CN104945529A - 一种活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法，对干制的荔枝果肉依次进行超高压酶解辅助热水浸提法提取荔枝粗多糖、脱蛋白处理、透析脱除小分子处理和乙醇分步沉淀处理后，制得具有肠道免疫调节活性的荔枝多糖级分。本发明制备的荔枝多糖具有较高的溶解性和肠道免疫调节活性。

Description

一种活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法

技术领域

本发明涉及功能食品领域，尤其涉及一种活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法。

背景技术

 荔枝是亚热带地区的主要特色水果，因其果皮鲜艳美观、肉汁细腻香甜而深受国内外消费者的喜爱，被誉为“果中珍品”。我国是荔枝的主产国，种植面积和产量均居世界第一。广东省作为荔枝的主产区其产量占全国荔枝总产量的60%以上。由于荔枝上市时间集中，且保鲜时间短，鲜销市场压力巨大。开展精深加工利用研究、延长其产业链是促进荔枝产业可持续发展的必由之路。目前市场上的荔枝深加工产品还比较少，荔枝干、荔枝果汁等产品尚不足以体现荔枝这一珍稀水果的价值。

据《本草纲目》记载“常食荔枝能补脑健身，治疗瘰疬，开胃益脾；干制能补元气，可作为产妇及老弱者的补品”，现代药理学研究表明多糖是荔枝中的主要活性成分，具有抗氧化和免疫调节等活性。充分发挥荔枝的“食疗”特性和优势，制备其免疫活性多糖用于功能食品的研发是开展荔枝精深加工利用的重要途径。近来的医学研究表明，肠道粘膜免疫系统对维持机体的免疫稳态具有重要作用，被认为是人体最大的免疫器官之一，肠道是多糖与人体直接作用的主要组织，肠粘膜及肠壁上分布着大量的淋巴细胞以及派氏结等淋巴细胞组织能够与多糖发生相互作用，有研究发现静脉注射的中药多糖的免疫调节作用不及口服给药效果明显，提示了肠道免疫在多糖免疫调节中可能具有十分重要的作用。而多糖作为一种生物大分子被人体口服摄入后很难被消化酶水解，因此能够吸收入血的多糖量非常有限。对银耳多糖的吸收利用情况的研究表明，大鼠口服摄入银耳多糖后只有0.4%能够以完整的多糖结构吸收入血，如此低的生物利用率很难使其达到可以发挥免疫调节活性的血药浓度。

水果多糖一般为杂多糖，由单糖组成和高级结构差异显著的多种多糖级分组成，不同的分离制备方法所得到的多糖在其结构特征上会存在明显的差别。如申请号为201210108487.6的发明专利公开了一种荔枝多糖的提取工艺，该发明采用微波法对荔枝中的多糖进行提取，具体为：将荔枝干去壳、去核、在水中浸泡后打浆；将浆液置于微波炉中加入料液比为1:6~1:12的水，设置微波的功率为480~800W，微波提取8~12min；过滤、离心，取上清液浓缩，加入60~80%的乙醇溶液，静置10~15h；离心、取上清液浓缩、干燥得成品。该发明只是采用常规的微波提取方法，并没有结合荔枝多糖的生物活性对提取条件进行优化，使得制备的荔枝多糖肠道免疫调节活性较低，且该方法得到的只是一种多糖含量相对较低的粗多糖，其中含有色素，蛋白、无机盐等多种杂质，且多糖的均一性较低，为多种不同分子量范围的多糖级分组成的杂多糖。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法，解决通过普通方法制备的荔枝多糖溶解性和肠道免疫调节活性较低的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下方案实现：

一种活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法，对干制的荔枝果肉依次进行超高压酶解辅助热水浸提法提取荔枝粗多糖、脱蛋白处理、透析脱除小分子处理和乙醇分步沉淀处理后，制得具有肠道免疫调节活性的荔枝多糖级分。

多糖的提取可以采用多种方式，例如热水浸提、超声辅助或微波辅助提取等，而本发明通过超高压酶解辅助热水浸提法提取得到的多糖活性更高；经提取得到的是粗多糖，需要进一步的去除杂质，因此需要进行脱蛋白的处理；脱去蛋白的多糖通过透析除去里面含有的盐离子、单糖，同时也可以去除色素之类的杂质，这时得到的多糖杂质含量已经比较低，但是这时的多糖是由不同分子量的很多种多糖分子组成的不均一的多糖混合物，因其分子量和单糖组成等的差别，活性也会有明显的不同；本发明进一步用不同终浓度的乙醇对这种多糖混合物进行分步醇沉，利用不同分子量的多糖溶解在不同浓度的乙醇中的原理，获得不同分子量分布的多糖级分，从而获得活性最高的多糖级分。

干制的荔枝果肉的制备包括如下步骤：将荔枝清洗干净后沥干，送入热风干燥设备中，于温度86~92℃条件下杀青4~6h；将经杀青的荔枝送入热泵干燥装置中，于温度50~65℃、风速1m/s条件下干燥至荔枝中水分含量为25％以下，得干制的荔枝果肉；干燥操作为每干燥9~12h后关闭热泵干燥装置缓苏3~4h，重复此干燥-缓苏周期3次。

从新鲜荔枝果肉和干制荔枝果肉中提取到的多糖在结构特征和活性上有明显的不同，前者的免疫调节活性低于后者，且相对于热风、真空冷冻等干制方式，热泵干制果干制备的多糖免疫调节活性最强。

超高压酶解辅助热水浸提法提取荔枝粗多糖具体步骤为：

S11：干制的荔枝果肉按料液比1：15~20加入蒸馏水，室温下浸泡1~2h后，打浆得均质液并在800~1000rpm条件下搅拌25~35min，向均质液中加入纤维素酶2000~3000U/kg和果胶酶4000~5500U/kg，磁力搅拌的条件下酶解60~80min，将酶解均质液转移至铝箔袋中，排出空气后封口，超高压条件下保压一段时间，卸压后将内容物倒出；

S12：将步骤S11处理后的酶解均质液于80~90℃的水浴下浸提4~6h并趁热过滤，滤液于4000~5000rpm条件下离心8~12min，收集上清液备用；

S13：对S12中得到的沉淀按料液比1:15~20再次加入蒸馏水并按照S12的浸提步骤重复操作1~2次，收集并合并每次离心后的上清液，于60~70℃旋转蒸发至上清液体积的1/8~1/10，得粗多糖溶液。

目前多糖的提取方法有多种，从一开始的浸提有传统的热水浸提，也有很多采用超声、微波辅助提取，其多糖提取得率会有明显的差别，导致很多研究会倾向于采用得率更高的方法。但不同的提取方法所得多糖的活性差异却不是很清楚。本发明针对这一问题，通过在线活性跟踪比较，有针对性的做出设置，使得提取的多糖活性最高；本发明中，酶浓度太低达不到水解效果，浓度太高水解过度会降低多糖提取率，酶解时间和温度同样有此影响。超高压处理的保压时间和压力都是经过单因素实验比较得出的，如果压力太高或太低或保压时间太长或太短，对其所得多糖单位重量的免疫调节活性虽无明显影响，但多糖的得率都会明显降低。热水浸提的料液比和温度也经过特别设置，料液比太高时虽然多糖提取比较完全但多糖提取液浓度太低，旋蒸时间加长，不节能，如果料液比太低，提取率会很低，造成原料的浪费。浸提温度会直接影响多糖的提取率，低于80℃时荔枝多糖的溶出率会有明显降低，有些多糖的提取温度会达到95℃，但本发明经过对比分析发现温度高于90℃后不仅多糖的溶出率没有提高，而且得到的多糖的溶解性和免疫调节活性方面反而降低，因此把温度限定在80~90℃范围内，步骤S11显著提高了多糖的溶出率。本技术方案所得多糖的提取得率和多糖的免疫调节活性显著高于单纯热水浸提以及超声辅助和微波辅助提取。本技术方案不对磁力搅拌的条件进行限制，调整转速能够起到搅拌均匀的效果即可。同时不对旋转蒸发的转速进行限制。

优选地，所述酶解温度为35~40℃。

优选地，所述保压时间为5~10min。

优选地，超高压压力为250~300MPa。

采用Sevag法进行脱蛋白处理，具体步骤为：向粗多糖溶液中加入1/4粗多糖溶液体积的Sevag试剂，并在转速为250~300rpm条件下震荡20~30min、转速为4000~5000rpm条件下离心8~12min，弃去有机相和蛋白沉淀，于上清液中再次加入1/4上清液体积的Sevag试剂并按前述步骤重复震荡、离心操作共3次，最后将上清液于温度60~70℃旋蒸除去有机试剂。

在多糖提取的开始步骤得到的粗多糖中含有两种不同类型的蛋白，一种是荔枝水果中本身存在的与多糖无关的游离状态的蛋白质，这种蛋白质通过提取多糖的过程被提取到粗提液中其实是一种杂质，因此需要通过Sevag法将其去除掉。而另外还有一种类型的蛋白质是与多糖通过化学键相结合形成的一种多糖与蛋白的复合物，为蛋白多糖。这种蛋白实际上是多糖的一个组成成分，它对于多糖发挥生物活性是有帮助的，因此要保留。通过Sevag法较温和的去除蛋白，去除的主要是前一种游离状态的杂质，因此不会对多糖活性产生不利影响。而现有很多的研究为了得到高纯度的多糖，方便对其结构的分析，并没有考虑对活性的影响，而采用较为彻底的酶－Sevag法来进行脱蛋白处理。往往同时脱除了与多糖结合的蛋白质，虽然蛋白的脱除率明显高于单独的Sevag法，但多糖的活性也因此容易受到影响而降低；通过对不同脱除次数后所得多糖的免疫调节活性的比较，发现经过3次脱蛋白处理后如果再进继续进行脱蛋白处理，虽然仍可以脱除一定量的蛋白，但多糖的免疫调节活性会明显降低，随着蛋白的逐步被脱除，可能是多糖的空间结构发生了变化，导致其溶解性降低，这些都会对其活性产生影响，因此将脱蛋白次数进行适当的控制可以保证所得多糖有较好的免疫调节活性。此步骤中的旋蒸转速无限制。

透析脱除小分子处理具体步骤为：将脱蛋白处理后的粗多糖溶液置于截留分子量为3000~8000Da的透析袋，在蒸馏水体系中，于2~6℃下透析3~5d，每10~12h换一次蒸馏水。

乙醇分步沉淀处理包括如下步骤：

S21．浓缩：将透析脱除小分子处理后的粗多糖溶液旋转蒸发浓缩至浓度为5~20mg/ml；

S22．分步沉淀：取一部分浓缩后的溶液加入无水乙醇至最终体系的乙醇体积百分比浓度为30%，在温度2~6℃下静置10~12h，弃去沉淀；向上清液中继续补加无水乙醇至体系乙醇体积百分比浓度为50%，在温度为2~6℃下静置10~12h，弃去沉淀；再向上一步骤得到的上清液中补加无水乙醇至体系乙醇体积百分比浓度为80%，在温度2~6℃下静置10~12h，过滤获得沉淀；

S23．分级洗涤：将上述获得的沉淀分别用乙醇清洗多次，直至沉淀颜色、形态均一，再将沉淀分别用蒸馏水溶解，真空冷冻干燥得到多糖粉末。

乙醇因通过减少多糖和水相互作用，使多糖脱水并相互聚集形成沉淀。如果醇沉处理时多糖浓度过低，乙醇对多糖分子的脱水作用不明显，导致多糖沉淀不完全；多糖浓度增大到一定浓度，多糖单位体积分子间作用力变大，多糖容易结合聚沉；当多糖浓度过高，溶液过于粘稠，乙醇脱水不充分，多糖容易形成凝胶存在于溶液，不利于分步沉淀；本发明通过对不同浓度下的粗多糖溶液的乙醇沉淀效果进行仔细的对比研究，确定出了其初始浓度为5-20mg/ml。不同浓度的乙醇对多糖进行沉淀可以获得不同分子量分布的多糖级分，多糖的分子量大小对其活性有明显影响，通过对各个级分的比较可以确定出活性最高的多糖级分，本技术方案中将上清液补加无水乙醇至浓度为80%时得到的沉淀，经过处理后最后得到的多糖粉末活性最高；旋转蒸发温度是60~70℃，对转速无限制；真空冷冻干燥温度为-20 ℃，真空度为3~10 Pa。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明通过各步骤的巧妙设计和配合，结合荔枝多糖的生物活性对提取条件进行优化，实现了制备所得的荔枝多糖具有较高的溶解性和肠道免疫调节活性，此方法对开展荔枝的精深加工利用、开发以荔枝为原料的功能性食品具有非常重要的意义。

具体实施方式

为了让本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合对本发明作进一步阐述。

实施例1

一种活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法，包括如下制备步骤：

S1. 干制荔枝果肉：荔枝清洗沥干后送入热风干燥设备中90℃进行杀青5h，杀青后的荔枝送热热泵干燥装置中，于温度58℃、风速1m/s条件下干燥至荔枝中水分含量为25%，热泵干燥装置干燥期间，每干燥10h后关闭，后缓苏3h，并重复此干燥-缓苏周期3次；

S2. 超高压酶解辅助热水浸提法提取荔枝粗多糖：干制的荔枝果肉按料液比1:15加入蒸馏水，室温下浸泡1h，打浆得均质液并在800rpm条件下搅拌25min，向均质液中加入纤维素酶2000U/kg和果胶酶4000U/kg，于35℃、磁力搅拌的条件下酶解60min，将酶解均质液转移至铝箔袋中，排出空气后封口，于250MPa条件下保压5min，卸压后将内容物倒出；将卸压后的均质液于80℃的水浴下浸提4h趁热过滤，滤液于4000rpm条件下离心8min得到沉淀，上清液备用；对得到的沉淀按料液比1:15再次加入蒸馏水并按照前述浸提步骤重复操作1次，收集每次离心后的上清液，60℃旋转蒸发至上清液体积的1/8，得粗多糖溶液；

S3. 脱蛋白处理：向粗多糖溶液中加入1/4粗多糖溶液体积的Sevag试剂，并在转速为250rpm条件下震荡20min、转速为4000rpm条件下离心8min，弃去有机相和蛋白沉淀，于上清液中再次加入1/4上清液体积的Sevag试剂并按前述步骤重复震荡、离心操作共3次，最后将上清液于温度60℃旋蒸除去有机试剂；

S4. 脱除小分子处理：将脱蛋白处理后的粗多糖溶液置于截留分子量为3000~8000Da的透析袋中，蒸馏水体系中，于2℃下透析3d，每10h换一次蒸馏水；

S5. 乙醇分步沉淀处理包括如下步骤：将透析脱除小分子处理的粗多糖溶液65℃旋转蒸发至浓度为5mg/ml；取一部分浓缩后的溶液加入无水乙醇至最终体系的乙醇体积百分比浓度为30%，在温度2℃下静置10h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP1，上清液备用；向上清液中继续补加无水乙醇至体系乙醇体积百分比浓度为50%，在温度2℃下静置10h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP2，上清液备用；再向上一步骤得到的上清液中补加无水乙醇至体系乙醇体积百分比浓度为80%，在温度2℃下静置10h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP3；同时向另一部分浓缩至5mg/ml的粗多糖溶液中加入4倍体积的无水乙醇，在温度2℃下静置10h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP；将上述获得的四种沉淀分别用无水乙醇清洗多次，直至沉淀颜色、形态均一，再将四种沉淀分别用蒸馏水溶解，于-20℃、6Pa条件下真空冷冻干燥得四种多糖粉末。

实施例2

一种活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法，包括如下制备步骤：

S1. 干制荔枝果肉：荔枝清洗沥干后送入热风干燥设备中90℃进行杀青5h，杀青后的荔枝送热热泵干燥装置中，于温度58℃、风速1m/s条件下干燥至荔枝中水分含量为25%，热泵干燥装置干燥期间，每干燥10h后关闭，后缓苏3h，并重复此干燥-缓苏周期3次；

S2. 超高压酶解辅助热水浸提法提取荔枝粗多糖：干制的荔枝果肉按料液比1：20加入蒸馏水，室温下浸泡2h，打浆得均质液并在1000rpm条件下搅拌35min，向均质液中加入纤维素酶3000U/kg和果胶酶5500U/kg，于40℃、磁力搅拌的条件下酶解80min，将酶解均质液转移至铝箔袋中，排出空气后封口，于300MPa条件下保压10min，卸压后将内容物倒出；将卸压后的均质液于90℃下浸提6h趁热过滤，滤液于5000rpm条件下离心12min得到沉淀，上清液备用；对得到的沉淀按料液比1:20再次加入蒸馏水并按照前述浸提步骤重复操作2次，收集每次离心后的上清液，70℃旋转蒸发至上清液体积的1/10，得粗多糖溶液；

S3. 脱蛋白处理：向粗多糖溶液中加入1/4粗多糖溶液体积的Sevag试剂，并在转速为300rpm条件下震荡30min、转速为5000rpm条件下离心12min，弃去有机相和蛋白沉淀，于上清液中再次加入1/4上清液体积的Sevag试剂并按前述步骤重复震荡、离心操作共3次，最后将上清液于温度70℃旋蒸除去有机试剂；

S4. 脱除小分子处理：将脱蛋白处理后的粗多糖溶液置于截留分子量为3000~8000Da的透析袋中，蒸馏水体系中，于6℃下透析5d，每12h换一次蒸馏水；

S5. 乙醇分步沉淀处理包括如下步骤：将透析脱除小分子处理的粗多糖溶液65℃旋转蒸发至浓度为20mg/ml；取一部分浓缩后的溶液加入无水乙醇至最终体系的乙醇体积百分比浓度为30%，在温度6℃下静置12h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP1，上清液备用；向上清液中继续补加无水乙醇至体系乙醇体积百分比浓度为50%，在温度6℃下静置12h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP2，上清液备用；再向上一步骤得到的上清液中补加无水乙醇至体系乙醇体积百分比浓度为80%，在温度6℃下静置12h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP3；同时向另一部分浓缩至20mg/ml的粗多糖溶液中加入4倍体积的无水乙醇，在温度6℃下静置12h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP；将上述获得的四种沉淀分别用无水乙醇清洗多次，直至沉淀颜色、形态均一，再将四种沉淀分别用蒸馏水溶解，于-20℃、6Pa条件下真空冷冻干燥得四种多糖粉末。

对比例1

除了纤维素酶浓度为1500U/kg，果胶酶浓度为3000 U/kg外，其它条件同实施例1。

对比例2

除了纤维素酶浓度为3500U/kg，果胶酶浓度为6000 U/kg外，其它条件同实施例2。

对比例3

除了酶解温度为30℃外，其它条件同实施例1。

对比例4

除了酶解温度为45℃外，其它条件同实施例2。

对比例5

除了保压时间为1min外，其它条件同实施例1。

对比例6

除了保压时间为15min外，其它条件同实施例2。

对比例7

除了浸提温度为70℃外，其它条件同实施例1。

对比例8

除了浸提温度为 100℃外，其它条件同实施例2。

对比例9

除了步骤S2采用微波辅助提取法外，其它条件同实施例1；

具体步骤如下：干制的荔枝果肉按料液比1:15加入蒸馏水，室温下浸泡1h，打浆得均质液并在800rpm条件下搅拌25min，将均质液置于微波炉中，微波功率580W，提取时间15min，然后趁热过滤，离心收集沉淀，上清液备用，将所得沉淀再次加入蒸馏水重复提取一次，合并上清液，65℃旋蒸至上清液体积的1/8，得粗多糖溶液，此步骤中不对离心转速作限定。

对比例10

除了步骤S3中于上清液中再次加入1/4上清液体积的Sevag试剂并按前述步骤重复震荡、离心操作共8次外，其它条件同实施例1。

对比例11

除了步骤S3为采用酶法-Sevag法进行脱蛋白处理外，其它条件同实施例1；

具体步骤如下：向粗多糖溶液中加入1%的木瓜蛋白酶（w/v），调整pH至6.4，于60℃下酶解3h，酶解液在5000r/min条件下离心20min，取上清液，再对上清液按照实施例1中步骤S3的步骤处理。

对比例12

除了步骤S5不同外，其它条件同实施例1；

具体如下：将透析脱除小分子处理的粗多糖溶液65℃旋转蒸发至浓度为5mg/ml；取一部分浓缩后的溶液加入无水乙醇至最终体系的乙醇体积百分比浓度为20%，在温度2℃下静置10h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP1，上清液备用；向上清液中继续补加无水乙醇至体系乙醇体积百分比浓度为70%，在温度2℃下静置10h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP2，上清液备用；再向上一步骤得到的上清液中补加无水乙醇至体系乙醇体积百分比浓度为90%，在温度2℃下静置10h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP3；同时向另一部分浓缩至5mg/ml的粗多糖溶液中加入3倍体积的无水乙醇，在温度2℃下静置10h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP；将上述获得的四种沉淀分别用无水乙醇清洗多次，直至沉淀颜色、形态均一，再将四种沉淀分别用蒸馏水溶解，于-20℃、6Pa条件下真空冷冻干燥得四种多糖粉末。

对比例13

除了步骤S5不同外，其它条件同实施例2；

将透析脱除小分子处理的粗多糖溶液65℃旋转蒸发至浓度为20mg/ml；取一部分浓缩后的溶液加入无水乙醇至最终体系的乙醇体积百分比浓度为40%，在温度6℃下静置12h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP1，上清液备用；向上清液中继续补加无水乙醇至体系乙醇体积百分比浓度为55%，在温度6℃下静置12h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP2，上清液备用；再向上一步骤得到的上清液中补加无水乙醇至体系乙醇体积百分比浓度为70%，在温度6℃下静置12h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP3；同时向另一部分浓缩至20mg/ml的粗多糖溶液中加入5倍体积的无水乙醇，在温度6℃下静置12h，过滤获得沉淀，此多糖命名为LP；将上述获得的四种沉淀分别用无水乙醇清洗多次，直至沉淀颜色、形态均一，再将四种沉淀分别用蒸馏水溶解，于-20℃、6Pa条件下真空冷冻干燥得四种多糖粉末。

试验方法：以上实施例和对比例均选自同一批的荔枝干进行试验，将所得多糖粉末分别测定其多糖得率，对小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞增殖和免疫因子分泌的影响，评价其肠道免疫调节活性。

测定方法如下：

多糖含量测定采用苯酚-硫酸法。

肠道免疫调节活性测定方法如下：

淋巴细胞增殖指数测定：颈椎脱臼处死Balb/c雄性小鼠后，75%乙醇浸泡30s，移入超净工作台，打开腹腔，无菌条件下分离肠系膜淋巴结（MLNs）放入装有冷PBS的培养皿中。将MLNs置于150目不锈钢筛网上，用注射器针芯挤压并轻轻研磨，用冷的PBS冲洗筛网后获得单细胞悬液。收集MLNs细胞用PBS洗2遍，然后将细胞重悬于含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，再用150目尼龙膜干净筛网过滤除去大颗粒结缔组织，即获得MLNs单细胞悬液。将分离到的MLNs细胞以1×10⁷ cells/mL，50 μL/孔加入96孔培养板中，然后每孔加入浓度为100μg/mL的多糖溶液（将上述制得的多糖粉末溶于细胞培养液后，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌制得）50 μL，使其终浓度为50μg/mL。培养板于培养箱中孵育68 h后，每孔加入20 μL的 MTT (5 mg/mL)。继续培养4 h后，每孔加入100 μL酸性异丙醇，放置12 h。培养板轻微振荡混匀后，采用酶标仪于570 nm下测定各孔OD值。空白对照用培养基代替多糖溶液。淋巴细胞增殖指数PI＝(多糖处理组OD值-空白组OD值)/ 空白组OD值；

IFN-γ分泌水平测定：将上述分离的MLNs淋巴细胞调整为4×10⁶ cell/mL细胞悬液，取100 μL/孔细胞悬液加入96孔培养板中，每孔再加入不同制备方法得到的100 μg/mL多糖溶液（多糖溶液制备方法同上）100μL，培养48 h后，将细胞培养板于4 °C，1000 r/min，10 min离心收集上清。将收集的细胞采用ELISA法测定IFN-γ含量。

测试结果如下表：

从各实施例和对比例看出，多糖级分LP3虽然不是得率最高，但是其活性最高，综合考虑得率和活性，多糖LP3为最优；从实施例1~2和对比例1~4可以看出，对比例1~4中由于酶解条件的改变使得高免疫调节活性多糖级分LP3的得率和/或活性明显降低；对比例5~6与实施例的对比可以看出，改变超高压的条件后，虽然LP3活性无明显影响，但是多糖的得率有明显的降低；对比例7~8与实施例对比可以看出，当浸提温度提高到100℃后，多糖的得率和活性都有明显的降低，同时温度越高耗能越大；对比例9与实施例1对比可以看出，微波辅助提取等传统提取方法提取的多糖的得率和活性均有所降低，对比例10~11与实施例1对比可以看出，增加Sevag法脱蛋白的次数或者换用酶-Sevag法脱蛋白后，多糖损失增多导致得率降低，同时多糖的活性也明显降低，特别是酶-Sevag法使得多糖活性大幅降低；对比例12~13与实施例对比，分步醇沉时乙醇的浓度梯度进行改变后，LP3级分的得率明显降低，虽然个别级分活性增强，活性级分LP3的活性却大幅降低。

上述实施例仅为本发明的其中具体实现方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法，其特征在于，对干制的荔枝果肉依次进行超高压酶解辅助热水浸提法提取荔枝粗多糖、脱蛋白处理、透析脱除小分子处理和乙醇分步沉淀处理后，制得具有肠道免疫调节活性的荔枝多糖级分。

2.根据权利要求1所述的活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法，其特征在于，超高压酶解辅助热水浸提法提取荔枝粗多糖具体步骤为：

S11：干制的荔枝果肉按料液比1：15~20加入蒸馏水，室温下浸泡1~2h后，打浆得均质液并在800~1000rpm条件下搅拌25~35min，向均质液中加入纤维素酶2000~3000U/kg和果胶酶4000~5500U/kg，磁力搅拌的条件下酶解60~80min，将酶解均质液转移至铝箔袋中，排出空气后封口，超高压条件下保压一段时间，卸压后将内容物倒出；

S12：将步骤S11处理后的酶解均质液于80~90℃的水浴下浸提4~6h并趁热过滤，滤液于4000~5000rpm条件下离心8~12min，收集上清液备用；

S13：对S12中得到的沉淀按料液比1:15~20再次加入蒸馏水并按照S12的浸提步骤重复操作1~2次，收集并合并每次离心后的上清液，于60~70℃旋转蒸发至上清液体积的1/8~1/10，得粗多糖溶液。

3.根据权利要求 2所述的活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法，其特征在于，酶解温度为35~40℃。

4.根据权利要求2所述的活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法，其特征在于，保压时间为5~10min。

5.根据权利要求2所述的活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法，其特征在于，超高压压力为250~300MPa。

6.根据权利要求1所述的活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法，其特征在于，采用Sevag法进行脱蛋白处理，具体步骤为：向粗多糖溶液中加入1/4粗多糖溶液体积的Sevag试剂，并在转速为250~300rpm条件下震荡20~30min、转速为4000~5000rpm条件下离心8~12min，弃去有机相和蛋白沉淀，于上清液中再次加入1/4上清液体积的Sevag试剂并按前述步骤重复震荡、离心操作共3次，最后将上清液于温度60~70℃旋蒸除去有机试剂。

7.根据权利要求1所述的活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法，其特征在于，透析脱除小分子处理具体步骤为：将脱蛋白处理后的粗多糖溶液置于截留分子量为3000~8000Da的透析袋，在蒸馏水体系中，于2~6℃下透析3~5d，每10~12h换一次蒸馏水。

8.根据权利要求1所述的活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法，其特征在于，乙醇分步沉淀处理包括如下步骤：

S21．浓缩：将透析脱除小分子处理后的粗多糖溶液旋转蒸发浓缩至浓度为5~20mg/ml；

S22．分步沉淀：取浓缩后的多糖溶液加入无水乙醇至最终体系的乙醇体积百分比浓度为30%，在温度2~6℃下静置10~12h，弃去沉淀，向上清液中继续补加无水乙醇至体系乙醇体积百分比浓度为50%，在温度为2~6℃下静置10~12h，弃去沉淀，再向上一步骤得到的上清液中补加无水乙醇至体系乙醇体积百分比浓度为80%，在温度2~6℃下静置10~12h，过滤获得沉淀；

S23．洗涤：将上述沉淀用乙醇清洗多次，直至沉淀颜色、形态均一，再将沉淀用蒸馏水溶解，真空冷冻干燥得到多糖粉末。

9.根据权利要求8所述的活性示踪下肠道免疫调节活性荔枝多糖级分制备方法，其特征在于，真空冷冻干燥的温度为-20℃，真空度为3~10 Pa。