发明内容
本发明的目的在于提供一种生物活性多肽,其氨基酸序列为Gln-Glu-Pro-Val-Leu(QEPVL)(SEQ ID NO:1)。
较优的,所述生物活性多肽的来源为乳源性。
本发明的生物活性多肽QEPVL为乳源性,具体来源于β-酪蛋白,并且为β-酪蛋白第209~213位的氨基酸残基。
较优的,所述生物活性多肽具有体外抗氧化活性和增强机体免疫力的功能。
本发明的生物活性多肽可以通过基因工程的方法和化学方法人工合成,也可以从乳制品中通过分离纯化的方法直接获得。
本发明还公开了编码前述生物活性多肽的核苷酸片段。
β-酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列为既有技术,编码β-酪蛋白(SEQ ID NO:3)第209~213位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽QEPVL。
进一步的,编码前述生物活性多肽的核苷酸片段,其序列为:5‘-cag gag cct gta ctc-3’(SEQ ID NO:2)。
本发明第二方面公开了前述生物活性多肽的制备方法,步骤如下:
1)发酵:将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)添加到脱脂乳中进行厌氧发酵,获得瑞士乳杆菌发酵乳;
2)多肽的粗提:对步骤1)的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离,取上清液;
3)多肽的纯化:
a.对步骤2)的上清液进行超滤处理,收集滤液;
b.收集的滤液采用反向层析柱SOURSE5RPC ST(4.6×150mm)进行反相高效液相色谱分离,收集生物活性多肽QEPVL。
本发明所述脱脂乳为经过脱脂处理的牛乳,通常脱脂乳中脂肪含量小于0.1%。
较优的,步骤1)所述厌氧发酵的条件为:发酵温度36~38℃,发酵培养15~20h;优选发酵培养19h。
较优的,步骤2)所述低温离心的条件为:4℃,8000~10000rpm,离心15~30min。
较优的,步骤3)a所述超滤法所采用的滤膜的截留分子量分别为10kDa和3kDa。本发明采用截留分子量分别为10kDa、3kDa的滤膜,使样品依次通过两张滤膜进行超滤。
更优的,步骤3)a所述超滤过程中,压力范围为0.1~0.3MPa,滤液流速为0.8~1.2mL/min。
较优的,步骤3)b反相高效液相色谱分离法中,流动相A为含有2%乙腈和0.05%TFA的ddH2O;流动相B为100%乙腈。
较优的,步骤3)b反相高效液相色谱分离法中,收集分子量为585.32Da的多肽的洗脱峰,即为生物活性多肽QEPVL。
在本发明反相高效液相色谱法分离过程中,已知QEPVL的分子量,收集分子大小为585.32Da的洗脱峰,即为本发明的生物活性多肽QEPVL。具体的,本发明分子大小为585.32Da的洗脱峰其保留时间为33min。
本发明第三方面公开了前述生物活性多肽在制备抗氧化和/或增强机体免疫力的食品、保健品及药物中的应用。
本发明的生物活性多肽QEPVL在体外模拟胃肠道消化条件下可以被消化酶降解,获得生物活性多肽QEPV。并且,本发明通过实验证实不仅生物活性多肽QEPVL本身具有体外抗氧化活性和增强机体免疫力的功能,其经人体消化道消化后的产物QEPV也同样具有体外抗氧化活性和增强机体免疫力的功能。因此,生物活性多肽QEPVL在体内消化过程中可以先被消化酶消化降解,然后被动物机体吸收,继续发挥其生物活性。
本发明的生物活性多肽QEPVL可以用于制备减少自由基对皮肤伤害的化妆品、制备具有抗氧化和/或增强机体免疫力的注射类药物;并且由于本发明的生物活性多肽QEPVL通过胃肠道降解后的产物仍旧具有生物活性,因此还可以用于制备酸奶等食品、提高免疫力的保健品,以及口服的用于制备具有抗氧化和/或增强机体免疫力的药物。
本发明第四方面公开了一种抗氧化药物,包含前述生物活性多肽QEPVL或前述生物活性多肽QEPVL的衍生物。
本发明第五方面公开了一种增强机体免疫力药物,包含前述生物活性多肽QEPVL或前述生物活性多肽QEPVL的衍生物。
所述多肽的衍生物,是指在多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰,得到的多肽衍生物。
本发明生物活性多肽QEPVL的有益效果为:本发明的乳源性生物活性多肽QEPVL具有较好的抗氧化活性和促进机体免疫力活性;一方面能够清除机体内的自由基,减少自由基对人体的伤害;另一方面,本发明的生物活性多肽QEPVL还能够增强机体免疫力,增强淋巴细胞的增殖能力,提高机体抵御外界病原体感染的能力,降低机体发病率,而且不会引起机体的免疫排斥反应,对开发具有抗氧化功能及增强免疫功能的乳制品、保健品和药品具有十分重要的意义。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates;theseries METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODSIN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
实施例1活性肽QEPVL的制备
一、发酵乳的制备
1)瑞士乳杆菌发酵乳
采用脱脂奶粉(新西兰NZMP牌脱脂奶粉)与水配置12wt%的脱脂乳(12g脱脂奶粉加入到88g水中,下同)。在无菌条件下,挑取瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus,CICC6024)菌落三环,将其加入已灭菌的12wt%的脱脂乳中,在无菌条件下搅拌均匀。接种完成后,用铝箔封口,以防止污染。置于培养箱中37℃培养19小时。培养结束后,在无菌条件下将凝乳搅拌均匀,即完成瑞士乳杆菌的活化,制得用于制备瑞士乳杆菌发酵乳的发酵剂。
取10mL已制备的瑞士乳杆菌发酵剂接种到500mL已灭菌的12wt%脱脂乳中(接种率为2v/v%),37℃发酵19小时后,在无菌条件下搅开凝乳,在4℃条件下保存,得到瑞士乳杆菌发酵乳。
2)对照发酵乳
采用同样方法,使用保加利亚乳杆菌(Lactobacillus Bulgaricus,LB340)和嗜热链球茵(Streptococcus Thermophilus,TA40)作为发酵菌种制作对照发酵乳。
具体方法为:在无菌条件下,分别挑取保加利亚乳杆菌与嗜热链球茵菌落三环,将其分别加入已灭菌的12wt%的脱脂乳中,搅拌均匀。接种完成后,用铝箔封口,以防止污染。置于培养箱中37℃培养19h。培养结束后,在无菌条件下将凝乳搅拌均匀,即完成保加利亚乳杆菌与嗜热链球茵的活化,制得用于制备对照发酵乳的两种发酵剂。
取5mL已制备的保加利亚乳杆菌发酵剂和5mL嗜热链球菌发酵剂,共同接种到500mL已灭菌的12wt%脱脂乳中(接种率为2v/v%),37℃发酵19h后,在无菌条件下搅开凝乳,在4℃条件下保存,得到对照发酵乳。
二、生物活性多肽的确认
1.实验方法
1)样品处理
分别将前一步骤制备的瑞士乳杆菌发酵乳和对照发酵乳,以及12wt%的脱脂乳装入离心管中进行低温离心,离心条件为9000rpm/min,4℃,20min。离心后弃沉淀,取上清液。
将上清液分别倒入超滤杯中,为了防止生物活性多肽被氧化,打开氮气罐压力阀充氮,同时打开磁力搅拌装置,以防止溶液出现浓差极化现象。使样品分别通过截留分子量为10kDa、3kDa的滤膜,待有滤液流出时进行收集。
超滤过程中,应保持流速稳定,滤液清澈。流速控制在1mL/min左右,压力为0.1~0.3MPa,分别收集瑞士乳杆菌发酵乳、对照发酵乳,以及未发酵的12wt%脱脂乳的滤液作为实验样、对照样以及空白对照,于-4℃冷冻保存。
2)质谱分析
将前一步骤收集的瑞士乳杆菌发酵乳超滤后的滤液(实验样)和脱脂乳超滤后的滤液(空白对照)进行质谱分析,质谱条件如下:
离子方式:ES+
质量范围(m/z):100-1500
毛细管电压(Capillary)(kV):3.0
采样锥(V):35.0
离子源温度(℃)):100
去溶剂温度(℃):350
去溶剂气流(L/hr):600.0
碰撞能量(eV):6.0
扫描时间(sec):0.3
内扫描时间(sec):0.02
2.实验结果
瑞士乳杆菌发酵乳超滤后的滤液(实验样)和脱脂乳超滤后的滤液(空白对照)的质谱对比结果见图1~2。图1中的A曲线为3000Da未经发酵的脱脂乳(空白对照)粗提物样品,图1中的B曲线为3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物样品(实验样)。经过比较可以看出,经过瑞士乳杆菌发酵后,3000Da未经发酵乳粗提物和3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳粗提物的组分上发生很大变化,且这些组分由于疏水性不同保留时间亦有所差异。此质谱质量范围为100Da-1500Da,因此可知脱脂乳在1500Da以下、210nm处有吸收的小分子物质相对较少;而经过瑞士乳杆菌发酵后,在这一分子量范围内的物质明显增多,说明了这些多肽并不存在于未经发酵处理的脱脂乳中,而是经瑞士乳杆菌发酵后才产生的。而且我们发现随着发酵时间的延长,多肽的丰度明显增多,进一步证实了通过瑞士乳杆菌的发酵,脱脂乳中原有的大分子蛋白被分解,从单一的大分子蛋白变为量多且复杂的小分子多肽。
图2是3000Da未经发酵脱脂乳(空白对照)粗提物与3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳(实验样)粗提物不同分子量物质丰度差异的比较结果。纵向轴表明在脱脂乳粗提物中所含物质对应的分子量,横向轴表明发酵乳粗提物中所含物质对应的分子量。通过比较,可以得到瑞士乳杆菌发酵乳和未经发酵脱脂乳中,因为发酵所带来的差异较大的物质的分子量,从而选择这些质荷比的母离子通过二级质谱进行进一步的分析。
如图1所示,分子量397.07Da,保留时间6.72分钟的物质在脱脂乳粗提物中含量较高(图1-A图谱中的峰),而对照发酵乳中几乎没有。而分子量为232.15Da,保留时间为3.61min的物质在发酵乳和脱脂乳中的含量均比较高。因此,我们选择了在发酵乳中含量较高而在未经发酵的脱脂乳中含量较低的组分进行了差异比较,比较结果见表1。
表1:3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物与3000Da脱脂乳粗提物差异比较
根据MarkerLynx软件分析,得到具有显著性差异的(p>0.05)分子量片段如表1所示,根据丰度和质荷比情况,选择585.3251Da,保留时间为16.20min的多肽进行二级质谱的测序分析。
三、生物活性多肽的分离提纯和产量的比较
1.实验仪器和试剂
色谱柱规格:SOURSE 5 RPC ST4.6/150
流速:1mL/min
温度:25℃
紫外检测波长:215nm
流动相A:含有2%乙腈和0.05%TFA的ddH2O
流动相B:100%乙腈
进样量:1mL
梯度条件:0min-7.5min保持100%A液;7.5min-42.5minB液从0%变为50%;42.5min-45minB液从50%变为100%;45min-50min保持100%B液;50min-72minA液从0%变为100%。
2.实验方法
样品前处理:将实验样和对照样与流动相A液对半稀释(体积比1:1进行稀释),作为上样样品。上样样品进行反相高效液相色谱分析,实验结果见图3。
3.实验结果
由图3可见,a曲线是对照样的反相高效液相色谱215nm的洗脱图谱,洗脱时间为26min处有一明显的吸收峰,其余峰高相对较低,根据吸收值和肽键浓度的正比关系,可认为在12%对照发酵乳3000Da上清液(对照样)中,其多肽类物质较少,且种类单一。b曲线是瑞士乳杆菌发酵乳3000Da上清液(实验样)反相高效液相色谱215nm的洗脱图谱,与对照发酵乳相比,瑞士乳杆菌发酵乳3000Da上清液的反相图谱中吸收峰明显增多,且在洗脱时间为21min、24min和33min处有三处最为明显的吸收峰,实验中对这三个峰进行了收集,分别记录为发酵乳分离物B峰、发酵乳分离物C峰和发酵乳分离物D峰。
根据对各分子量对应的多肽与原发酵乳分离物B峰、C峰和D峰对应分子量物质的保留时间对比,发现585.32Da的物质来源于发酵乳分离物的D峰。
通过对照发酵乳和瑞士乳杆菌发酵乳的比较,可发现经过瑞士乳杆菌发酵得到的发酵乳,其含有比对照发酵乳更为丰富的、分子量小于3000Da的多肽物质。这些多肽类物质是由于原脱脂乳中的大蛋白被瑞士乳杆菌所分泌的胞内酶和胞外酶分解,释放出一些多肽片段和游离的氨基酸所形成的。乳酸菌所分泌的胞外酶对乳品中β-酪蛋白片段具有非特异性或特异性的切割。通常这些由微生物发酵得到的多肽类物质,极有可能具有一定的生物活性。如果使用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组合生产普通酸奶,由于多肽的产量少,品种单一,生物活性相对较低。
根据反相高效液相色谱原理,疏水性较差的物质由于与分离柱固相结合力较弱,先从分离柱中洗脱下来,而疏水性较好的物质与分离柱固相键合作用较大,后从分离柱中被洗脱下来。由此可得,三个分离物其疏水性按如下顺序排列:瑞士乳杆菌发酵乳分离物B峰>C峰>D峰。经过收集操作,得到D峰值的样品,采用真空冷冻干燥技术进行冷冻干燥,-4℃冷冻保藏,作为后续质谱分析、体外功能性检测的实验材料。四、生物活性多肽的质量和氨基酸序列测定
1.实验方法
(1)色谱条件:
仪器:Waters ACQUITY UPLC超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质仪
色谱柱规格:BEH C18色谱柱
流速:0.4mL/min
温度:45℃
紫外检测波长:210nm
进样量:7μL
梯度条件:0min-3min保持99%A液,1%B液;3min-9minB液从1%变为5%,A液从99%变为95%;9min-15minB液从5%变为10%,A液从95%变为90%;15min-21min%B液从10%变为25%,A液从90%变为75%;21min-24min,B液从25%变为40%,A也从75%变为60%;24min-27min,B液从40%变为80%,A液从60%变为20%;27min-27.5min保持80%B液,20%A液;27.5min-28min,B液从80%变为5%,A液从20%变为95%;28min-28.5min,B液从5%变为1%,A液从95%变为99%;28.5min-30min,保持99%A液,1%B液。A液:含有2%乙腈和0.05%TFA的ddH2O;B液:100%乙腈
(2)质谱条件:
离子方式:ES+
质量范围(m/z):100-1500
毛细管电压(Capillary)(kV):3.0
采样锥(V):35.0
离子源温度(℃)):100
去溶剂温度(℃):350
去溶剂气流(L/hr):600.0
碰撞能量(eV):6.0
扫描时间(sec):0.3
内扫描时间(sec):0.02二级质谱母离子质量(m/z):439.3
根据上述实验条件,利用超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱,得到瑞士乳杆菌发酵乳分离物D峰中分子量为585.32Da的多肽的质量色谱提取图、一级质谱图、二级质谱图,并通过Masslynx软件计算氨基酸序列,结果见图4~图6。
2.实验结果
经过Masslynx软件分析计算,得到分子量为585.32Da的活性多肽片段的氨基酸序列为Gln-Glu-Pro-Val-Leu(QEPVL),记为SEQ ID NO:1。该片段来源于瑞士乳杆菌发酵乳分离物D峰,与β-酪蛋白的209~213位的残基序列相对应,β-酪蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAA30431.1,序列见SEQ ID NO:3。
实施例2生物活性肽QEPV的制备和确认
1.体外模拟胃肠道消化对生物活性多肽QEPVL进行酶解
模拟胃肠道消化实验主要分为两步进行。首先,采用灭菌去离子水配制浓度为500μg/mL生物活性多肽QEPVL溶液,在浓度为500μg/mL QEPVL溶液中加入胃蛋白酶(购自Sigma公司),比例是每克QEPVL加入胃蛋白酶20mg,调节反应液的pH值至2.0,在37℃恒温水浴中保温90min;然后将反应液的pH值调整至7.5,加入胰酶(Corolase PP,购自德国AB公司),比例是每克QEPVL加入胰酶40mg,在37℃恒温水浴中保温150min;最后置于95℃水浴中加热5min使酶失活,将反应液冷冻浓缩干燥,制成干粉,储存于-20℃条件下,备用。
2.酶解产物的质量和氨基酸序列测定
取体外模拟肠胃道消化后的样品粉末0.2mg,加入50μL水和450μL无水乙醇,充分震荡后放入-20℃冰箱20min,在15000rpm转速条件下离心30min,取上清液400μL进行UPLC-Q-TOF-MS分析。
UPLC条件:Hypersil GOLD C18色谱柱(100mm*2.1mm,1.9μm,
)(ThermoScientific Co.);流动相A:0.1%甲酸水溶液,流动相B:含0.1%甲酸乙腈;采用从99%的A相到50%A相的梯度洗脱程序;流速0.4mL/min;柱温:45℃;进样量:5μL。
Q-TOF-MS条件:飞行时间质谱仪,质谱采用电喷雾电离源(ESI),正离子模式。并以200ng/mL的亮氨酸脑啡肽进行实时精确质量校正。质量扫描范围为m/z80~1000,扫描时间为0.3s。毛细管电压3kV;锥孔电压35V;一级质谱碰撞能量分别为4;离子源温度100℃;脱溶剂气温度和流量分别为300℃,500L/h。
根据上述实验条件,生物活性多肽QEPVL经过消化酶处理前和处理后产物经UPLC-Q-TOF-MS分析,获得的总离子流图见图7。并对图中b1峰和b2峰进行了提取,采用Q-TOF-MS分析获得了相应的质谱图,见图8-9。
图7中A是空白对照组,为没有经过酶消化处理的生物活性多肽QEPVL总离子流图(TIC);图7中B是生物活性多肽QEPVL经过胃蛋白酶处理后产物的总离子流图(TIC);图7中C是生物活性多肽QEPVL经过胃蛋白酶和胰酶先后处理得到的产物总离子流图(TIC)。图7中b2峰的保留时间约为6.50min;图8的质谱分析结果表明b2的相对分子质量为585.3223Da,与生物活性多肽QEPVL的分子量一致,说明是b2峰是QEPVL的原始峰。图7中b1峰的保留时间约为7.10min;图9的质谱分析结果证明b1峰的相对分子质量568.2966Da,是QEPVL脱去一个水分子之后的产物。在图7中A、B、C三条曲线的这两个峰的分子量和保留时间完全相同,说明是来源于同一物质。和空白对照组相比,经过胃蛋白酶处理后的消化产物b1和b2的峰面积与空白对照组基本相等,说明生物活性多肽QEPVL并没有被胃蛋白酶消化。在胃蛋白酶和胰蛋白酶组合作用下,消化产物中b1峰、b2峰的面积大大减少,同时新增了b3峰和b4峰,说明生物活性多肽QEPVL在胃蛋白酶和胰蛋白酶组合作用下,可以消化降解为新的产物。
对生物活性多肽QEPVL在胃蛋白酶和胰蛋白酶组合作用下降解产物的氨基酸组成和分子量进行检测,采用Q-TOF-MS分析获得b3峰和b4的相应的质谱图10和图11。
图10为b4峰提取物的质谱图,分子量为472.2409Da。图11为b3峰提取物的质谱图,分子量为455.2092Da。并且b3峰提取物为b4峰提取物脱去一个水分子后相对应的分子质量。按照QEPVL可能的断裂方式进行分子式的推算和分子量的计算,结果见表2。经过上述计算并结合Masslynx软件分析结果,最终确认生物活性多肽QEPVL经消化酶处理后的主要新产物为QEPV(其含量占全部物质总量的86.37wt%,为b3和b4峰面积之和),其分子量为472.2409Da;同时存在少量的其他降解物。生物活性多肽QEPVL经消化酶处理前后的主要产物保留时间、峰高度、峰面积和峰面积比例见表3。
表2生物活性多肽QEPVL经消化酶处理后可能的断裂方式和分子量的计算
表3生物活性多肽QEPVL经消化酶处理前后的主要产物质谱分析时的保留时间、峰高度、峰面积和峰面积比例
由上述数据可知,多肽QEPVL在进入动物和人的胃肠道后可能被消化酶降解。其降解产物是新生成的生物活性多肽QEPV。而新生成的生物活性多肽QEPV没有被消化酶进一步降解,证明产生的生物活性多肽QEPV在消化过程中稳定,可以被动物机体直接吸收利用。
实施例3生物活性多肽QEPVL和QEPV的抗氧化活性实验
采用清除自由基法(DPPH·法)和总抗氧化能力法(Ferric ReducingAbility Power FRAP法),对实施例1得到的生物活性多肽QEPVL的抗氧化活性进行了测试。
1、[DPPH·]法测定生物活性肽QEPVL的体外抗氧化活性
1)实验试剂及仪器
试剂:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl[DPPH·]),日本Wako公司生产;甲醇,上海国药公司提供;实施例1获得的瑞士乳杆菌发酵得到的乳源性生物活性多肽QEPVL(收集到的D峰值样品)和实施例2获得的乳源性生物活性多肽QEPV。
主要仪器:Sunrise酶标仪,奥地利Tecan公司产品;96孔细胞培养板,美国Millipore公司制造;分析天平,Meitelei-tolido公司产品。
2)实验方法
(1)1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液
用分析天平称取0.349mg[DPPH·]溶于1mL甲醇溶液中,配制得到的1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液,锡纸避光保存,即配即用。
(2)[DPPH·]甲醇标准曲线的测定
在96孔板中按表4分别加入100μL[DPPH·]甲醇标准曲线样品,室温静置90min,用酶标仪在517nm处检测吸光值。
表4[DPPH·]甲醇标准曲线溶液配制
根据实验结果,使用Excel拟合曲线并计算回归方程,结果见图12(回归方程:y=-0.192x+0.2271,R2=0.9991)。[DPPH·]甲醇标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.999,表明[DPPH·]甲醇标准曲线精密度和准确度均符合检测要求。从结果看,吸光度值与[DPPH·]含量呈反比关系,[DPPH·]含量越少,吸光值越高,即样品清除自由基的能力越强。
(3)[DPPH·]法测定生物活性肽QEPVL和QEPV的抗氧化活性
1)样品组:在96孔板中加入80μL浓度为1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液、按表5分别加入20μL不同浓度的待测样品(QEPVL、QEPV)、阳性对照1(2.5mg/mL的Trolox)、阳性对照2(0.025mg/mL的Trolox),和阴性对照(植酸);
2)空白组:在同一96孔板上,以加入80μL浓度为1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液和20μL去离子水的样品做空白对照。
待检测样品加样完毕后,室温静置90min,用酶标仪在517nm处检测吸光值。按照下式计算自由基清除率,实验结果见表3。
表5[DPPH·]法测定瑞士乳杆菌发酵乳中生物活性多肽的抗氧化活性结果
从表5可以看出,作为阳性对照的2.5mg/mL的Trolox在相同条件下具有最强的清除自由基的能力,几乎能清除溶液中所有的自由基,其次为0.025mg/mL的Trolox、植酸、活性多肽。从发酵乳分离物D峰中分离的多肽QEPVL,以及多肽QEPVL的降解产物QEPV清除[DPPH·]自由基率随浓度变化均呈现倒钟型,并且都在浓度为2.5mg/mL处达到最高值,分别为22.50%和21.81%。
2、FARP法测定瑞士乳杆菌发酵乳中多肽体外抗氧化能力
1)实验试剂和仪器
总抗氧化能力检测试剂盒(Ferric Reducing Ability ofPlasma FRAP法),购自上海碧云天生物科技公司;FeSO4溶液(10mmol/L),水溶性维生素E(Trolox溶液)(10mmol/L),实施例1获得的瑞士乳杆菌发酵得到的乳源性生物活性多肽QEPVL和实施例2获得的乳源性生物活性多肽QEPV。
主要仪器:Sunri se酶标仪,奥地利Tecan公司产品;96孔细胞培养板,美国Millipore公司制造;分析天平,Meitelei-tolido公司产品;HWS26型电热恒温水浴锅,上海一恒科技有限公司制造。
2)实验方法
(1)FRAP工作液的配制
根据总抗氧化能力检测试剂盒,将TPTZ7.5mL稀释液、TPTZ750μL溶液、检测缓冲液750μL混合均匀,并在37℃水浴中孵育,2小时内用完。
(2)FeSO4标准曲线曲线的制作
在96孔板中先加入180μLFRAP工作液,按表6加入5μL FeSO4标准曲线溶液,轻轻混匀,37℃孵育3-5min后,用酶标仪在593nm处测定吸光值。
表6FeSO4标准曲线测定的溶液配制
FeSO4浓度与吸光值呈良好的正比关系,FeSO4浓度越高,吸光值越高。本发明FeSO4标准曲线结果见图13,标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.998,FeSO4标准曲线的精密度和准确度均符合检测要求,可用于后续计算。
(3)FRAP法测定生物活性多肽QEPVL和QEPV的抗氧化能力
在96孔板中先加入180μL FRAP工作液,空白对照孔中加入5μL ddH2O,样品检测孔内加入5μL待测样品、阳性对照内加入5μL植酸,轻轻混匀,37℃孵育3-5min后,用酶标仪在593nm处测定吸光值。总抗氧化能力表示方式以FeSO4标准溶液的浓度来表示。按照下式计算总抗氧化能力,实验结果见表7。
表7FARP法测定瑞士乳杆菌发酵乳中生物活性多肽的总抗氧化能力结果
通过总抗氧化能力法(Ferric Reducing Ability Power FRAP法)对瑞士乳杆菌发酵乳中分离的多肽QEPVL和其降解产物多肽QEPV的体外总抗氧化活性进行了测定,发现生物活性多肽QEPVL和生物活性多肽QEPV均具有较好的还原氧化物质的能力;在浓度为4mg/mL情况下,多肽QEPV显示出的总抗氧化能力达到0.0201mmol/g,多肽QEPVL的总抗氧化水平达到0.0212mmol/g;说明生物活性多肽QEPVL和QEPV的总抗氧化能力,高于同等浓度下的具有弱抗氧化活性的植酸,具有显著性(p>0.05)差异。因此,可认定发明的生物活性多肽QEPVL和QEPV具有显著的抗氧化能力。
实施例4生物活性肽的促进机体免疫力活性实验
一、MTT法测定生物活性多肽QEPVL和QEPV的体外淋巴细胞增殖能力实验
1)实验材料与仪器:
试剂与材料:实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄,上海交通大学农业与生物学院动物实验中心);瑞士乳杆菌发酵得到的乳源性生物活性多肽QEPVL;小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司);RPMI1640培养基(购自GIBCO公司);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT,购自Amresco公司);伴刀豆蛋白(ConA,购自Sigma公司);牛血清白蛋白(BSA,购自Genebase公司);胃蛋白酶(购自Sigma公司);胰酶(CorolasePP,购自AB公司)。
仪器:LRH-250F生化培养箱,上海恒科技有限公司;GL-22M高速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;Hera cell150CO2培养箱,Heraeus公司;Dragon Wellscan MK3酶标仪,Labsystems公司;ALPHA1-2-LD真空冷冻干燥机,Christ公司;超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪,waters公司。
2)实验方法:
无菌条件下取小鼠脾脏,用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞,进行元代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入:100μL小鼠淋巴细胞悬液,100μL RPMI1640完全培养液,20μL伴刀豆蛋白,100μL样品。另外,设置空白对照组(pH7.2~7.4,3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA),研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5%CO237℃培养箱中培养68h后,无菌条件下每孔加入20μL MTT,继续培养4h,小心弃去上清液,每孔加入100μL二甲基亚砜,37℃生化培养箱孵化10min,摇匀,用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示,计算方法如下:
式中:A1为空白对照在570nm处下的吸光值;A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值,A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3)实验结果及分析
实验结果见表8。由表8可知,在生物活性肽QEPVL的质量浓度为100μg/mL的条件下,乳源性生物活性肽QEPVL的刺激指数大于BSA,说明QEPVL一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且QEPVL的刺激指数达到了1.186,和阴性对照组具有显著差异(P<0.05)。在多肽QEPV的质量浓度为100μg/mL的情况下,设定阴性对照组的刺激指数为1,多肽QEPV的刺激指数可以达到1.1466,说明QEPV是一种具有促进淋巴细胞增殖功能的生物活性多肽,且和阴性对照组具有显著差异(P<0.05)。因此,可以认定该瑞士乳杆菌发酵乳分离的到的活性多肽QEPVL以及其人体内消化代谢产物QEPV均具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力,可以作为一种保健品或者添加剂食用,能够提高动物和人体的免疫力。
表8生物活性多肽QEPVL对体外淋巴细胞增殖的影响
实验分组 |
刺激指数SI |
阴性对照组 |
1 |
QEPV |
1.1466±0.013* |
QEPVL |
1.186±0.038* |
注:*号标记为与阴性对照比较,有显著性差异(P<0.05)。
二、MTT法测定生物活性多肽QEPVL的体外巨噬细胞增殖能力实验
1)实验试剂及仪器
试剂:实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心;瑞士乳杆菌发酵得到的乳源性生物活性多肽QEPVL;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)Amresco公司;LPS(脂多糖)Sigma公司;牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin,BSA)Genebase公司;三联溶解液,含10%SDS、5%异丁醇以及0.012mol/LHCl的水溶液。
仪器设备:LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司;GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司;Hera cell150CO2培养箱Heraeus公司;Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2)试验方法:
balb/c小鼠腹腔注射2ml的2%(w/w)灭菌淀粉溶液,连续注射三天,最后一次注射24小时后断颈处死。剥去腹部皮肤,用注射器吸取4℃磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗腹腔,离心管收集冲洗液后,离心(1000rpm,4℃)10分钟后弃上清,用4℃RPMI1640完全培养液(含10%FBS)洗涤两次,0.2%台盼蓝溶液染色做细胞活力检测,确认采集到的有活力巨噬细胞占95%以上。细胞计数板读数后,调整细胞浓度至合适浓度。
将已吹打至完全悬浮的细胞悬液以合适体积加入96孔细胞培养板,37℃、5%CO2环境下培养4小时后,吸弃孔中液体,用37℃RPMI1640完全培养液小心清洗细胞培养板孔底,洗去未贴壁的细胞和细胞碎片,得到纯化后的贴壁腹腔巨噬细胞。每孔加入0.2ml RPMI1640完全培养基,实验用小肽样品及LPS事先溶解于培养基后加入,开始细胞培养。
加入细胞个数为2×105/ml的细胞悬液100μl/孔,贴壁纯化后加入含生物活性多肽(100,500,1000μg/mL)的RPMI1640完全培养液(10%FBS)200μl/孔,连续培养48小时,炎症组在24小时时加入LPS至终浓度100ng/ml。44小时时加入5%MTT20μl/孔,达到48小时后加入100μl/孔的三联溶解液以终止培养,隔夜溶解后,在波长570nm下用酶标仪测各孔的吸光度值(OD570),生长指数(Growth Indices)的计算公式如下:
其中,空白组为不施加小肽和BSA的细胞处理组,BSA组为阴性对照。
3)实验结果
实验结果见图14-图15,在实验组中生物活性多肽(QEPVL或QEPV)的添加浓度分别为1000,500,100μg/mL,空白组加入相应量的PBS作为空白对照,表示在没有LPS刺激的情况下巨噬细胞的增殖情况。和空白对照组相比,添加不同浓度的多肽QEPVL实验组随着实验浓度的增加,巨噬细胞的增殖能力逐渐上升,在浓度为1000,500μg/mL时,具有显著性差异(P<0.05);添加不同浓度的多肽QEPV实验组也随着实验浓度的增加,巨噬细胞的增殖能力逐渐上升,在浓度为1000,500μg/mL时,具有显著性差异(P<0.05)。说明生物活性多肽QEPVL和其代谢产物QEPV均具有促进巨噬细胞增殖的能力。
三、生物活性多肽QEPVL的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及设备
1)试剂:实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄),上海斯莱克实验动物有限公司;小鼠淋巴细胞提取液,上海索莱宝生物科技有限公司;RPMI1640培养基,GIBCO公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),Genebase公司;提出分离得到的乳源性生物活性多肽QEPVL;ELISA细胞因子快速试剂盒(IL-4),武汉博士德生物工程有限公司。
1)仪器设备
CM-230型摩尔超净水,上海摩勒科学仪器有限公司;LRH-250F生化培养箱,上海恒科技有限公司;GL-22M高速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;Hera cell150CO2培养箱,Heraeus公司;Dragon Wellscan MK3酶标仪,Labsystems公司。
2.试验方法
1)标准曲线的制备
制作IL-4标准曲线:将浓度为500pg/mL,250pg/mL,125pg/mL,62.5pg/mL,31.3pg/mL,15.6pg/mL,7.8pg/mL的IL-4标准品分别依次加入酶标板孔内,再加入生物素标记抗小鼠IL-4抗体(ELISA细胞因子快速试剂盒),酶标板加上盖,37℃反应90min。甩去酶标板内液体,每孔依次加入亲和素-过氧化物酶复合物(ELISA细胞因子快速试剂盒)0.1mL。37℃反应60min。0.01M PBS洗涤3次,每孔加入0.1mL ABC工作液,37℃反应30min。0.01M PBS洗涤5次,每孔加入90ul TMB显色液,37℃避光反应25min。每孔加入0.1mL TMB终止液,用酶标仪在450nm测定吸光值。制作的IL-4检测用标准曲线如图16所示。IL-4标准曲线是以浓度为横坐标(单位pg/mL),450nm下的吸光值为纵坐标,进行一次回归拟合,获得标准曲线Y=0.0038X+0.1224,R2=0.9979。其中X代表IL-4浓度,单位为pg/mL,Y代表OD450下的吸光值。
2)多肽QEPVL的促巨噬细胞分泌细胞因子检测
在无菌条件下取小鼠脾脏淋巴细胞,调整细胞浓度至5×105/mL接种于96孔板,实验组加入生物活性多肽QEPVL进行培养,调整生物活性多肽QEPVL的终浓度分别为100,50,10μg/mL,与淋巴细胞共同培养36小时后进行细胞因子IL-4的测定。空白组不加生物活性多肽QEPVL,培养36h作为对照。
3.实验结果
实验结果见图17,与空白对照组相比,随着多肽浓度的增加,IL4的分泌量逐渐增加;当多肽添加浓度达到50和100μg/mL时,IL-4分泌量显著大于空白组;可见生物活性多肽QEPVL具有促进淋巴细胞增殖的功能,并且通过对巨噬细胞分泌细胞因子IL4的调节,发挥对机体体液免疫的调节作用。