DE10392697B4 - Extrakt von Peptid-verknüpften Glucanen und Peptid-verknüpfte Clucane mit nachweisbarer oraler Resorbierbarkeit aus Coriolus Versicolor und deren Reinigungsverfahren und Verwendungen - Google Patents

Extrakt von Peptid-verknüpften Glucanen und Peptid-verknüpfte Clucane mit nachweisbarer oraler Resorbierbarkeit aus Coriolus Versicolor und deren Reinigungsverfahren und Verwendungen Download PDF

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Abstract

Gereinigter Extrakt von Coriolus versicolor, enthaltend mindestens ein Peptid-verknüpftes Glucan, das durch eine (1→3)-Bindung verknüpfte Glucosemoleküle umfasst, ein durchschnittliches Molekulargewicht von 0,7 kDa bis 3 kDa, bestimmt durch Größenausschluss-Chromatografie aufweist und immunstimulierende Aktivität hat.

Description

  • VERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
  • Diese Anmeldung ist eine PCT-Anmeldung auf Basis der US provisional Application Nr. 60/383,339, angemeldet am 22. Mai 2002 und einer regulären US-Patentanmeldung Nr. 10/236,996, angemeldet am 6. September 2002.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Wichtigkeit einzelner Komponenten mit immunologischer Funktion für die natürliche Abwehr des Wirtsorganismus wurde am deutlichsten aufgedeckt, wenn isolierte Defizite zu einer klinischen Erkrankung führten. Da nun solche Abnormitäten mit Hilfe von neuen Labormethoden wirksam nachgewiesen und definiert werden können, werden Immunmangel-Erkrankungen mit steigender Häufigkeit entdeckt. Immunmangel-Erkrankungen müssen in zwei Hauptkategorien berücksichtigt werden: die primäre Immundefizienz, die häufig genetisch bestimmt ist, und der Zustand einer sekundären Immundefizienz. Die Letztere tritt als Komplikation von Infektionen und Parasitenbefall, gastrointestinalen Störungen, Mangelernährung, Alter, malignen Erkrankungen des Lymphsystems, anderen Krebsarten und vielen anderen Erkrankungen auf. Immundefizienz mit variierendem Schweregrad wird auch als Nebenwirkung von vielen Behandlungsmodalitäten angetroffen, einschließlich Strahlungstherapie und Chemotherapie für Krebs. Von diesem Standpunkt sind primäre und sekundäre Immundefizienz keine seltenen Krankheiten. Diese Probleme erforderten eine Suche nach neuen therapeutischen Mitteln, welche die Eigenschaft der Immunpotenzierung (Potenzierung der Immunantwort) haben.
  • Die Entdeckung, dass das Immunsystem an der Pathogenese einer immer noch steigenden Anzahl von Krankheiten teilnimmt, hat unvermeidlich zu Versuchen geführt, den Verlauf dieser Krankheiten zu modifizieren, indem die verschiedenen Elemente des immunologischen Mechanismus manipuliert werden. Die Stimulierung des Immunsystems ist unverändert die Wahl für die Linderung des Immunmangelzustands. Diese Methode, für die mehrere Sätze potenter Mittel (d. h. Bacillus Calmette-Guerin, Endotoxine) zur Zeit verfügbar sind, ist in zwei therapeutischen Hauptbereichen der Medizin – Krebs und Infektionskrankheiten – besonders vielversprechend.
  • Nach dem Konzept der Immunüberwachung beseitigt das Immunsystem maligne Zellen, wenn diese auftreten. Es wurde über die Rolle von T-Zellen und in jüngerer Zeit von Makrophagen, natürlichen Killerzellen gegen Krebs, berichtet. Selbst wenn die Antitumor-Immunantwort nicht prinzipiell an der Kontrolle des Tumorwachstums beseitigt ist, ist es außerdem wahrscheinlich, dass eine geeignete Immunstimulierung eine wirksame Immunantwort hervorrufen könnte oder eine sonst unwirksame Antwort effektiv machen kann. Alle diese Betrachtungen haben die Anwendung der Immunstimulierung bei der Behandlung von Krebs als zusätzliche Methode zu der Operation, Radiotherapie oder Chemotherapie gerechtfertigte.
  • Immunstimulanzien wurden außerdem in Tiermodellen in weitem Umfang bei Infektionskrankheiten untersucht. Patienten, die ein erkanntes Problem der Immundefizienz zeigen und häufig Infektionen mit opportunistischen Mikroben zeigen, sollten theoretisch Nutzen durch die Immuntherapie haben. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass auch Infektionen, die nicht offensichtlich mit Immunmangel verbunden sind, mit immunpotenzierenden Mitteln behandelt werden können, da eine Verstärkung einer immunologischen Antwort dazu helfen kann, ein besonders virulentes Mittel, welches die normale physiologische Antwort unterdrückt, zu beseitigen. Außerdem sollte der Fall von alternden Patienten besonders beachtet werden, die häufig schlecht auf eine Zahl von Vakzinen (z. B. Influenza) ansprechen.
  • EP 0725077 A1 und EP 0295962 A2 offenbaren jeweils gereinigte Extrakte von Coriolis versicolor, die Peptid-verknüpftes Glucan mit (1→3)verknüpften Glucosemolekülen, einem Molekulargewicht von 5 kDa und immunstimulierender Aktivität enthalten.
  • KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In einem Aspekt stellt die Erfindung einen gereinigten Extrakt von Coriolus versicolor bereit, der mindestens ein Peptid-verknüpftes Glucan bereit, das durch eine (1→3)-Verknüpfung verbundene Glucosemoleküle enthält, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 0,7 kDa bis 3 kDa, bestimmt durch Größenausschluss-Chromatografie und das immunstimulierende Aktivität hat. Gemäß einem anderen Aspekt wird durch die Erfindung ein isoliertes Peptid-verknüpftes Glucan von Coriolus versicolor zur Verfügung gestellt, das zahlreiche Glucosemoleküle, die durch eine (1→3)-Verknüpfung verknüpft sind, enthält, ein Molekulargewicht von 0,7 kDa bis 3,0 kDa, bestimmt durch Größenausschluss-Chromatografie aufweist, und wobei das isolierte Peptidverknüpfte Glucan immunstimulierende Aktivität hat. Die Erfindung stellt außerdem pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die ein isoliertes Peptid-verknüpftes Glucan von Coriolus versicolor enthalten.
  • Gemäß einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung Verfahren zur Reinigung eines Peptid-verknüpften Glucans von Coriolus versicolor zur Verfügung, welches folgende Stufen umfasst: Behandeln von Coriolus versicolor mit Alkali und Abtrennen eines Überstands, Behandeln des Überstands durch Kationenaustausch, Unterwerfen des Eluats aus dem Kationenaustausch einem Anionenaustausch, Behandeln des Eluats aus dem Anionenaustausch mit Hilfe einer Größenfraktionierungstechnik und Gewinnen einer Fraktion, die Peptid-verknüpftes Glucan mit einem Molekulargewicht von 0,7 bis 3 kDa enthält.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß die Verwendung eines Extrakts oder gereinigten Peptid-verknüpften Glucans gemäß den Ansprüchen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten bereitgestellt, der eine Stimulierung des Immunsystems benötigt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Fließschema, welches die in dem Protokoll zur Herstellung des CV-Rohextrakts angewendeten Stufen zeigt.
  • 2A und 2B. 2A ist ein Größenausschluss-Chromatogramm, welches das Elutionsprofil der Proteinkomponente des CV-Rohextrakts zeigt. 2B ist ein Größenausschluss-Chromatogramm des CV-Rohextrakts, welches das Elutionsprofil der Kohlenhydrat-Komponente des CV-Rohextrakts zeigt.
  • 3 veranschaulicht die Vermehrung von lebensfähigen Maus-Splenozyten, die mit CV-Rohextrakt oder Concanavalin A (Con A) in vitro kontaktiert wurden.
  • 4 verdeutlicht die wachstumsfördernde Wirkung des Kontakts von isolierten Maus-Knochenmarkzellen mit CV-Rohextrakt oder LPS in vitro.
  • 5 verdeutlicht die erhöhte Ausscheidung von Stickstoffoxid durch Maus-Bauchfell-Makrophagen, die in vitro mit CV-Rohextrakt oder LPS kontaktiert wurden.
  • 6A und 6B. 6A veranschaulicht den in vivo-Ef-fekt auf lebende Splenozyten der Maus, die mit CV-Rohextrakt bei i. p.-Verabreichung (3-tägiges Dosierschema) behandelt wurden. 6B verdeutlicht den ex vivo-vermehrungsfördernden Effekt auf lebende Knochenmarkzellen der Maus, die mit CV-Rohextrakt behandelt wurden, der i. p. (3-tägiges Dosierschema) verabreicht wurde.
  • 7A und 7B. 7A veranschaulicht den in vivo-Ef-fekt auf lebende Splenozyten von normalen Mäusen, die mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt behandelt wurden (7-tägiges Dosierschema). 7B zeigt den ex vivo-wachstumsfördernden Effekt auf lebende Knochenmarkzellen von normalen Mäusen, die mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt (7-tägiges Dosierschema) behandelt wurden.
  • 8A, 8B und 8C. 8A verdeutlicht den in vivo-Effekt auf lebende Splenozyten und auf lebende Knochenmarkzellen von immun-geschädigten Mäusen, die mit i. p. (3-tägiges Dosierschema) verabreichten CV-Rohextrakt behandelt wurden. 8B verdeutlicht den in vivo-Effekt auf lebende Splenozyten und auf lebende Knochenmarkzellen von immun-geschädigten Mäusen, die mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt (7-tägiges Dosierschema) behandelt wurden. 8C verdeutlicht den in vivo-Effekt auf lebende Splenozyten und auf lebende Knochenmarkzellen von schwer immun-geschädigten Mäusen, die mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt (7-tägiges Dosierschema) behandelt wurden.
  • 9A, 9B und 9C. 9A verdeutlicht den in vivo-Effekt auf lebende Splenozyten und Knochenmarkzellen von schwer immun-geschädigten Mäusen, die mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt (14-tägiges Dosierschema) behandelt wurden. 9B verdeutlicht den ex vivo-vermehrungsfördernden Effekt auf lebende Splenozyten von schwer immun-geschädigten Mäusen, die mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt (14-tägiges Dosierschema) behandelt wurden. 9C verdeutlicht den ex vivo- wachstumsfördernden Effekt auf lebende Knochenmarkzellen von schwer immun-geschädigten Mäusen, die oral mit CV-Rohextrakt (14-tägiges Dosierschema) behandelt wurden.
  • 10 veranschaulicht den in vivo-Effekt auf lebende Splenozyten und Knochenmarkzellen von immun-geschädigten Mäusen, die mit verschiedenen Dosierungen von CV-Rohextrakt bei oraler Verabreichung (7-tägiges Dosierschema) behandelt wurden.
  • 11 veranschaulicht Ohrmessungen für normale Mäuse, an Immunsuppression und an schwerer Immunsuppression leidende Mäuse, die mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt behandelt wurden und dann 2,4-Dinitro-1-fluorbenzol (DNFB) ausgesetzt wurden.
  • 12A, 12B und 12C. 12A veranschaulicht den in vivo-Effekt auf lebende Splenozyten und Knochenmarkzellen von normalen Mäusen, die mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt (30-tägiges Dosierschema) behandelt wurden. 12B veranschaulicht den ex vivo-vermehrenden Effekt auf lebende Splenozyten der normalen Maus, die mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt (30-tägiges Dosierschema) behandelt wurde. 12C verdeutlicht den ex vivo-vermehrenden Effekt auf lebende Knochenmarkzellen von normalen Mäusen, die mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt (30-tägiges Dosierschema) behandelt wurden.
  • 13 veranschaulicht die Vermehrung von lebenden Maus-Splenozyten, die mit CV-Rohextrakt, CV-D2, CV-D3, CV-D4 und CV-D5 in vitro kontaktiert wurden.
  • 14 verdeutlicht die erhöhte Ausscheidung von Stickstoffoxid durch Bauchfell-Makrophagen der Maus, die mit CV-Rohextrakt, CV-E8, CV-E6, CV-E4, CV-E2 und CV-E0 in vitro kontaktiert wurden.
  • 15 ist ein Fließschema, welches die Stufen zeigt, die in einem Protokoll zur weiteren Reinigung der aktiven Komponenten in dem CV-Rohextrakt der 1 angewendet wurden.
  • 16 verdeutlicht den Zusammenhang der Zusammensetzung der grundlegenden Struktureinheiten (Neutralzucker, Uronsäure und Protein/Peptid) der CV-Fraktion mit den mitogenen Aktivitäten in vitro.
  • 17 zeigt die in vitro-stimulierenden Aktivitäten von drei aktiven, partiell gereinigten CV-Fraktionen, nämlich C1D5E8, C1D5E7 und C1D5EX, auf die Ausscheidung von Stickstoffoxid durch Bauchfell-Makrophagen der Maus.
  • 18A und 18B. 18A ist ein Chromatogramm, welches die Molekulargewichtsverteilung von CV-Rohextrakt veranschaulicht. 18B ist ein Chromatogramm, welches die Molekulargewichtsverteilung von Komponenten des CV-Rohextrakts zeigt, welche die Caco-2-Zellen-Monoschicht durchdringen.
  • 19A und 19B. 19A ist ein Chromatogramm, das die Molekulargewichtsverteilung eines partiell gereinigten CV-Extrakts, C1D5E8, zeigt. 19B ist ein Chromatogramm, das die Molekulargewichtsverteilung von Komponenten von C1D5E8-Extrakt zeigt, welche die Caco-2-Zellen-Monoschicht durchdringen.
  • 20A und 20B. 20A ist ein Chromatogramm, das die Molekulargewichtsverteilung eines partiell gereinigten CV-Extrakts, C1D5E7, zeigt. 20B ist ein Chromatogramm, das die Molekulargewichtsverteilung der Komponenten von C1D5E7-Extrakt zeigt, die die Caco-2-Zellen-Monoschicht durchdringen.
  • 21A und 21B. 21A ist ein Chromatogramm, das die Molekulargewichtsverteilung eines partiell gereinigten CV-Extrakts, C1D5EX, zeigt. 21B ist ein Chromatogramm, das die Molekulargewichtsverteilung von Komponenten des C1D5EX- Extrakts zeigt, welche die Caco-2-Zellen-Monoschicht durchdringen.
  • 22 verdeutlicht den in vitro-Effekt auf die Ausscheidung von Stickstoffoxid durch Bauchfell-Makrophagen der Maus, die mit den die Caco-2-Zellen-Monoschicht durchdringenden Komponenten von partiell gereinigten CV-Extrakten oder mit LPS kontaktiert wurden.
  • 23A und 23B. 23A verdeutlicht den in vivo-Effekt auf lebende Splenozyten von immun-geschädigten Mäusen, die mit i. p. verabreichtem partiell gereinigten CV-Extrakt (3-tägiges Dosierschema) behandelt wurden. 23B veranschaulicht den in vivo-Effekt auf lebende Knochenmarkzellen von immun-geschädigten Mäusen, die mit i. p. verabreichtem partiell gereinigten CV-Extrakt (3-tägiges Dosierschema) behandelt wurden.
  • 24A und 24B 24A veranschaulicht den in vivo-Effekt auf lebende Splenozyten von immun-geschädigten Mäusen, die mit oral verabreichtem partiell gereinigten CV-Extrakt (7-tägiges Dosierschema) behandelt wurden. 24B verdeutlicht den in vivo-Effekt auf lebende Knochenmarkzellen von immungeschädigten Mäusen, die mit oral verabreichtem partiell gereinigten CV-Extrakt (7-tägiges Dosierschema) behandelt wurden.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • I. Definitionen
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Bezeichnungen nachstehend definiert:
  • ”Immunstimulanzien”, ”immunstimulierende Mittel” und ”immunmodulierende Mittel”, wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf ein Mittel, welches eine Immunantwort induziert.
  • ”Immunogen” bezieht sich auf ein Mittel oder eine Substanz mit der Fähigkeit, eine Immunantwort hervorzurufen oder Immunität zu erzeugen.
  • ”Immunogenität” bezieht sich auf die Fähigkeit eines Immunogens, eine Immunantwort zu induzieren.
  • ”Immundefizienz (Immunmangel)” bezieht sich auf jede Defizienz der Fähigkeit, immunologisch zu antworten, wie durch mangelnde Ausbildung der humoralen oder zellvermittelten Immunität.
  • ”Immunkompetenz” bezieht sich auf die Fähigkeit, immunologisch auf ein Antigen oder Immunogen zu antworten.
  • ”Nicht-spezifische Immunität” bezieht sich auf die Widerstandsfähigkeit gegen das Eindringen von Pathogen als Resultat irgendeines Mechanismus, der verschieden von der Bildung von Antikörpern und der Erzeugung von spezifisch-antigenreaktiven Lymphozyten ist.
  • ”Peptid” bezieht sich auf beliebige Substanzen, die aus Aminosäureresten, die durch Amidbindungen verbunden sind, bestehen.
  • ”Polysaccharid” bezieht sich auf eine Klasse von Kohlenhydraten, in denen die Moleküle durch Polymerisation von Monosaccharid-Untereinheiten resultieren. Ein Polysaccharid enthält gewöhnlich 5 oder mehr Monosaccharid-Untereinheiten, die miteinander durch glykosidische Verknüpfungen verbunden sind.
  • ”Glucan” bezieht sich auf ein aus Glucose bestehendes Polysaccharid.
  • Die Bezeichnung ”immunvermittelt (immun-mediated)” bezieht sich auf einen Vorgang, der entweder autoimmuner oder entzündlicher Natur ist.
  • Eine aktive Komponente eines Extrakts oder einer Zusammensetzung ist eine solche, welche das Immunsystem stimuliert.
  • Die Bezeichnung ”Leukozyt” bedeutet eine weiße Blutzelle. Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen sind Beispiele für Leukozyten.
  • Die Bezeichnung ”Lymphozyt” bezieht sich auf einen einkernigen Leukozyten, der humorale oder zelluläre Immunität vermittelt.
  • Die Bezeichnung ”Monozyt” bezieht sich auf einen einkernigen phagozytischen Leukozyt, der kurze Zeit im Blutstrom zirkuliert, bevor er in die Gewebe wandert, wo er zu einem Makrophagen wird.
  • ”T-Zelle” bezieht sich auf einen Lymphozyten, der im Thymus reift und einen T-Zellrezeptor, CD3 und CD4 oder CD8 exprimiert. Es existieren einige anerkannte T-Zell-Subpopulationen.
  • ”Patient” umfasst Menschen und andere Säuger, die entweder eine prophylaktische oder therapeutische Behandlung erhalten.
  • Die Bezeichnung ”isoliert”, ”gereinigt” oder ”im Wesentlichen rein” bedeutet ein Objekt, das angereichert oder von den Komponenten in seiner nativen Umgebung abgetrennt wurde. So ist ein Peptid-verknüpftes Glucan in einem Extrakt isoliert, obwohl es zusammen mit anderen Peptid-verknüpften Glucanen oder anderen Zellbestandteilen vorhanden sein kann. Die Bezeichnung kann auch anzeigen, dass eine betreffende Spezies die vorherrschende vorhandene makromolekulare Spezies ist (d. h. auf molarer Basis ist sie überwiegend gegenüber anderen einzelnen Spezies in der Zusammensetzung) und vorzugsweise umfasst die betreffende Spezies mindestens etwa 50 Prozent (auf molarer Basis) aller anwesenden makromolekularen Spezies. Im Allgemeinen umfasst eine isolierte, gereinigte oder im Wesentlichen reine Zusammensetzung mehr als 80 bis 90 Prozent aller in einer Zusammensetzung vorhandenen makromolekularen Spezies. Stärker bevorzugt ist die betreffende Spezies bis zur wesentlichen Homogenität gereinigt (d. h. verunreinigende Spezies können in der Zusammensetzung durch konventionelle Nachweismethoden nicht nachgewiesen werden), wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen aus einer einzigen makromolekularen Spezies besteht.
  • Alle quantitativen Werte schließen eine Fehlergrenze ein, die den typischen Versuchsfehler bei der Messung der Menge darstellt.
  • II. Allgemeines
  • Die vorliegende Erfindung stellt gereinigte Extrakte von Coriolus versicolor (CV), Verfahren zur Reinigung dieser und Verfahren zur Anwendung dieser zur Stimulierung der Immunantwort zur Verfügung. Die aktiven Komponenten der gereinigten Extrakte gemäß der Erfindung sind ein oder mehr Peptid-verknüpfte Glucane mit niederem Molekulargewicht (0,7 kDa bis 3 kDa). Die Peptidverknüpften Glucane bewahren die immunstimulierenden Eigenschaften von CV-Rohextrakten, die in weitem Umfang in der Chinesischen Gesellschaft als Mittel zum Verbessern der Gesundheit und zur Verlängerung des Lebens bei regelmäßigem Gebrauch gefördert wurden. In jüngerer Zeit wurden traditionelle Extrakte üblicherweise zur Behandlung der allgemeinen Immunschwäche und von Tumoren verwendet. Eine signifikante Verbesserung sowohl des Immunstatus als auch des Gesundheitsstatus wurde bei Krebspatienten, die durch Operation, Chemotherapie und/oder Radiotherapie behandelt wurden, beobachtet, nachdem traditioneller CV-Extrakt während längerer Zeit oral verabreicht wurde.
  • Der Extrakt und die Peptid-verknüpften Glucane gemäß der Erfindung sind nützlich zur Stimulierung von Immunantworten in Patienten und in vitro in gleicher Weise wie rohere Extrakte von CV, wie sie in der Chinesischen Medizin traditionell praktisch angewendet wurden. Außerdem gibt die vorliegende Anmeldung Daten an, welche anzeigen, dass die erfindungsgemäßen Peptidverknüpften Glucane durch die Darmwand aufgenommen werden können, was die orale Verabreichung wie bei den roheren Extrakten der traditionellen Chinesischen Medizin ermöglicht. Die erfindungsgemäßen Extrakte und Peptid-verknüpften Glucane haben jedoch den Vorteil einer größeren Reinheit, größeren Potenz und/oder größeren Reproduzierbarkeit. Die Extrakte, Peptidverknüpften Glucane dieser gemäß der Erfindung können auch noch für eine weitere Isolierung verwendet werden. So lassen beispielsweise die in den Beispielen gezeigten Daten die Annahme zu, dass die Peptideinheit(-einheiten) der Peptid-verknüpften Glucane die hauptsächliche immunstimulierende Aktivität haben, obwohl die Glucaneinheit zusätzliche immunstimulierende Aktivität verleihen kann. Somit können die Extrakte und Peptid-verknüpften Glucane verwendet werden, um isolierte Peptide herzustellen.
  • Obwohl das Verständnis der Mechanismen zur praktischen Durchführung der Erfindung nicht erforderlich ist, wird angenommen, dass der Wirkungsmodus offensichtlich die Vermehrung der Lymphozyten und Knochenmarkzellen und die Aktivierung der Makrophagen einschließt.
  • III. Gereinigte Extrakte und Peptid-verknüpfte Glucane der Erfindung
  • Gereinigte Extrakte der Erfindung enthalten mindestens ein Peptid-verknüpftes Glucan mit einem Molekulargewicht von 0,7 kDa bis 3 kDa, bestimmt durch Größenausschluss-Chromatografie. Das mindestens eine Peptid-verknüpfte Glucan hat eine immunstimulierende Aktivität. Die immunstimulierende Aktivität kann durch eine statistisch signifikante Antwort in irgendeinem der nachstehend oder in den Beispielen beschriebenen Tests gemessen werden.
  • Vorzugsweise bestehen die erfindungsgemäßen gereinigten Extrakte aus mindestens 50% der Peptid-verknüpften Glucane mit einem Molekulargewicht von 0,7 kDa bis 3 kDa. Einige gereinigte Extrakte gemäß der Erfindung bestehen aus mindestens 60% an Peptid-verknüpften Glucanen mit einem Molekulargewicht von 0,7 kDa bis 3 kDa. Einige gereinigte Extrakte der Erfindung bestehen aus mindestens 70% an Peptid-verknüpften Glucanen mit einem Molekulargewicht von 0,7 kDa bis 3 kDa. Einige gereinigte Extrakte der Erfindung bestehen aus mindestens 80% an Peptidverknüpften Glucanen mit einem Molekulargewicht von 0,7 kDa bis 3 kDa. Einige gereinigte Extrakte der Erfindung bestehen aus mindestens 85% an Peptid-verknüpften Glucanen mit einem Molekulargewicht von 0,7 kDa bis 3 kDa. Einige gereinigte Extrakte der Erfindung bestehen aus mindestens 90% an Peptidverknüpften Glucanen mit einem Molekulargewicht von 0,7 kDa bis 3 kDa. Einige gereinigte Extrakte der Erfindung bestehen aus mindestens 99% an Peptid-verknüpften Glucanen mit einem Molekulargewicht von 0,7 kDa bis 3 kDa.
  • Die Glucankomponente des Peptid-verknüpften Glucans umfasst Glucosemoleküle, die durch eine 1-3-Bindung verknüpft sind. Einige Extrakte enthalten mehrere Peptid-verknüpfte Glucane, während andere ein einzelnes Peptid-verknüpftes Glucan enthalten. In Extrakten, die mehrere Peptid-verknüpfte Glucane enthalten, kann die Peptideinheit wie auch die Glucaneinheit die gleiche oder verschieden in den verschiedenen Peptid-Glucanen sein.
  • In einigen Extrakten ist das durchschnittliche Molekulargewicht der Peptid-verknüpften Glucane 0,7 kDa oder 1,0 kDa. Molekulargewichte von nicht mehr als 3 kDa sind vorteilhaft, um das Passieren der Darmwand zu gewährleisten. Einige Peptidverknüpfte Glucane der Erfindung sind außerdem durch Löslichkeit in Wasser, Ethanol und Aceton, Unlöslichkeit in Chloroform und Dichloroform und fehlende Hygroskopizität gekennzeichnet.
  • IV. Herstellung von gereinigten Extrakten und Peptidverknüpften Glucanen der Erfindung
  • 1. Herstellung eines aktiven wässerigen Extrakts von Coriolus Versicolor
  • Wie durch das Fließschema in 1 gezeigt ist, kann ein aktiver wässeriger Extrakt von CV aus den getrockneten fruchtbildenden Körpern von CV durch Extraktion der Fruchtkörper mit einem flüssigen Lösungsmittel und Konzentrieren der resultierenden Lösung unter Bildung eines konzentrierten Extrakts hergestellt werden. In einigen Methoden werden getrocknete Fruchtkörper von CV mazeriert, entpigmentiert und in einer verdünnten wässerigen alkalischen Lösung, wie 0,01 n Natriumhydroxidlösung, gekocht. Es kann auch eine andere alkalische Lösung, wie Kaliumhydroxid verwendet werden. Unter der Bedingung des Erhitzens ist die Konzentration dieser alkalischen wässerigen Extraktionsmittel vorzugsweise weniger als 0,1 n, um einen möglichen Verlust der Aktivität zu vermeiden. Nach der Extraktion werden unlösliche Materialien entfernt, beispielsweise durch Filtration, und das verbleibende Produkt wird durch Zentrifugieren oder andere Methoden geklärt. Der geklärte Überstand wird konzentriert und lyophilisiert, bevor er gelagert und verwendet wird.
  • Der lyophilisierte Überstand ist durch einen Peptid-Anteil der Zusammensetzung von etwa 4–6 Gew.-%, vorzugsweise 4,7 Gew.-% (innerhalb des Versuchsfehlers) gemäß der Bestimmung durch einen Bradford-Test, gekennzeichnet. Bevorzugte Extrakte haben den Anteil einer Glucoseverbindung von 50–60 Gew.-% (vorzugsweise 55 Gew.-%), bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode. Bevorzugte Extrakte enthalten eine Uronsäure-Verbindung von etwa 4–6 Gew.-%, vorzugsweise etwa 4,8 Gew.-%.
  • 2. Herstellung von gereinigten oder partiell gereinigten aktiven Fraktionen des CV-Extrakts
  • Das Fließschema in 15 zeigt eine beispielhafte Methode zur Herstellung partiell gereinigter Extrakte. Der getrocknete rohe CV-Extrakt wird in Wasser gelöst und die weniger wasserlöslichen Substanzen werden durch Zentrifugieren entfernt. Kationische Substanzen des wasserlöslichen CV-Extrakts bei pH 4 können absorbiert und mit Hilfe eines Kationenaustauscherharzes entfernt werden. Die aktiven Komponenten können dann mit jeder Methode weitergereinigt werden, die selektiv für negativ geladene Moleküle ist. Vorzugsweise wurde das Anionenaustauscherharz DEAE-Cellulose verwendet. Die partiell gereinigten Fraktionen können durch stufenweise ethanolische Fraktionierung oder Gelfiltration, welche Moleküle auf Basis ihrer Molekulargewichte trennt, weiterfraktioniert werden. Der Molekulargewichtsbereich ist 0,7–3 kDa. In einem fünfstufigen Ethanolgradienten wurden aktive Fraktionen aus allen Stufen isoliert, ausgenommen von in 95%igen wässerigen ethanollöslichen Substanzen. Eine weitere Reinigung kann unter Anwendung einiger auf dem Fachgebiet bekannter Standardmethoden, wie Chromatografie, erreicht werden. So kann beispielsweise die Glucaneinheit von Peptid-verknüpften Glucanen von der Peptideinheit durch Behandlung mit einer Peptidase abgetrennt werden. Das Peptid kann von der Glucaneinheit durch Behandlung mit einer Glucanase abgetrennt werden. Fragmente von Peptiden von Peptid-verknüpften Glucanen können durch se lektiven proteolytischen Abbau hergestellt werden. Einzelne Peptid-verknüpfte Glucane können durch Gelelektrophorese, gegebenenfalls in zwei Dimensionen und Ausschneiden von abgetrennten Banden, abgetrennt werden.
  • V. Methoden zum Bestimmen der immunstimulierenden Aktivität von gereinigten Extrakten und aktiven Komponenten
  • Die immunstimulierende Aktivität hat unterschiedliche Wirkungen bei verschiedenen Zelltypen. Wenn unreife Immunzellen durch immunstimulierende Mittel angeregt werden, tritt eine Serie biochemischer Ereignisse ein, einschließlich der verstärkten Synthese von Phospholipiden und der erhöhten Permeabilität für zweiwertige Kationen. Die Synthese von Protein, RNA und schließlich DNA findet kurz danach statt. Es ist die letztere Erscheinung, der Anstieg der DNA-Synthese (die schließlich zur Zellteilung führt), welche die quantitative Basis für die Messung der Aktivierung von Knochenmarkzellen und Lymphozyten bildet. Die DNA-Synthese wird durch radioaktive Markierung der Kulturen mit Tritium-Thymidin (3H-Tdr), einem Nukleosidvorläufer, gemessen, der in neu synthetisierte DNA eingebaut wird. Die Menge von eingebautem 3H-Tdr bezogen auf die Rate der DNA-Synthese wird durch Szintillationszählung bestimmt. Die Szintillationszählung ergibt Daten in Zahlen pro Minute (counts per minutes) (CPM), die gewöhnlich als Standardmaß der mitogenen Ansprechbarkeit verwendet werden. Die CPMs der stimulierten Kultur werden durch CPMs-Werte, die in der Kontrollkultur gemessen werden, normalisiert, wobei ein Verhältnis erhalten wird, welches als Stimulationsindex bezeichnet wird.
  • Effektor-Immunzellen, wie Makrophagen, sind befähigt, zytotoxische Mediatoren (z. B. NO–) und Zytokine (z. B. Interleukine und Gewebenekrosefaktoren) abzuscheiden, wenn sie durch Immunstimulanzien aktiviert werden. Da Makrophagen NO– nur bei immunogener Stimulierung ausscheiden, wird der Anstieg der NO–-Produktion durch Makrophagen gewöhnlich als Methode zur quantitativen Bestimmung der immunstimulierenden Aktivität eines Immunogens verwendet. Während der Inkubation mit den immunstimulierenden Mitteln wird das durch die Makrophagen produzierte hoch reaktive NO– rasch zu dem stabileren Nitrit (NO2 –) oxidiert. Die Menge der Nitritionen in dem Überstand der Kultur kann dann durch die Griess-Reaktion gemessen werden.
  • Die immunstimulierende Aktivität kann auch in in vivo-Modellen der Immunität gemessen werden. Diese Modelle haben den Vorteil die Immunantwort auf der Basis des gesamten Tieres zu integrieren. Vorhandene Modelle zur Bestimmung des in vivo-Effekts auf die Immunität umfassen die Prüfung des Zellanteils (der Zahl der lebenden Bestandteile bildenden Zellen) von wichtigen Immunorganen und die Überempfindlichkeit des verzögerten Typs. Der jüngste Trend in der immunologischen Forschung geht in Richtung eines größeren Gewichts auf die Anwendung von ex vivo-Lymphozyten-vermehrenden Antworten, um die Fähigkeit zur Immunantwort3,4 zu zeigen. Ex vivo-Tests machen sich die Fähigkeit von gezüchteten Lymphozyten zur Vermehrung zunutze, da die in vitro-Vermehrung eine gut erkannte Eigenschaft von Lymphozyten ist und gezeigt hat, dass sie in guter Korrelation zur Wirtsimmunität steht. Am Ende der Arzneimittelbehandlung werden die Tiere getötet, um immunkompetente Zellen zu gewinnen. Die Zellen werden dann während einer gewissen Dauer in vitro gezüchtet und die Aufnahme von Tritiumthymidin durch die Zellen wird geprüft. Obwohl die meisten immunkompetenten Zellen sich vermehren können, wenn sie gezüchtet werden, muss die Vermehrung mit Immunstimulanzien, z. B. Con A und LPS, verstärkt werden, um messbare Werte zu erreichen3.
  • Überempfindlichkeitsreaktionen des verzögerten Typs haben gute Korrelation mit der zellvermittelten Immunität. Die Kon takt-Überempfindlichkeit ist eine Art der Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ. Antigene, im Wesentlichen ein Hapten, wenn dieses auf die Hautoberfläche gegeben wird, wird es aufgenommen, bearbeitet und durch Langerhans-Zellen an T CD4+-Lymphozyten präsentiert, was schließlich zur Gefäßerweiterung und zum Anschwellen des Ohrs führt. Potente Kontakt-Sensibilisatoren, wie Dinitrofluorbenzol (DNFB) werden verwendet, um eine Kontakt-Empfindlichkeitsreaktion bei der Maus zu induzieren, deren Intensität durch Behandeln der Tiere mit Arzneimitteln oder Chemikalien-Behandlung reguliert werden kann. Die Dicke des Ohrs wird unmittelbar vor der Sensibilisierung und 24 Stunden später unter Verwendung einer digitalen Kalibriervorrichtung gemessen. Der Anstieg der Ohrdicke ist ein guter Indikator der Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ3.
  • Die immunstimulierende Aktivität kann auch bei Patienten in klinischen und vorklinischen Untersuchungen gemessen werden, welche anzeigten, dass die Fähigkeit von Immunstimulanzien die klinische Effizienz der konventionellen Krebsbehandlung zu potenzieren, die Immunfunktionen bei einem immun-geschädigten Status wiederherzustellen und die Widerstandsfähigkeit gegen Infektionen zu erhöhen, hauptsächlich auf ihrer nichtspezifischen Stimulierung des immunologischen Abwehrsystems beruht2. Nicht-spezifische Immunität kann durch Antigen, oder direkter, Immunogen verstärkt (”boosted”) werden. Im molekularen Bereich kann Immunogen, welches als antigene Determinanten bezeichnete spezielle Struktureinheiten besitzt, die Oberflächenrezeptoren von bestimmten Immunzellen vernetzen, was zur klonalen Expansion oder Aktivierung führt.
  • Ein Extrakt oder Peptid-verknüpftes Glucan gemäß der Erfindung hat immunstimulierende Aktivität wenn es eine statistisch signifikante Antwort in einem der vorstehenden Nachweise hervorruft. Häufig wird die Antwort auf den Extrakt oder das Peptid-verknüpfte Glucan mit der einer Kontrolle oder eines Placebos verglichen.
  • VI. Intestinale Permeabilität
  • Gereinigte Extrakte, Peptid-verknüpfte Glucane gemäß der Erfindung können auch im Hinblick auf die Durchdringungsfähigkeit durch die Darmwand geprüft werden. Dies ist vorteilhaft für die Ermöglichung einer oralen Verabreichung. Die Prüfung kann unter Verwendung einer Caco-2-Zelllinie, einer gut differenzierten menschlichen intestinalen Zelllinie, die von kolorektalem Karzinom abgeleitet ist, vorgenommen werden, die streng als Ersatz für intestinale Epithelzellen für das Studium von intestinaler Resorption in vitro bestätigt worden ist. Eine gute Übereinstimmung zwischen der biologischen Wirksamkeit im Menschen und dem mit Caco-2-Monoschicht in Transwell®-Insert erhaltenen Permeabilitäts-Ergebnissen wurde bestätigt. Die Molekulargewichtsverteilung und Immunogenität der Komponenten, die zum Transport durch die Caco-2-Monoschicht befähigt sind, kann durch Größenausschluss-Chromatografie und die vorstehend beschriebenen biologischen Prüfungen charakterisiert werden5, 6. Die Permeabilität kann außerdem in in vivo-Tiermodellen gemessen werden.
  • VII. In vitro-Methoden für zelluläre Antwort
  • CV-Extrakt oder Peptid-verknüpftes Glucan können in zahlreichen in vitro- oder ex vivo-Methoden verwendet werden. In einigen Methoden werden die zellulären Antworten auf diese Mittel analysiert, um Information dafür zu ergeben, die Dosierungen dieser Mittel in vivo zu optimieren. In einigen Methoden werden CV-Extrakt oder Peptid-verknüpftes Glucan als positive Kontrolle verwendet, um andere Arzneimittel im Hinblick auf ihre Wirkungen auf die Vermehrung von Splenozyten oder Knochenmarkzellen oder die Makrophagen-Sekretion zu prüfen. Wenn die positive Kontrolle die Vermehrung der Splenozyten oder Knochenmarkzellen oder die Sekretion der Makrophagen stimuliert, während ein Arzneimittelkandidat dies in einer parallelen Reaktion nicht tut, kann geschlossen werden, dass das Test-Arzneimittel unwirksam ist. Bei anderen Methoden werden sich vermehrende beziehungsweise wachsende PMB's aus einem Patienten mit einer Immunstörung erhalten. Die Lymphozyten werden mit CV-Extrakt oder Peptid-verknüpftem Glucan ex vivo behandelt und dann in den Patienten zurückgeführt. Wie bei anderen Mitteln, die das Immunsystem stimulieren, wie ConA oder LPS können auch CV-Extrakt oder Peptid-verknüpftes Glucan als wissenschaftliche Reagenzien an die Forschungsgemeinschaft geliefert werden, um den aktivierten Zustand von Zellen zu untersuchen oder um als Kontrolle zur Entdeckung anderer Mittel, die das Immunsystem stimulieren, verwendet zu werden.
  • VIII. Für die Behandlung geeignete Patienten
  • Für die Behandlung geeignete Patienten umfassen Personen mit dem Risiko eines Immunmangels, die jedoch noch nicht immundefizient sind, sowie Patienten, die zur Zeit an Immunmangel leiden. Immunmangel führt zu einer erhöhten Empfänglichkeit für opportunistische Infektionen. So haben mit CV-Extrakten oder Peptidverknüpften Glucanen behandelte Patienten verminderte Empfänglichkeit für opportunistische Infektionen.
  • Die Methoden sind speziell geeignet zur Behandlung des sekundären Immunmangels, der als Resultat einer Primärbedingung auftritt. In einigen Störungen kann der sekundäre Immunmangel vorübergehend sein und die Patienten können wieder immunkompetent durch eine geeignete Behandlung der Primärerkrankung werden, z. B. Tuberkulose, Lepra. Unter anderen Bedingungen kann der sekundäre Immunmangel permanent werden, z. B. an geborene Röteln. Daher können die Behandlungsschemata auf Basis der primären Bedingung variiert werden. Verschiedene Erkrankungen sind mit sekundärem Immunmangel verbunden; sekundärer Immunmangel kann als Resultat einer Infektion, einer bösartigen neoplastischen Erkrankung, einer Autoimmunerkrankung, dem Zustand nach Proteinverlust, einer Immunsuppressions-Behandlung, Operation oder Anästhesie auftreten.
  • Infektionen, die zum sekundären Immunmangel führen können, umfassen: Röteln, angeborene Röteln, Masern, Lepra, Tuberkulose, Coccidioidomycose, chronische Infektion, akute Virusinfektion, Zytomegalovirus, Mehrfach-Virusinfektion und wiederholte Virusinfektionen.
  • Bösartige neoplastische Erkrankungen, die zu einem sekundären Immunmangel führen können, umfassen: Hodgkin-Krankheit, akute Leukämie, chronische Leukämie, nicht-lymphoider Krebs und Myelom.
  • Autoimmunerkrankungen, die zum sekundären Immunmangel führen können, umfassen: generalisierter Lupus erythematosus (SLE), rheumatoide Arthritis und chronische aktive Hepatitis.
  • Proteinverlust-Zustände, die zu einem sekundären Immunmangel führen können, umfassen: nephrotisches Syndrom und mit Proteinverlust einhergehende Darmerkrankungen.
  • Immunsuppressive Behandlungen, die zu einem sekundären Immunmangel führen können, umfassen: Corticosteroide, zytotoxische Arzneimittel, Alkylierungsmittel, Antimetabolite, Antithymozyt-Globulin, Strahlung, Cyclosporine, Phenytoin und Penicillamin.
  • Andere Bedingungen, die zum sekundären Immunmangel führen können, umfassen: Diabetes, alkoholische Zirrhose, Mangelernährung, Verbrennungen, Sarkoidosis, Splenektomie, Sichelzell- Krankheit, Urämie, Alterung, subakute sklerosierende Panenkaphalitis, Down's-Syndrom, neugeborene und unreife Babys.
  • IX. Therapeutische Methoden, pharmazeutische Zusammensetzungen und Verabreichungsmethoden
  • A. Therapeutische Methoden
  • Bei der prophylaktischen Anwendung werden pharmazeutische Zusammensetzungen oder Arzneimittel in einer Menge, die ausreicht, um die Entwicklung einer Immunstörung zu verhindern, vermindern oder zu unterbrechen, einem Patienten verabreicht, der empfänglich ist oder ein anderes Risiko hat, eine Immunstörung zu entwickeln. Bei therapeutischen Anwendungen werden Zusammensetzungen oder Arzneimittel in einer Menge, die ausreicht, um die Symptome einer Immunstörung rückzubilden, zu unterbrechen oder mindestens teilweise zu unterbrechen, einem Patienten verabreicht, von dem angenommen wird, dass er eine immunologische Erkrankung entwickelt oder der bereits an dieser Erkrankung leidet. In beiden sowohl bei der prophylaktischen, als auch der therapeutischen Maßnahme werden der Coriolus versicolor-Extrakt oder das Peptid-verknüpfte Glucan gemäß der Erfindung gewöhnlich in mehreren Dosen verabreicht, bis eine ausreichende Antwort erzielt worden ist. Jedoch kann sowohl bei der prophylaktischen, als auch der therapeutischen Maßnahme der Extrakt oder das Peptid-verknüpfte Glucan oder der partiell gereinigte CV-Extrakt der vorliegenden Erfindung in einer einzigen Dosis verabreicht werden, bis eine ausreichende Antwort erzielt worden ist. Typischerweise wird die Behandlung überwacht und es können wiederholte Dosen gegeben werden. Darüber hinaus können die Behandlungsmaßnahmen ähnliche Dosierungen, Verabreichungswege und Häufigkeiten der Verabreichung wie diejenigen anwenden, die zur Behandlung anderer immun-vermittelter Störungen verwendet werden.
  • Die Menge an CV-Extrakt oder Peptid-verknüpftem Glucan, die mit einem Trägermaterial kombiniert werden kann, um eine einzelne Dosierungsform herzustellen, kann in Abhängigkeit von der behandelten Erkrankung, der Säugetierspezies und dem besonderen Modus der Verabreichung variieren. Die ”wirksame Dosis”, ”pharmakologisch geeignete Dosis” oder ”pharmakologisch geeignete Menge” für jeden bestimmten Patienten kann von einer Vielfalt von Faktoren abhängen, einschließlich der Aktivität der verwendeten spezifischen Verbindung, der Spezies, dem Alter, Körpergewicht, der allgemeinen Gesundheit, dem Geschlecht und der Diät des behandelten Patienten, der Zeit und dem Weg der Verabreichung, der Rate des Metabolismus oder der Ausscheidung, anderen Arzneimitteln, die gleichzeitig verabreicht werden oder vorher verabreicht wurden, der Art und dem Schweregrad der immunologischen Erkrankung, dem Schweregrad von Nebenwirkungen, ob der Patient ein Tier oder Mensch ist und dergleichen. Gewöhnlich ist der Patient ein Mensch, jedoch können auch nicht-menschliche Säuger, einschließlich transgene Säugetiere, behandelt werden.
  • Für jeden Extrakt oder jedes Peptid-verknüpfte Glucan, die erfindungsgemäß eingesetzt werden, kann eine wirksame Dosis für den Menschen zuerst anhand von nicht-menschlichen Tiermodellen abgeschätzt werden. Eine wirksame Dosis kann durch einen Arzt unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Parametern bestimmt werden. Im Allgemeinen beginnt die Dosierung mit einer Menge, die etwas weniger als die optimale effektive Dosis beträgt. Die Dosierung wird dann durch geringe Erhöhungen vergrößert, bis eine wirksame Dosierung erreicht ist. (Siehe The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 16. Auflage, § 22, 1992, Berkow, Merck Research Laboratories, Rahway, New Jersey, auf das hier Bezug genommen wird.)
  • Es ist erforderlich, die Dosierungen zu titrieren, um die Sicherheit und Wirksamkeit zu optimieren. Die Toxizität und die therapeutische Wirksamkeit der hier beschriebenen Verbindungen können durch pharmazeutische Standardverfahren in Versuchstieren bestimmt werden, z. B. die Bestimmung des LD50-Werts (letale Dosis für 50% der getesteten Population) und der ED50-Wert (therapeutisch wirksame Dosis für 50% der getesteten Population).
  • Das Verhältnis der Dosierung zwischen dem toxischen und dem therapeutischen Effekt ist der therapeutische Index, der durch das Verhältnis zwischen LD50 und ED50 ausgedrückt werden kann. Verbindungen, die einen hohen therapeutischen Index zeigen, werden bevorzugt. Die aus diesen Tierversuchen erhaltenen Daten können verwendet werden, um einen Dosisbereich festzulegen, der zur Verwendung beim Menschen nicht toxisch ist. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereiches von zirkulierenden Konzentrationen, welche einen ED50-Wert bei geringer oder keiner Toxizität umfassen. Die exakte Formulierung, der Verabreichungswert und die Dosierung können durch den einzelnen Arzt im Hinblick auf den Zustand des Patienten gewählt werden. (Siehe z. B., Fingl et al. (1975) in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Kapitel 1, auf das hier Bezug genommen wird).
  • In einigen Methoden wird der CV-Extrakt oder das Peptid-verknüpfte Glucan oral in einer Dosis von 1,0 mg bis 1.000 mg/kg pro Tag, vorzugsweise in einer Dosis von 20 mg/kg bis 50 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht. In anderen Methoden wird der CV-Extrakt oder das Peptid-verknüpfte Glucan oral in einer Dosis von 0,001 mg bis 100 mg/kg pro Tag verabreicht. Der CV-Extrakt oder das Peptid-verknüpfte Glucan kann als einzelne Tagesdosis oder in mehrfachen Tagesdosen verabreicht werden. Bei einigen Methoden wird der CV-Extrakt, das Peptid-verknüpfte Glucan oder eine aktive Komponente davon oral in einer Tagesdosis verabreicht, die mindestens 50 mg des CV-Rohextrakts pro kg Körpergewicht pro Tag äquivalent ist.
  • B. Pharmazeutische Zusammensetzungen und Methoden der Verabreichung
  • CV-Extrakt und Peptid-verknüpftes Glucan können einem Säuger, z. B. einem menschlichen Patienten oder einer Person allein, in Form eines pharmazeutisch geeigneten Salzes oder eines hydrolysierbaren Vorläufers oder in Form einer pharmazeutischen Zubereitung verabreicht werden, worin die Verbindung mit geeigneten Trägern oder Exzipienten in einer wirksamen Dosis vermischt ist. Feste orale Dosen sind die bevorzugte pharmazeutische Zubereitung. Ein wirksames Dosierungsschema bedeutet, dass ein Arzneimittel oder eine Arzneimittelkombination in einer ausreichenden Menge und Häufigkeit und auf einem geeigneten Weg verabreicht wird, um mindestens feststellbar die Entwicklung mindestens eines Symptoms einer immunologischen Störung zu verhindern, verzögern, zu hemmen oder umzukehren. Eine ”wirksame Dosierung”, ”pharmazeutisch geeignete Dosis”, ”pharmakologisch geeignete Menge” bedeutet, eine Menge des CV-Extrakts oder des Peptid-verknüpften Glucans, die ausreicht, ein gewünschtes Ergebnis zu erhalten, z. B. Stimulieren einer Immunantwort, Verhindern, Verzögern, Inhibieren oder Umkehren eines Symptoms einer Immunstörung oder des Fortschreitens einer Immunstörung, wenn die Verabreichung in einem geeigneten Dosierungsschema erfolgt.
  • CV-Extrakt oder Peptid-verknüpftes Glucan, die erfindungsgemäße verwendet werden, können als pharmazeutische Zusammensetzungen allein, gemeinsam und/oder mit einer Vielfalt von anderen pharmazeutisch geeigneten Komponenten verabreicht werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen können in Form von Feststoffen (wie Pulver, Granulate, Dragees, Tabletten oder Pillen), Halbfeststoffen (wie Gele, Aufschlämmungen oder Salben), Flüssigkeiten oder Gasen (wie Aerosole oder Inhaliermittel) sein.
  • Geeignete Zubereitungen zur Verwendung für die vorliegende Erfindung finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company 1985) Philadelphia, PA, 17. Ausgabe, Langer, Science (1990) 249: 1527–1533, auf die hier Bezug genommen wird. Die dort beschriebenen pharmazeutischen Zubereitungen können auf konventionelle Weise hergestellt werden, das heißt durch Mischen, Auflösen, Granulieren, Drageeherstellung, Pulverisieren, Emulgieren, Einkapseln, Einschließen oder durch Lyophilisierungsverfahren.
  • CV-Extrakt oder Peptid-verknüpftes Glucan können mit üblichen Exzipienten, Verdünnungsmitteln oder Trägern zubereitet werden und zu Tabletten verpresst oder als Elixiere oder Lösungen zur bequemen oralen Verabreichung formuliert werden. CV-Extrakt oder Peptid-verknüpftes Glucan können auch als Dosierungsformen mit verzögerter Abgabe und dergleichen zubereitet werden. Die Verabreichung der Verbindungen kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden, einschließlich orale, bukkale, rektale, parenterale, intraperitoneale, intradermale, transdermale, intratracheale, intravenöse, subkutane und intramuskuläre Verabreichung. Die orale Verabreichung wird bevorzugt. Die Verbindung kann statt systemisch auch in lokaler Art, in einem Depot oder einer Zubereitung mit verzögerter Abgabe verabreicht werden. Außerdem können die Verbindungen in einem Liposom verabreicht werden. Außerdem können die Verbindungen mit Nahrungsmitteln kombiniert und verzehrt oder mit verzehrbaren Flüssigkeiten kombiniert und als Getränk getrunken werden.
  • Zur oralen Verabreichung können die Verbindungen die Form von Pillen, Tabletten, Kapseln, Pulvern oder Granulat, die in üblicher Weise zubereitet sind, annehmen. Zur oralen Verabreichung können die Zubereitungen in flüssiger Form, z. B. Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, sein.
  • Zur bukkalen Verabreichung können die Verbindungen die Form von Tabletten oder Lutschtabletten annehmen, die in üblicher Weise formuliert werden.
  • Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen zur erfindungsgemäßen Anwendung bequem in Form einer Aerosol-Sprayzubereitung aus Druckpackungen, Vernebelvorrichtungen oder Sprühspritzen unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder anderer geeigneter Gase oder aus Treibmittel-freien Trockenpulver-Inhalationsvorrichtungen abgegeben. Im Fall eines Druck-Aerosols kann die Dosiseinheit durch Vorsehen eines Ventils, welches eine abgemessene Menge abgibt, bestimmt werden. Kapseln und Patronen aus beispielsweise Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Pulververstäuber können so formuliert werden, dass sie ein Pulvergemisch aus der Verbindung und einer geeigneten Pulvergrundlage, wie Lactose oder Stärke, enthalten.
  • Die Verbindungen können für die parenterale Verabreichung durch Injektion z. B. durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion formuliert werden. Formulierungen für die Injektion können in Form einer Einheitsdosis, z. B. in Ampullen oder in Mehrdosen-Behältern mit Zusatz eines Konservierungsmittels, bereitgestellt werden. Die Zusammensetzungen können die Form von Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässerigen Trägern annehmen und können Formulierungs-Additive, wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel enthalten. Die Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung werden als sterile im Wesentlichen isotonische Zusammensetzungen und unter völliger Erfüllung aller Good Manufacturing Practice(GMP)-Regulierungen der US Food and Drug Administration formuliert.
  • CV-Extrakt oder Peptid-verknüpftes Glucan können auch als rektale Zubereitungen, wie Suppositorien oder Retentionseinläufe zubereitet werden, die z. B. übliche Suppositorien-Grundlagen, wie Kakaobutter, Carbowachse, Polyethylenglykole oder andere Glyceride, die alle bei Körpertemperatur schmelzen, jedoch bei Raumtemperatur fest sind, enthalten.
  • Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Zubereitungen kann der CV-Extrakt oder das Peptid-verknüpfte Glucan auch als Depotpräparat zubereitet werden. Solche lang wirksamen Formulierungen können durch Implantation verabreicht werden (z. B. subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion. So können die Verbindungen beispielsweise mit geeigneten Polymeren oder hydrophoben Materialien (z. B. als Emulsion in einem geeigneten Öl) oder Ionenaustauscherharzen oder als wenig lösliche Derivate, beispielsweise als wenig lösliches Salz formuliert werden (Siehe z. B. Urquhart et al., (1984), Ann Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199; Lewis, Hrsg., 1981, Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals, Plenum Press, New York, N. Y., US-Pat. Nrn. 3,773,919 und 3,270,960 , auf die hier Bezug genommen wird).
  • Alternativ können andere Verabreichungssysteme für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen angewendet werden. Liposomen und Emulsionen sind gut bekannte Beispiele für Verabreichungs-Vehicle oder Träger für hydrophobe Arzneimittel. In einigen Methoden können lange zirkulierende, d. h. ”stealth Liposomen”, angewendet werden. Derartige Liposomen sind im Allgemeinen in Woodle, et al., US-Patent Nr. 5,013,556 beschrieben, auf dessen Offenbarung hier Bezug genommen wird. Die Ver bindungen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch durch Methoden der kontrollierten Abgabe, Methoden der verzögerten Abgabe und/oder mit Hilfe von Abgabevorrichtungen verabreicht werden, wie die in den US-Patenten Nrn. 3,845,770 , 3,916,899 , 3,536,809 , 3,598,123 und 4,008,719 beschriebenen auf deren Offenbarung hier Bezug genommen wird, verabreicht werden.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch geeignete feste oder als Gelphase vorliegende Träger oder Exzipienten enthalten. Beispiele für solche Träger oder Exzipienten umfassen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere, wie Polyethylenglykole.
  • XI. Beispiele
  • Die folgenden Beispiele werden zur Verdeutlichung, jedoch nicht zur Beschränkung gegeben. So werden die Auswahl der Reagenzien sowie die Konzentrationen der Reagenzien, die Temperaturen und andere variable Parameter verwendet, um die vorliegende Erfindung beispielhaft zu verdeutlichen, sind jedoch nicht als Beschränkungen dieser zu betrachten. Der Fachmann erkennt leicht nicht-kritische Parameter, die variiert werden können, um die hier beschriebene Erfindung zu verwirklichen.
  • Beispiel I
  • Herstellung des Coriolus versicolor-Rohextrakts
  • Der Coriolus versicolor (CV)-Rohextrakt wird mit Hilfe der folgenden Stufen hergestellt. Getrocknete Fruchtkörper von Coriolus versicolor (CV) werden mazeriert. Die mazerierten CV-Fruchtkörper werden dann gemahlen. Eine Stufe zum Entfernen von Pigment aus den mazerierten, gemahlenen CV-Fruchtkörpern kann durchgeführt werden. Danach werden die CV-Fruchtkörper extrahiert. Die Extraktion kann durch Kochen der CV-Fruchtkörper in einer wässerigen alkalischen Lösung, z. B. Natriumhy droxid oder Kaliumhydroxid, erfolgen. Eine wässerig-alkalische Lösung von weniger als 0,1 n wird bevorzugt. Nach der Extraktionsstufe kann die Herstellung des CV-Rohextrakts eine oder mehr der folgenden Stufen umfassen: Entfernen der unlöslichen Materialien, z. B. durch Filtration, Klären des Extrakts, z. B. durch Zentrifugieren, Konzentrieren des Extrakts, z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Gefrieren des Extrakts oder Lyophilisieren des Extrakts, z. B. mit Hilfe eines Gefriertrockners. Der resultierende CV-Rohextrakt kann dann zur späteren Verwendung aufbewahrt werden.
  • 1 ist ein Fließschema, welches die Stufen eines Protokolls zur Herstellung des CV-Rohextrakts verdeutlicht. 300 g getrocknete Fruchtkörper von Coriolus versicolor (CV) werden durch Eintauchen in 1 l entionisiertes Wasser während etwa einer Stunde mazeriert. Nach dem Abdekantieren des entionisierten Wassers werden die mazerierten CV-Fruchtkörper gemahlen. Pigment kann von den mazerierten, gemahlenen CV-Fruchtkörpern entfernt werden. Die Entfernung des Pigments wird dadurch erreicht, dass die mazerierten, gemahlenen CV-Fruchtkörper in 3 l entionisiertem Wasser über Nacht eingetaucht werden. Die Extraktion der CV-Fruchtkörper erfolgt durch Kochen der mazerierten, gemahlenen CV-Fruchtkörper in 2 l 0,01 n Natriumhydroxid während 5 Stunden unter ständigem leichtem Rühren.
  • Die unlöslichen Materialien werden entfernt, indem der Extrakt durch ein grobes Tuch gegossen wird, welches die unlöslichen Materialien abfängt. Der resultierende Überstand wird durch Zentrifugieren bei 4.000 UpM während 10 Minuten geklärt. Der geklärte Überstand wird dann durch Rotationsverdampfung bei 80°C konzentriert, bis das Volumen auf 50% vermindert ist. Dann wird der geklärte konzentrierte Überstand bei –70°C gefroren und lyophilisiert. Der resultierende CV-Rohextrakt enthält eine Trockenmasse von etwa 43 g bis 47 g, ist dunkelbraun gefärbt und hat eine flaumige Textur. Der rohe CV-Extrakt kann sofort verwendet oder zur späteren Verwendung aufbewahrt werden.
  • Beispiel II
  • Physikalische und chemische Eigenschaften von CV-Rohextrakt
  • Der CV-Rohextrakt wurde analysiert, um seine Löslichkeit, seinen Schmelzpunkt, die Zersetzungstemperatur und Hygroskopizität zu bestimmen. Die zur Analyse angewendeten Methoden und die jeweiligen Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt. Tabelle I
    Ergebnisse Methode(n)
    Hoch wasserlöslich 10 mg CV-Extrakt werden in 2 ml Lösungsmittel (Wasser) in einem Glas-Reagenzrohr gelöst. Ultraschallbehandlung während 30 Minuten. Messung der Absorption bei 254 nm.
    Mäßig weniger löslich in Ethanol als in Wasser Wie vorstehend beschrieben, ausgenommen, dass das Lösungsmittel Ethanol ist.
    Mäßig weniger löslich in Aceton als in Wasser Wie vorstehend beschrieben, ausgenommen, dass das Lösungsmittel Aceton ist.
    Unlöslich in Chloroform Wie vorstehend beschrieben, ausgenommen, dass das Lösungsmittel Chloroform ist.
    Unlöslich in Dichlormethan Wie vorstehend beschrieben, ausgenommen, dass das Lösungsmittel Dichlormethan ist.
    Kein definierter Schmelzpunkt 1. Differential-Scanningkalorimetrie Ein Perkin Elmer Pyris 1-Differential-Scanningkalorimeter (mit Pyris Manager Software) wurde verwendet. Die Probe wurde in eine hermetisch verschlossene Aluminiumschale gelegt und unter Stickstoffspülung bei einer Heizrate von 10°C/min und 40° bis 90°C abgetastet. (Siehe Ford, J. L. and Timmins P. Pharmaceutical Thermal Analysis – Techniques and Applications, Ellis Horwood Ltd., Chichester, West Sussex, Engand, 1989.) 2. Thermogravimetrische Analyse Ein thermogravimetrisches Analysegerät Perkin Elmer TGA7 mit einem Thermal Analysis Controller TAC 7/DX wurde verwendet. Die Probe wurde in eine offene Schale gelegt und bei einer Heizrate von 10°C/min von 40° bis 110°C abgetastet. (Siehe Ford, J. L. and Timmins P. Pharmaceutical Thermal Analysis – Techniques and Applications, Ellis Horwood Ltd., Chichester, West Sussex, Engand, 1989.)
    Keine definierte Zersetzungstemperatur 1. Differential-Scanningkalorimetrie Wie vorstehend beschrieben durchgeführt. 2. Thermogravimetrische Analyse Wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
    Ergebnisse Methode(n)
    Nicht-hygroskopisch Gravimetrische Veränderungen beobachtet nach dem Inkubieren bei konstanter relativer Feuchtigkeit (RH): < 5% Gewichtsanstieg nach dem Inkubieren bei 10–70% RH während 14 Tagen Chu K. K. W. and Chow A. H. L., Pharm. Res. 2000, 17(9): 1133–1137.
  • CV-Rohextrakt wurde analysiert, um das durchschnittliche Molekulargewicht und die Gewichtsprozente von neutralem Zucker, Uronsäure und Peptid/Protein zu bestimmen. CV-Rohextrakt wurde außerdem im Hinblick auf das Vorliegen von Glucose als Monozucker-Komponente und auf das Vorliegen von (1→3)-Glucanbindungen analysiert. Die Verknüpfung der Peptideinheit mit der Kohlenhydrateinheit in dem CV-Rohextrakt wurde charakterisiert. Die zur Analyse und Charakterisierung verwendeten Methoden und die jeweiligen Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt. Tabelle II
    Ergebnisse Methode(n)
    Durchschnittliches Molekulargewicht: 2,6 kDa Molekulargewichtsbereich: 0,5–40 kDa Chromatografie
    Peptid/Protein: 4,7 Gew.-% Bradford-Test nach Bradford, M. M., Anal. Biochem. 1976, 72: 248–254.
    Neutralzucker: 55 Gew.-% Phenol-Schwefelsäure-Methode nach Dubois, M. et al., Anal. Chem., 1956, 28: 350–356.
    Uronsäure: 4,8 Gew.-% Carbozol-Test von Blumenkrantz, N. et al., Anal. Biochem. 1973, 54: 484–489.
    Glucose als Monozucker-Komponente Säurehydrolyse, bestimmt nach der Methode von Zhang Y. W. et al., 1997, 63(00): 393–399. Alditolacetat-Derivatisierung, bestimmt nach der Methode von Kiyohara, H. et al., Carbohydr. Res., 1998, 182: 259–275. Gaschromatografie wie beschrieben von Kiyohara, H. et al., Carbohydr. Res., 1998, 182: 259–275.
    (1→3)-Glucan Methylierung, bestimmt durch die Methode von Hakomori, S., J. Biochem. Tokyo, 1964, 55: 205–208. Säurehydrolyse, bestimmt durch die Methode von Zhang Y. W. et al., 1997, 63(00): 393–399. Alditolacetat-Derivatisierung, bestimmt durch die Methode von Kiyohara, H. et al. Carbohydr. Res., 1998, 182: 259–275. GC/MS, bestimmt durch die Methode von Kiyohara, H. et al., Carbohydr. Res., 1998, 182: 259–275.
    Peptideinheit fest verknüpft mit der Kohlenhydrateinheit Gemeinsame Elution der beiden Einheiten in verschiedenen chromatografischen Analysen.
  • Die durchschnittlichen Molekulargewichte der rohen CV-Extrakte wurden durch Größenausschluss-Chromatografie bestimmt. 200 μl wässeriger Proben von 1–2 mg/ml wurden in ein Hochleistungs-Flüssigchromatografie (HPLC)-System eingespritzt (fast performance liquid chromatographic system, Pharmacia), das mit einer Superose 12 10/30-Kolonne betrieben wurde, und mit einer 0,2 m NaCl-Lösung von pH 7,0 eluiert. Das Eluat wurde dann auf eine 2 × 40 cm Superdex 75 10/30-Kolonne aufgetragen und mit 200 mM Ammoniumacetat von pH 7,0 eluiert. Das Eluat wurde als 1 ml-Fraktionen gewonnen. Die Fraktionen wurden danach als Proben für die Analyse verwendet. Während des Trennverfahrens wurde die UV-Absorption bei 210 nm überwacht.
  • Das Molekulargewicht der Proben war im Bereich von 0,5–40 kDa. Das durchschnittliche Molekulargewicht der Proben betrug 2,6 kDa. Das Molekulargewicht wurde unter Bezugnahme auf eine Eichkurve bestimmt, die unter Verwendung von verschiedenen Kohlenhydratstandards aufgestellt worden war.
  • 2A zeigt ein Größenausschluss-Chromatogramm, welches das Elutionsprofil der Proteinkomponente des CV-Rohextrakts darstellt. Der Proteingehalt der Proben wurde ge messen, indem das Elutionsprofil der proteinhaltigen Substanzen bei 254 nm überwacht wurde. (Siehe Tabelle II). 2B ist ein Größenausschluss-Chromatogramm von CV-Rohextrakt, welches das Elutionsprofil der Kohlenhydratkomponente des CV-Rohextrakts zeigt. Der Kohlenhydratgehalt in den Eluaten wurde durch den Phenol-Schwefelsäure-Test gemessen (Siehe Tabelle II).
  • Untersuchungen in vitro
  • Beispiel III
  • Vermehrung von lebenden Maus-Splenozyten im Kontakt mit CV-Rohextrakt in vitro
  • Drei ICR-Mäuse wurden durch Dislokation der Halswirbelsäule getötet. Die Milz der getöteten Mäuse wurde aseptisch entfernt. Splenozyten wurden isoliert, indem jede Milz sanft durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl gepresst wurde. Die von jeder Maus isolierten Splenozyten wurden kombiniert, die resultierende Zellsuspension wurde 3 Minuten bei 1.600 UpM zentrifugiert und der Überstand wurde abdekantiert. Zu den Zellpellets wurden etwa 6 ml Lysepuffer gegeben, um die in den Pellets vorhandenen roten Blutzellen zu zerstören. Der verbliebene Lysepuffer wurde danach mit PBS weggewaschen. Die Splenozyten wurden dann in einem vollständigen Zellkulturmedium suspendiert.
  • Die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde durch den Tryptanblau-Ausschlusstest geprüft. (Siehe Parslow T. G. The immune response. In Medical Immunology; Sities D. P., Terr A. I., Parslow T. G., Hrsg., Appleton und Lange: London, 1997; S. 63–73.) Die Zelldichte der lebenden Zellsuspensionen wurde auf 2 × 106 Zellen/ml eingestellt. 100 μl der Zellsuspensionen wurden in 96-Loch-Mikrotiterplatten (NUNCTM) eingeimpft.
  • Die eingeimpften Zellen wurden dann mit (1) einer 100 μl-Probe von CV-Rohextrakt (bei Endkonzentrationen von 1–500 μg/ml), (2) 100 μl Concanavalin A (Con A) (bei Endkonzentrationen von 0,016–4,0 μg/ml) als positive Kontrolle, (Sigma) oder (3) 100 μl Kulturmedium als negative Kontrolle in Kontakt gebracht.
  • Die kontaktierten Zellen wurden dann während 72 Stunden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre von 95% O2 und 5% CO2 inkubiert. Nach 54 Stunden wurden die Zellen mit 0,5 μCi/10 μl/Well 3H-Methylthymidin radioaktiv markiert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen dann auf einem Glasfaser-Filterpapier mit einer Zellgewinnungsvorrichtung gewonnen und die Menge des relativ zur DNA-Synthese eingebauten 3H-Methylthymidins wurde durch Szintillationszählung bestimmt. Die Anzahl pro Minute (CPM) der kontaktierten Zellen wurde durch die CPMs in den negativen Kontrollzellen normalisiert, um den Stimulierungsindex zu erhalten. Der Stimulierungsindex wurde durch Division des Einbaus von 3H-Methylthymidin in die Zellen (Zahlen pro Minute (CPM) in den kontaktierten Zellen durch den der negativen Kontrollzellen errechnet.
  • Die Vermehrungsaktivität der Splenozyten von mit CV-Extrakt behandelten Mäusen war bei niederen Con A-Konzentrationen dosisabhängig. Die Vermehrungsaktivität von Splenozyten von Mäusen, die mit CV-Extrakt behandelt worden waren, betrug das 20-fache bei einer Konzentration von 50 μg/ml Con A, im Vergleich mit der Kontrolle. Das Ansprechen durch Vermehrung von Splenozyten von Mäusen, die mit CV-Rohextrakt bei Konzentrationen von 100 μg/ml bis 350 μg/ml behandelt wurden und mit Konzentrationen von etwa 1 μg/ml bis etwa 3 μg/ml Con A stimuliert wurden, war ähnlich. Die Ergebnisse sind als Stimulierungsindex ausgedrückt. (Siehe 3).
  • Beispiel IV
  • Knochenmarkzellen der Maus, die in vitro mit CV-Rohextrakt kontaktiert wurden
  • 5 ICR-Mäuse wurden durch Dislokation der Halswirbelsäule getötet. Die Oberschenkelknochen der getöteten Mäuse wurden aseptisch entfernt. Die mit den Oberschenkelknochen verbundenen Muskeln wurden soweit wie möglich entfernt und Knochenmarkpfropfen wurden entnommen. Die Knochenmarkpfropfen wurden mit Hilfe einer 2 ml-Spritze, die mit einer 25 G Nadel ausgestattet war, mit PBS gespült. Die aus jedem Knochenmarkpfropfen isolierten Knochenmarkzellen wurden kombiniert. Die resultierende Zellsuspension wurde hergestellt und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist, getestet. Die Dichte der lebenden Zellsuspensionen wurde eingestellt, sodass eine Zellsuspension von 4 × 106 Zellen/ml gebildet wurde. 100 μl der Zellsuspensionen wurden in 96-Loch-Mikrotiterplatten (NUNCTM) eingeimpft.
  • Die Zellen wurden dann mit (1) einer 100 μl-Probe von CV-Rohextrakt (bei Endkonzentrationen von 25–200 μg/ml), (2) 100 μl Lipopolysaccharid (LPS) (bei Endkonzentrationen von 2,5–20 μg/ml) als positive Kontrolle, (Sigma) oder (3) 100 μl Kulturmedium als negative Kontrolle in Kontakt gebracht. Die kontaktierten Zellen wurden 120 Stunden lang bei 37°C in einer Atmosphäre von 95% O2 und 5% CO2 inkubiert. Nach 104 Stunden wurden die Zellen mit 0,5 μCi/10 μl/Loch 3H-Methylthymidin radioaktiv markiert. Nach 120 Stunden wurden die Zellen gewonnen und der Stimulierungsindex wie in dem obigen Beispiel III bestimmt.
  • 4 zeigt die vermehrungsfördernde Wirkung des Kontakts von isolierten Maus-Knochenmarkzellen mit CV-Rohextrakt oder LPS in vitro. Die Ergebnisse sind als Stimulierungsindex ausgedrückt. Es wurde gezeigt, dass CV-Rohextrakt das Knochen mark bei 200 μg/ml um das 40-fache vermehrt. Das vermehrende Ansprechen von Knochenmarkzellen durch Kontakt mit CV-Rohextrakt war größer als das Ansprechen bei ähnlichen relativen Konzentrationen von LPS.
  • Beispiel V
  • Maus-Makrophagen, die mit CV-Rohextrakt in vitro kontaktiert wurden
  • 10 ICR-Mäuse erhielten eine intraperitoneale Injektion mit 1 ml 3% (Gewicht/Volumen) wässerigen Thioglykolat. Nach 3 Tagen wurden die Mäuse durch Dislokation der Halswirbelsäule getötet. Die Makrophagen wurden durch Öffnen des Peritoneums und Spülung des Raums mit PBS gewonnen. Die PBS-Spülungen aus jeder getöteten Maus wurden kombiniert. Die resultierende Zellsuspension wurde hergestellt und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist, getestet. Die Dichte der lebenden Zellsuspensionen wurde so eingestellt, dass eine Zellsuspension von 4 × 106 Zellen/ml gebildet wurde. 100 μl der Zellsuspensionen wurden in 96-Loch-Mikrotiterplatten (NUNCTM) eingeimpft.
  • Die Zellen wurden am Boden der Vertiefungen der Mikrotiterplatten während 1 Stunde bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 95% O2 und 5% CO2 anhaften gelassen. Dann wurde der Überstand in den Vertiefungen sorgfältig entfernt. Die Zellen wurden dann mit (1) 200 μl CV-Rohextrakt in Konzentrationen von 25–200 μg/ml, (2) 200 μl LPS (Sigma) in Konzentrationen von 0,125–1 μg/ml als positive Kontrolle oder (3) 200 μl des vollständigen Zellkulturmediums als negative Kontrolle in Kontakt gebracht. Die kontaktierten Zellen wurden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 95% O2 und 5% CO2 24 Stunden lang inkubiert.
  • Nach 24 Stunden wurde die Menge des in dem zellfreien Kulturmedium vorhandenen Nitrats durch die Griess-Reaktion bestimmt. (Siehe Green L. C. et al, Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] nitrate in biological fluids, Anal. Biochem., 1982, 126: 131–138). Ein 150 μl-Anteil des zellfreien Kulturmediums wurde aus jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte pipettiert und mit 50 μl Griess-Reagens 10 Minuten lang in der Vertiefung einer frischen Mikrotiterplatte umgesetzt. Die Absorption des Anteils wurde dann bei 540 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts (microplate reader) (BTI, ELX 800) gemessen.
  • 5 verdeutlicht die erhöhte Ausscheidung von Stickstoffoxid durch peritoneale Makrophagen der Maus, die in vitro mit CV-Rohextrakt oder LPS kontaktiert wurden. Die erhöhte Ausscheidung von Stickstoffoxid durch die Vermehrungsaktivität der mit CV-Rohextrakt behandelten peritonealen Makrophagen der Maus war dosisabhängig bei CV-Konzentrationen von weniger als etwa 100 μg/ml. Es ergab sich kein Anstieg der Vermehrungsaktivität von Zellen, die mit mehr als etwa 100 μg/ml CV-Rohextrakt kontaktiert wurden. Die Vermehrungsaktivität von LPS war bei niederen LPS-Konzentrationen dosisabhängig.
  • In vivo-Untersuchungen
  • Beispiel VI
  • Verabreichung von CV-Rohextrakt an normale Mäuse
  • Versuchsplan
  • 20 ICR-Mäuse wurden in 4 Gruppen mit jeweils 5 Mäusen unterteilt. Wie in Tabelle III gezeigt ist, wurde Gruppe 1 mit i. p. verabreichtem CV-Rohextrakt behandelt, Gruppe 2 mit i. p. verabreichter normaler Kochsalzlösung als negative Kontrolle behandelt, Gruppe 3 wurde mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt behandelt und Gruppe 4 wurde mit oral verabreichtem ent ionisierten Wasser als negative Kontrolle behandelt. Die orale Verabreichung erfolgte mit Hilfe einer Magensonde zur Zwangsernährung der Maus.
  • Tabelle III zeigt die Dosis und das Dosierschema für jede Gruppe. Die Mäuse der Gruppe 1 und Gruppe 2 wurden am 4.
  • Tag getötet. Die Mäuse der Gruppe 3 und der Gruppe 4 wurden am B. Tag getötet.
  • Am 1. Tag wurde CV-Rohextrakt abgewogen und in entionisiertem Wasser gelöst und die Konzentration der Lösung wurde auf 5 mg/ml Lösung eingestellt. Die Lösung wurde 30 Minuten lang mit Ultraschall behandelt, 10 Minuten bei 4.000 UpM zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen und danach durch ein steriles 0,22 μm-Filter (IWAKI) in eine sterile Flasche filtriert. Die Lösung wurde zwischen den Anwendungen bei 4°C aufbewahrt. TABELLE III
    Behandelte Gruppe Anzahl der Mäuse CV-Dosis CV-Dosierungsschema Verabreichungsweg
    1 5 50 mg/kg/Tag (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) Tage 1, 2 & 3 i. p. Injektion
    2 5 0,25 ml sterile normale Kochsalzlösung pH 7,4 Tage 1, 2 & 3 i. p. Injektion
    3 5 50 mg/kg/Tag (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml oral in eine Maus von etwa 25 g) An Tagen 1–7 oral
    4 5 0,25 ml entionisiertes Wasser An Tagen 1–7 oral
  • 1. Wirkung der i. p.-Verabreichung von CV-Rohextrakt auf die in vivo-Vermehrung von lebenden Maus-Splenozyten von normalen Mäusen
  • Der i. p. an Mäuse (Gruppe 1) verabreichte CV-Rohextrakt erhöhte die Anzahl der in vivo lebenden Splenozyten um 58,6% im Vergleich mit Kontrollmäusen (Gruppe 2). (Siehe 6A). Splenozyten wurden wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist, gewonnen und isoliert. Die resultierende Zellsuspension wurde zubereitet und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist, getestet.
  • 2. Wirkung der i. p.-Verabreichung von CV-Rohextrakt auf die ex vivo-Vermehrung von LPS-stimulierten Maus-Knochenmarkzellen von normalen Mäusen
  • Die Knochenmarkzellen von Mäusen, die durch i. p.-Verabreichung mit CV-Rohextrakt behandelt wurden (Gruppe 1) zeigten eine größere ex vivo-LPS-stimulierte Vermehrungsaktivität als die Knochenmarkzellen von Kontrollmäusen (Gruppe 2). (Siehe 6B). Die Knochenmarkzellen wurden gewonnen und isoliert, wie in dem obigen Beispiel IV beschrieben ist. Die vermehrungsfördernde Aktivität von CV-Rohextrakt auf die Knochenmarkzellen wurde wie in dem obigen Beispiel IV beschrieben ist, getestet.
  • 3. Wirkung der oralen Verabreichung von CV-Extrakt auf die in vivo-Vermehrung von lebenden Maus-Splenozyten von normalen Mäusen
  • CV-Rohextrakt, der oral an Mäuse (Gruppe 3) verabreicht wurde, erhöhte die Anzahl der in vivo lebenden Splenozyten um 40% im Vergleich mit Kontrollmäusen (Gruppe 4). (Siehe 7A). Splenozyten wurden gewonnen und isoliert, wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist. Die resultierende Zellsus pension wurde zubereitet und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist, getestet.
  • 4. Wirkung der oralen Verabreichung von CV-Extrakt auf die ex vivo-Vermehrung von LPS-stimulierten Knochenmarkzellen von normalen Mäusen
  • Die Knochenmarkzellen von Mäusen, die mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt behandelt wurden (Gruppe 3) zeigten eine größere ex vivo-LPS-stimulierte Vermehrungsaktivität als die Knochenmarkzellen der Kontrollmäuse (Gruppe 4). (Siehe 7A). Die Knochenmarkzellen wurden gewonnen und isoliert, wie in dem obigen Beispiel IV beschrieben ist. Die vermehrungsfördernde Aktivität von CV-Rohextrakt auf die Knochenmarkzellen wurde getestet, wie vorstehend in Beispiel IV beschrieben ist.
  • Beispiel VII
  • Verabreichung von CV-Extrakt an immun-geschädigte Mäuse oder schwer immun-geschädigte Mäuse
  • Versuchsplan
  • 40 ICR-Mäuse wurden in 8 Gruppen mit jeweils 5 Mäusen unterteilt. Am 1. Tag wurden die Mäuse der Gruppen 1–4 durch i. p.-Injektion von 20 mg/kg Cyclophosphamid einer Immunsuppression unterworfen. Außerdem wurden am 1. Tag die Mäuse der Gruppen 5–8 durch i. p.-Injektion von 100 mg/kg Cyclophosphamid einer schweren Immunsuppression unterworfen. (Siehe Tabelle IV für die Dosis von Cyclophosphamid und das Dosierungsschema). An den Tagen 5, 6 und 7 nach der Immunsuppression wurde Gruppe 1 mit CV-Rohextrakt, der durch i. p.-Injektion verabreicht wurde, behandelt, Gruppe 2 wurde mit normaler Kochsalzlösung durch i. p.-Verabreichung behandelt. An den Tagen 1–7 nach der Immunsuppression wurde Gruppe 3 mit oral ver abreichtem CV-Rohextrakt behandelt und Gruppe 4 wurde mit entionisiertem Wasser behandelt. An den Tagen 1–7 nach der schweren Immunsuppression wurde Gruppe 5 mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt behandelt und Gruppe 6 mit entionisiertem Wasser behandelt. An den Tagen 1–14 nach der schweren Immunsuppression wurde Gruppe 7 mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt behandelt und Gruppe 8 mit entionisiertem Wasser behandelt. (Siehe Tabelle IV für die Dosis des CV-Rohextrakts, das Dosierungsschema und den Verabreichungsweg). Die Gruppen 2, 4, 6 und 8 sind negative Kontrollgruppen. Die Mäuse der Gruppen 1–6 wurden am B. Tag getötet. Die Mäuse der Gruppe 7 und Gruppe 8 wurden am 15. Tag getötet.
  • Die Gruppen 1–4 wurden mit einer wie nachstehend hergestellten Cyclophosphamidlösung injiziert. 200 mg/Fläschchen Cyclophosphamid (Endoxan-Asta) wurde von Asta Medica bezogen. Das Cyclophosphamid wurde nach Vorschrift mit sterilem entionisierten Wasser rekonstituiert. Die Konzentration der Lösung wurde mit steriler normaler Kochsalzlösung auf 1 mg/ml eingestellt, anteilweise in sterile Flaschen gegeben und bei –80°C gelagert. Die Cyclophosphamidlösung wurde unter aseptischen Bedingungen hergestellt. Am ersten Tag wurde die Cyclophosphamidlösung aufgetaut und in die Mäuse der Gruppen 1–4 injiziert.
  • Die Gruppen 5–8 erhielten Injektionen mit einer Cyclophosphamidlösung, die wie für Gruppen 1–4 beschrieben ist, hergestellt war, mit der Ausnahme, dass die Konzentration der Lösung auf 5 mg/ml eingestellt wurde. Am 1. Tag wurde die Cyclophosphoamidlösung aufgetaut und in die Mäuse der Gruppen 5–8 injiziert.
  • Der CV-Rohextrakt wurde zur i. p.- oder oralen Verabreichung zubereitet, wie in dem obigen Beispiel VI beschrieben ist. TABELLE IV
    Behandelte Gruppe Anzahl der Mäuse Cyclophosphamid-Dosis & Dosierungsschema CV-Dosis & Dosierungsschema Verabreichungsweg
    1 5 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) 50 mg/kg/Tag an den Tagen 5,6,&7 (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml oral an eine Maus von etwa 25 g) i. p. Injektion
    2 5 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) 0,25 ml normale sterile Kochsalzlösung pH 7,4 an den Tagen 5,6&7 (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml oral an eine Maus von etwa 25 g) i. p. Injektion
    3 5 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) 50 mg/kg/Tag an den Tagen 1–7 (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml oral an eine Maus von etwa 25 g) oral
    4 5 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) 0,25 ml entionisiertes Wasser an den Tagen 1–7 oral
    Behandelte Gruppe Anzahl der Mäuse Cyclophosphamid-Dosis & Dosierungsschema CV-Dosis & Dosierungsschema Verabreichungsweg
    5 5 100 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 5 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) 50 mg/kg/Tag an den Tagen 1–7 (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml oral an eine Maus von etwa 25 g) oral
    6 5 100 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 5 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) 0,25 ml entionisiertes Wasser an den Tagen 1–7 oral
    7 5 100 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 5 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) 50 mg/kg/Tag an den Tagen 1–14 (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml oral an eine Maus von etwa 25 g) oral
    8 5 100 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 5 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) 0,25 ml entionisiertes Wasser an den Tagen 1–14 oral
  • 1. Wirkung der i. p.-Verabreichung von CV-Rohextrakt auf die in vivo-Vermehrung von lebenden Maus-Splenozyten aus immun-geschädigten Mäusen
  • CV-Rohextrakt, der i. p. an immun-geschädigte Mäuse (Gruppe 1) verabreicht wurde, erhöhte die Anzahl der lebenden Splenozyten in vivo merklich (p < 0,001) im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 2). (Siehe 8A). Die Splenozyten wurden wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist, gewonnen und isoliert. Die resultierende Zellsuspension wurde zubereitet und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde getestet, wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist.
  • 2. Wirkung der i. p.-Verabreichung von CV-Rohextrakt auf die Vermehrung in vivo von lebenden Maus-Knochenmarkzellen aus immun-geschädigten Mäusen
  • Die Knochenmarkzellen von Mäusen, die mit CV-Rohextrakt durch i. p.-Verabreichung behandelt wurden (Gruppe 1) zeigten einen wesentlichen Anstieg der Zahl der in vivo lebenden Knochenmarkzellen (p < 0,05) im Vergleich mit den Knochenmarkzellen der Kontrollmäuse (Gruppe 2). (Siehe 8A). Die Knochenmarkzellen wurden in gleicher Weise gewonnen und isoliert, wie in dem obigen Beispiel IV beschrieben ist. Die Lebensfähigkeit der Knochenmarkzellen wurde getestet, wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist.
  • 3. Wirkung der oralen Verabreichung (7-tägiges Dosierschema) von CV-Extrakt auf die Vermehrung in vivo von lebenden Maus-Splenozyten aus immun-geschädigten Mäusen
  • CV-Rohextrakt, der oral an Mäuse mit Immunsuppression (Gruppe 3) verabreicht wurde, erhöhte die Anzahl der lebenden Splenozyten in vivo nicht im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 4). (Siehe 8B). Die Splenozyten wurden gewonnen und isoliert, wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist.
  • Die resultierende Zellsuspension wurde hergestellt und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde getestet, wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist.
  • 4. Wirkung der oralen Verabreichung (7-tägiges Dosierschema) von CV-Extrakt auf die Vermehrung in vivo von lebenden Maus-Knochenmarkzellen von immun-geschädigten Mäusen
  • Die Knochenmarkzellen von Mäusen, die mit CV-Rohextrakt durch orale Verabreichung behandelt wurden (Gruppe 3) zeigten einen wesentlichen Anstieg der Zahl der lebenden Knochenmarkzellen in vivo (p < 0,005) im Vergleich mit den Knochenmarkzellen der Kontrollmäuse (Gruppe 4). (Siehe 8B). Die Knochenmarkzellen wurden gewonnen und isoliert, wie in dem obigen Beispiel IV beschrieben ist. Die resultierende Zellsuspension wurde hergestellt und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde getestet, wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist.
  • 5. Wirkung der oralen Verabreichung von CV-Rohextrakt (7-tägiges Dosierschema) auf die Vermehrung in vivo von lebenden Maus-Splenozyten von schwer immun-geschädigten Mäusen
  • CV-Rohextrakt, der oral an Mäuse mit schwerer Immunsuppression (Gruppe 5) verabreicht wurde, erhöhte die Anzahl der lebenden Splenozyten in vivo im Vergleich zu den Kontrollmäusen (Gruppe 6). Der Anstieg war jedoch nicht statistisch signifikant. (Siehe 8C). Die Splenozyten wurden gewonnen und isoliert, wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist. Die resultierende Zellsuspension wurde zubereitet und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde getestet, wie vorstehend in Beispiel III beschrieben ist.
  • 6. Wirkung der oralen Verabreichung von CV-Rohextrakt (7-tägiges Dosierschema) auf die Vermehrung in vivo von lebenden Maus-Knochenmarkzellen aus schwer immun-geschädigten Mäusen
  • CV-Rohextrakt, der oral an Mäuse mit schwerer Immunsuppression (Gruppe 5) verabreicht wurde, erhöhte in vivo die Anzahl der lebenden Knochenmarkzellen wesentlich (p < 0,01) im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 6). (Siehe 8C). Die Knochenmarkzellen wurden gewonnen und isoliert, wie in dem obigen Beispiel IV beschrieben ist. Die resultierende Zellsuspension wurde zubereitet und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde getestet, wie oben in Beispiel III beschrieben ist.
  • 7. Wirkung der oralen Verabreichung (14-tägiges Dosierschema) von CV-Rohextrakt auf die in vivo-Vermehrung von lebenden Maus-Splenozyten aus schwer immun-geschädigten Mäusen
  • CV-Rohextrakt, der oral an Mäuse mit Immunsuppression verabreicht wurde (Gruppe 7), erhöhte in vivo die Anzahl der lebenden Splenozyten nicht im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 8). (Siehe 9A). Die Splenozyten wurden wie vorstehend in Beispiel III beschrieben ist, gewonnen und isoliert. Die resultierende Zellsuspension wurde hergestellt und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde getestet, wie vorstehend in Beispiel III beschrieben ist.
  • 8. Wirkung der oralen Verabreichung (14-tägiges Dosierschema) von CV-Extrakt auf die Vermehrung in vivo von lebenden Maus-Knochenmarkzellen aus schwer immun-geschädigten Mäusen
  • Die Knochenmarkzellen von Mäusen, die mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt behandelt wurden (Gruppe 7) zeigten eine wesentliche Erhöhung der Anzahl von in vivo lebenden Knochenmarkzellen (p < 0,05) im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 8). (Siehe 9A). Die Knochenmarkzellen wurden gewonnen und isoliert, wie oben in Beispiel IV beschrieben ist.
  • Die vermehrungsfördernde Aktivität von CV-Rohextrakt auf die Knochenmarkzellen wurde getestet, wie oben in Beispiel IV beschrieben ist.
  • 9. Wirkung der oralen Verabreichung von CV-Extrakt (14-tägiges Dosierschema) auf die Vermehrung ex vivo von Con Astimulierten Splenozyten aus Mäusen mit schwerer Immunsuppression
  • Die Splenozyten von Mäusen, die mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt behandelt wurden (Gruppe 7) zeigten eine größere ex vivo-Vermehrungsaktivität als die Splenozyten der Kontrollmäuse (Gruppe 8). (Siehe 9B). Die Splenozyten wurden gewonnen und isoliert, wie oben in Beispiel III beschrieben ist. Die vermehrungsfördernde Aktivität von CV-Rohextrakt auf die Splenozyten wurde getestet, wie oben in Beispiel III beschrieben ist.
  • 10. Wirkung der oralen Verabreichung von CV-Extrakt auf die ex vivo-Vermehrung von LPS-stimulierten Knochenmarkzellen aus schwer immun-geschädigten Mäusen
  • Die Knochenmarkzellen von Mäusen, die mit CV-Rohextrakt durch orale Verabreichung behandelt wurden (Gruppe 7) zeigten eine größere ex vivo-LPS-stimulierte Vermehrungsaktivität als die Knochenmarkzellen der Kontrollmäuse (Gruppe 8) (p < 0,05). (Siehe 9C). Die Knochenmarkzellen wurden gewonnen und isoliert, wie oben in Beispiel IV beschrieben ist. Die vermehrende Aktivität von CV-Rohextrakt auf die Knochenmarkzellen wurde getestet, wie oben in Beispiel IV beschrieben ist.
  • Beispiel VIII
  • Untersuchung des Ansprechens auf die Dosis bei immungeschädigten Mäusen
  • Versuchsplan
  • 20 ICR-Mäuse wurden in 4 Gruppen von jeweils 5 Mäusen unterteilt. Am Tag 1 erhielten die Mäuse der Gruppen 1–4 eine Immunsuppression durch i. p.-Injektion von 20 mg/kg-Cyclophosphamid. (Siehe Tabelle V für die Dosis und das Dosierungsschema von Cyclophosphamid). An den Tagen 1–7 nach der Verabreichung von Cyclophosphamid wurden die Mäuse der Gruppen 1, 2 und 3 mit 5, 20 beziehungsweise 50 mg/kg/Tag CV-Rohextrakt durch orale Verabreichung behandelt. An den Tagen 1–7 nach der Verabreichung von Cyclophosphamid wurden die Mäuse der Gruppe 4 mit entionisiertem Wasser behandelt. (Siehe Tabelle V für die Dosis und das Dosierungsschema von CV-Rohextrakt). Gruppe 4 ist eine negative Kontrollgruppe. Die Mäuse der Gruppen 1–4 wurden am 8. Tag getötet.
  • Das Cyclophosphamid wurde wie vorstehend in Beispiel VII beschrieben ist, zubereitet und verabreicht.
  • Der CV-Rohextrakt für die orale Verabreichung von 50 mg/kg/Tag des CV-Rohextrakts wurde hergestellt, wie oben in Beispiel VI beschrieben ist. Der CV-Rohextrakt für die orale Verabreichung von 5 mg/kg/Tag und 20 mg/kg/Tag CV-Rohextrakt wurde hergestellt, wie vorstehend in Beispiel VI beschrieben ist, ausgenommen, dass die Konzentrationen der Lösungen auf 0,5 mg/ml beziehungsweise 2 mg/ml eingestellt wurden. TABELLE V
    Behandelte Gruppe Anzahl der Mäuse Cyclophosphamid-Dosis & Dosierungsschema CV-Dosis & Dosierungsschema Verabreichungsweg
    1 5 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) 50 mg/kg/Tag an den Tagen 1–7 (0,25 ml einer Lösung von 0,5 mg/ml oral verabreicht an eine Maus von etwa 25 g) oral
    2 5 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) 20 mg/kg/Tag an den Tagen 1–7 (0,25 ml einer Lösung von 2 mg/ml oral verabreicht an eine Maus von etwa 25 g) oral
    3 5 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) 50 mg/kg/Tag an den Tagen 1–7 (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml oral an eine Maus von etwa 25 g) oral
    4 5 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) 0,25 ml entionisiertes Wasser an den Tagen 1–14 oral
  • 1. Wirkung der oralen Verabreichung von unterschiedlichen Dosen von CV-Extrakt auf die Vermehrung in vivo von lebenden Maus-Splenozyten aus Mäusen mit Immunsuppression
  • CV-Rohextrakt, der oral in einer Dosis von 5 mg/kg/Tag (Gruppe 1) und von 20 mg/kg/Tag (Gruppe 2) an Mäuse verabreicht wurde, erhöhte die Anzahl der lebenden Splenozyten in vivo in dosisabhängiger Weise im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 4). (Siehe 10). CV-Rohextrakt, der oral in einer Dosis von 50 mg/kg/Tag (Gruppe 3) an Mäuse verabreicht wurde, erhöhte die Anzahl der lebenden Splenozyten in vivo nicht im Vergleich mit Kontrollmäusen (Gruppe 4). (Siehe 10). Die für die Mäuse der Gruppe 3 angegebenen Daten stimmen mit dem Ergebnis überein, das in dem vorstehend diskutierten Beispiel VIII und 8A dargestellt ist.
  • Die Splenozyten wurden gewonnen und isoliert, wie oben in Beispiel III beschrieben ist. Die resultierende Zellsuspension wurde hergestellt und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde getestet, wie in dem vorstehenden Beispiel III beschrieben ist.
  • 2. Wirkung der oralen Verabreichung von verschiedenen Dosierungen von CV-Extrakt auf die Vermehrung in vivo von lebenden Maus-Knochenmarkzellen aus Mäusen mit Immunsuppression
  • CV-Rohextrakt, der oral an Mäuse in einer Dosis von 5 mg/kg/Tag (Gruppe 1), von 20 mg/kg/Tag (Gruppe 2) und 50 mg/kg/Tag (Gruppe 3) verabreicht wurde, erhöhte die Anzahl der lebenden Knochenmarkzellen in vivo in dosisabhängiger Weise im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 4). (Siehe 10). CV-Extrakt, der oral an die Mäuse der Gruppe 2 verabreicht wurde, verstärkte die Vermehrung von Knochenmarkzellen (p < 0,01) im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 4) und CV-Extrakt, der oral an die Mäuse der Gruppe 3 verabreicht wurde, verstärkte die Vermehrung von Knochenmarkzellen (p < 0,001) im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 4).
  • Die Knochenmarkzellen wurden gewonnen und isoliert, wie vorstehend in Beispiel IV beschrieben ist. Die resultierende Zellsuspension wurde hergestellt und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde getestet, wie vorstehend in Beispiel III beschrieben ist.
  • Beispiel IX
  • Orale Verabreichung von CV-Extrakt an normale Mäuse, immun-geschädigte Mäuse und schwer immun-geschädigte Mäuse: Wirkung auf die zellvermittelte Immunantwort.
  • Versuchsplan
  • Ein Mausmodell wird verwendet, um die Erhöhung der zellvermittelten Immunantwort zu bestimmen. Die Kontakt-Überempfindlichkeit ist eine zellvermittelte Immunantwort. Dieses Modell basiert auf Standarduntersuchungen der Kontakt-Überempfindlichkeit, die auf Messungen der Schwellung eines Mausohrs beruhen, um die Expression der Kontakt-Überempfindlichkeit zu bestimmen.
  • 36 Mäuse wurden in 6 Gruppen von jeweils 6 Mäusen unterteilt. Um eine spätere Identifizierung der Individuen zu ermöglichen, erhielt jede Maus eine Markierung auf den Schwanz. Die Gruppen 1 und 2 waren normale Mäuse, Gruppen 3 und 4 waren immun-geschädigte Mäuse und Gruppen 5 und 6 waren schwer immun-geschädigte Mäuse. An den Tagen 1–7 wurden die Gruppen 1, 3 und 5 mit 50 mg/kg/Tag CV-Rohextrakt durch orale Verabreichung behandelt. An den Tagen 1–7 wurden die Gruppen 2, 4 und 6 mit 0,25 ml entionisiertem Wasser durch orale Verabreichung behandelt. An den Tagen 3 und 4 wurden alle 36 Mäuse mit 2,4-Dinitro-1-fluorbenzol (DNFB) sensibilisiert. Am 7. Tag wurden alle 36 Mäuse DNFB ausgesetzt. Am 8. Tag wurden Ohrmessungen an allen 36 Mäusen vorgenommen. (Siehe Tabelle VI).
  • Der CV-Rohextrakt wurde zur oralen Verabreichung an Gruppen 1, 3 und 5 wie in dem obigen Beispiel VI beschrieben ist, zubereitet. Der CV-Rohextrakt wurde verabreicht, wie vorstehend in Beispiel VI und Tabelle III beschrieben ist. (Siehe auch Tabelle VI für die Dosis und das Dosierungsschema von CV-Rohextrakt).
  • Das Cyclophosphamid wurde wie vorstehend in Beispiel VII erläutert zur Lagerung und Verabreichung zubereitet. Die Mäuse der Gruppen 3 und 4 wurden durch Verabreichung von 20 mg/kg am Tag 1 wie vorstehend in Beispiel VII und Tabelle IV beschrieben ist, der Immunsuppression unterworfen. Die Mäuse der Gruppen 5 und 6 wurden durch Verabreichung von 100 mg/kg am Tag 1 der Immunsuppression unterworfen, wie vorstehend in Beispiel VII und Tabelle IV beschrieben ist. (Siehe auch Tabelle VI für die Dosis von Cyclophosphamid und das Dosierungsschema).
  • An den Tagen 3 und 4 wurden alle 36 Mäuse in folgender Weise mit 2,4-Dinitro-1-fluorbenzol (DNFB) sensibilisiert. Die Exposition erfolgte durch direktes Auftragen von 25 μl 0,25%igem (Gewicht/Volumen) DNFB auf den rasierten Bauch jeder Maus mit einer Pipette und durch direktes Auftragen von 5 μl 0,25%igem (Gewicht/Volumen) DNFB auf jede Pfote jeder Maus. Am Tag 7 wurden alle 36 Mäuse 2,4-Dinitro-1-fluorbenzol (DNFB) wie folgt ausgesetzt. Die Exposition wurde durch direktes Auftragen von 10 μl an 0,20%igem (Gewicht/Volumen) DNFB auf beide Seiten jedes Ohres jeder Maus mit einer Pipette vorgenommen. Am Tag 8 wurde die Ohrmessung der Ohrdicke unter Verwendung einer digitalen Kalibriervorrichtung, d. h. Mitutoyo digital micrometer, durchgeführt. TABELLE VI
    Behaudelte Gruppe Anzahl der Mäuse Cyclophosphamid-Dosis (i. p. verabreicht) & Dosierungsschema DNFB-Dosis & Dosierungsschema CV-Dosis (oral verabreicht) & Dosierungsschema
    1 6 N/A 25 μl 0,25% (Gew./Vol.) DNFB aufgetragen auf den rasierten Bauch und 5 μl auf jede Pfote an den Tagen 3 & 4. 10 μl 0,2% (Gew./Vol.) DNFB aufgetragen auf beide Seiten jedes Ohrs am Tag 7. Messung der Ohrdicke am Tag 8. 50 mg/kg/Tag an den Tagen 1–7 (0,25 ml) (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml oral an eine Maus von etwa 25 g)
    2 6 N/A Das Gleiche wie Gruppe 1 0,25 ml entionisiertes Wasser an den Tagen 1–7
    3 6 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) Das Gleiche wie Gruppe 1 50 mg/kg/Tag an den Tagen 1–7 (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml oral an eine Maus von etwa 25 g)
    Behandelte Gruppe Anzahl der Mäuse Cyclophosphamid-Dosis (i. p. verabreicht) & Dosierungsschema DNFB-Dosis & Dosierungsschema CV-Dosis (oral verabreicht) & Dosierungsschema
    4 6 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) Das Gleiche wie Gruppe 1 0,25 ml entionisiertes Wasser an den Tagen 1–7
    5 6 100 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 5 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) Das Gleiche wie Gruppe 1 50 mg/kg/Tag an den Tagen 1–7 (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml oral an eine Maus von etwa 25 g)
    6 6 100 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 5 mg/ml injiziert in eine Maus von etwa 25 g) Das Gleiche wie Gruppe 1 0,25 ml entionisiertes Wasser an den Tagen 1–7
  • 1. Ergebnisse bei normalen Mäusen, die oral mit CV-Extrakt behandelt wurden
  • Normale Mäuse (Gruppe 1) zeigten eine wesentlich größere Überempfindlichkeitsreaktion (p < 0,05), die durch Anschwellen des Mausohrs gemessen wurde, als die Kontrollmäuse (Gruppe 2). (Siehe 11).
  • 2. Ergebnisse bei Mäusen mit Immunsuppression, die oral mit CV-Extrakt behandelt wurden
  • Mäuse mit Immunsuppression (Gruppe 3) zeigten eine wesentlich größere Überempfindlichkeitsreaktion (p < 0,05), gemessen durch das Anschwellen des Mausohrs, als die Kontrollmäuse (Gruppe 4). (Siehe 11).
  • Die Überempfindlichkeitsreaktion der Mäuse mit Immunsuppression (Gruppe 3) war nicht wesentlich verschieden von der Überempfindlichkeitsreaktion der Kontrollmäuse (Gruppe 2).
  • 3. Ergebnisse bei Mäusen mit schwerer Immunsuppression, die oral mit CV-Extrakt behandelt wurden
  • Mäuse mit schwerer Immunsuppression (Gruppe 5) zeigten eine wesentlich größere Überempfindlichkeitsreaktion (p < 0,001), gemessen durch Anschwellen des Mausohrs, als die Kontrollmäuse (Gruppe 6). (Siehe 11).
  • Die Überempfindlichkeitsreaktion (p < 0,001) der schwer immun-geschädigten Mäuse (Gruppe 5) war größer als die Überempfindlichkeitsreaktion (p < 0,05), die in den Mäusen mit Immunsuppression (Gruppe 3) oder den normalen Mäusen (Gruppe 1) (p < 0,05) beobachtet wurde.
  • Beispiel X
  • Orale Langzeitverabreichung (30 Tage) von CV-Extrakt an normale Mäuse
  • Versuchsplan
  • 10 ICR-Mäuse wurden in 2 Gruppen von jeweils 5 Mäusen unterteilt. Wie in Tabelle VII gezeigt ist, wurde die Gruppe 1 mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt behandelt und die Gruppe 2 wurde mit oral verabreichtem entionisierten Wasser als negative Kontrolle behandelt. Tabelle VII zeigt die Dosis und das Dosierungsschema für jede Gruppe. Die Mäuse beider Gruppen wurden am 31. Tag getötet. Der CV-Rohextrakt wurde hergestellt, aufbewahrt und verabreicht wie in dem obigen Beispiel VI erläutert ist. (Siehe auch Tabelle VII). TABELLE VII
    Behandelte Gruppe Anzahl der Mäuse CV-Dosis CV-Dosierungsschema Verabreichungsweg
    1 5 50 mg/kg/Tag (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml oral an eine Maus von etwa 25 g) An Tagen 1–30 oral
    2 5 0,25 ml entionisiertes Wasser An Tagen 1–30 oral
  • 1. Wirkung der oralen Langzeit-Verabreichung (30 Tage) von CV-Rohextrakt auf die Vermehrung in vivo von lebenden Maus-Splenozyten aus normalen Mäusen
  • CV-Rohextrakt, der oral an Mäuse (Gruppe 1) verabreicht wurde, erhöhte die Anzahl von lebenden Splenozyten in vivo nicht signifikant im Vergleich mit Kontrollmäusen (Gruppe 2).
  • (Siehe 12A). Die Splenozyten wurden wie oben in Beispiel III beschrieben ist, gewonnen und isoliert. Die resultierende Zellsuspension wurde zubereitet und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde getestet, wie oben in Beispiel III beschrieben ist.
  • 2. Wirkung der oralen Langzeit-Verabreichung von CV-Rohextrakt auf die Vermehrung in vivo von LPS-stimulierten Maus-Knochenmarkzellen aus normalen Mäusen
  • CV-Rohextrakt, der oral an Mäuse (Gruppe 1) verabreicht wurde, erhöhte die Anzahl der lebenden Knochenmarkzellen in vivo nicht wesentlich im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 2). (Siehe 12A). Die Knochenmarkzellen wurden gewonnen und isoliert, wie oben in Beispiel IV beschrieben ist. Die Lebensfähigkeit der Knochenmarkzellen wurde getestet, wie oben in Beispiel III beschrieben ist.
  • 3. Wirkung der oralen Langzeit-Verabreichung von CV-Extrakt auf die Vermehrung ex vivo von lebenden Maus-Splenozyten aus normalen Mäusen
  • Das Vermehrungs-Ansprechen von Splenozyten nach Behandlung mit CV-Rohextrakt (Gruppe 1) war größer als das Vermehrungs-Ansprechen der Kontrollmäuse (Gruppe 2). (Siehe 12B). Die Splenozyten wurden gewonnen und isoliert, wie vorstehend in Beispiel III beschrieben ist. Die resultierende Zellsuspension wurde zubereitet und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde getestet, wie oben in Beispiel III beschrieben ist. Die Splenozyten wurden mit Con A stimuliert und der Stimulierungsindex wurde errechnet, wie oben in Beispiel V diskutiert wurde.
  • 4. Wirkung der oralen Langzeit-Verabreichung von CV-Extrakt auf die Vermehrung ex vivo von LPS-stimulierten Knochenmarkzellen aus normalen Mäusen
  • Die Knochenmarkzellen von Mäusen, die mit oral verabreichtem CV-Rohextrakt behandelt wurden (Gruppe 1) zeigten eine größere LPS-stimulierte Vermehrungsaktivität ex vivo als die Knochenmarkzellen der Kontrollmäuse (Gruppe 2). (Siehe 12C).
  • Die Knochenmarkzellen wurden gewonnen und isoliert, wie oben in Beispiel IV beschrieben ist. Die Vermehrungsaktivität von CV-Rohextrakt auf die Knochenmarkzellen wurde getestet, wie oben in Beispiel IV beschrieben ist.
  • Beispiel XI
  • Akute Toxizität von oral verabreichtem CV-Rohextrakt
  • Am 1. Tag wurden 5 ICR-Mäuse jedes Geschlechts mit 1 g/kg CV-Rohextrakt durch orale Verabreichung behandelt und bis zu 14 Tagen auf toxische Anzeichen beobachtet. Während der Beobachtungszeit starb keine der Mäuse und keine der 10 Mäuse zeigte irgendein toxisches Anzeichen während des gesamten Beobachtungszeitraums.
  • Der CV-Rohextrakt wurde für die orale Verabreichung an die 10 Mäuse (mit Ausnahme der Konzentration) zubereitet, wie oben in Beispiel VI beschrieben ist. Der CV-Rohextrakt wurde auf einmal verabreicht.
  • Der an die 10 Mäuse verabreichte CV-Rohextrakt war frei von Verunreinigung durch Endotoxin. Eine 2 mg/ml-Probe des CV-Rohextrakts wurde einem Endotoxintest unterworfen. Der Test erfolgte unter Verwendung eines Test-Kits Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (Cape Cod Ltd.) mit einer Nachweisgrenze von 0,25 EU/ml LAL.
  • Beispiel XII
  • Wirkung der negativen Ladungsdichte auf die immunologische Aktivität von Peptid-verknüpftem Glucan
  • Die immunologischen Aktivitäten in vitro von CV-Peptidverknüpften Glucanen, die mit Hilfe von Anionenaustausch-Chromatografie in Gruppen mit unterschiedlicher negativer Ladungsdichte fraktioniert wurden, d. h. C1D2, C1D3, C1D4 und C1D5, wurden verglichen. 13 verdeutlicht die Vermehrung von lebenden Maus-Splenozyten die in vitro mit C1D2, C1D3, C1D4 und C1D5 in Kontakt gebracht wurden. Unter den verschiedenen Fraktionen wurden große Unterschiede der immunologischen Potenz beobachtet. Peptid-verknüpfte Glucane mit hoher negativer Ladungsdichte zeigten eine höhere maximale Aktivität (d. h. Höhe des Plateaus) und Potenz (d. h. steilerer Anstieg der Aktivität bei niederer Konzentration der Probe) als Fraktionen mit niederer negativer Ladungsdichte und als der nicht-fraktionierte CV-Extrakt. Dies zeigt an, dass die negative Ladungsdichte ein wichtiger Bestimmungsfaktor der Immunogenität der von CV abgeleiteten Peptid-verknüpften Glucane ist. Die immunologische Aktivität in vitro wurde geprüft, wie in dem vorstehenden Beispiel III beschrieben ist.
  • Beispiel XIII
  • Einfluss des Molekulargewichts auf die immunologischen Aktivitäten von Peptid-verknüpften Glucanen
  • Die immunologische Aktivität in vitro wurde für die Fraktionen C1E8, C1E6, C1E4, C1E2 und C1E0 bestimmt. 14 zeigt die erhöhte Ausscheidung von Stickstoffoxid durch peritoneale Makrophagen der Maus, die in vitro mit C1E8, C1E6, C1E4, C1E2 und C1E0 kontaktiert wurden. Die immunologische Aktivität war nicht auf einen besonderen Molekulargewichtsbereich begrenzt. Mit C1E8, C1E6, C1E4, C1E2 und C1E0 wurde ein ähnliches Profil des Dosis-Ansprechens erhalten, das ein Plateau zwischen 100 und 200 μg/ml erreichte. Die maximalen Aktivitäten (Plateau) erhöhten sich mit ansteigendem Molekulargewicht der Fraktion. Die immunologische Aktivität in vitro wurde geprüft, wie vorstehend in Beispiel III beschrieben ist.
  • Beispiel XIV
  • Herstellung von partiell gereinigtem Coriolus versicolor-Extrakt
  • Der partiell gereinigte Extrakt von Coriolus versicolor (CV) wurde durch Auflösen von CV-Rohextrakt, der mit Hilfe der in Beispiel I beschriebenen Methode hergestellt worden war, Durchführen von zwei chromatografischen Trennstufen und einer ethanolischen Fraktionierungsstufe, hergestellt. Die Lösung des CV-Rohextrakts wurde einer ersten chromatografischen Stufe, beispielsweise an einer CM-Cellulosekolonne unterworfen, um kationische Substanzen zu entfernen. Das resultierende Eluat wurde einer zweiten Chromatografie unterworfen, z. B. an einer DEAE-Cellulosekolonne, um anionische Substanzen zu binden. Dieses abfließende Produkt wurde dann einem auf dem Molekulargewicht beruhenden Trennprotokoll unterworfen, z. B. der ethanolischen Fraktionierung oder Gelfiltration. Das resultierende abfließende Produkt, ein partiell gereinigter CV-Extrakt, kann weiter mit Hilfe beliebiger Reinigungsmethoden gereinigt werden, die weiterhin Kationen aus dem partiell gereinigten CV-Extrakt entfernen.
  • 15 ist ein Fließschema, welches die Stufen verdeutlicht, die in einem Protokoll zur weiteren Reinigung der aktiven Komponenten in dem rohen CV-Extrakt der 1 angewendet werden. 1,0 g CV-Rohextrakt, wie er nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellt wurde, wurde in entionisiertem Wasser gelöst. Der gelöste CV-Rohextrakt wurde 10 Minuten bei 4.000 UpM zentrifugiert, um unlösliche Substanzen zu entfernen. Dann wurde der Überstand durch ein 0,45 μm-Filter (IWAKI) filtriert, um weiter unlösliche Teilchen zu entfernen.
  • Eine offene 600 ml-Glaskolonne (Bio-Rad) mit faseriger CM-Cellulose (Sigma) wurde durch dreimaliges Waschen des Harzes mit 0,5 m NaOH jeweils während 30 Minuten äquilibriert und dann dreimal jeweils 30 Minuten mit 0,5 m HCl gewaschen. Die Kolonne wurde mit entionisiertem Wasser äquilibriert.
  • Der Überstand wurde dann über die Kolonne gegossen und der Ablauf gewonnen. (Siehe 15 zu den Pufferbedingungen). Die Fraktionen wurden auf ihre Aktivität geprüft. Fraktion C1 zeigte Aktivität, wurde auf eine DEAE-Cellulosekolonne gegeben und der Ablauf wurde gewonnen. (Siehe 15 zu den Pufferbedingungen). Die Fraktionen wurden im Hinblick auf ihre Aktivität getestet. Fraktion C1D5 wurde der ethanolischen Fraktionierung unterworfen (siehe 15 zu den Pufferbedingungen) und die resultierenden Fraktionen wurden auf ihre Aktivität geprüft, wobei Maus-Splenozyten verwendet wurden, wie in Beispiel III beschrieben ist. Die Fraktionen C1D5E8, C1D5E7, C1D5E4 und C1D5EX des partiell gereinigten CV-Extrakts zeigten Aktivität. Die Fraktionen C1D5E8, C1D5E7, C1D5E4 und C1D5EX wurden lyophilisiert und hatten ein Gewicht von 5, 14, 49 beziehungsweise 13 mg. Weitere Reinigungsstufen, speziell solche, die kationische Moleküle entfernen, können an den Fraktionen C1D5E8, C1D5E7, C1D5E4 und C1D5EX vorgenommen werden.
  • Beispiel XV
  • Rolle der Peptideinheit als antigene Determinante in den CV-Peptid-verknüpften Glucanen
  • Dieses Beispiel stellt einen Zusammenhang zwischen der Zusammensetzung der grundlegenden Struktureinheiten der CV-Fraktion (Neutralzucker, Uronsäure und Protein/Peptid) mit den mitogenen Aktivitäten in vitro dar. 16 zeigt den Zusammenhang zwischen dem Stimulierungsindex der mitogenen Antwort in vitro und dem Gehalt der Grundstruktureinheiten der entsprechenden Fraktionen. Für die analysierten CV-Fraktionen bestand ein starker Zusammenhang zwischen den Peptidgehalten (r = 0,99, p < 0,05) und der mitogenen Aktivität. Der Koeffizient des Zusammenhangs zwischen der mitogenen Aktivität und dem Uronsäuregehalt war bei einem Wert von 10% (r = 0,61) kaum signifikant und der Zusammenhang mit dem Neutralzucker war insignifikant. Die immunologische Aktivität in vitro wurde geprüft, wie in dem vorstehenden Beispiel III beschrieben ist.
  • Beispiel XVI
  • Physikochemische und biologische Charakterisierung der partiell gereinigten CV-Fraktionen
  • Der Molekulargewichtsbereich und das durchschnittliche Molekulargewicht wurden für die Fraktionen C1D5E8, C1D5E7 und C1D5EX bestimmt. (Siehe Tabelle A). TABELLE A Molekulargewichtsbereiche von C1D5E8, C1D5E7 und C1D5EX
    Fraktion Original (kDa)
    C1D5E8 0,7–2,6; durchschnittlich = 0,8
    C1D5E7 1,6–52; durchschnittlich = 2,6
    C1D5EX 0,8–111 (starke Schweifbildung des Peaks); durchschnittlich = 6,2
  • Der Gehalt an Neutralzuckern, Uronsäure und Protein wurde für die Fraktionen C1D5E8, C1D5E7 und C1D5EX bestimmt. (Siehe Tabelle B). TABELLE B Chemische Zusammensetzung von C1D5E8, C1D5E7 und C1D5EX
    Fraktion Kohlenhydratgehalt (% der Gesamtmasse) Uronsäuregehalt (% der Gesamtmasse) Proteingehalt (% der Gesamtmasse)
    C1D5E8 18,77 ± 1,20 1,32 ± 0,15 5,04 ± 0,21
    C1D5E7 33,72 ± 1,48 5,23 ± 4,28 12,01 ± 0,24
    C1D5EX 75,86 ± 6,82 16,95 ± 0,92 8,76 ± 0,31
  • Der Gehalt an Neutralzuckern, Uronsäure und Protein wurde für die Fraktionen C1D5E8, C1D5E7 und C1D5EX bestimmt, wie in Beispiel II beschrieben ist. Aufgrund der GC/MS-Analyse war Glucose der einzige nachweisbare Monozucker. Die Glucosemoleküle waren durch eine 1→3-Bindung verknüpft.
  • Die Aminosäuresequenz der Protein/Peptid-Einheit der Fraktion C1D5E7 war gemäß der Bestimmung Asp-Cys-Pro-Pro-Cys-Glu (SEQ ID Nr: 1). SEQ ID Nr: 1 wurde unter Verwendung einer Aminosäure-Sequenzierungsvorrichtung (Hewlett Packard 1000 A Proteinsequenzer, ausgestattet mit einem HPLC-System), bestimmt.
  • Die immunologischen Aktivitäten der partiell gereinigten CV-Fraktionen C1D5E8, C1D5E7 und C1D5EX (siehe 15) wurden bestimmt. 17 zeigt die stimulierenden Aktivitäten in vitro von drei aktiven partiell gereinigten CV-Fraktionen, nämlich C1D5E8, C1D5E7 und C1D5EX, auf die Ausscheidung von Stickstoffoxid durch peritoneale Makrophagen der Maus. Alle partiell gereinigten CV-Fraktionen haben sich als so aktiv und potent wie LPS erwiesen. (Siehe 17).
  • Beispiel XVII
  • Wirkung des Molekulargewichts des CV-Rohextrakts und des partiell gereinigten CV-Extrakts auf die Durchlässigkeit der Darmwand
  • Die Darmwand-Durchlässigkeit von CV-Rohextrakt und von partiell gereinigtem CV-Extrakt, Fraktionen C1D5E8, C1D5E7 und C1D5EX wurde in vitro unter Verwendung der Caco-2-Zell-Monoschicht (Transwell-Methode) bestimmt. Die Molekulargewichtsverteilungen der nativen CV-Proben und ihrer Caco-2-Zell-permeablen Verbindungen wurden verglichen. Die Analysen wurden unter Verwendung eines HPLC-Systems, das mit einer Supedex 75 10/30-Kolonne verbunden war, durchgeführt. Der Elutionspuffer war 200 mM Natriumchloridlösung von pH 7,0 und die Eluate wurden durch UV 210 nm überwacht.
  • Alle Versuche wurden unter Temperaturkontrolle bei 37°C durchgeführt. Als Transportpuffer für alle Messungen der Durchlässigkeit (Permeabilität) wurde Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) verwendet, dem 80 mM Magnesiumchlorid und 90 mM Calciumchlorid zugesetzt waren. Vor dem Versuch wurde die Zellmonoschicht zweimal mit dem Transportpuffer gewaschen. 1,5 ml Transportpuffer, der die zu testenden Proben enthielt, wurde auf die basolaterale Seite der Caco-2-Zell-Monoschicht aufgegeben. Nach 30-minütigem Äquilibrieren bei 37°C wurde das Transwell zusammen mit der Probelösung auf eine Clusterplatte übertragen, die vorher mit 2,6 ml Transportpuffer gefüllt wurde. Die Komponenten, die durch die Zellen durchgetreten waren, wurden am Ende des Versuchs auf der basolateralen Seite gewonnen. Die gewonnenen Proben wurden für eine anschließende chemische und biologische Charakterisierung entsalzt und lyophilisiert.
  • 1. CV-Rohextrakt
  • Die Komponenten des CV-Rohextrakts, welche die Caco-2-Zell-Monoschicht (kDa) durchdringen, sind in der nachstehenden Tabelle C gezeigt.
  • 18A zeigt ein Größenausschluss-Chromatogramm von CV-Rohextrakt und 18B veranschaulicht die Gehalte des CV- Rohextrakts, welche Caco-2-Zellen durchdringen, die nach der Untersuchung des Transports gewonnen wurden. Der wie in Beispiel I hergestellte CV-Rohextrakt war im Bereich von 0,5–40 kDa mit einem Durchschnitt von 2,6 kDa. Wie durch 18B verdeutlicht ist, waren die bei 7,07 und 8,89 ml eluierten Peaks in jeder Probe vorhanden, die in der basolateralen Kammer (einschließlich der Kontrolle, d. h. ohne CV-Rohextrakt) gewonnen wurden. Dieses Ergebnis zeigt an, dass die Peaks nicht aus den Proben von CV-Rohextrakt stammen, sondern möglicherweise durch Makromoleküle verursacht werden, welche aus den Caco-2-Zellen herausgelöst werden. Der in der 17,67 ml-Fraktion eluierte Peak beruht wahrscheinlich auf kleinen Molekülen und nicht auf den bioaktiven Glucanen, die in dem CV-Rohextrakt vorliegen. Aufgrund der in 18A und 18B gezeigten Molekulargewichtsprofile wird geschlossen, dass die niedermolekularen Bestandteile leichter als ihre hochmolekularen Gegenstücke die Monoschicht durchqueren. Außerdem wird geschlossen, dass 3 kDa möglicherweise die obere Molekulargewichtsgrenze für die Darmresorption des CV-Rohextrakts ist. TABELLE C Molekulargewichtsbereich von C1D5E8, C1D5E7 und C1D5EX
    Komponenten mit Durchdringungsfähigkeit für Caco-2-Zell-Monoschicht (kDa)
    CV-Rohextrakt 0,3–5 (jedoch hauptsächlich zwischen 0,3–3) durchschnittlich = 0,7
  • 2. Partiell gereinigter CV-Extrakt: C1D5E8, C1D5E7 und C1D5EX
  • Die Komponenten der Fraktionen C1D5E8, C1D5E7 und C1D5E, die fähig sind, die Caco-2-Zell-Monoschicht zu durchdringen (kDa) sind in der nachstehenden Tabelle D gezeigt.
  • 19A ist ein Größenausschluss-Chromatogramm der die Caco-2-Zellen-durchdringenden Substanzen in C1D5E8. Das durchschnittliche Molekulargewicht von C1D5E8 betrug 0,8 kDa. Wie in 19B gezeigt ist, wurde eine wesentliche Menge des Peptid-verknüpften Glucans in der Fraktion 16,73 ml eluiert, was anzeigte, dass die in C1D5E8 vorhandenen Bestandteile von etwa 0,7 kDa in dem in vitro-Absorptionsmodell durch die Monoschicht transportiert wurden.
  • 20A ist ein Größenausschluss-Chromatogramm der Caco-2-Zellen-durchdringenden Substanzen in C1D5E7. C1D5E7 hatte ein durchschnittliches Molekulargewicht von 2,6 kDa. (Siehe 20A). Am Ende der Transportstudie konnten auf der basolateralen Seite der Caco-2-Zell-Monoschicht nur die niedermolekularen Komponenten (d. h. durchschnittliches Molekulargewicht von 1,2 kDa) nachgewiesen werden. (Siehe 20B).
  • 21A ist ein Größenausschluss-Chromatogramm der Caco-2-Zellen-durchdringenden Substanzen in C1D5EX. Das durchschnittliche Molekulargewicht von C1D5EX wurde zu etwa 6 kDa geschätzt. (Siehe 21A). 21B zeigt, dass außer den bei 17,67 ml eluierten kleinen Molekülen auch eine sehr geringe Menge anderer Komponenten die Intestinal-Barriere zu der basolateralen Seite der Monoschicht durchdrangen. TABELLE D Molekulargewichtsbereich von C1D5E8, C1D5E7 und C1D5EX
    Fraktionen Die Caco-2-Zell-Monoschicht durchdringende Komponenten (kDa)
    C1D5E8 0,3–2 durchschnittlich = 0,7
    C1D5E7 0,3–5 (jedoch hauptsächlich zwischen 0,3–3) durchschnittlich = 1,2
    C1D5EX Nachweis einer unbedeutenden Menge
  • Beispiel XVIII
  • Maus-Makrophagen, die in vitro mit Caco-2-Zellen durchdringenden Bestandteilen von partiell gereinigtem CV-Extrakt kontaktiert wurden
  • 22 verdeutlicht den in vitro-Effekt auf die Ausscheidung von Stickstoffoxid durch peritoneale Makrophagen der Maus, die mit Caco-2-Zellen durchdringenden Komponenten von partiell gereinigten CV-Extrakt oder LPS in Kontakt gebracht wurden. Die Zellen-durchdringenden Komponenten aller partiell gereinigten CV-Proben waren immunologisch aktiv und alle der Proben hatten eine höhere Aktivität als die von LPS. Die Fraktionen mit niederem Molekulargewicht und die Fraktionen mit mittlerem Molekulargewicht, C1D5E8 und C1D5E7 zeigten stärkere Aktivität als die Fraktion mit höherem Molekulargewicht, C1D5EX. Die Peptid-verknüpften Glucane in C1D5E8 und C1D5E7 haben ein durchschnittliches Molekulargewicht von weniger als etwa 3 kDa.
  • Beispiel XIX
  • Verabreichung von partiell gereinigtem CV-Extrakt an normale Mäuse
  • Versuchsplan
  • 25 ICR-Mäuse wurden in 5 Gruppen von jeweils 5 Mäusen unterteilt. Wie in Tabelle VIII gezeigt ist, wurden die Gruppen wie folgt behandelt. Gruppe 1 wurde mit C1D5E8, einem i. p.-verabreichten partiell gereinigten CV-Extrakt behandelt, Gruppe 2 wurde mit C1D5E7, einem i. p.-verabreichten partiell gereinigten CV-Extrakt behandelt, Gruppe 3 wurde mit C1D5E4, einem i. p.-verabreichten partiell gereinigten CV-Extrakt behandelt, Gruppe 4 wurde mit C1D5EX, einem i. p.-verabreichten partiell gereinigten CV-Extrakt behandelt, und Gruppe 5 wurde als negative Kontrolle mit i. p.-verabreichter normaler Kochsalzlösung behandelt.
  • Tabelle VIII zeigt die Dosis und das Dosierschema für jede Gruppe. Die Mäuse der Gruppen 1–5 wurden am 8. Tag getötet.
  • Der CV-Rohextrakt wurde in der in dem obigen Beispiel VI beschriebenen Weise für die intraperitoneale oder orale Verabreichung zubereitet und aufbewahrt. TABELLE VIII
    Behandelte Gruppe Anzahl der Mäuse Cyclophosphamid-Dosis & -Dosierungsschema CV-Dosis & -Dosierungsschema Verabreichungsweg
    1 5 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml, injiziert in eine Maus von etwa 25 g) C1D5E8 50 mg/kg/Tag an den Tagen 5–7 (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml, injiziert in eine Maus von etwa 25 g) i. p.
    2 5 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml, injiziert in eine Maus von etwa 25 g) C1D5E7 50 mg/kg/Tag an den Tagen 5–7 (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml, injiziert in eine Maus von etwa 25 g) i. p.
    Behandelte Gruppe Anzahl der Mäuse Cyclophosphamid-Dosis & -Dosierungsschema CV-Dosis & -Dosierungsschema Verabreichungsweg
    3 5 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml, injiziert in eine Maus von etwa 25 g) C1D5E4 50 mg/kg/Tag an den Tagen 5–7 (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml, injiziert in eine Maus von etwa 25 g) i. p.
    4 5 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml, injiziert in eine Maus von etwa 25 g) C1D5EX 50 mg/kg/Tag an den Tagen 5–7 (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml, injiziert in eine Maus von etwa 25 g) i., p.
    5 5 20 mg/kg/Tag am Tag 1 (0,5 ml einer Lösung von 1 mg/ml, injiziert in eine Maus von etwa 25 g) 0,25 ml sterile normale Kochsalzlösung, pH 7,4, an den Tagen 5–7 i. p.
  • 1. Wirkung der i. p.-Verabreichung von partiell gereinigtem CV-Extrakt in vivo auf die Vermehrung von lebenden Maus-Splenozyten aus normalen Mäusen
  • Alle Gruppen (Gruppen 1–4) (p < 0,001) zeigten eine erhöhte Anzahl von in vivo-lebenden Splenozyten im Vergleich mit Kontrollmäusen (Gruppe 5). (Siehe 23A). Die Gruppen 1–3, C1D5E8, C1D5E7 und C1D5E4 zeigten jeweils eine Erhöhung der Anzahl der Splenozyten um etwa 100%. Gruppe 4, C1D5EX (der partiell gereinigte CV-Extrakt mit dem höchsten Molekulargewicht) zeigte eine Erhöhung der Anzahl der Splenozyten von etwa 64%.
  • Die Splenozyten wurden gewonnen und isoliert, wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist. Die resultierende Zellsuspension wurde zubereitet und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde getestet, wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist.
  • 2. Wirkung von i. p.-verabreichtem partiell gereinigtem CV-Extrakt auf die Vermehrung in vivo von lebenden Knochenmarkzellen aus normalen Mäusen
  • Alle Gruppen (Gruppen 1–4) zeigten eine Erhöhung der Anzahl der lebenden Knochenmarkzellen in vivo im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 5). (Siehe 23B). Nur Gruppe 4, C1D5EX, zeigte einen statistisch signifikanten Anstieg (p < 0,002) der Zahl der lebenden Knochenmarkzellen.
  • Die Knochenmarkzellen wurden gewonnen und isoliert, wie vorstehend in Beispiel IV beschrieben ist. Die resultierende Zellsuspension wurde zubereitet und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde getestet, wie oben in Beispiel III beschrieben ist.
  • Beispiel XX
  • Verabreichung von partiell gereinigtem CV-Extrakt an immun-geschädigte Mäuse
  • Allgemeine Materialien und Methoden
  • 25 ICR-Mäuse wurden in Gruppen von je 5 Mäusen unterteilt. Wie in Tabelle IX gezeigt ist, wurden die Gruppen wie folgt behandelt. Die Mäuse der Gruppen 1–5 wurden einer Immunsuppression unterzogen, wie oben in Beispiel VII beschrieben ist. Gruppe 1 wurde mit oral verabreichtem C1D5E8, einem partiell gereinigten CV-Extrakt behandelt, Gruppe 2 wurde mit oral verabreichtem C1D5E7, einem partiell gereinigten CV-Extrakt behandelt, Gruppe 3 wurde mit oral verabreichtem C1D5E4, einem partiell gereinigten CV-Extrakt behandelt, Gruppe 4 wurde mit oral verabreichtem C1D5EX, einem partiell gereinigten CV-Extrakt behandelt und Gruppe 5 wurde mit oral verabreichtem entionisierten Wasser als negative Kontrolle behandelt. Tabelle IX zeigt die Dosis und das Dosierschema für jede Gruppe. Die Mäuse der Gruppen 1–5 wurden am Tag 8 getötet.
  • Das Cyclophosphamid wurde in der in dem obigen Beispiel VII beschriebenen Weise zubereitet und verabreicht.
  • Der CV-Rohextrakt wurde wie in dem obigen Beispiel VI beschrieben ist, hergestellt und für die i. p.- oder orale Verabreichung aufbewahrt. TABELLE IX
    Behandelte Gruppe Anzahl der Mäuse Partiell gereinigtes CV-Fragment & Dosis CV-Dosierschema Verabreichungsweg
    1 5 C1D5E8 50 mg/kg/Tag (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml, oral an eine Maus von etwa 25 g) An den Tagen 1–7 oral
    Behandelte Gruppe Anzahl der Mäuse Partiell gereinigtes CV-Fragment & Dosis CV-Dosierschema Verabreichungsweg
    2 5 C1D5E7 50 mg/kg/Tag (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml, oral an eine Maus von etwa 25 g) An den Tagen 1–7 oral
    3 5 C1D5E4 50 mg/kg/Tag (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml, oral an eine Maus von etwa 25 g) An den Tagen 1–7 oral
    4 5 C1D5EX 50 mg/kg/Tag (0,25 ml einer Lösung von 5 mg/ml, oral an eine Maus von etwa 25 g) An den Tagen 1–7 oral
    5 5 0,25 ml entionisiertes Wasser An den Tagen 1–7 oral
  • 1. Wirkung der oralen Verabreichung von partiell gereinigtem CV-Extrakt auf die in vivo-Vermehrung von lebenden Maus-Splenozyten aus immun-geschädigten Mäusen
  • Partiell gereinigter CV-Extrakt, der oral an die Mäuse der Gruppen 1–4 verabreicht wurde, erhöhte die Anzahl der lebenden Splenozyten in vivo im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 5). (Siehe 24A). C1D5E8, das an Gruppe 1 verabreicht wurde, erhöhte die Anzahl der lebenden Splenozyten in vivo signifikant (p < 0,01) (um 66%) im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 5). C1D5E7, das an Gruppe 2 verabreicht wurde, erhöhte (p < 0,01) die Anzahl der lebenden Splenozyten in vivo signifikant im Vergleich mit Kontrollmäusen (Gruppe 5). C1D5E4, das an Gruppe 3 verabreicht wurde, erhöhte (p < 0,05) die Anzahl der lebenden Splenozyten in vivo wesentlich im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 5). C1D5EX, das an Gruppe 4 verabreicht wurde, erhöhte die Anzahl der lebenden Splenozyten in vivo nicht signifikant im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 5).
  • Splenozyten wurden wie in dem obigen Beispiel beschrieben ist, gewonnen und isoliert. Die resultierende Zellsuspension wurde zubereitet und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde getestet, wie oben in Beispiel III beschrieben ist.
  • 2. Wirkung der oralen Verabreichung von partiell gereinigtem CV-Extrakt auf die Vermehrung in vivo von lebenden Knochenmarkzellen aus immun-geschädigten Mäusen
  • Alle Gruppen (Gruppen 1–4) zeigten eine Erhöhung der Anzahl der lebenden Knochenmarkzellen in vivo im Vergleich mit den Kontrollmäusen (Gruppe 5). (Siehe 24B).
  • C1D5E8, das an Gruppe 1 verabreicht wurde, erhöhte (p < 0,001) die Anzahl der lebenden Knochenmarkzellen in vivo signifikant im Vergleich mit Kontrollmäusen (Gruppe 5). C1D5E7, C1D5E4, C1D5EX, die jeweils an Gruppe 2, Gruppe 3 und Gruppe 4 verabreicht wurden, erhöhten (p < 0,05) die Anzahl der lebenden Knochenmarkzellen in vivo wesentlich im Vergleich mit Kontrollmäusen (Gruppe 5).
  • Die Knochenmarkzellen wurden gewonnen und isoliert, wie in dem obigen Beispiel IV beschrieben ist. Die resultierende Zellsuspension wurde hergestellt und die Lebensfähigkeit der Zellsuspension wurde getestet, wie in dem obigen Beispiel III beschrieben ist.
  • 1. Pflege der Spezies
  • Mäuse des Institute of Cancer Research (ICR) (Inzuchtstamm) wurden durch das Animal House, The Chinese University of Hong Kong, bezogen. Die Mäuse werden in einer Zahl von nicht mehr als 20 Tiere pro Käfig gehalten. Die Mäuse werden in einer Einrichtung gehalten, in der die Temperatur bei 18–26°C gehalten und die relative Feuchtigkeit zwischen etwa 40–70% gehalten wird. Der Hell/Dunkel-Zyklus wird auf 12-Stunden-Intervalle eingestellt. Die Mäuse wurden mit einer Diät aus Standard-Nagetierfutter gehalten. Die in den obigen Beispielen verwendeten Mäuse hatten ein Gewicht von 25–30 g und waren 8–12 Wochen alt.
  • 2. Caco-Zell-Kultur
  • Caco-2-Zellen (bezogen von der American Type Culture Collection, Rockville, Md.) (Durchgang (Passage) 30 bis 50) wurden bei 37°C in DMEM-Medium, das mit 25 mM D-Glucose versetzt war, die 10% FBS, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 1% L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) enthielt, in einer Atmosphäre von 5% CO2 und 90% O2 (von Gibbs BRL, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Md.) gezüchtet und routinemäßig aufrechterhalten. Die Zellen wurden bei einer Konfluenz von 70% mit 0,05% Trypsin-EDTA gewonnen und auf ein Polycarbonat-Filter, das vorher mit Kollagen Typ I beschichtet worden war (3,0 μm-Poren, 4,71 cm2 Wachstumsfläche) im Inneren der Transwell-Zellkultur-Kammern (bezogen von Costar-Corning, Rockville, Md.) in einer Zelldichte von 3 × 105 Zellen pro Filter aufgeimpft. Das Kulturmedium (1,5 ml in dem Transwell-Einsatz und 2,6 ml in der Clusterplatte) wurde alle 48 Stunden ersetzt.
  • Die Monoschichten wurden an den Tagen 21 bis 25 nach dem Beimpfen verwendet.
  • 3. Puffer
    • Lysepuffer
    • 8,29 g NH4Cl
    • 1,002 g NaHCO3
    • 29,2 mg EDTA
  • Alles wurde in 1 1 entionisiertem Wasser gelöst, der pH auf 7,2 eingestellt und durch Filtration durch sterile 0,22 μm-Filter sterilisiert.
  • 4. Vollständiges Zellkulturmedium
  • RMPI 1640-Medium (Gibco), mit dem Zusatz von 10% (Volumen/Volumen) fötalem Kälberserum (FBS), 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin.
  • Alle vorstehend zitierten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen werden in ihre Gesamtheit zur Bezugnahme für alle Zwecke im gleichen Maß wie wenn jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell als Referenz zur Bezugnahme angegeben wäre, eingebracht. Obwohl die vorliegende Erfindung detailliert zur Verdeutlichung und als Beispiel für die Zwecke der Klarheit und des Verständnis beschrieben wurde, ist ersichtlich, dass gewisse Änderungen und Modifizierungen innerhalb des Bereiches der beigefügten Patentansprüche vorgenommen werden können. Wenn nichts anderes aus dem Kontext ersichtlich ist, können die Elemente, Stufen, Merkmale und Ausführungsformen der in dieser Anmeldung beschriebenen Erfindung in allen Kombinationen miteinander angewendet werden.
  • LITERATURSTELLEN
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    • 11. Ikuzawa M., Oguchi Y., Matsunaga K., Toyoda N., Furusho T., Fujii T., Yoshikumi C. US-Pat. Nr. 5,008,243 : Pharmaceutical composition containing a glycoprotein, 6. April 1991.
    • 12. Suguira M., Ohno H., Sasaki Y., Mama K. US-Pat. Nr. 4,225,673 : Glucan having antitumor activity, 30. September 1980.
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    • 14. Yang M. P., Chef G. US-Pat. Nr. 6,087,335 : Rnase-CV (Coriolus versicolor), 11. Juli 2000.

Claims (50)

  1. Gereinigter Extrakt von Coriolus versicolor, enthaltend mindestens ein Peptid-verknüpftes Glucan, das durch eine (1→3)-Bindung verknüpfte Glucosemoleküle umfasst, ein durchschnittliches Molekulargewicht von 0,7 kDa bis 3 kDa, bestimmt durch Größenausschluss-Chromatografie aufweist und immunstimulierende Aktivität hat.
  2. Gereinigter Extrakt nach Anspruch 1, wobei das Molekulargewicht 0,7 kDa ist.
  3. Gereinigter Extrakt nach Anspruch 1, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht 2,6 kDa ist.
  4. Gereinigter Extrakt nach Anspruch 2, wobei das Peptidverknüpfte Glucan zur intestinalen Resorption befähigt ist, wie durch die Caco-2-Zellmonoschicht-Transwellmethode bestimmt wird.
  5. Gereinigter Extrakt nach Anspruch 3, wobei das Peptidverknüpfte Glucan zur intestinalen Resorption befähigt ist, wie durch die Caco-2-Zellmonoschicht-Transwellmethode bestimmt wird.
  6. Gereinigter Extrakt nach Anspruch 1, hergestellt durch Behandeln von Coriolus versicolor mit Alkali und Abtrennen eines Überstands, Unterwerfen des Überstands dem Kationenaustausch, Behandeln des Eluats aus dem Kationenaustausch durch Anionenaustausch, Behandeln des Eluats aus dem Anionenaustausch durch eine Größenfraktionierungsmethode und Gewinnen einer Fraktion, die das mindestens eine Peptid-verknüpfte Glucan enthält.
  7. Gereinigter Extrakt nach Anspruch 6, wobei die Größenfraktionierungsmethode Molekülausschluss-Chromatografie oder ethanolische Fraktionierung ist.
  8. Gereinigter Extrakt nach Anspruch 6, wobei der Kationenaustausch an einer CM-Cellulosekolonne durchgeführt wird.
  9. Gereinigter Extrakt nach Anspruch 6, wobei der Anionenaustausch an einer DEAE-Cellulosekolonne durchgeführt wird.
  10. Gereinigter Extrakt nach Anspruch 1, wobei das Peptidverknüpfte Glucan in Wasser, Ethanol und Aceton löslich ist, in Chloroform und Dichloroform unlöslich ist und nicht hygroskopisch ist.
  11. Isoliertes Peptid-verknüpftes Glucan aus Coriolus versicolor, das mehrere durch eine (1→3)-Bindung verknüpfte Glucosemoleküle enthält und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 0,7 kDa bis 3,0 kDa, bestimmt durch Größenausschluss-Chromatografie, aufweist, wobei das isolierte Peptid-verknüpfte Glucan immunstimulierende Aktivität besitzt.
  12. Gereinigter Extrakt nach Anspruch 1, wobei das Peptidverknüpfte Glucan zur intestinalen Resorption befähigt ist, bestimmt durch die Caco-2-Zellmonoschicht-Transwellmethode.
  13. Mehrere der Peptid-verknüpften Glucane nach Anspruch 11, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht 0,8 kDa ist.
  14. Peptid-verknüpftes Glucan nach Anspruch 11, wobei das Molekulargewicht 0,7 kDa ist.
  15. Mehrere der Peptid-verknüpften Glucane nach Anspruch 11, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht 2,6 kDa ist.
  16. Mehrere der Peptid-verknüpften Glucane nach Anspruch 11, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht weniger als 3,0 kDa ist.
  17. Peptid-verknüpftes Glucan nach Anspruch 11, wobei das Peptid-verknüpfte Glucan zur intestinalen Resorption befähigt ist, wie durch die Caco-2-Zellmonoschicht-Transwellmethode bestimmt wird.
  18. Peptid-verknüpftes Glucan nach Anspruch 11, hergestellt durch Behandeln von Coriolus versicolor mit Alkali und Abtrennen eines Überstands, Unterwerfen des Überstands dem Kationenaustausch, Behandeln des Eluats aus dem Kationenaustausch durch Anionenaustausch, Unterwerfen des Eluats aus dem Anionenaustausch einer Größenfraktionierungsmethode und Gewinnen einer Fraktion, die das eine Peptid-verknüpfte Glucan enthält.
  19. Peptid-verknüpftes Glucan nach Anspruch 18, wobei die Größenfraktionierungsmethode Molekülausschluss-Chromatografie oder ein Ethanol-Stufengradient ist.
  20. Peptid-verknüpftes Glucan nach Anspruch 18, wobei der Kationenaustausch an einer CM-Cellulosekolonne durchgeführt wird.
  21. Peptid-verknüpftes Glucan nach Anspruch 11, das weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 ist.
  22. Arzneimittelzusammensetzung, welche den Extrakt oder das isolierte Peptid-verknüpfte Glucan nach einem der vorhergehenden Patentansprüche enthält.
  23. Verfahren zur Reinigung eines Peptid-verknüpften Glucans aus der Behandlung von Coriolus versicolor mit Alkali und Abtrennen eines Überstands, bei dem der Überstand dem Kationenaustausch unterworfen wird, das Eluat aus dem Kationenaustausch dem Anionenaustausch unterworfen wird, das Eluat aus dem Anionenaustausch einer Größenfraktionierungsmethode unterworfen wird und eine Fraktion gewonnen wird, die das Peptid-verknüpfte Glucan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 0,7 bis 3 kDa enthält.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Behandlungsstufen das Mazerieren von Fruchtkörpern von Coriolus versicolor, die Extraktion der mazerierten Fruchtkörper von Coriolus versicolor mit Alkali, um einen Extrakt zu erhalten, das Entfernen der unlöslichen Materialien aus dem Extrakt, das Klären des Überstands aus dem ersten Extrakt, und das Konzentrieren des Überstands, um einen dritten Extrakt zu erhalten, umfasst, wobei der dritte Rohextrakt dem Kationenaustausch unterworfen wird.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Alkali-Extraktionsstufe das Kochen der mazerierten Fruchtkörper von Coriolus versicolor in einer wässerig-alkalischen Lösung umfasst.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die wässerigalkalische Lösung aus der aus Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  27. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die wässerig-alkalische Lösung eine Normalität von weniger als oder gleich 0,1 n hat.
  28. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die wässerigalkalische Lösung eine Normalität von 0,01 n hat.
  29. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die unlöslichen Materialien aus dem ersten Extrakt durch Filtration entfernt werden.
  30. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Fraktion, die das Peptid-verknüpfte Glucan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 0,7 bis 3 kDa enthält, durch Zentrifugieren geklärt wird.
  31. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Fraktion, die das Peptid-verknüpfte Glucan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 0,7 bis 3 kDa enthält, durch Rotationsverdampfung, Gefrieren oder Lyophilisieren konzentriert wird.
  32. Verfahren zum Stimulieren einer Immunantwort, welches das Kontaktieren von Zellen des Immunsystems in vitro mit dem Extrakt, dem Peptid-verknüpften Glucan oder einer aktiven Komponente davon gemäß einem der Ansprüche 1, 6 oder 11 umfasst.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Zellen Splenozyten oder Knochenmarkzellen sind und der in vitro-Kontakt eine Wachstumsreaktion der Zellen hervorruft.
  34. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Zellen Makrophagen sind und der in vitro Kontakt die Abscheidung von Stickstoffoxid durch die Zellen hervorruft.
  35. Verwendung eines Extrakts oder gereinigten Peptidverknüpften Glucans gemäß Ansprüchen 1, 6, 11 oder 24 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten, der eine Stimulierung des Immunsystems benötigt.
  36. Verwendung nach Anspruch 35, wobei der Patient an Immunmangel leidet.
  37. Verwendung nach Anspruch 35, wobei der Patient symptomlos ist, jedoch empfänglich für Immunmangel ist.
  38. Verwendung nach Anspruch 35, wobei der Immunmangel das Ergebnis einer Infektion, einer bösartigen neoplastischen Krankheit, einer Autoimmunerkrankung, des Zustands bei Proteinverlust, einer Immunsuppressions-Behandlung, einer Operation oder Anästhesie ist.
  39. Verwendung nach Anspruch 38, wobei die Infektion aus der aus Rubella, angeborener Rubella, Masern, Lepra, Tuberkulose, Coccidioidomycose, chronischer Infektion, akuter Virusinfektion, Zytomegalovirus, multipler viraler Infektion und wiederholter viraler Infektion bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  40. Verwendung nach Anspruch 38, wobei die bösartige neoplastische Krankheit aus der aus Hodgkin's-Krankheit, akuter Leukämie, chronischer Leukämie, nicht-lymphoidem Krebs und Myelom bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  41. Verwendung nach Anspruch 38, wobei die Autoimmunerkrankung aus der aus systemischen Lupus erythematosus (SLE), rheumatoider Arthritis und chronischer aktiver Hepatitis bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  42. Verwendung nach Anspruch 38, wobei der Zustand bei Proteinverlust aus der aus dem nephrotischen Syndrom und mit Proteinverlust verbundene Enteropathie bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  43. Verwendung nach Anspruch 38, wobei die Immunsuppressions-Behandlung aus der aus Behandlung mit Corticosteroiden, zytotoxischen Arzneimitteln, Alkylierungsmitteln, Antimetaboliten, Antithymozyt-Globulin, Strahlung, Cyclosporin, Phenytoin und Penicillamin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  44. Verwendung nach Anspruch 38, wobei der Immunmangel das Ergebnis eines Zustands ist, der aus der aus Diabetes, alkoholischer Zirrhose, Mangelernährung, Verbrennungen, Sarkoidose, Splenektomie, Sichelzell-Krankheit, Urämie, Alterung, subakuter sklerosierender Panenkaphalitis, Down's-Syndrom, neugeborene und unreife Babys bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  45. Verwendung nach Anspruch 35, wobei die Immunantwort die Vermehrung von Splenozyten oder Knochenmarkzellen oder die Ausscheidung von Stickstoffoxid durch Makrophagen umfasst.
  46. Verwendung nach Anspruch 35, das weiterhin die Überwachung eines Symptoms des Patienten umfasst, um die Verbesserung oder Verhütung eines Symptoms, das auf die Verabreichungsstufe anspricht, umfasst.
  47. Verwendung nach Anspruch 35, wobei der Immunmangel ein erworbener Immunmangel in einem Patienten ist.
  48. Verwendung nach Anspruch 47, wobei der erworbene Immunmangel das Ergebnis einer Infektion mit dem menschlichen Immundefizienzvirus (HIV) ist.
  49. Verwendung nach Anspruch 48, wobei der Patient an einer Störung leidet oder für diese empfänglich ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Herpesvirus Typ I, Herpesvirus Typ II, Cytomegalovirus, Varicella, Adenovirus, Epstein-Barr-Virus, HTLV-I, HTLV-III, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Nocardia sps., Pneumocystis carinii, Toxoplasma gondii, Isospora sp. Cyptosporidium, Giardia lamblia, Entamoebahistolytica, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium-intracellulare, Mycobacterium kansasii, Legionella sp, Treponema sp, Treponema pallidum, Campylobacter sp, Neisseria sp, Neisseria gonorrhoeae, Shigella sp, Salmonella sp, und Chlamydia besteht.
  50. Verwendung nach Anspruch 35, welches außerdem die Überwachung der Vermehrung der Splenozyten und/oder Knochenmarkzellen in einem Patienten umfasst, um die Immunstimulierung als Antwort auf die Verabreichungsstufe festzustellen.
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