CN103012552B - 一种生物活性多肽qepv及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种具有体外抗氧化活性和增强机体免疫力的乳源性生物活性多肽，其氨基酸序列为Gln-Glu-Pro-Val。经过体外抗氧化实验、体外免疫功能促进实验，验证了多肽QEPV具有较好的抗氧化生物学活性和促进细胞免疫的活性，一方面能够清除机体内的自由基，减少自由基对人体的伤害；另一方面，本发明的生物活性多肽QEPV还能够增强机体免疫力，增强淋巴细胞、巨噬细胞的增殖能力，使巨噬细胞一氧化氮诱生量增加，并促巨噬细胞分泌细胞因子，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，对开发具有抗氧化功能及增强免疫功能的乳制品、保健品和药品具有十分重要的意义。

Description

一种生物活性多肽QEPV及其制备和应用

技术领域

本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种生物活性多肽QEPV及其制备和应用。

背景技术

在牛乳经乳酸菌发酵的过程中，牛乳中的一部分蛋白质被乳酸菌代谢利用，并发生了一系列生理生化反应，使蛋白质变为多肽或者游离的氨基酸，被人体消化吸收或通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进入人体的血液循环。在这些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被称为“生物活性肽”。

免疫活性肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性肽。1981年，Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊血红细胞的吞噬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗。李素萍等人用合成的乳源免疫调节肽（PGPIPN）饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的免疫调节功能有显著的增强。

研究表明，免疫活性肽不仅能够增强机体免疫力，刺激机体淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的吞噬功能，促进细胞因子的释放、提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且不会引起机体的免疫排斥反应。

免疫活性肽无论是作为功能食品还是药品，其最终都要摄入人体内被人体吸收，只有到达相应的靶器官才能发挥其生理功能。在人体胃肠道复杂的环境下，肽极容易受到胃蛋白酶、胰蛋白酶等一系列酶的影响而发生降解，从而在体内失去生理活性，无法达到预期目的。因此，研究免疫调节肽的抗胃肠道酶降解的能力对于其今后的应用具有重要意义。其次，有些生物活性多肽是在动物的胃肠道里经过各种生物酶降解后生成的新片段，被动物吸收后发挥其生活活性作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物活性多肽，其氨基酸序列为Gln-Glu-Pro-Val（QEPV）（SEQ ID NO：1）。

较优的，所述生物活性多肽的来源为乳源性。

本发明的生物活性多肽QEPV为乳源性，具体来源于β-酪蛋白，并且为β-酪蛋白（SEQ IDNO:3）第209~212位的氨基酸残基。

较优的，所述生物活性多肽具有体外抗氧化活性和增强机体免疫力的功能。

本发明的生物活性多肽可以通过基因工程的方法和化学方法人工合成，也可以从乳制品中通过分离纯化、酶降解的方法获得。

本发明还公开了编码前述生物活性多肽的核苷酸片段。

β-酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列为既有技术，编码β-酪蛋白第209~212位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽QEPV。

进一步的，编码前述生物活性多肽的核苷酸片段，其序列为：5’-caggagcctgta-3’(SEQ IDNO:2)。

本发明第二方面公开了前述生物活性多肽的制备方法，步骤如下：

1）发酵：将瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）添加到脱脂乳中进行厌氧发酵，获得瑞士乳杆菌发酵乳；

2）多肽的粗提：对步骤1）的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离，取上清液；

3）多肽的纯化：

a.对步骤2）的上清液进行超滤处理，收集滤液；

b.收集的滤液采用反向层析柱SOURSE 5 RPC ST（4.6×150mm）进行反相高效液相色谱分离，收集生物活性多肽QEPVL；

4）多肽的消化：采用两步酶解法酶解步骤3）的生物活性多肽QEPVL，获得生物活性多肽QEPV；第一步酶解所采用的酶为胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶为胰酶。

本发明所述脱脂乳为经过脱脂处理的牛乳，通常脱脂乳中脂肪含量小于0.1%。

较优的，所述厌氧发酵的条件为：发酵温度36～38℃，发酵培养15～20h；优选发酵培养19h。

较优的，步骤2）所述低温离心的条件为：4℃，8000～10000rpm，离心15～30min。

较优的，步骤3）a所述超滤法所采用的滤膜的截留分子量分别为10kDa和3kDa。本发明采用截留分子量分别为10kDa、3kDa的滤膜，使样品依次通过两张滤膜进行超滤。

更优的，步骤3）a所述超滤过程中，压力范围为0.1~0.3MPa，滤液流速为0.8～1.2mL/min。

较优的，步骤3）b反相高效液相色谱分离法中，流动相A为含有2%乙腈和0.05%TFA的ddH₂O；流动相B为100%乙腈。

较优的，步骤3）b反相高效液相色谱分离法中，收集分子量为585.32Da的多肽的洗脱峰，即为生物活性多肽QEPVL。

在本发明反相高效液相色谱法分离过程中，已知QEPVL的分子量，收集分子大小为585.32Da的洗脱峰，即为本发明的生物活性多肽QEPVL。具体的，本发明分子大小为585.32Da的洗脱峰其保留时间为33min。

较优的，步骤4）所述两步酶解法具体步骤为将QEPVL溶于灭菌去离子水中，并加入胃蛋白酶，获得反应液，调节反应液pH值为2.0±0.1，在37±0.5℃的恒温水浴中保温反应60～120min，获得第一步酶解液；将第一步酶解液的pH值调整为7.5±0.1，并加入胰酶，于37±0.5℃的恒温水浴中保温反应120～180℃，获得第二步酶解液；将第二步酶解液采用沸水浴法使酶失活，获得酶解产物；酶解产物冷冻干燥获得产品。

较优的，步骤4）所述胃蛋白酶的添加量为胃蛋白酶10～30mg/g底物；所述胰酶的添加量为胰酶30～50mg/g底物。

更优的，步骤4）所述胃蛋白酶的添加量为胃蛋白酶20mg/g底物；所述胰酶的添加量为胰酶40mg/g底物。

较优的，步骤4）中将QEPVL配置成450～550μg/mL的多肽QEPVL溶液。更优的，配置成500μg/mL QEPVL溶液。

本发明第三方面公开了前述生物活性多肽在制备抗氧化和/或增强机体免疫力的食品、保健品及药物中的应用。

本发明的生物活性多肽QEPV可以用于酸奶等乳制品、减少自由基对皮肤伤害的化妆品；并且由于本发明的生物活性多肽QEPV能够通过胃肠道直接吸收不被降解，因此可以用于制备提高免疫力的保健品，或者用于制备具有抗氧化和/或增强机体免疫力的药物。

本发明第四方面公开了一种抗氧化药物，包含前述生物活性多肽QEPV或前述生物活性多肽QEPV的衍生物。

本发明第五方面公开了一种增强机体免疫力药物，包含前述生物活性多肽QEPV或前述生物活性多肽QEPV的衍生物。

所述多肽的衍生物，是指在多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。

本发明生物活性多肽QEPV的有益效果为：本发明的乳源性生物活性多肽QEPV具有较好的抗氧化活性和促进机体免疫力活性；一方面能够清除机体内的自由基，减少自由基对人体的伤害；另一方面，本发明的生物活性多肽QEPV还能够增强机体免疫力，增强淋巴细胞、巨噬细胞的增殖能力，使巨噬细胞一氧化氮诱生量增加，并促巨噬细胞分泌细胞因子，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且不会引起机体的免疫排斥反应，对开发具有抗氧化功能及增强免疫功能的乳制品、和保健品和药品具有十分重要的意义。

附图说明

图1：瑞士乳杆菌发酵乳与未经发酵处理的脱脂乳超滤后粗提物的质谱对比图（A：3000Da未经发酵的脱脂乳粗提物质谱图，B：3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物质谱图）

图2：3000Da未经发酵脱脂乳粗提物与3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳粗提物分子量差异及丰度比较

图3：反相高效液相色谱分离对照发酵乳和瑞士乳杆菌发酵乳中生物活性多肽比较图（a曲线：对照发酵乳反相高效液相色谱215nm的洗脱图谱；b曲线：瑞士乳杆菌发酵乳3000Da上清液反相高效液相色谱215nm的洗脱图谱）

图4：质量色谱提取图（m/z=585.32）

图5：质荷比为585.32的片段的一级质谱图

图6：质荷比为585.32的片段的二级质谱图

图7：生物活性多肽QEPVL经过消化酶处理前后的总离子流图

图8：生物活性多肽QEPVL经消化酶处理前后b2峰的质谱分析图

图9：生物活性多肽QEPVL经消化酶处理前后b1峰的质谱分析图

图10：生物活性多肽QEPVL经消化酶处理后b3峰的质谱分析图

图11：生物活性多肽QEPVL经消化酶处理后b4峰的质谱分析图

图12：[DPPH·]甲醇标准曲线

图13：FeSO₄标准曲线

图14：生物活性多肽QEPV的体外巨噬细胞增殖能力实验结果

图15：不同浓度QEPVL和QEPV对一氧化氮诱生量的比较（正常组）

图16：不同浓度QEPVL和QEPV对一氧化氮诱生量的比较（炎症组）

图17：TNF-γ标准曲线

图18：添加生物活性多肽QEPV的淋巴细胞培养时间与IFN-γ分泌量的关系

图19：不同浓度的生物活性多肽QEPV在有分裂原（ConA）存在和没有分裂原存情况下在对细胞因子IFN-γ分泌的促进作用

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

实施例1活性肽QEPVL的制备

一、发酵乳的制备

1）瑞士乳杆菌发酵乳

采用脱脂奶粉（新西兰NZMP牌脱脂奶粉）与水配置12wt%的脱脂乳（12wt%的脱脂乳的制备为将12g脱脂奶粉加入到88g水中，下同）。在无菌条件下，挑取瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus，CICC6024）菌落三环，将其加入已灭菌的12wt%的脱脂乳中，搅拌均匀。接种完成后，用铝箔封口，以防止污染。置于培养箱中37℃培养19小时。培养结束后，在无菌条件下将凝乳搅拌均匀，即完成瑞士乳杆菌的活化，制得用于制备瑞士乳杆菌发酵乳的发酵剂。

取10mL已制备的瑞士乳杆菌发酵剂接种到500mL已灭菌的12wt%脱脂乳中（接种率为2v/v%），37℃发酵19小时后，在无菌条件下搅开凝乳，在4℃条件下保存，得到瑞士乳杆菌发酵乳。

2）对照发酵乳

采用同样方法，使用保加利亚乳杆菌(Lactobacillus Bulgaricus，LB340)和嗜热链球茵(Streptococcus Thermophilus，TA40)作为发酵菌种制作对照发酵乳。

具体方法为：在无菌条件下，分别挑取保加利亚乳杆菌与嗜热链球茵菌落三环，将其分别加入已灭菌的12wt%的脱脂乳中，在无菌条件下搅拌均匀。接种完成后，用铝箔封口，以防止污染。置于培养箱中37℃培养19h。培养结束后，在无菌条件下将凝乳搅拌均匀，即完成保加利亚乳杆菌与嗜热链球茵的活化，制得用于制备对照发酵乳的两种发酵剂。

取5mL已制备的保加利亚乳杆菌发酵剂和5mL嗜热链球菌发酵剂，共同接种到500mL已灭菌的12wt%脱脂乳中（接种率为2v/v%），37℃发酵19h后，在无菌条件下搅开凝乳，在4℃条件下保存，得到对照发酵乳。

二、生物活性多肽的确认

1.实验方法

1）样品处理

分别将前一步骤制备的瑞士乳杆菌发酵乳和对照发酵乳，以及12wt%的脱脂乳装入离心管中进行低温离心，离心条件为9000rpm/min，4℃，20min。离心后弃沉淀，取上清液。

将上清液分别倒入超滤杯中，为了防止生物活性多肽被氧化，打开氮气罐压力阀充氮，同时打开磁力搅拌装置，以防止溶液出现浓差极化现象。使样品分别通过截留分子量为10kDa、3kDa的滤膜，待有滤液流出时进行收集。

超滤过程中，应保持流速稳定，滤液清澈。流速控制在1mL/min左右，压力为0.1~0.3MPa，分别收集瑞士乳杆菌发酵乳、对照发酵乳，以及未发酵的12wt%脱脂乳的滤液作为实验样、对照样以及空白对照，于-4℃冷冻保存。

2）质谱分析

将前一步骤收集的瑞士乳杆菌发酵乳超滤后的滤液（实验样）和脱脂乳超滤后的滤液（空白对照）进行质谱分析，质谱条件如下：

离子方式：ES+

质量范围（m/z）：100-1500

毛细管电压（Capillary）（kV）：3.0

采样锥（V）：35.0

离子源温度（℃））：100

去溶剂温度（℃）：350

去溶剂气流（L/hr）：600.0

碰撞能量（eV）：6.0

扫描时间（sec）：0.3

内扫描时间（sec）：0.02

2．实验结果

瑞士乳杆菌发酵乳超滤后的滤液（实验样）和脱脂乳超滤后的滤液（空白对照）的质谱对比结果见图1～2。图1中的A曲线为3000Da未经发酵的脱脂乳（空白对照）粗提物样品，图1中的B曲线为3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物样品（实验样）。经过比较可以看出，经过瑞士乳杆菌发酵后，3000Da未经发酵乳粗提物和3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳粗提物的组分上发生很大变化，且这些组分由于疏水性不同保留时间亦有所差异。此质谱质量范围为100Da-1500Da，因此可知脱脂乳在1500Da以下、210nm处有吸收的小分子物质相对较少；而经过瑞士乳杆菌发酵后，在这一分子量范围内的物质明显增多，说明了这些多肽并不存在于未经发酵处理的脱脂乳中，而是经瑞士乳杆菌发酵后才产生的。而且我们发现随着发酵时间的延长，多肽的丰度明显增多，进一步证实了通过瑞士乳杆菌的发酵，脱脂乳中原有的大分子蛋白被分解，从单一的大分子蛋白变为量多且复杂的小分子多肽。

图2是3000Da未经发酵脱脂乳（空白对照）粗提物与3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳（实验样）粗提物不同分子量物质丰度差异的比较结果。纵向轴表明在脱脂乳粗提物中所含物质对应的分子量，横向轴表明发酵乳粗提物中所含物质对应的分子量。通过比较，可以得到瑞士乳杆菌发酵乳和未经发酵脱脂乳中，因为发酵所带来的差异较大的物质的分子量，从而选择这些质荷比的母离子通过二级质谱进行进一步的分析。

如图1所示，分子量397.07Da，保留时间6.72分钟的物质在脱脂乳粗提物中含量较高（图1-A图谱中的峰），而对照发酵乳中几乎没有。而分子量为232.15Da，保留时间为3.61min的物质在发酵乳和脱脂乳中的含量均比较高。因此，我们选择了在发酵乳中含量较高而在未经发酵的脱脂乳中含量较低的组分进行了差异比较，比较结果见表1。

根据MarkerLynx软件分析，得到具有显著性差异的（p>0.05）分子量片段如表1所示，根据丰度和质荷比情况，选择585.3251Da，保留时间为16.20min的多肽进行二级质谱的测序分析。

表1：3000Da发酵乳粗提物与3000Da脱脂乳粗提物差异比较

三、生物活性多肽的分离提纯和产量的比较

1.实验仪器和试剂

仪器：

    蛋白纯化仪purifier10

色谱柱规格：SOURSE 5 RPC ST4.6/150

流速：1mL/min

温度：25℃

紫外检测波长：215nm

流动相A：含有2%乙腈和0.05%TFA的ddH2O

流动相B：100%乙腈

进样量：1mL

梯度条件：0min-7.5min保持100%A液；7.5min-42.5minB液从0%变为50%；42.5min-45minB液从50%变为100%；45min-50min保持100%B液；50min-72minA液从0%变为100%。

2．实验方法

样品前处理：将实验样和对照样与流动相A液对半稀释（体积比1:1进行稀释），作为上样样品。上样样品进行反相高效液相色谱分析，实验结果见图3。

3．实验结果

由图3可见，a曲线是对照样的反相高效液相色谱215nm的洗脱图谱，洗脱时间为26min处有一明显的吸收峰，其余峰高相对较低，根据吸收值和肽键浓度的正比关系，可认为在12%对照发酵乳3000Da上清液（对照样）中，其多肽类物质较少，且种类单一。b曲线是瑞士乳杆菌发酵乳3000Da上清液（实验样）反相高效液相色谱215nm的洗脱图谱，与对照发酵乳相比，瑞士乳杆菌发酵乳3000Da上清液的反相图谱中吸收峰明显增多，且在洗脱时间为21min、24min和33min处有三处最为明显的吸收峰，实验中对这三个峰进行了收集，分别记录为发酵乳分离物B峰、发酵乳分离物C峰和发酵乳分离物D峰。

根据对各分子量对应的多肽与原发酵乳分离物B峰、C峰和D峰对应分子量物质的保留时间对比，发现585.32Da的物质来源于发酵乳分离物的D峰。

通过对照发酵乳和瑞士乳杆菌发酵乳的比较，可发现经过瑞士乳杆菌发酵得到的发酵乳，其含有比对照发酵乳更为丰富的、分子量小于3000Da的多肽物质。这些多肽类物质是由于原脱脂乳中的大蛋白被瑞士乳杆菌所分泌的胞内酶和胞外酶分解，释放出一些多肽片段和游离的氨基酸所形成的。乳酸菌所分泌的胞外酶对乳品中β-酪蛋白片段具有非特异性或特异性的切割。通常这些由微生物发酵得到的多肽类物质，极有可能具有一定的生物活性。如果使用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组合生产普通酸奶，由于多肽的产量少，品种单一，生物活性相对较低。

根据反相高效液相色谱原理，疏水性较差的物质由于与分离柱固相结合力较弱，先从分离柱中洗脱下来，而疏水性较好的物质与分离柱固相键合作用较大，后从分离柱中被洗脱下来。由此可得，三个分离物其疏水性按如下顺序排列：瑞士乳杆菌发酵乳分离物B峰>C峰>D峰。经过收集操作，得到D峰值的样品，采用真空冷冻干燥技术进行冷冻干燥，-4℃冷冻保藏，作为后续质谱分析、体外功能性检测的实验材料。

四、生物活性多肽的质量和氨基酸序列测定

1.实验方法

（1）色谱条件：

仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质仪

色谱柱规格：BEH C18色谱柱

流速：0.4mL/min

温度：45℃

紫外检测波长：210nm

进样量：7μL

梯度条件：0min-3min保持99%A液，1%B液；3min-9minB液从1%变为5%，A液从99%变为95%；9min-15minB液从5%变为10%，A液从95%变为90%；15min-21min%B液从10%变为25%，A液从90%变为75%；21min-24min，B液从25%变为40%，A也从75%变为60%；24min-27min，B液从40%变为80%，A液从60%变为20%；27min-27.5min保持80%B液，20%A液；27.5min-28min，B液从80%变为5%，A液从20%变为95%；28min-28.5min，B液从5%变为1%，A液从95%变为99%；28.5min-30min，保持99%A液，1%B液。A液：含有2%乙腈和0.05%TFA的ddH2O；B液：100%乙腈

（2）质谱条件：

离子方式：ES+

质量范围（m/z）：100-1500

毛细管电压（Capillary）（kV）：3.0

采样锥（V）：35.0

离子源温度（℃））：100

去溶剂温度（℃）：350

去溶剂气流（L/hr）：600.0

碰撞能量（eV）：6.0

扫描时间（sec）：0.3

内扫描时间（sec）：0.02

二级质谱母离子质量（m/z）：439.3

根据上述实验条件，利用超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱，得到瑞士乳杆菌发酵乳分离物D峰中分子量为585.32Da的多肽的质量色谱提取图、一级质谱图、二级质谱图，并通过Masslynx软件计算氨基酸序列，结果见图4～图6。

2.实验结果

经过Masslynx软件分析计算，得到分子量为585.32Da的活性多肽片段的氨基酸序列为Gln-Glu-Pro-Val-Leu（QEPVL），记为SEQ ID NO：1。该片段来源于瑞士乳杆菌发酵乳分离物D峰，与β-酪蛋白的209~212号的残基序列相对应，β-酪蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAA30431.1，序列见SEQ ID NO：3。

实施例2生物活性肽QEPV的制备和确认

1.体外模拟胃肠道消化对生物活性多肽QEPVL进行酶解

模拟胃肠道消化实验主要分为两步进行。首先，采用灭菌去离子水配制浓度为500μg/mL生物活性多肽QEPVL溶液，在浓度为500μg/mL QEPVL溶液中加入胃蛋白酶（购自Sigma公司），比例是每克QEPVL加入胃蛋白酶20mg，调节反应液的pH值至2.0，在37℃恒温水浴中保温90min；然后将反应液的pH值调整至7.5，加入胰酶（Corolase PP，购自德国AB公司），比例是每克QEPVL加入胰酶40mg，在37℃恒温水浴中保温150min；最后置于95℃水浴中加热5min使酶失活，将反应液冷冻浓缩干燥，制成干粉，储存于-20℃条件下，备用。

2.酶解产物的质量和氨基酸序列测定

取体外模拟肠胃道消化后的样品粉末0.2mg，加入50μL水和450μL无水乙醇，充分震荡后放入-20℃冰箱20min，在15000rpm转速条件下离心30min，取上清液400μL进行UPLC-Q-TOF-MS分析。

UPLC条件：Hypersil GOLD C18色谱柱（100mm*2.1mm，1.9μm，

）(ThermoScientific Co.)；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：含0.1%甲酸乙腈；采用从99%的A相到50%A相的梯度洗脱程序；流速0.4mL/min；柱温：45℃；进样量：5μL。

Q-TOF-MS条件：飞行时间质谱仪，质谱采用电喷雾电离源（ESI），正离子模式。并以200ng/mL的亮氨酸脑啡肽进行实时精确质量校正。质量扫描范围为m/z 80~1000，扫描时间为0.3s。毛细管电压3kV；锥孔电压35V；一级质谱碰撞能量分别为4；离子源温度100℃；脱溶剂气温度和流量分别为300℃，500L/h。

根据上述实验条件，生物活性多肽QEPVL经过消化酶处理前和处理后产物经UPLC-Q-TOF-MS分析，获得的总离子流图见图7。并对图中b1峰和b2峰进行了提取，采用Q-TOF-MS分析获得了相应的质谱图，见图8-9。

图7中A是空白对照组，为没有经过酶消化处理的生物活性多肽QEPVL总离子流图（TIC）；图7中B是生物活性多肽QEPVL经过胃蛋白酶处理后产物的总离子流图（TIC）；图7中C是生物活性多肽QEPVL经过胃蛋白酶和胰酶先后处理得到的产物总离子流图（TIC）。图7中b2峰的保留时间约为6.50min；图8的质谱分析结果表明b2的相对分子质量为585.3223Da，与生物活性多肽QEPVL的分子量一致，说明是b2峰是QEPVL的原始峰。图7中b1峰的保留时间约为7.10min；图9的质谱分析结果证明b1峰的相对分子质量568.2966Da，是QEPVL脱去一个水分子之后的产物。在图7中A、B、C三条曲线的这两个峰的分子量和保留时间完全相同，说明是来源于同一物质。和空白对照组相比，经过胃蛋白酶处理后的消化产物b1和b2的峰面积与空白对照组基本相等，说明生物活性多肽QEPVL并没有被胃蛋白酶消化。在胃蛋白酶和胰蛋白酶组合作用下，消化产物中b1峰、b2峰的面积大大减少，同时新增了b3峰和b4峰，说明生物活性多肽QEPVL在胃蛋白酶和胰蛋白酶组合作用下，可以消化降解为新的产物。

对生物活性多肽QEPVL在胃蛋白酶和胰蛋白酶组合作用下降解产物的氨基酸组成和分子量进行检测，采用Q-TOF-MS分析获得b3峰和b4的相应的质谱图10和图11。

图10为b4峰提取物的质谱图，分子量为472.2409Da。图11为b3峰提取物的质谱图，分子量为455.2092Da。并且b3峰提取物为b4峰提取物脱去一个水分子后相对应的分子质量。按照QEPVL可能的断裂方式进行分子式的推算和分子量的计算，结果见表2。经过上述计算并结合Masslynx软件分析结果，最终确认生物活性多肽QEPVL经消化酶处理后的主要新产物为QEPV（其含量占全部物质总量的86.37wt%，为b3和b4峰面积之和），其分子量为472.2409Da；同时存在少量的其他降解物。生物活性多肽QEPVL经消化酶处理前后的主要产物保留时间、峰高度、峰面积和峰面积比例见表3。

表2生物活性多肽QEPVL经消化酶处理后可能的断裂方式和分子量的计算

表3生物活性多肽QEPVL经消化酶处理前后的主要产物质谱分析时的保留时间、峰高度、峰面积和峰面积比例

由上述数据可知，多肽QEPVL降解产物是新的物活性多肽QEPV。而新生成的生物活性多肽QEPV没有被消化酶进一步降解，证明产生的生物活性多肽QEPV在消化过程中稳定，可以被动物机体直接吸收利用。

实施例3生物活性肽QEPV的抗氧化活性实验

采用清除自由基法（DPPH·法）和总抗氧化能力法（Ferric Reducing Ability Power FRAP法），对实施例1得到的生物活性多肽QEPV的抗氧化活性进行了测试。

1、[DPPH·]法测定生物活性肽QEPV的体外抗氧化活性

1）实验试剂及仪器

试剂：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl[DPPH·]），日本Wako公司生产；甲醇，上海国药公司提供；实施例2获得的乳源性生物活性多肽QEPV。

主要仪器：Sunrise酶标仪，奥地利Tecan公司产品；96孔细胞培养板，美国Millipore公司制造；分析天平，Meitelei-tolido公司产品。

2）实验方法

（1）1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液

用分析天平称取0.349mg[DPPH·]溶于1mL甲醇溶液中，配制得到的1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液，锡纸避光保存，即配即用。

（2）[DPPH·]甲醇标准曲线的测定

在96孔板中按表4分别加入100μL[DPPH·]甲醇标准曲线样品，室温静置90min，用酶标仪在517nm处检测吸光值。

表4[DPPH·]甲醇标准曲线溶液配制

根据实验结果，使用Excel拟合曲线并计算回归方程，结果见图12（回归方程：y=-0.192x＋0.2271，R²=0.9991）。[DPPH·]甲醇标准曲线的线性关系良好，相关系数为0.999，表明[DPPH·]甲醇标准曲线精密度和准确度均符合检测要求。从结果看，吸光度值与[DPPH·]含量呈反比关系，[DPPH·]含量越少，吸光值越高，即样品清除自由基的能力越强。

(3)[DPPH·]法测定生物活性肽QEPV的抗氧化活性

1）样品组：在96孔板中加入80μL浓度为1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液、按表5分别加入20μL不同浓度的待测样品（QEPV）、阳性对照1（2.5mg/mL的Trolox）、阳性对照2（0.025mg/mL的Trolox），和阴性对照（植酸）；

2）空白组：在同一96孔板上，以加入80μL浓度为1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液和20μL去离子水的样品做空白对照。

待检测样品加样完毕后，室温静置90min，用酶标仪在517nm处检测吸光值。按照下式计算自由基清除率，实验结果见表5。

公式：

表5[DPPH·]法测定生物活性多肽QEPV的抗氧化活性结果

由表5可知，作为阳性对照的2.5mg/mL的Trolox在相同条件下具有最强的清除自由基的能力，几乎能清除溶液中所有的自由基，其次为0.025mg/mL的Trolox、植酸、生物活性多肽QEPV。乳源性生活活性多肽QEPVL消化降解得到的多肽QEPV清除[DPPH·]自由基率随浓度变化先上升后下降，在浓度为2.5mg/mL处达到最高值为21.81%。

2、FARP法测定生物活性多肽QEPV的体外抗氧化能力

1）实验试剂和仪器

总抗氧化能力检测试剂盒（Ferric Reducing Ability of Plasma FRAP法），购自上海碧云天生物科技公司；FeSO₄溶液（10mmol/L），水溶性维生素E（Trolox溶液）（10mmol/L），实施例2获得的乳源性生物活性多肽QEPV。

主要仪器：Sunrise酶标仪，奥地利Tecan公司产品；96孔细胞培养板，美国Millipore公司制造；分析天平，Meitelei-tolido公司产品；HWS26型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司制造。

2）实验方法

（1）FRAP工作液的配制

根据总抗氧化能力检测试剂盒，将TPTZ 7.5mL稀释液、TPTZ 750μL溶液、检测缓冲液750μL混合均匀，并在37℃水浴中孵育，2小时内用完。

（2）FeSO₄标准曲线曲线的制作

在96孔板中先加入180μL FRAP工作液，按表6加入5μL FeSO₄标准曲线溶液，轻轻混匀，37℃孵育3-5min后，用酶标仪在593nm处测定吸光值。

表6FeSO₄标准曲线测定的溶液配制

FeSO₄浓度与吸光值呈良好的正比关系，FeSO₄浓度越高，吸光值越高。本发明FeSO₄标准曲线结果见图13，标准曲线的线性关系良好，相关系数为0.998，FeSO₄标准曲线的精密度和准确度均符合检测要求，可用于后续计算。

（3）FRAP法测定生物活性多肽QEPV的抗氧化能力

在96孔板中先加入180μL FRAP工作液，空白对照孔中加入5μL ddH₂O，样品检测孔内加入5μL待测样品、阳性对照内加入5μL植酸，轻轻混匀，37℃孵育3-5min后，用酶标仪在593nm处测定吸光值。总抗氧化能力表示方式以FeSO₄标准溶液的浓度来表示。按照下式计算总抗氧化能力，实验结果见表7。

表7FARP法测定生物活性多肽QEPV的总抗氧化能力结果

通过总抗氧化能力法（Ferric Reducing Ability Power FRAP法）对生物活性多肽QEPV体外总抗氧化活性进行了测定，发现生物活性多肽QEPV具有一定的还原氧化物质的能力：在浓度为4mg/mL情况下多肽QEPV显示出的总抗氧化能力达到0.0201mmol/g，而具有弱抗氧化活性的植酸的总抗氧化能力为0.0089mmol/g。说明生物活性多肽QEPV的总抗氧化能力高于同等浓度下的具有弱抗氧化活性的植酸，具有显著性（p>0.05）差异。因此，可认定发明的生物活性多肽QEPV具有显著的抗氧化能力。

实施例4生物活性肽的促进机体免疫力活性实验

一、MTT法测定生物活性多肽QEPV的体外淋巴细胞增殖能力实验

1)实验材料与仪器：

试剂与材料：实验动物balb/c小鼠（雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心）；实施例2制备的乳源性生物活性多肽QEPV；小鼠淋巴细胞提取液（购自索来宝公司）；RPMI1640培养基（购自GIBCO公司）；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，购自Amresco公司）；伴刀豆蛋白（ConA，购自Sigma公司）；牛血清白蛋白（BSA，购自Genebase公司）；胃蛋白酶（购自Sigma公司）；胰酶（Corolase PP，购自AB公司）。

仪器：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO₂培养箱，Heraeus公司；Dragon Wellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。

2）实验方法：

无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行元代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×10⁶个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL样品。设置空白对照组（pH7.2～7.4，3mol/L的PBS）和阴性对照组（500μg/mL BSA），研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5%CO₂37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。

体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：

式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。

3）实验结果及分析

实验结果见表8。由表8可知，在多肽QEPV的质量浓度为100μg/mL的情况下，设定阴性对照组的刺激指数为1，多肽QEPV的刺激指数可以达到1.1466，说明QEPV是一种具有促进淋巴细胞增殖功能的生物活性多肽，且和阴性对照组具有显著差异（P<0.05）。因此，可以认定生物活性多肽QEPV具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力。可以作为一种保健品或者添加剂食用，能够提高动物和人体的免疫力。

表8生物活性多肽QEPVL对体外淋巴细胞增殖的影响

注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)。

二、MTT法测定生物活性多肽QEPV的体外巨噬细胞增殖能力实验

1）实验试剂及仪器

试剂：实验动物balb/c小鼠（雄性6-8周龄）上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；瑞士乳杆菌发酵得到的乳源性生物活性多肽QEPVL；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）Amresco公司；LPS Sigma公司；牛血清白蛋白（Bovine SerumAlbumin，BSA）Genebase公司；三联溶解液，含10%SDS、5%异丁醇以及0.012mol/L HCl的水溶液。

仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO₂培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。

2）试验方法：

balb/c小鼠腹腔注射2ml的2%（w/w）灭菌淀粉溶液，连续注射三天，最后一次注射24小时后断颈处死。剥去腹部皮肤，用注射器吸取4℃磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗腹腔，离心管收集冲洗液后，离心（1000rpm，4℃）10分钟后弃上清，用4℃RPMI1640完全培养液（含10%FBS）洗涤两次，0.2%台盼蓝溶液染色做细胞活力检测，确认采集到的有活力巨噬细胞占95%以上。细胞计数板读数后，调整细胞浓度至合适浓度。

将已吹打至完全悬浮的细胞悬液以合适体积加入96孔细胞培养板，37℃、5%CO₂环境下培养4小时后，吸弃孔中液体，用37℃RPMI1640完全培养液小心清洗细胞培养板孔底，洗去未贴壁的细胞和细胞碎片，得到纯化后的贴壁腹腔巨噬细胞。每孔加入0.2ml RPMI1640完全培养基，实验用小肽样品及LPS事先溶解于培养基后加入，开始细胞培养。

加入细胞个数为2×10⁵/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性多肽QEPV(100，500，1000μg/mL)的RPMI1640完全培养液（10%FBS）200μl/孔，连续培养48小时，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度100ng/ml。44小时时加入5%MTT 20μl/孔，达到48小时后加入100μl/孔的溶解液以终止培养，隔夜溶解后，在波长570nm下用酶标仪测各孔的吸光度值（OD570），生长指数（Growth Indices）的计算公式如下：

其中，空白组为不施加小肽和BSA的细胞处理组，BSA组为阴性对照。

3）实验结果

实验结果见图14，在实验组中生物活性多肽QEPV的添加浓度分别为1000，500，100μg/mL，空白组加入相应量的PBS作为空白对照，表示在没有LPS刺激的情况下巨噬细胞的增殖情况。和空白对照组相比，添加不同浓度的多肽QEPV实验组随着实验浓度的增加，巨噬细胞的增殖能力逐渐上升，在浓度为1000，500μg/mL时，具有显著性差异（P<0.05）。说明生物活性多肽QEPV具有促进巨噬细胞增殖的能力。

三、生物活性多肽QEPVL和QEPV的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的比较（Griess法）

1）实验试剂和仪器

试剂：实验动物balb/c小鼠（雄性6-8周龄）上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1和实施例2制备的瑞士乳杆菌发酵得到的乳源性生物活性多肽QEPV和QEPVL；LPS Sigma公司；一氧化氮检测试剂盒，碧云天生物技术研究所生产。

仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO₂培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。

2）试验方法：

加入细胞个数为2×10⁶/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含活性多肽的RPMI1640完全培养液（10%FBS）200μl/孔，炎症组在24h时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48h后，收集培养液上清50μl/孔，在培养液上清中依次添加Griess试剂1和Griess试剂2各50μl/孔，室温反应10分钟后，在540nm波长下测定吸光度值（OD540）。

3）实验结果：

实验结果见图15-16，实验结果表明在实验组中生物活性多肽QEPVL及其的降解产物多肽QEPV在有LPS造炎症情况下均能促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加。与细胞空白组相比，均具有显著性差异（P<0.05）。在正常情况（没有LPS刺激的情况）下，高浓度QEPVL（1000μg/mL）的表现效果较好。在低浓度（100μg/mL、500μg/mL）时，QEPV对一氧化氮的诱生量高于QEPVL。无论是否有LPS刺激，QEPVL随着浓度的增加，对于一氧化氮的诱生能力逐渐提高。而QEPV的剂量效应正好与QEPVL相反。在没有LPS刺激的情况下，QEPV各组间没有显著性差异。在LPS存在的情况下，QEPV各组实验结果呈现了显著性差异（p<0.05）。说明来源于生物活性多肽QEPVL的降解产物多肽QEPV同样具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力，而且在有外源性刺激物存在情况下，QEPV促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力比QEPVL高。

四、生物活性多肽QEPV的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验（ELISA法）

1.实验试剂及设备

1）试剂：实验动物balb/c小鼠（雄性6-8周龄），上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），Genebase公司；实施例2制备的乳源性生物活性多肽QEPV；ELISA细胞因子快速试剂盒（IFN-γ），武汉博士德生物工程有限公司；ConA，购自Sigma公司。

1）仪器设备

CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO₂培养箱，Heraeus公司；Dragon Wellscan MK3酶标仪，Labsystems公司。

2.试验方法

1）制作TNF-γ标准曲线：

将浓度为2000pg/mL，1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.825pg/mL的TNF-γ标准品依次加入酶标板孔内，再加入细胞因子检测液100ul，酶标板加上盖，37℃反应90min。甩去酶标板内液体，每孔依次加入相应细胞因子抗体工作液（试剂盒内药品）0.1mL。37℃反应60min。0.01M PBS洗涤3次，每孔加入0.1mLABC工作液（试剂盒内药品），37℃反应30min。0.01M PBS洗涤5次，每孔加入90ul TMB显色液，37℃避光反应25min。每孔加入0.1mL TMB终止液，用酶标仪在450nm测定吸光值。制作的TNF-γ检测用标准曲线如图17所示：IFN-γ标准曲线是以浓度为横坐标（单位pg/mL），450nm下的吸光值为纵坐标，进行一次回归拟合，获得标准曲线Y=0.0007X+0.2336，R²=0.9689；其中X代表IFN-γ浓度，单位为pg/mL，Y代表OD450下的吸光值。

2）生物活性多肽QEPV对IFN-γ分泌量的影响：

在无菌条件下取小鼠脾脏淋巴细胞，调整细胞浓度至5×10⁵/mL接种于96孔板。实验组每孔加入20μg/mL的生物活性多肽QEPV进行培养，分别培养24，36，48，60，72小时后，收集培养液，离心2000*g 20min，取上清液作为细胞因子检测，检测IFN-γ，实验结果如图18所示。同时，以未添加QEPV培养的小鼠脾脏淋巴细胞的细胞培养液作为对照。

4）在有分裂原（ConA）刺激淋巴细胞情况下生物活性多肽QEPV对IFN-γ分泌的影响

在无菌条件下取小鼠脾脏淋巴细胞，调整细胞浓度至5×10⁵/mL接种于96孔板。实验组生物活性多肽QEPV每孔的添加终浓度分别为100，50，10μg/mL，培养36小时后进行细胞因子的测定；有分裂原刺激组，每孔除了添加浓度分别为100，50，10μg/mL的生物活性多肽QEPV之外，每孔还加入10μg/ml的ConA0.1ml作为分裂原；空白对照不添加任何物质；阴性对照每孔添加10μg/ml的ConA 0.1ml，实验结果如图19所示。

3.实验结果及分析

由图18可知，实验组与空白组相比，在生物活性多肽QEPV的作用下，实验组的IFN-γ分泌量大于对照组，并且在36小时分泌量达到最大值。从IFN-γ分泌变化来看，生物活性多肽QEPV的浓度使其影响趋势呈现先显著上升，之后缓慢下降的过程。因此，选定36小时作为测定IFN-γ分泌量的最佳培养时间。

由图19可知，无论培养液中是否有分裂原（ConA）作为抗原存在，均呈现于高浓度的生物活性多肽QEPV抑制IFN-γ的分泌，低浓度促进IFN-γ的分泌。说明本发明得到的生物活性多肽QEPV可能通过调节IFN-γ的分泌量发挥体液免疫调节作用。

Claims (10)

1.一种生物活性多肽，其氨基酸序列为Gln-Glu-Pro-Val。

2.编码权利要求1所述生物活性多肽的核苷酸片段。

3.权利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段的序列如SEQ ID NO：2所示。

4.权利要求1所述生物活性多肽的制备方法，步骤如下：

1）发酵：将瑞士乳杆菌添加到脱脂乳中进行厌氧发酵，获得瑞士乳杆菌发酵乳；

2）多肽的粗提：对步骤1）的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离，取上清液；

3）多肽的纯化：

a.对步骤2）的上清液进行超滤处理，收集滤液；

b.收集的滤液采用反向层析柱SOURSE5RPC ST进行反相高效液相色谱分离，收集生物活性多肽Gln-Glu-Pro-Val-Leu；

4）多肽的消化：采用两步酶解法酶解步骤3）的生物活性多肽Gln-Glu-Pro-Val-Leu，获得生物活性多肽Gln-Glu-Pro-Val；第一步酶解所采用的酶为胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶为胰酶。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1）所述厌氧发酵的条件为：发酵温度36～38℃，发酵时间15～20h。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3）a所述超滤法所采用的滤膜的截留分子量分别为10kDa和3kDa；所述超滤过程中，压力范围为0.1～0.3MPa，滤液流速为0.8～1.2mL/min。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤4）所述两步酶解法为:将生物活性多肽Gln-Glu-Pro-Val-Leu溶于灭菌去离子水中，并加入胃蛋白酶，获得反应液，调节反应液pH值为2.0±0.1，在37±0.5℃的恒温水浴中保温反应60～120min，获得第一步酶解液；将第一步酶解液的pH值调整为7.5±0.1，并加入胰酶，于37±0.5℃的恒温水浴中保温反应120～180℃，获得第二步酶解液；将第二步酶解液采用沸水浴法使酶失活，获得酶解产物；酶解产物冷冻干燥获得产品。

8.权利要求1所述生物活性多肽在制备抗氧化和/或增强机体免疫力的食品、保健品及药物中的应用。

9.一种抗氧化药物，包含权利要求1所述生物活性多肽Gln-Glu-Pro-Val。

10.一种增强机体免疫力药物，包含权利要求1所述生物活性多肽Gln-Glu-Pro-Val。

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