KR20000038315A - 동충하초 균사체 액체배양물로부터 균체외 고분자물질의제조방법 및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 동충하초(Cordyceps militaris) 균사체의 액체배양물로부터 균체외 고분자물질(Extracellular polymer)의 생산 및 상기 균체외 고분자물질의 혈중지질강하제로서의 신규한 용도에 관한 것으로 21개 타입의 고등진균 균사체의 액체배양물로부터 얻은 균체외 고분자물질의 항-컴플리멘트 활성을 측정하고 이중 항-컴플리멘트 활성이 가장 높은 Cordyceps militaris 균사체를 선택하여 이 균주 균사체의 성장과 균체외 고분자물질의 생산을 조사하고 생산된 균체외 고분자물질의 당과 아미노산 조성을 분석한 후 혈중지질 강하효과를 조사한 결과, 이들 균체외 고분자물질은 혈중 지질 강하시키는 뛰어난 효과가 있다.
Description
본 발명은 동충하초(Cordyceps militaris) 균사체 배양물로부터 균체외 고분자물질의 제조방법 및 상기 고분자물질의 의학적 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 동충하초 균사체를 액체배양한 배양물로부터 균체외 고분자물질의 생산방법 및 상기 균체외 고분자물질의 신규한 의학적 용도에 관한 것이다.
내독소 리포폴리사카라이드(Gewurz, H., H. S. Shin and S. E. Mergenhagen, 1968)와 인슐린(Gotze, O. and H. J. Muller Eberhard. 1971) 및 미생물이나 식물 진균으로부터 얻은 수용성 β-1,3-글루칸(Okuda, T., Y. Yoshioka, T. Ikekawa, G. Chihara, and K. Nishioka. 1972)과 같은 다양한 생고분자물질은 컴플리멘트(Complement) 시스템을 활성화시킨다고 알려져 있다. 컴플리멘트 시스템은 염증내에서 그리고 알레르기 반응에서 숙주 방어 시스템으로 중요한 역할을 담당한다고 보통 알려져 있다. 특히 고등진균으로부터 생산된 많은 타입의 고분자물질들은 항-컴플리멘트 활성(Jeong, H., J.W. Lee, and K. H. Lee. 1990), 임파구에서 마이토젠 활성(Hsu, H. C., C. I. Hsu, R. H. Lin. C. L. Kao, and J. Y. Lin. 1997), 인터페론 유도활성(Kandefer-Szerszen. M. Z. Kawecki, and M. Guz. 1979))과 같은 면역조절활성(Gregory, F.J., E. M. Healy, H. P. K. Jr. Agerbory, and G. H. Warren. 1996)을 갖는다고 보고되어 있다. 다양한 버섯의 배양배지(Lee, H. C. Sung, and H. C. Yang. 1994)와 균사체(Jeong, H., J.W. Lee, and K. H. Lee. 1990) 및 자실체(Song, C. H., J. H. Kim, B. K. Yang, and K. W. Kim. 1996)로부터 추출된 고분자물질의 항-컴플리멘트 활성은 이미 연구되어져 있다. 진균의 생고분자물질에 의한 컴플리멘트 시스템의 활성은 거의 항종양 효과(Ito, H. 1986)와 관련되어 보고되어 있고 항-컴플리멘트 활성은 또한 항종양작용(Lee, K.H., J. W. Lee, M. D. Han, H. Jeong, Y. I. kim, and D. W. Oh. 1994)과 함께 이루어지고 있다. 버섯으로부터 추출된 대부분의 고분자물질은 β-1,3-글루칸과 그 치환체(Franz, G. 1989)인 β-1,6-글루코스 또는 폴리사카라이드-단백질 복합체가 알려져 있다(Mizuno, T., R. Inagaki, T. Kanao, T. Hagiwara, T. Nakamura, H. Ito, K. Shimura, T. Sumiya, and A. Asakura. 1990). Lentinus edodes로부터 얻어진 렌티난, Schizophyllum commune로부터 얻은 시조필란, Coriolus verscolor로부터 얻은 크레스틴 및 Phellinus linteus로부터 얻은 메시마는 상업적으로 항종양제로 사용되고 있다. 그러나 이들 고분자물질들은 균사체로부터 얻은 균체내 고분자물질(endo-polymer)이였다.
따라서 본 발명자들은 고등진균 21개 타입의 균사체 액체배양물로부터 생산된 균체외 고분자물질(exo-polymer)의 항-컴플리멘트 활성을 스크링 목적으로 테스트하였고 선택된 균주로부터 생산된 균체외 고분자물질의 생산과 성장비율을 5L 공기-주입 발효기내에서 검사하였으며 이 균체외 고분자물질의 당과 아미노산 조성을 분석하였다. 또 동물실험으로 상기 균체외 고분자물질의 혈중지질 강하효과를 조사하여 아직까지 연구된 바와 없었던 고등진균 균사체의 액내 배양물내에서 생산된 균체외 고분자물질을 생산하고 이 물질의 용도를 밝히므로써 달성하였다.
본 발명의 목적은 동충하초(Cordyceps militaris) 균사체의 액체배양물로부터 균체외 고분자물질의 생산방법을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 균체외 고분자물질의 혈중지질강하제로서의 신규한 용도를 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 21개 타입의 고등진균 균사체의 액체배양물로부터 얻은 균체외 고분자물질의 항-컴플리멘트 활성을 측정하고 이중 항-컴플리멘트 활성이 가장 높은 균주를 선택하여 이 균주의 균사체 성장과 균체외 고분자물질의 생산을 조사하고 생산된 균체외 고분자물질의 당과 아미노산 조성을 분석한 후 혈중지질 강하효과를 조사하므로써 달성하였다.
이하 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 고등진균 균사체 액체배양물로부터 얻어진 균체외 고분자물질(Extracellular polymer)의 제조방법을 나타낸다.
도 2는 고등진균 21개 타입의 균사체 액체배양물로부터 얻어진 균체외 고분자물질의 항-컴플리멘트 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 합성배지와 함께 공기-주입 발효기내에서 동충하초(Cordyceps militaris) 균사체의 성장곡선과 이로부터 얻어진 균체외 고분자물질의 생산을 나타낸다.
본 발명은 합성배지에 21개 타입의 고등진균을 배양하고 이들 배양물로부터 얻은 균체외 고분자물질의 항-컴플리멘트 활성을 측정하는 단계; 상기 항-컴플리멘트 측정시 가장 높은 활성을 나타낸 동충하초(Cordyceps militaris) 균사체의 성장을 조사하면서 이들의 액체배양물로부터 얻어지는 균체외 고분자물질의 생산을 조사하는 단계; 상기 Cordyceps militaris 균사체의 액체배양물로부터 얻은 균체외 고분자물질의 당과 아미노산 조성을 분석하는 단계 및; 상기 균체외 고분자물질의 혈중지질 강하효과를 조사하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 사용한 고등 진균의 21개 타입은 주로 대한민국 경북 지역으로부터 수집하거나 시드니 대학 미생물학과의 K.Y.Cho로부터 기부받았다. 모든 유기물들은 감자 덱스트로스 아가(Difco) 배지내에서 보존하였고 저장은 4℃에서 매 3개월마다에 서브배양하였다.
실시예 1: 고등진균 균사체의 액체배양과 배양물로부터 균체외 고분자물질 추출
본 실시예에서 균사체 성장을 위헤 사용한 합성 배지의 조성은 갈락토스 1g/L, 슈크로스 9g/L, 크실로스 1g/L, 글루코스 9g/L, 이스트 추출물 0.5g/L, 펩톤 2g/L, 감자 덱스트로스 배지 2g/L, NH4H2PO40.5g/L, DL-세린 0.5g/L, KH2PO41g/L, CaCl20.6g/L, MgSO4·7H2O, FeSO4·7H2O 0.02g/L, MnSO4·5H2O 0.02g/L 및 티아민 HCl×10-3g/L로 하였고 pH는 4.5를 유지시켰다. 액체배양된 균사체 배양물은 회전 교반기상의 배지 200mL을 함유하는 500mL 플라스크내에 담아 공기흐름비율이 1.0vvm, 온도 20℃ 및 pH가 6.0인 5L 공기 주입 발효기내로 옮겼다. 배양브로스를 원심분리(10,447× g/20 min)하여 수확하였고 상청액은 도 1에서 보여주는 바와 같이 균체외 고분자물질을 에탄올로 처리하여 수집하였다.
실험예 1: 항-컴플리멘트 활성 측정
본 실험예에서 항-컴플리멘트 활성은 컴플리멘트 소모에 기초한 컴플리멘트 고정 테스트와 잔기 컴플리멘트에 의해 용해되는 적혈세포양으로 측정하였다. 정상 사람혈청은 건강한 성인으로부터 얻었다. 균체외 고분자물질의 수용액(1,000㎍/mL) 50㎕를 500㎍ Mg++및 150㎍ Ca++을 함유하는 GVB++및 같은 양의 정상 인간혈청과 혼합하였다. 혼합물은 30분동안 37℃에서 배양하였고 잔기의 전체 용혈성 컴플리멘트(TCH50)를 1× 108 cell/mL의 IgM-용혈-민감성 양 적혈구를 사용하여 측정하였다. 정상 사람 혈청은 대조군을 제공하기 위해 물을 GVB++과 함께 혼합하여 배양하였다. 균체외 고분자물질의 항-컴플리멘트 활성은 TCH50대조군의 저해 퍼센트로 나타냈다. 즉, 항-컴플리멘트 활성(ITCH50) 하기의 식으로 나타냈다.
실험결과, 21개 타입의 고등진균의 배양브로스부터 얻어진 균체외 고분자물질의 항-컴플리멘트 활성은 도 2에 나타낸 바와 같았으며 액체 배양된 균사체로부터 생산된 균체외 고분자물질들 중 테스트된 C.militaris는 가장 높은 활성을 나타냈고(69.0%)를 나타냈고 그 다음이 P.ostreatus(63.7%), T.suaveolens(61.4%)를 나타냈다. 균사체 배양물로부터 얻어진 균체내 고분자물질은 일반적으로 낮은 항-컴플리멘트 활성을 나타냈다. 예를들면, Corious vesicolor(29.3%), Armillariella mellea(37.1%) 그리고 Lentinus edodes(31.3%)를 나타냈다.
실험예 2: 액체 배양된 Cordyceps militaris 균사체의 성장과 균체외 고분자물질의 생산
상기 실험예 1에서 가장 높은 항-컴플리멘트 활성을 나타낸 Cordyceps militaris의 성장과 균사체 성장에 따른 균체외 고분자물질의 생산관계를 그래프로 나타냈다. 실험결과, 도 3에 나타낸 바와 같으며 합성 배지내의 액체배양된 배양물의 균사체 성장 비율과 생중량 배가시간은 5L 공기주입 발효기내에서 각각 0.0255h-1과 27.2시간이였다. C.militars의 배양브로스로부터 얻어진 균체외 고분자물질의 생산량은 배양 브로스의 건조중량/mL으로 2.95mg이였다. 균사체 성장은 12일에 최대였는데 균체외 고분자물질 생산은 14일에 최대였다.
실험예 3: Cordyceps militaris 균사체 액체배양물로부터 얻은 균체외 고분자물질의 아미노산 및 당 분석
Cordyceps militaris 균사체의 액체배양물로부터 얻은 균체외 고분자물질을 건조시킨 후 봉합 튜브내에서 2M 트리플루오로아세트산(TFA)으로 24시간동안 121℃로 가수분해하였고 아미노산분석을 위해 상기 가수분해물의 2M TFA를 증발시켜 제거하였다. 아미노산 조성을 Pharmacia Biochrom 20 아미노산 분석기를 사용해 분석하였고 분석조건은 하기 표 1과 같다. 또 당분석은 상기 균체외 고분자물질을 가수분해하고 Jones과 Albersheim의 방법에 따라 아세틸화한 후 당분석하였다. 당조성물은 표 2에 조건에 따라 HPLC를 행하여 분석하였다.
준비장치 | Pharmacia Biochrom 20 아미노산 분석기 |
컬럼 | 고성능 4.5mm × 200mmL |
이온교환레진 | No 3906 |
용출비 | 버퍼용액: 0.58μL/min닌히드린 0.41μL/min |
분석반복시간 | 45분 |
칼럼 압력 | 56.1kgf/cm2 |
닌히드린 압력 | 12.24kgf/cm2 |
칼럼온도 | 48 ~ 89℃ 구배 |
반응코일온도 | 135℃ |
파장 | 440nm, 570nm |
준비장치 | Varian STAR 9040 |
검출기 | Refractive Index |
컬럼 | 스테인레스 칼럼(L: 300mm, ID: 6.5mm) |
칼럼 팩킹물질 | IC6020 |
컬럼온도 | 85℃ |
컬럼압력 | 56.1kgf/cm2 |
이동상 | DDI H2O |
용출비 | 0.7mL/min |
주입부피 | 20μL |
실험결과, Cordyceps militaris 균사체의 액체배양물로부터 얻은 균체외 고분자물질은 15종의 아미노산을 함유하였다. 즉, 표 3에 나타낸 바와 같이 아스파르트산 6.6%, 쓰레오닌 0.8%, 세린 2.0%, 글루타민산 2.0%, 프롤린 2.4%, 글리신 5.6%, 알라닌 1.3%, 시스테인 5.6%, 발린 9.7%, 메티오닌 5.0%, 이소로이신 5.9%, 로이신 2.7%, 티로신 38.3%, 히스티딘 5.6%, 리신 6.7%을 함유하였다. 당분석 결과는 주로 다량의 갈락토오스(87.2%) 그리고 적은 양의 글루코스(9.3%) 및 아라비노스(3.5%)로 구성되었다. 따라서 균체외 고분자물질은 당과 아미노산으로 구성된 글리코펩타이드임을 알 수 있었다.
아미노산 | 조성(%) | 당 | 조성(%) |
아스파르트산 | 6.566 | 글루코스 | 9.283 |
쓰레오닌 | 0.804 | 갈락토스 | 87.255 |
세린 | 2.001 | 아라비노스 | 3.463 |
글루타민산 | 1.994 | ||
프롤린 | 2.373 | ||
글리신 | 5.626 | ||
알라닌 | 1.295 | ||
시스테인 | 5.570 | ||
발린 | 9.671 | ||
메티오닌 | 4.929 | ||
이소로이신 | 5.943 | ||
로이신 | 2.691 | ||
티로신 | 38.269 | ||
히스티딘 | 5.559 | ||
리신 | 6.697 |
실험예 4: Cordyceps militaris 균사체의 액체배양물로부터 생산된 균체외 고분자물질의 혈중 지질강하효과 조사
본 실험에서는 스프라그-도레이(sprague-dawley)계 수컷을 사용하였다. 먼저 실험동물을 1주간 사육실에서 적응시키고 적응 기간동안 물과 사료는 충분히 공급하였다. 적응기간을 거친 후 6마리씩 2군으로 나누어 아파트식 사육상자에 각 1마리씩 넣어 2주간 식이 적응기간을 가진 뒤 실험을 실시하였다. 식이적응기간에는 고지방식이와 물을 충분히 섭취시켜 고지혈증을 유발시켰으며 본 실험 2주 동안은 경구투여하였다. 경구투여는 50mg/kg(B.W)의 도즈(dose)로 매일 동일한 시간에 실시하고, 이때 샘플 섭취효율을 증가시키기 위해 공복시에 투여하며 대조군은 동일한 스트레스를 부여시키기 위해 동량의 생리식염수를 경구투여하였다. 실험동물은 생리식염수를 경구투여하는 대조군과 Cordyceps militaris 균사체의 액체배양물로부터 생산된 균체외 고분자물질 경구투여군으로 나누었고 기초식이 조성은 하기 표 4와 같다. 실험사육 기간중 3일 간격으로 오후의 일정한 시간에 체중을 측정하고 식이섭취량 또한 2일 간격으로 잔류식이량을 측정하므로써 산출하여 중량을 표시하였다. 실험 사육 2주 동안 매일 동일한 시간에 경구투여를 실시하였으며 최종일에는 9시간 절식시키고 물만 공급하였다. 혈액은 에테르 마취를 통해 동맥으로 재취하고 빙수 중에 방치한 후 2500rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 취하여 본 실험에 사용하였다. 실제 분석에 있어서, 혈청중의 총콜레스테롤 농도는 총콜레스테롤 측정용 키트시약(ASAN), HDL-콜레스테롤 농도는 HDL-콜레스테롤 측정용 키트시약(ASAN)을 사용하였다. 실험결과, 표 5에 나타낸 바와 같이 2주 후 Cordyceps militaris 균사체의 액체배양물로부터 생산된 균체외 고분자물질을 경구투여한 동물군이 대조군보다 전체 콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤 양이 감소한 것으로 나타났다.
성 분 | 조 성(%) |
카제인 | 20.00 |
덱스트린 | 10.00 |
슈크로스 | 50.00 |
라드 | 9.00 |
소이빈 오일 | 6.52 |
미네랄 복합체 | 4.00 |
비타민 복합체 | 0.04 |
콜레스테롤 | 0.40 |
α-셀룰로스 | 0.04 |
[주]*AIN-76TM |
그 룹 | 전체 콜레스테롤(mg/dL) | HDL-콜레스테롤(mg/dL) |
대 조 군 | 109.5±23.0 | 18.6±2.3 |
Cordyceps militaris균체외 고분자물질 | 88.1±18.2 | 17.3±4.4 |
[주] 평균 값±6마리 랫트의 S.E |
본 발명은 상기 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이 고등진균 21개 타입의 균사체를 액체배양한 배양물로부터 추출한 균체외 고분자물질중 가장 높은 항-컴플리멘트활성을 나타내는 Cordyceps militaris 균사체의 액체배양물로부터 균체외 고분자물질을 분리하여 당 및 아미노산을 분석하였고 이들 균체외 고분자물질은 혈중 지질 강하효과를 나타내는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (3)
- 동충하초(Cordyceps militaris) 균사체의 액체배양물로부터 얻은 항-컴플리멘트 활성을 나타내는 균체외 고분자물질.
- 동충하초(Cordyceps militaris) 균사체의 액체배양물을 원심분리한 후 에탄올 처리하여 얻음을 특징으로 하는 항-컴플리멘트 활성을 나타내는 균체외 고분자물질 생산방법.
- 제 1항 기재의 균체외 고분자물질의 혈중지질강하제로서의 용도.
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KR10-1998-0053269A KR100344272B1 (ko) | 1998-12-05 | 1998-12-05 | 동충하초균사체 액체배양물로부터 균체외 고분자물질의 제조방법 및 그 용도 |
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Cited By (2)
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KR100729213B1 (ko) * | 2005-07-29 | 2007-06-19 | 주식회사 라이벌코리아 | 면역 증강 활성을 갖는 잎새 버섯의 액체배양물로부터분리한 세포외 생체고분자 |
KR100754821B1 (ko) * | 2006-03-13 | 2007-09-03 | 학교법인 영광학원 | 벌 동충하초 j―201 균주의 균사체와 그 세포외 다당체의대량 생산방법 |
-
1998
- 1998-12-05 KR KR10-1998-0053269A patent/KR100344272B1/ko not_active IP Right Cessation
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