CN106047968A - 大鲵活性肽及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种大鲵活性肽及用途，是以大鲵肉为原料，通过海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶进行酶解，酶解产物通过胰蛋白酶固定超滤膜分离器进行分离，再通过Sephadex LH‑20分子筛层析、高效液相色谱分离纯化后得到的大鲵活性肽。该大鲵活性肽即能够有效清除自由基、提高机体免疫力，同时还能够促进皮肤纤维原细胞增殖，在食品、医药和化妆品领域中有广阔的应用前景。

Description

大鲵活性肽及用途
技术领域
本发明属于大鲵制品，尤其是涉及一种同时具备可清除自由基、提高机体免疫力以及促皮肤纤维原细胞生长作用的大鲵活性肽及用途。
背景技术
研究表明，大鲵的肌肉、皮肤、内脏、脂肪、血液等含有丰富的蛋白质、氨基酸、脂肪酸及微量元素等，对大鲵蛋白质进行深加工，可以获得一系列益于人类生命活动的大鲵生物活性肽，是保健食品及药品的潜在来源。目前，大鲵生物活性肽大多是以大鲵的肌肉、皮肤、内脏、脂肪、血液为原料，通过酶解、分离等技术制备而成，但是不同部位的原料，以及使用不同的酶和酶解时间、采用不同的分离技术，可以得到具有不同功能的活性肽，但大多功能单一。迄今为止，还没有关于同时具备可清除自由基、提高机体免疫力以及促皮肤纤维原细胞生长作用的大鲵活性肽的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种同时具备可清除自由基、提高机体免疫力以及促皮肤纤维原细胞生长作用的大鲵活性肽及用途。
本发明的技术解决方案是：一种大鲵活性肽，其特征在于按照如下步骤制备：
a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入1~3倍体积pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0.1~1%的复合酶，酶解12~48 h；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按活力单位比为7:3比例混合；
b. 离心取上清，采用截留分子量为4000 Da以下用物理吸附法制备的胰蛋白酶固定超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体；
c. 通过Sephadex LH-20分子筛层析柱，按每管1ml收集层析产物，取第30~36管层析产物进行冷冻干燥；
d．将c步骤所得到的冷冻干燥物制备成10~50mg/ml的去离子水溶液，8000 rpm、4℃条件下离心10 min，用0.22 µm水膜过滤，得到上样上清液；
e. 使用ddH2O 配制5%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A，使用ddH2O 配制95%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B；使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0~20min，流动相A100%；20.5~40min，流动相A50%，流动相B50%；40.5~60min, 流动相B100%；将上液上清液注入C18柱高效液相色谱仪进样口，收集紫外检测波长280 nm的吸收峰；
f. 挥发收集物中的甲醇后真空冷冻干燥，得到大鲵肽制品。
一种上述的大鲵活性肽在制备清除自由基产品中的应用。
一种上述的大鲵活性肽在制备提高机体免疫力产品中的应用。
一种上述的大鲵活性肽在制备促进皮肤纤维原细胞增殖产品中的应用。
本发明是以大鲵肉为原料，通过海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶进行酶解，酶解产物通过胰蛋白酶固定超滤膜分离器进行分离，再通过Sephadex LH-20分子筛层析、高效液相色谱分离纯化后得到的大鲵活性肽。该大鲵活性肽即能够有效清除自由基、提高机体免疫力，同时还能够促进皮肤纤维原细胞增殖，在食品、医药和化妆品领域中有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例Sephadex LH-20分子筛层析图。
图2是本发明实施例的高效液相色谱图。
图3是本发明实施例大鲵活性肽的一级质谱图。
图4至图11是本发明实施例大鲵活性肽的二级质谱图。
图12是本发明实施例大鲵活性肽清除DPPH自由基的能力示意图。
图13是本发明实施例大鲵活性肽清除ABTS自由基的能力示意图。
图14是本发明实施例大鲵活性肽提高小鼠脾细胞中的IgG值验结果图。
图15是本发明实施例大鲵活性肽对小鼠吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数结果图。
图16是本发明实施例大鲵活性肽对小鼠T淋巴细胞ANAE染色数结果图。
图17是本发明实施例大鲵活性肽对小鼠皮肤的纤维原细胞的影响示意图。
具体实施方式
实施例1：
按照如下步骤进行：
a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入1倍体积pH 7的0.01M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0.1%的复合酶，酶解12 h；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按活力单位比为7:3比例混合；
b. 离心取上清，采用截留分子量为4000 Da以下用物理吸附法制备的胰蛋白酶固定超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体；
c. 通过Sephadex LH-20分子筛层析柱（15mm×1000mm），按每管1ml收集层析产物，取第30~36管层析产物进行冷冻干燥，如图1所示：所收集的层析产物是OD280nm的吸收峰（峰II）；
d．将c步骤所得到的冷冻干燥物制备成10mg/ml的去离子水溶液，8000 rpm、4℃条件下离心10 min，用0.22 µm水膜过滤，得到上样上清液；
e. 使用ddH2O 配制5%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A，使用ddH2O 配制95%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B；使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0~20min，流动相A100%；20.5~40min，流动相A50%，流动相B50%；40.5~60min, 流动相B100%；将上液上清液注入C18柱P230型高效液相色谱仪进样口，收集UV230紫外检测波长280 nm的吸收峰；
f. 在通风厨挥发收集物中的甲醇后真空冷冻干燥，得到大鲵肽制品。
实施例2：
按照如下步骤进行：
a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入3倍体积pH 8的0.1M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为1%的复合酶，酶解48 h；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按活力单位比为7:3比例混合；
b. 离心取上清，采用截留分子量为4000 Da以下用物理吸附法制备的胰蛋白酶固定超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体；
c. 通过Sephadex LH-20分子筛层析柱（15mm×1000mm），按每管1ml收集层析产物，取第30~36管层析产物进行冷冻干燥，如图1所示：所收集的层析产物是OD280nm的吸收峰（峰II）；
d．将c步骤所得到的冷冻干燥物制备成10mg/ml的去离子水溶液，8000 rpm、4℃条件下离心10 min，用0.22 µm水膜过滤，得到上样上清液；
e. 使用ddH2O 配制5%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A，使用ddH2O 配制95%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B；使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0~20min，流动相A100%；20.5~40min，流动相A50%，流动相B50%；40.5~60min, 流动相B100%；将上液上清液注入C18柱P230型高效液相色谱仪进样口，收集UV230紫外检测波长280 nm的吸收峰；
f. 在通风厨挥发收集物中的甲醇后真空冷冻干燥，得到大鲵肽制品。
实施例3：
按照如下步骤进行：
a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入2倍体积pH 8的0.1M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0.5%的复合酶，酶解34 h；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按活力单位比为7:3比例混合；
b. 离心取上清，采用截留分子量为4000 Da以下用物理吸附法制备的胰蛋白酶固定超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体；
c. 通过Sephadex LH-20分子筛层析柱（15mm×1000mm），按每管1ml收集层析产物，取第30~36管层析产物进行冷冻干燥；如图1所示：所收集的层析产物是OD280nm的吸收峰（峰II）；
d．将c步骤所得到的冷冻干燥物制备成10mg/ml的去离子水溶液，8000 rpm、4℃条件下离心10 min，用0.22 µm水膜过滤，得到上样上清液；
e. 使用ddH2O 配制5%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A，使用ddH2O 配制95%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B；使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0~20min，流动相A100%；20.5~40min，流动相A50%，流动相B50%；40.5~60min, 流动相B100%；将上液上清液注入C18柱P230型高效液相色谱仪进样口，如图2所示，收集UV230紫外检测波长280 nm的吸收峰1；
f. 在通风厨挥发收集物中的甲醇后真空冷冻干燥，得到大鲵肽制品。
将实施例1或2或3所得到的冷冻干燥物制备成5~10mg/ml的去离子水溶液，使用液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪，经过如图3所示的一级质谱图，如图4所示的二级质谱，在NCBI上进行BLAST的分析，得到m/z为928.4271氨基酸序列为HDCDLLR以及m/z为1261.6527氨基酸序列为LEAQSRPFDAK的两个抗氧化大鲵肽。
实验：
一．本发明实施例大鲵活性肽清除自由基能力
1．本发明实施例大鲵活性肽清除DPPH 自由基能力
将本发明实施例所得大鲵活性肽用去离子水配成不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml）的溶液，分别取2ml不同浓度样品溶液于试管中，加入2ml所配置的DPPH溶液（0.004gDPPH粉末加到50mL容量瓶，用95%乙醇定容，4℃下避光保存），混合均匀，室温避光30min。在10000rpm离心10min，取上清于517nm下测定吸光度Aj，同时测2ml不同样品溶液加2ml的95%乙醇的吸光度Ai，2mlDPPH加2mL蒸馏水的吸光度A0。
DPPH自由基清除率（%）=[A0-(Aj-Ai)]/A0×100%
式中：A0空白对照的吸光值； Aj样液的吸光值；Ai 本身的吸光值
结果如图5所示：大鲵活性肽清除DPPH自由基的能力随着大鲵肽浓度的增加而增加（图5）。
2．本发明实施例大鲵活性肽清除ABTS的能力
用蒸馏水配置 ABTS使浓度为7.4mmol/L，然后与2.6 mmol/L的K2S2O8均匀混合，黑暗室温放置12 h。用95%乙醇溶液稀释，使其能在波长为734 nm处的吸光度值为0.70±0.02A，即得到ABTS自由基储备液。在试管中加入0.9ml不同浓度（20、60、100、140、180µg/ml）的本发明大鲵活性肽溶液和2ml的ABTS自由基储备液，在室温条件下放置6min，随后在转速10000rpm下离心10min，取上清液在波长734nm处进行测定。
ABTS自由基清除率（%）=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%
式中：A0 空白对照的吸光值； Ai 样液的吸光值； Aj 本身的吸光值
结果如图6所示：大鲵肽清除ABTS自由基的能力随着大鲵活性肽浓度的增加而增加。
二．本发明实施例大鲵活性肽提高小鼠免疫能力的测定
清洁级昆明种小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，于12 h黑暗，12 h光亮的塑料饲养箱内饲养，室温20±2℃，湿度40% ~ 60%，自由采食和饮水。32只小鼠随机分为4组：对照组以及低、中、高3个剂量组。将本发明实施例的大鲵活性肽溶于生理盐水中，每天定时等体积灌胃1次，灌胃的大鲵肽分别为0、0.01、0.05、0.1 g/（kg·bw），连续灌胃8 d。最后一次灌服大鲵肽后1 h，摘眼球取血。将采集的全血于37℃恒温30 min，然后于4℃冰箱中1h，在3000rpm下离心3 min，分离血清。将抗小鼠IgG单抗溶液包被于酶标板上，每孔中加入100μl待测血清，37℃孵育2 h。PBS洗板3次后，每孔中加入生物素标记的抗小鼠IgG单抗100μl，37℃孵育1 h。PBS洗板3次后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin）与生物素结合，加入酶底物（0.4mg/ml邻苯二胺和0.1 M的柠檬酸-磷酸缓冲液中的0.01%H2O2，pH 5.0）。反应10 min后，每孔加入50μl 0.2 M的H2SO4终止反应。在492nm处测定吸光值。通过标准曲线求出对应的IgG值。
连续灌胃8 d，与对照组相比，低、中、高剂量组小鼠血清中IgG数量差异显著（P<0.05），如图7所示，其中50mg/kg剂量组高出对照组的2.5倍。IgG起着激活补体，中和多种毒素的作用，同时它也是反应机体免疫状态的重要指标。大鲵肽可以显著增加小鼠的IgG数量。因此，它具有对正常小鼠体液免疫功能的促进作用。
最后一次灌服大鲵活性肽后1 h，腹腔注入20%（v/v,生理盐水配制）鸡红细胞悬液1ml。30 min后，腹腔注射生理盐水，取腹腔液涂片，瑞氏染色，计数200个巨噬细胞，计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数。
实验结果显示，连续灌胃8 d后各剂量组吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数显著增多。计数200个巨噬细胞，其中50mg/kg剂量组吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数达133个（图8）。结果表明：大鲵低聚糖肽具有提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的功能。图8计数200个巨噬细胞，*为P<0.05
取小鼠新鲜血液0.5ml， 置于载玻片上，吹干。在4℃的福尔马林-丙酮固定液中，固定1min。取出蒸馏水冲洗3 min，吹干。用4%副品红盐酸溶液、4%亚硝酸钠溶液以及2%α-醋酸萘酯乙二醇甲醚溶液组成的孵育液于37℃孵育1.5 h。孵育后蒸馏水冲洗3 min。用2%的甲基绿复染1 min，油镜观察。计数200个T淋巴细胞，以胞浆内含有1个或数个棕红色颗粒者为α-醋酸萘酯酶（ANAE）阳性淋巴细胞。
ANAE是T淋巴细胞溶酶体中重要的非特异性同工酶。ANAE阳性率反应T淋巴细胞免疫水平。从图9可以看出，连续灌胃大鲵肽8 d后50mg/kg剂量组ANAE阳性率显著高于对照组（计数200个T淋巴细胞，P<0.05），即大鲵肽能增强小鼠的细胞免疫功能。
三．本发明实施例大鲵活性肽促进小鼠皮肤的纤维原细胞增殖作用
来自于Balb/c 小鼠皮肤的纤维原细胞制成悬浮液（5×103个细胞/孔）接种于96孔培养板中，加入本发明实施例大鲵活性肽溶液，使最终浓度分别为2、20、200 µg/ml。于37℃5% CO2培养箱中分别培养36 h后，每孔加入10 μl 四唑溶液（细胞计数试剂盒kit-8），混匀后，在培养箱中继续孵育2 h，测定其在450 nm处的吸光值。
随着大鲵肽浓度的增加，小鼠皮肤的纤维原细胞显著增加，这表明本发明实施例大鲵活性肽可以显著促进小鼠皮肤的纤维原细胞增殖作用（图10）。
本发明实施例1、2、3的大鲵活性肽上述效果一致，可应用于制备清除自由基产品、制备提高机体免疫力产品及制备促进皮肤纤维原细胞增殖产品。
序列表
<110> 张家界（中国）金驰大鲵生物科技有限公司
<120>大鲵活性肽及用途
<160>2
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213>大鲵（ Andrias davidianus ）
<220>
<223>蛋白肽
<400>1
HDCDLLR 7
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213>大鲵（ Andrias davidianus ）
<220>
<223>蛋白肽
<400>2
LEAQSRPFDAK 11

Claims (4)

1.一种大鲵活性肽，其特征在于按照如下步骤制备：
a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入1~3倍体积pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0.1~1%的复合酶，酶解12~48 h；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按活力单位比为7:3比例混合；
b. 离心取上清，采用截留分子量为4000 Da以下用物理吸附法制备的胰蛋白酶固定超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体；
c. 通过Sephadex LH-20分子筛层析柱，按每管1ml收集层析产物，取第30~36管层析产物进行冷冻干燥；
d．将c步骤所得到的冷冻干燥物制备成10~50mg/ml的去离子水溶液，8000 rpm、4℃条件下离心10 min，用0.22 µm水膜过滤，得到上样上清液；
e. 使用ddH2O 配制5%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A，使用ddH2O 配制95%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B；使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0~20min，流动相A100%；20.5~40min，流动相A50%，流动相B50%；40.5~60min, 流动相B100%；将上液上清液注入C18柱高效液相色谱仪进样口，收集紫外检测波长280 nm的吸收峰；
f. 挥发收集物中的甲醇后真空冷冻干燥，得到大鲵肽制品。
2.一种如权利要求1所述的大鲵活性肽在制备清除自由基产品中的应用。
3.一种如权利要求1所述的大鲵活性肽在制备提高机体免疫力产品中的应用。
4.一种如权利要求1所述的大鲵活性肽在制备促进皮肤纤维原细胞增殖产品中的应用。
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