶，这些水解酶一方面可以降解龙眼果肉中的果胶和半纤维素，产生可溶性多糖，使提取的多糖得率增加；另一方面，这些水解酶也可以作用于果肉中的水溶性多糖，使其糖苷链断裂，导致分子量降低、粘度减小、溶解性增加。

进一步的，所述步骤S2中，接种比例为乳酸菌相对灭菌果浆重量比为1%-2%。

乳酸菌在接种之前先进行培养，培养至乳酸菌成对数增长时，将其接种至果浆中。乳酸菌的接种量与乳酸菌的生长状态关系非常大，因此选用对数期的乳酸菌，能够保证乳酸菌的生长状态最佳，且能够减少接种量，缩短发酵时间。因此，本发明选用接种重量比为1%-2%，即100g的果浆接种1g~2g的乳酸菌。

进一步的，所述步骤S1和S2中，灭菌条件为95~105℃灭菌3~8min。

所述步骤S1中，灭菌的目的在于杀死果浆中的各种菌类，由于杂菌的生长一方面影响乳酸菌的生长，影响正常发酵；另一方面一些有害细菌的生长还会引起果浆变质，对人体健康造成不良影响，因此需要高温进行灭菌。所述步骤S2中，由于果浆中接种了乳酸菌，在发酵12~24小时后，果浆中存在大量的乳酸菌，为了防止过度的降解，因此需要终止发酵，利用高温将其杀死。由于乳酸菌的适宜生长温度在40℃上下，因此，利用高温，能够杀死乳酸菌，保证终止完全。本发明选择灭菌条件为95~105℃灭菌3~8min，优选为100℃，灭菌5分钟即可。

进一步的，所述步骤S3中，所述龙眼果肉发酵液加水后进行加热提取，加水的体积与所述步骤S1中使用的龙眼干果肉或新鲜龙眼果肉的质量的比例为10~30:1（mL/g）。

所述加水定容用于对果肉中多糖进行提取。加水定容的量根据龙眼果肉的量而决定，加水太少，可能导致提取不够充分，使得资源利用不充分，造成资源浪费。另一方面，如果加水太多，使得生产设备压力过大，同样加大了生产成本，因此需要根据实验确定加水定容的比例。本发明最终选择加水定容的体积与所述步骤S1中使用的龙眼果肉的质量比为10~30:1（mL/g），即1g果肉加入10~30ml的水进行提取，能够达到充分提取得目的，使得龙眼多糖能够最大限度溶解在水中，既不会造成提取不充分或设备的生产压力，又能够得到充分提取。

进一步的，所述步骤S3中，提取条件为80~90℃提取3~5h。

由于多糖为亲水性物质，通过加热提取，能够使多糖类成分最大限度的溶解在水中。本发明的提取采用80~90℃提取3~5h，优选的85℃下提取4个小时。由于加热温度过高可能导致多糖成分的破坏，温度过低可能造成提取不够充分，因此选用80~90℃提取3~5h。

进一步的，所述步骤S4中，萃取条件为乙醇-硫酸铵溶液构建的双相体系萃取。

双相体系指两种亲水性化合物的水溶液在一定质量分数下混合后自发形成两个不相混溶的水相体系。与常规的溶剂萃取原理类似，即目标物质在两相间的选择性分配，可能与分子间氢键作用、范德华力、疏水作用、界面性质等因素有关。目前在天然活性物质分离提取方面有着广泛的应用，多用于蛋白质、酶、氨基酸、多糖等生物活性物质的萃取。双相萃取是一种新型液-液萃取分离技术，本发明选用乙醇-硫酸铵溶液构建的双相体系萃取，具有分离操作简单、条件温和、活性损失小且不存在有机溶剂残留等优点。

乙醇-硫酸铵溶液构建的双相体系主要由20-30%乙醇、20-25%硫酸铵和蒸馏水组成，分成两相，上层为乙醇溶液，下层为硫酸铵溶液，提取物按照10~20:1（mg/mL）的比例加入双相体系，本发明利用多糖含有大量羟基，易溶于低盐溶液，难溶于乙醇溶液，多糖分子进入底层，与其他非多糖物质分离。

进一步的，所述步骤S4中，萃取时采用超声辅助处理，超声条件为300-600w，时间为5-15min。

超声波萃取利用超声波辐射压强产生的强烈空化应效应、机械振动、扰动效应、高的加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进萃取的进行。进一步的，本发明设置超声条件为300-600w，时间为5-15min。超声波萃取多糖与传统工艺相比，超声波强化操作简单，提取率高，反应过程无物料损失和无副反应发生。在超声的辅助下，龙眼提取物在双相体系中分子运动加剧，扩散速度加快，多糖分子更快的进入底层，与其他非多糖物质分离。

进一步的，所述步骤S5中，采用Sevage试剂脱蛋白。

脱蛋白是多糖分离、纯化中首要、关键的环节。多糖脱蛋白方法很多，涉及化学法、物理法以及生物法。其中最常用的有Sevage法、离子交换树脂法以及酶法等。因此本发明除了可使用Sevage法外，其他方法进行脱蛋白也属于本发明的保护范围。其中Sevage法除蛋白操作简单，条件温和，对糖链破坏较小，且所用试剂常规、廉价，因此优选的，本发明采用Sevage法脱蛋白。具体方法为：在所述步骤S4中得到的萃取液中加入Sevage试剂（V氯仿：V正丁醇=4:1），充分震荡后离心，弃去下层变性蛋白沉淀，上清液透析、干燥得到龙眼多糖。

进一步的，所述透析条件为：使用截流分子量为3000-8000Da的透析袋在4℃下透析3天。

透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。由于多糖类成分一般分子量较大，为了除掉小分子的杂质，因此本发明选用透析袋将多糖类成分与小分子化合物进行分离。由于多糖类成分在3000-8000Da透析袋中无法透过，因此选用透析袋能够进一步纯化多糖，也不会引入其他杂质成分，更加安全可靠。

本发明的有益效果：

（1）本发明龙眼多糖制备方法简单，成本低，易于规模化生产。

（2）本发明通过乳酸菌发酵降解制备的龙眼多糖具有得率高、粘度小、溶解性好的特性。

（3）本发明制备的龙眼多糖比常规提取的龙眼多糖具有更好的免疫调节作用，可用于龙眼功能食品的开发，对龙眼的精深加工有重要的意义。

附图说明

图1为发酵前后龙眼多糖对巨噬细胞分泌IL-6的影响。

图2为发酵前后龙眼多糖对巨噬细胞分泌TNF-α的影响。

具体实施例

为使本发明实施的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行更加详细的描述。在附图中，自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。

实施例1：

取100g龙眼干果肉，按照质量体积比（g/mL）1:6加入蒸馏水，打浆后100℃灭菌5min，然后接种1%发酵乳杆菌，37℃下发酵12h后，于100℃灭菌5min阻止微生物继续发酵；然后加入蒸馏水定容至2L，在85℃下浸提4h后，过滤除残渣，收集浸提液后真空浓缩后冷冻干燥得龙眼提取物。将25%乙醇、22%硫酸铵和蒸馏水混匀后静置15min，溶液分层形成双相体系。将提取物按照15:1（mg/mL）的比例加入双相体系，混匀后300w条件下，超声10min，离心后收集下层溶液。进一步采用Sevage试剂脱蛋白后，使用截流分子量为8000Da的透析袋透析在4℃下透析3d，冷冻干燥得到龙眼多糖。

实施例2：

取100g龙眼干果肉，按照质量体积比（g/mL）1:7加入蒸馏水，打浆后95℃灭菌8min，然后接种1%发酵乳杆菌，37℃下发酵8h后，于95℃灭菌8min阻止微生物继续发酵；然后加入蒸馏水定容至1L，在80℃下浸提5h后，过滤除残渣，收集浸提液后真空浓缩后冷冻干燥得龙眼提取物。将30%乙醇、25%硫酸铵和蒸馏水混匀后静置15min，溶液分层形成双相体系。将提取物按照10:1（mg/mL）的比例加入双相体系，混匀后400w条件下，超声15min，离心后收集下层溶液。进一步采用Sevage试剂脱蛋白后，使用截流分子量为8000Da的透析袋透析在2℃下透析4d，冷冻干燥得到龙眼多糖。

实施例3：

取100g龙眼干果肉，按照质量体积比（g/mL）1:8加入蒸馏水，打浆后105℃灭菌3min，然后接种2%发酵乳杆菌，37℃下发酵24h后，于105℃灭菌3min阻止微生物继续发酵；然后加入蒸馏水定容至3L，在90℃下浸提3h后，过滤除残渣，收集浸提液后真空浓缩后冷冻干燥得龙眼提取物。将20%乙醇、20%硫酸铵和蒸馏水混匀后静置15min，溶液分层形成双相体系。将提取物按照20:1（mg/mL）的比例加入双相体系，混匀后600w条件下，超声5min，离心后收集下层溶液。进一步采用Sevage试剂脱蛋白后，使用截流分子量为8000Da的透析袋透析在3℃下透析2d，冷冻干燥得到龙眼多糖。

实施例4

取100g龙眼干果肉，按照质量体积比（g/mL）1:8加入蒸馏水，打浆后105℃灭菌3min，然后接种2%发酵乳杆菌，37℃下发酵18h后，于105℃灭菌3min阻止微生物继续发酵；然后加入蒸馏水定容至2.5L，在85℃下浸提4h后，过滤除残渣，收集浸提液后真空浓缩后冷冻干燥得龙眼提取物。将20%乙醇、20%硫酸铵和蒸馏水混匀后静置15min，溶液分层形成双相体系。将提取物按照15:1（mg/mL）的比例加入双相体系，混匀后600w条件下，超声15min，离心后收集下层溶液。进一步采用Sevage试剂脱蛋白后，使用截流分子量为3000Da的透析袋透析在4℃下透析3d，冷冻干燥得到龙眼多糖。

实施例5

取100g新鲜龙眼果肉，打浆后105℃灭菌3min，然后接种2%发酵乳杆菌，37℃下发酵24h后，于105℃灭菌3min阻止微生物继续发酵；然后加入蒸馏水定容至3L，在90℃下浸提3h后，过滤除残渣，收集浸提液后真空浓缩后冷冻干燥得龙眼提取物。将20%乙醇、20%硫酸铵和蒸馏水混匀后静置15min，溶液分层形成双相体系。将提取物按照20:1（mg/mL）的比例加入双相体系，混匀后600w条件下，超声5min，离心后收集下层溶液。进一步采用Sevage试剂脱蛋白后，使用截流分子量为8000Da的透析袋透析在3℃下透析2d，冷冻干燥得到龙眼多糖。

实施例6

本发明采用的发酵乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌等乳酸菌能分泌半乳糖苷酶、木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶等水解酶，这些水解酶一方面可以降解龙眼果肉中的果胶和半纤维素，产生可溶性多糖，使提取的多糖得率增加；另一方面，这些水解酶也可以作用于果肉中的水溶性多糖，使其糖苷链断裂，导致分子量降低、粘度减小、溶解性增加，本实施例选择实施例1方法制得的发酵龙眼多糖对比了未发酵龙眼多糖的得率、分子量、特征粘度以及溶解度，具体测定数据见表1。其他实施例制得的龙眼多糖与实施例1制得的龙眼多糖取得的技术效果相同，因此不再一一赘述。

表1发酵前后龙眼多糖的分子量和溶解度比较

样 品	得率（%）	分子量（kDa）	特征粘度（mL/g）	溶解度（mg/mL）
					发酵龙眼多糖	2.83	72.80	9.53	9.85
未发酵龙眼多糖	1.08	126.78	38.27	4.74

实施例7

本实施例对经发酵降解的龙眼多糖测其免疫调节作用，采用巨噬细胞进一步比较了根据实施例1方法制得的乳酸菌发酵降解的龙眼多糖和常规提取的未发酵降解多糖的免疫调节活性，发现经乳酸菌降解处理后的龙眼多糖比未发酵的龙眼多糖对巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6具有更强的刺激作用（如图1和图2所示），表明其具有更好的免疫调节作用。其他实施例制得的龙眼多糖与实施例1制得的龙眼多糖取得的技术效果相同，因此不再一一赘述。

以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照以上较佳实施方式对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换都不应脱离本发明技术方案的精神和范围。本领域技术人员还可在本发明精神内做其它变化等用在本发明的设计，只要其不偏离本发明的技术效果均可。这些依据本发明精神所做的变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种通过乳酸菌发酵降解的龙眼多糖的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1：取龙眼干果肉，加入蒸馏水后打浆并灭菌，得灭菌果浆；或取新鲜龙眼果肉，打浆并灭菌，得灭菌果浆；

S2：取所述步骤S1所述的灭菌果浆接种乳酸菌，发酵后灭菌，得龙眼果肉发酵液；

S3：将所述步骤S2所述的龙眼果肉发酵液加热提取，收集提取液，浓缩干燥得提取物；

S4：萃取所述步骤S3中所述的提取物，得到萃取液；

S5：将所述步骤S4中所得萃取液进行脱蛋白，透析，干燥得龙眼多糖。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，龙眼干果肉与蒸馏水的质量体积比为1:6~8。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述乳酸菌为发酵乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，接种比例为乳酸菌相对灭菌果浆重量比为1%-2%。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1和S2中，灭菌条件为95~105℃灭菌3~8min。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所说龙眼果肉发酵液加水后进行加热提取，加水的体积与所述步骤S1中使用的龙眼干果肉或新鲜龙眼果肉的质量的比例为10~30:1。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，提取条件为80~90℃提取3~5h。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中，萃取步骤为将提取物置于乙醇-硫酸铵溶液构建的双相体系中，超声辅助处理，超声条件为300-600w，时间为5-15min。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述透析条件为：使用截流分子量为3000-8000Da的透析袋在2~4℃下透析2~4天。

10.一种通过乳酸菌发酵降解的龙眼多糖，其特征在于，由权利要求1~9任一项所述的方法制备。