CN103232526B - 一种生物活性多肽lplp及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种具有体外抗氧化活性和提高机体免疫力的乳源性生物活性多肽LPLP，其氨基酸序列为Leu-Pro-Leu-Pro。经过体外抗氧化实验、体外免疫功能促进实验，验证了多肽LPLP具有较好的抗氧化生物学活性和促进细胞免疫的活性：一方面能够清除机体内的自由基，减少自由基对人体的伤害；另一方面，本发明的生物活性多肽LPLP还能够增强巨噬细胞的吞噬功能，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且不会引起机体的免疫排斥反应。对开发具有抗氧化功能及增强免疫功能的乳制品、保健品以及药物具有十分重要的意义。

Description

一种生物活性多肽LPLP及其制备和应用
技术领域
本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种生物活性多肽LPLP及其制备和应用。
背景技术
在牛乳经乳酸菌发酵的过程中，牛乳中的一部分蛋白质被乳酸菌代谢利用，并发生了一系列生理生化反应，使蛋白质变为多肽或者游离的氨基酸，被人体消化吸收或通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进入人体的血液循环。在这些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被称为“生物活性多肽”。
氧化反应和氧化代谢对于食物和人体来说都是至关重要的，自由基和活性氧引起了一系列的氧化反应。当过量的自由基形成，它们会超过保护性酶如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的保护作用，从而导致脂质氧化、细胞凋亡等一系列的副作用产生。这一类的氧化反应，不仅影响含脂食物的保质期，也对人体的健康造成了一定的危害，如风湿性关节炎、糖尿病、动脉硬化等。此外，Collins等人2005年研究发现癌症的发生也与DNA的氧化损伤有关。
早期一些人工合成的抗氧化剂如丁基羟基茴香醚（BHA）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）被运用到食品中，作为脂质的抗氧化剂，但这些人工合成的添加剂对于人体都有潜在的风险。因此，在天然食物来源中寻找安全的抗氧化剂尤为重要。近些年来，人们发现一些食物来源的多肽类物质具有良好的抗氧化作用，如玉米短肽、大豆肽、牛乳多肽等。这些多肽可以通过微生物发酵、消化酶解等多种途径得到，并且大多具有抗氧化活性的多肽是由2~20个氨基酸残基组成，分子量小于6000Da，含有一定量的疏水氨基酸、芳香族氨基酸。
免疫活性肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性多肽。1981年Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊血红细胞的吞噬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗。李素萍等人用合成的乳源免疫调节肽（PGPIPN）饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的免疫调节功能有显著的增强。
研究表明，免疫活性肽不仅能够增强机体免疫力，刺激机体淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的吞噬功能，还能促进细胞因子的释放、提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且不会引起机体的免疫排斥反应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物活性多肽，其氨基酸序列为Leu-Pro-Leu-Pro（LPLP，SEQ ID NO：1）。
较优的，所述生物活性多肽的来源为乳源性。
本发明的生物活性多肽LPLP为乳源性，具体来源于β-酪蛋白，并且为β-酪蛋白(SEQ IDNO:3)第150~153位的氨基酸残基。
较优的，所述生物活性多肽具有体外抗氧化活性和增强机体免疫力的功能。
本发明的生物活性多肽可以通过基因工程的方法和化学方法人工合成，也可以从乳制品中通过分离纯化的方法直接获得。
本发明还公开了编码前述生物活性多肽的核苷酸片段。
β-酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列为既有技术，编码β-酪蛋白第150～153位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽LPLP。
进一步的，编码前述生物活性多肽的核苷酸片段，其序列为：5’-cttcctctgcct-3’（SEQ IDNO:2）
本发明第二方面公开了前述生物活性多肽的制备方法，步骤如下：
1）发酵：将瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）添加到脱脂乳中进行厌氧发酵，获得瑞士乳杆菌发酵乳；
2）多肽的粗提：对步骤1）的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离，取上清液；
3）多肽的纯化：
a.对步骤2）的上清液进行超滤处理，收集滤液；
b.收集的滤液采用反向层析柱SOURSE 5RPC ST（4.6×150mm）进行反相高效液相色谱分离，收集生物活性多肽LPLP。
本发明所述脱脂乳为经过脱脂处理的乳制品，通常脱脂乳中脂肪含量小于0.1%。
较优的，步骤1）所述厌氧发酵的条件为：发酵温度36～38℃，发酵培养15～20h；优选发酵培养19h。
较优的，步骤2）所述低温离心的条件为：4℃，8000～10000rpm，离心15～30min。
较优的，步骤3）a所述超滤法所采用的滤膜的截留分子量分别为10kDa和3kDa。本发明采用截留分子量分别为10kDa、3kDa的滤膜，使样品依次通过两张滤膜进行超滤。
更优的，步骤3）a所述超滤过程中，压力范围为0.1~0.3MPa，滤液流速为0.8～1.2mL/min。
较优的，步骤3）b反相高效液相色谱分离法中，流动相A为含有2%乙腈和0.05%TFA的ddH2O；流动相B为100%乙腈。
较优的，步骤3）b反相高效液相色谱分离法中，收集分子量为439.29Da的多肽的洗脱峰，即为生物活性多肽LPLP。
在本发明反相高效液相色谱法分离过程中，已知LPLP的分子量，收集分子大小为439.29Da的洗脱峰，即为本发明的生物活性多肽LPLP。具体的，本发明分子大小为439.29Da的洗脱峰其保留时间为21min。
本发明第三方面公开了前述生物活性多肽在制备抗氧化和/或增强机体免疫力的食品、保健品及药物中的应用。
本发明的生物活性多肽LPLP可以用于酸奶等乳制品、减少自由基对皮肤伤害的化妆品；并且由于本发明的生物活性多肽LPLP能够通过胃肠道直接吸收不被降解，因此可以用于制备提高免疫力的保健品，或者用于制备具有抗氧化和/或增强机体免疫力的药物。
本发明第四方面公开了一种抗氧化药物，包含前述生物活性多肽LPLP或前述生物活性多肽LPLP的衍生物。
本发明第五方面公开了一种增强机体免疫力药物，包含前述生物活性多肽LPLP或前述生物活性多肽LPLP的衍生物。
所述多肽的衍生物，是指在多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
本发明生物活性多肽LPLP的有益效果为：本发明的乳源性生物活性多肽LPLP具有很好的抗氧化活性和促进机体免疫力活性；一方面能够清除机体内的自由基，减少自由基对人体的伤害；另一方面，本发明的生物活性多肽LPLP还能够增强机体免疫力，增强巨噬细胞的吞噬功能，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且能够通过胃肠道直接吸收不被降解，进入体内不会引起机体的免疫排斥反应。对开发具有抗氧化功能及增强免疫功能的乳制品、保健品和药品具有十分重要的意义。
附图说明
图1：瑞士乳杆菌发酵乳与未经发酵处理的脱脂乳超滤后粗提物的质谱对比图（A：3000Da未经发酵的脱脂乳粗提物质谱图，B：3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物质谱图）
图2：3000Da未经发酵脱脂乳粗提物与3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳粗提物分子量差异及丰度比较
图3：反相高效液相色谱分离对照发酵乳和瑞士乳杆菌发酵乳中生物活性多肽比较图（a曲线：对照发酵乳反相高效液相色谱215nm的洗脱图谱；b曲线：瑞士乳杆菌发酵乳3000Da上清液反相高效液相色谱215nm的洗脱图谱）
图4：质量色谱提取图（m/z=439.29）
图5：质荷比为439.29的片段的一级质谱图
图6：质荷比为439.29的片段的二级质谱图
图7：质荷比为439.29的多肽az、by断裂情况及计算得到的序列
图8：[DPPH·]甲醇标准曲线
图9：瑞士乳杆菌发酵乳中生物活性多肽对[DPPH·]自由基清除率
图10：FeSO4标准曲线结果
图11：酶解处理后LPLP的总离子流图
图12：酶解处理后LPLP的一级质谱图
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1活性肽的制备
一、发酵乳的制备
1）瑞士乳杆菌发酵乳
采用脱脂奶粉（新西兰NZMP牌脱脂奶粉）与水配置12wt%的脱脂乳（12g脱脂奶粉加入到88g水中，下同）。在无菌条件下，挑取瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus，CICC6024）菌落三环，将其加入已灭菌的12wt%的脱脂乳中，在无菌条件下搅拌均匀。接种完成后，用铝箔封口，以防止污染。置于培养箱中37℃培养19h。培养结束后，在无菌条件下将凝乳搅拌均匀，即完成瑞士乳杆菌的活化，制得用于制备瑞士乳杆菌发酵乳的发酵剂。
取10mL已制备的瑞士乳杆菌发酵剂接种到500mL已灭菌的12wt%脱脂乳中（接种率为2v/v%），37℃发酵19h后，在无菌条件下搅开凝乳，在4℃条件下保存，得到瑞士乳杆菌发酵乳。
2）对照发酵乳
采用同样方法，使用保加利亚乳杆菌(Lactobacillus Bulgaricus，LB340)和嗜热链球茵(Streptococcus Thermophilus，TA40)作为发酵菌种制作对照发酵乳。
具体方法为：在无菌条件下，分别挑取保加利亚乳杆菌与嗜热链球茵菌落三环，将其分别加入已灭菌的12wt%的脱脂乳中，在无菌条件下搅拌均匀。接种完成后，用铝箔封口，以防止污染。置于培养箱中37℃培养19h。培养结束后，在无菌条件下将凝乳搅拌均匀，即完成保加利亚乳杆菌与嗜热链球茵的活化，制得用于制备对照发酵乳的两种发酵剂。
取5mL已制备的保加利亚乳杆菌发酵剂和5mL嗜热链球菌发酵剂，共同接种到500mL已灭菌的12wt%脱脂乳中（接种率为2v/v%），37℃发酵19h后，在无菌条件下搅开凝乳，在4℃条件下保存，得到对照发酵乳。
二、生物活性多肽的确认
1.实验方法
1）样品处理
分别将前一步骤制备的瑞士乳杆菌发酵乳和对照发酵乳，以及12wt%的脱脂乳装入离心管中进行低温离心，离心条件为9000rpm/min，4℃，20min。离心后弃沉淀，取上清液。
将上清液分别倒入超滤杯中，为了防止生物活性多肽被氧化，打开氮气罐压力阀充氮，同时打开磁力搅拌装置，以防止溶液出现浓差极化现象。使样品分别通过截留分子量为10kDa、3kDa的滤膜，待有滤液流出时进行收集。
超滤过程中，应保持流速稳定，滤液清澈。流速控制在1mL/min左右，压力为0.1~0.3MPa，分别收集瑞士乳杆菌发酵乳、对照发酵乳，以及未发酵的12wt%脱脂乳的滤液作为实验样、对照样以及空白对照，于-4℃冷冻保存。
2）质谱分析
将前一步骤收集的瑞士乳杆菌发酵乳超滤后的滤液（实验样）和脱脂乳超滤后的滤液（空白对照）进行质谱分析，质谱条件如下：
离子方式：ES+
质量范围（m/z）：100-1500
毛细管电压（Capillary）（kV）：3.0
采样锥（V）：35.0
离子源温度（℃））：100
去溶剂温度（℃）：350
去溶剂气流（L/hr）：600.0
碰撞能量（eV）：6.0
扫描时间（sec）：0.3
内扫描时间（sec）：0.02
2．实验结果
瑞士乳杆菌发酵乳超滤后的滤液（实验样）和脱脂乳超滤后的滤液（空白对照）的质谱对比结果见图1～2。图1中的A曲线为3000Da未经发酵的脱脂乳（空白对照）粗提物样品，图1中的B曲线为3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物样品（实验样）。经过比较可以看出，经过瑞士乳杆菌发酵后，3000Da未经发酵乳粗提物和3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳粗提物的组分上发生很大变化，且这些组分由于疏水性不同保留时间亦有所差异。此质谱质量范围为100Da-1500Da，因此可知脱脂乳在1500Da以下、210nm处有吸收的小分子物质相对较少；而经过瑞士乳杆菌发酵后，在这一分子量范围内的物质明显增多，说明了这些多肽并不存在于未经发酵处理的脱脂乳中，而是经瑞士乳杆菌发酵后才产生的。而且我们发现随着发酵时间的延长，多肽的丰度明显增多，进一步证实了通过瑞士乳杆菌的发酵，脱脂乳中原有的大分子蛋白被分解，从单一的大分子蛋白变为量多且复杂的小分子多肽。
图2是3000Da未经发酵脱脂乳（空白对照）粗提物与3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳（实验样）粗提物不同分子量物质丰度差异的比较结果。纵向轴表明在脱脂乳粗提物中所含物质对应的分子量，横向轴表明发酵乳粗提物中所含物质对应的分子量。通过比较，可以得到瑞士乳杆菌发酵乳和未经发酵脱脂乳中，因为发酵所带来的差异较大的物质的分子量，从而选择这些质荷比的母离子通过二级质谱进行进一步的分析。
如图1所示，分子量397.07Da，保留时间6.72分钟的物质在脱脂乳粗提物中含量较高（图1-A图谱中的峰），而发酵乳中几乎没有。而分子量为232.15Da，保留时间为3.61min的物质在发酵乳和脱脂乳中的含量均比较高。因此，我们选择了在发酵乳中含量较高而在未经发酵的脱脂乳中含量较低的组分进行了差异比较，比较结果见表1。
表1：3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物与3000Da脱脂乳粗提物差异比较
根据MarkerLynx软件分析，得到具有显著性差异的（p>0.05）分子量片段如表1所示，根据丰度和质荷比情况，选择439.291Da，保留时间为16.20min的多肽进行二级质谱的测序分析。
三、生物活性多肽的分离提纯和产量的比较
1.实验仪器和试剂
仪器：蛋白纯化仪purifier10
色谱柱规格：SOURSE 5RPC ST4.6/150
流速：1mL/min
温度：25℃
紫外检测波长：215nm
流动相A：含有2%乙腈和0.05%TFA的ddH2O
流动相B：100%乙腈
进样量：1mL
梯度条件：0min-7.5min保持100%A液；7.5min-42.5minB液从0%变为50%；42.5min-45minB液从50%变为100%；45min-50min保持100%B液；50min-72minA液从0%变为100%。
2．实验方法
样品前处理：将实验样和对照样与流动相A液对半稀释（体积比1:1进行稀释），作为上样样品。上样样品进行反相高效液相色谱分析，实验结果见图3。
3．实验结果
由图3可见，a曲线是对照样的反相高效液相色谱215nm的洗脱图谱，洗脱时间为26min处有一明显的吸收峰，其余峰高相对较低，根据吸收值和肽键浓度的正比关系，可认为在12%对照发酵乳3000Da上清液（对照样）中，其多肽类物质较少，且种类单一。b曲线是瑞士乳杆菌发酵乳3000Da上清液（实验样）反相高效液相色谱215nm的洗脱图谱，与对照发酵乳相比，瑞士乳杆菌发酵乳3000Da上清液的反相图谱中吸收峰明显增多，且在洗脱时间为21min、24min和33min处有三处最为明显的吸收峰，实验中对这三个峰进行了收集，分别记录为发酵乳分离物B峰、发酵乳分离物C峰和发酵乳分离物D峰。
根据对各分子量对应的多肽与原发酵乳分离物B峰、C峰和D峰对应分子量物质的保留时间对比，发现分子量439.29Da的物质来源于发酵乳分离物的B峰。
通过对照发酵乳和瑞士乳杆菌发酵乳的比较，可发现经过瑞士乳杆菌发酵得到的发酵乳，其含有比对照发酵乳更为丰富的、分子量小于3000Da的多肽物质。这些多肽类物质是由于原脱脂乳中的大蛋白被瑞士乳杆菌所分泌的胞内酶和胞外酶分解，释放出一些多肽片段和游离的氨基酸所形成的。乳酸菌所分泌的胞外酶对乳品中β-酪蛋白片段具有非特异性或特异性的切割。通常这些由微生物发酵得到的多肽类物质，极有可能具有一定的生物活性。如果使用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组合生产普通酸奶，由于多肽的产量少，品种单一，生物活性相对较低。
根据反相高效液相色谱原理，疏水性较差的物质由于与分离柱固相结合力较弱，先从分离柱中洗脱下来，而疏水性较好的物质与分离柱固相键合作用较大，后从分离柱中被洗脱下来。由此可得，三个分离物其疏水性按如下顺序排列：瑞士乳杆菌发酵乳分离物B峰>C峰>D峰。经过收集操作，得到B峰值的样品，采用真空冷冻干燥技术进行冷冻干燥，-4℃冷冻保藏，作为后续质谱分析、体外功能性检测的实验材料。
四、生物活性多肽的质量和氨基酸序列测定
1.实验方法
（1）色谱条件：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质仪色谱柱规格：BEH C18色谱柱
流速：0.4mL/min
温度：45℃
紫外检测波长：210nm
进样量：7μL
梯度条件：0min-3min保持99%A液，1%B液；3min-9minB液从1%变为5%，A液从99%变为95%；9min-15minB液从5%变为10%，A液从95%变为90%；15min-21min%B液从10%变为25%，A液从90%变为75%；21min-24min，B液从25%变为40%，A也从75%变为60%；24min-27min，B液从40%变为80%，A液从60%变为20%；27min-27.5min保持80%B液，20%A液；27.5min-28min，B液从80%变为5%，A液从20%变为95%；28min-28.5min，B液从5%变为1%，A液从95%变为99%；28.5min-30min，保持99%A液，1%B液。A液：含有2%乙腈和0.05%TFA的ddH2O；B液：100%乙腈
（2）质谱条件：
离子方式：ES+
质量范围（m/z）：100-1500
毛细管电压（Capillary）（kV）：3.0
采样锥（V）：35.0
离子源温度（℃））：100
去溶剂温度（℃）：350
去溶剂气流（L/hr）：600.0
碰撞能量（eV）：6.0
扫描时间（sec）：0.3
内扫描时间（sec）：0.02
二级质谱母离子质量（m/z）：439.3
根据上述实验条件，利用超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱，得到瑞士乳杆菌发酵乳分离物B峰中分子量为439.29Da的质量色谱提取图、一级质谱图、二级质谱图和通过Masslynx软件计算氨基酸序列，结果图见图4-7。
2.实验结果
由图7可知，根据az、by断裂的情况，经过Masslynx软件分析计算，得到质荷比439.29Da的片段序列为Leu-Pro-Leu-Pro（LPLP），记为SEQ ID NO：1。该片段来源于瑞士乳杆菌发酵乳分离物B峰，与β-酪蛋白的150～153号的残基序列相对应，β-酪蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAA30431.1，序列见SEQ ID NO：3。
实施例2生物活性多肽的抗氧化活性实验
采用清除自由基法（DPPH·法）和总抗氧化能力法（Ferric Reducing Ability Power FRAP法），对实施例1得到的生物活性多肽LPLP的抗氧化活性进行测试。
1、[DPPH·]法测定生物活性多肽LPLP的体外抗氧化活性
1）实验试剂及仪器
试剂：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl[DPPH·]），日本Wako公司生产；甲醇，上海国药公司提供；实施例1获得的瑞士乳杆菌发酵得到的乳源性生物活性多肽LPLP（收集到的B峰值样品）。
主要仪器：Sunrise酶标仪，奥地利Tecan公司产品；96孔细胞培养板，美国Millipore公司制造；分析天平，Meitelei-tolido公司产品。
2）实验方法
（1）1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液
用分析天平称取0.349mg[DPPH·]溶于1mL甲醇溶液中，配制得到的1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液，锡纸避光保存，即配即用。
（2）[DPPH·]甲醇标准曲线的测定
在96孔板中按表2分别加入100μL[DPPH·]甲醇标准曲线样品，室温静置90min，用酶标仪在517nm处检测吸光值。
表2[DPPH·]甲醇标准曲线溶液配制
根据实验结果，使用Excel拟合曲线并计算回归方程，结果见图8（回归方程：y=-0.192x＋0.2271，R2=0.9991）。[DPPH·]甲醇标准曲线的线性关系良好，相关系数为0.999，表明[DPPH·]甲醇标准曲线精密度和准确度均符合检测要求。从结果看，吸光度值与[DPPH·]含量呈反比关系，[DPPH·]含量越少，吸光值越高，即样品清除自由基的能力越强。
(3)[DPPH·]法测定生物活性多肽LPLP的抗氧化活性
待检测样品的制备：
1）样品组：在96孔板中加入80μL浓度为1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液、按表3分别加入20μL不同浓度的待测样品（LPLP）、阳性对照1（2.5mg/mL的Trolox）、阳性对照2（0.025mg/mL的Trolox），和阴性对照（植酸）；
2）空白组：在同一96孔板上，以加入80μL浓度为1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液和20μL去离子水的样品做空白对照。
待检测样品加样完毕后，室温静置90min，用酶标仪在517nm处检测吸光值。按照下式计算自由基清除率，实验结果见表3。
表3[DPPH·]法测定瑞士乳杆菌发酵乳中生物活性多肽的抗氧化活性结果（%）
从图9可以看出，作为阳性对照的2.5mg/mL的Trolox在相同条件下具有最强的清除自由基的能力，几乎能清除溶液中所有的自由基，其次为0.025mg/mL的Trolox、植酸、发酵乳分离物B峰分离肽。本发明从发酵乳分离物B峰中分离的多肽LPLP清除[DPPH·]自由基率为29.23%，并且随着LPLP浓度的降低，清除自由基能力减弱。
2、FARP法测定发酵乳中多肽体外抗氧化能力
1）实验试剂和仪器
试剂：总抗氧化能力检测试剂盒（Ferric Reducing Ability ofPlasma FRAP法），购自上海碧云天生物科技公司；FeSO4溶液（10mmol/L）；水溶性维生素E（Trolox溶液）（10mmol/L）；
实施例1获得的瑞士乳杆菌发酵得到的乳源性生物活性多肽LPLP。
主要仪器：Sunrise酶标仪，奥地利Tecan公司产品；96孔细胞培养板，美国Millipore公司制造；分析天平，Meitelei-tolido公司产品；HWS26型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司制造。
2）实验方法
（1）FRAP工作液的配制
根据总抗氧化能力检测试剂盒，将TPTZ 7.5mL稀释液、TPTZ 750μL溶液、检测缓冲液750μL混合均匀，并在37℃水浴中孵育，2h内用完。
（2）FeSO4标准曲线曲线的制作测定
在96孔板中先加入180微升FRAP工作液，按表4加入5μL FeSO4标准曲线溶液，轻轻混匀，37℃孵育3-5min后，用酶标仪在593nm处测定吸光值。
表4FeSO4标准曲线测定的溶液配制
FeSO4浓度与吸光值呈良好的正比关系，FeSO4浓度越高，吸光值越高。本发明FeSO4标准曲线结果见图10，标准曲线的线性关系良好，相关系数为0.998，FeSO4标准曲线的精密度和准确度均符合检测要求，可用于后续计算。
（3）FRAP法测定生物活性多肽LPLP的抗氧化能力
在96孔板中先加入180μL FRAP工作液，空白对照孔中加入5μL ddH2O，样品检测孔内加入5μL待测样品、阳性对照内加入5μL植酸，轻轻混匀，37℃孵育3-5min后，用酶标仪在593nm处测定吸光值。总抗氧化能力表示方式以FeSO4标准溶液的浓度来表示。按照下式计算总抗氧化能力，实验结果见表5。
表5FARP法测定瑞士乳杆菌发酵乳中生物活性多肽的总抗氧化能力结果
通过总抗氧化能力法（Ferric Reducing Ability Power FRAP法）对瑞士乳杆菌发酵乳中分离的多肽LPLP的体外总抗氧化活性进行了测定，发现瑞士乳杆菌发酵乳中分离物中的生物活性多肽LPLP具有一定的还原氧化物质的能力，其总抗氧化能力为0.0209mmol/g。本发明从瑞士乳杆菌发酵乳中分离得到的多肽LPLP的总抗氧化能力，高于同等浓度下具有弱抗氧化活性的植酸，并且具有显著性（p>0.05）差异。因此，本发明的生物活性多肽LPLP具有显著的抗氧化能力。
实施例3生物活性多肽LPLP的促进机体免疫力活性实验
一、MTT法测定生物活性多肽LPLP的体外巨噬细胞增殖能力实验
1）实验试剂和仪器
试剂：实验动物balb/c小鼠（雄性6-8周龄）上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；瑞士乳杆菌发酵得到的乳源性生物活性多肽LPLP；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）Amresco公司；LPS（脂多糖），购自Sigma公司；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）Genebase公司；三联溶解液，含10%SDS、5%异丁醇以及0.012mol/LHCl的水溶液。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2）试验方法：
balb/c小鼠腹腔注射2ml的2%（w/w）灭菌淀粉溶液，连续注射三天，最后一次注射24h后断颈处死。剥去腹部皮肤，用注射器吸取4℃磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗腹腔，离心管收集冲洗液后，离心（1000rpm，4℃）10分钟后弃上清，用4℃的RPMI 1640完全培养液（含10%FBS）洗涤两次，0.2%台盼蓝溶液染色做细胞活力检测，确认采集到的有活力巨噬细胞占95%以上。细胞计数板读数后，调整细胞浓度至合适浓度。
将已吹打至完全悬浮的细胞悬液加入96孔细胞培养板，细胞悬液100μl/孔，细胞个数为2×105/ml；37℃、5%CO2环境下培养4h后，吸弃孔中液体，用37℃的RPMI1640完全培养液小心清洗细胞培养板孔底，洗去未贴壁的细胞和细胞碎片，得到纯化后的贴壁腹腔巨噬细胞。每孔加入0.2ml的RPMI1640完全培养基，实验用小肽样品及LPS事先溶解于培养基后加入，开始细胞培养。
得到纯化后的贴壁腹腔巨噬细胞后，实验组每孔加溶解有生物活性多肽LPLP(1mg/ml)的RPMI 1640完全培养液（10%FBS）200μl/孔，连续培养48h；阴性对照组每孔加溶解有BSA（500μg/mL）的RPMI1640完全培养液（10%FBS）200μl/孔；空白组添加RPMI1640完全培养液（10%FBS）200μl/孔，连续培养48h。并且，实验组、阴性对照组和空白组又分别设正常组和炎症组；炎症组在培养到24h时加入LPS至终浓度为100ng/ml；正常组不加LPS；并且正常组和炎症组在44h时加入5%MTT 20μl/孔；细胞培养达到48h后加入100μl/孔的三联溶解液以终止培养，隔夜溶解后，在波长570nm下用酶标仪测各孔的吸光度值（OD570），生长指数（Growth Indices）的计算公式如下：
其中，空白培养液为含10%FBS的RPMI 1640完全培养液。
3）实验结果及分析
实验结果见表7，由表7可知，在添加1mg/ml生物活性多肽LPLP的条件下，正常组和炎症组的巨噬细胞均有增殖。而且与阴性对照组比较，均有显著性差异(P＜0.01)。说明生物活性多肽LPLP对体外巨噬细胞具有显著的增殖作用。
表7生物活性多肽LPLP对体外巨噬细胞增殖的影响
  实验分组   正常组GI   炎症组GI
  阴性对照组   1   1
  LPLP（1mg/ml）   1.0975±0.0491**   1.150±0.0742**
注：**表示与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)
二、生物活性多肽LPLP的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验
1）实验试剂和仪器
试剂：实验动物balb/c小鼠（雄性6-8周龄）上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；瑞士乳杆菌发酵得到的乳源性生物活性多肽LPLP；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2）试验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含活性肽LPLP（1mg/ml）的RPMI1640完全培养液（10%FBS）200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液（10%FBS）200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液（冰醋酸：无水乙醇=1:1，v/v）。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值（OD540）。
3）实验结果：
表8生物活性多肽LPLP促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定
  实验分组   炎症组吸光度值（OD540）
  空白组   0.1160±0.0181
  实验组   0.1408±0.006**
注：**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表8，与细胞空白相比较，添加1mg/ml生物活性多肽LPLP的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有显著性差异(P＜0.01)。说明生物活性多肽LPLP在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。
三、生物活性多肽LPLP的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定（Griess法）
1）实验试剂和仪器
试剂：实验动物balb/c小鼠（雄性6-8周龄）上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；瑞士乳杆菌发酵得到的乳源性生物活性多肽LPLP；LPS Sigma公司；一氧化氮检测试剂盒，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2）试验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液（10%FBS）200μl/孔，炎症组在24h时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48h后，收集培养液上清50μl/孔，在培养液上清中依次添加Griess试剂1和Griess试剂2各50μl/孔，室温反应10分钟后，在540nm波长下测定吸光度值（OD540）。
3）实验结果：
表9生物活性多肽LPLP促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定结果
  实验分组   正常组   炎症组
  细胞空白   0.0592±0.00525   0.3241±0.0381
  LPLP 1mg/ml   0.1273±0.1066**   0.4703±0.0.0103**
  LPLP 0.5mg/ml   0.1210±0.0140**   0.3472±0.0313**
  LPLP 0.1mg/ml   0.2506±0.0154**
注：**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表9，由表9可知，在实验组中添加生物活性多肽LPLP，浓度分别为1mg/mL和0.5mg/mL，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用。与细胞空白组相比，具有显著性差异（P<0.05）。当生物活性多肽LPLP的添加浓度为0.1mg/mL，在LPS造炎症情况下相比，也能促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加，并具有显著性差异（P<0.05）。但是与正常情况下生长的细胞空白组相比，没有显著性差异。说明生物活性多肽LPLP在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。
实施例4生物活性多肽LPLP模拟胃肠道消化实验
（1）体外模拟胃肠道消化
模拟胃肠道消化实验主要分为两步进行。首先，配制浓度为500μg/mL生物活性多肽LPLP溶液，在浓度为500μg/mL LPLP溶液中加入胃蛋白酶，比例是每克LPLP加入胃蛋白酶20mg，调节反应液的pH值至2.0，在37℃恒温水浴中保温90min；然后将反应液的pH值调整至7.5，加入胰酶，比例是每克LPLP加入胰酶40mg，在37℃恒温水浴中保温150min；最后置于95℃水浴中加热5min使消化酶失活，将反应液冷冻浓缩干燥，制成干粉，储存于-20℃条件下，备用。
（2）LPLP模拟肠胃道消化前后的质量和氨基酸序列测定
取体外模拟肠胃道消化后的样品粉末0.2mg，加入50μL水和450μL无水乙醇，充分震荡后放入-20℃冰箱20min，在15000rpm转速条件下离心30min，取上清液400μL进行UPLC-Q-TOF-MS分析。
UPLC条件：Hypersil GOLD C18色谱柱（100mm*2.1mm，1.9μm，(ThermoScientific Co.)；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：含0.1%甲酸乙腈；采用从99%的A相到50%A相的梯度洗脱程序；流速0.4mL/min；柱温：45℃；进样量：5μL。
Q-TOF-MS条件：飞行时间质谱仪，质谱采用电喷雾电离源（ESI），正离子模式。并以200ng/mL的亮氨酸脑啡肽进行实时精确质量校正。质量扫描范围为m/z 80~1000，扫描时间为0.3s。毛细管电压3kV；锥孔电压35V；一级质谱碰撞能量分别为4；离子源温度100℃；脱溶剂气温度和流量分别为300℃，500L/h。
根据上述实验条件，生物活性多肽LPLP经过消化酶处理前后产物经UPLC-Q-TOF-MS分析，获得的总离子流图，见图11。并对图中峰进行了提取，采用Q-TOF-MS分析获得了相应的质谱图。
利用超高效液相-四级杆-飞行时间质谱对消化液冷冻干燥浓缩物进行氨基酸序列测定，酶解处理后LPLP的一级质谱图见图12，得到的分子量和氨基酸序列与消化前的LPLP完全相同，证明生物活性多肽LPLP在上述模拟胃肠道消化条件下稳定，没有被进一步降解，可以被动物机体直接吸收利用，发挥其具有的生物活性。

Claims (2)

1.一种氨基酸序列为Leu-Pro-Leu-Pro的生物活性多肽的制备方法，步骤如下：
1)发酵：将瑞士乳杆菌CICC6024添加到脱脂乳中进行厌氧发酵，获得瑞士乳杆菌发酵乳，所述厌氧发酵的条件为：发酵温度36～38℃，发酵时间15～20h；
2)多肽的粗提：对步骤1)的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离，取上清液，所述低温离心的条件为：4℃，8000～10000rpm，离心15～30min；
3)多肽的纯化：
a.对步骤2)的上清液进行超滤处理，收集滤液；
b.收集的滤液采用反向层析柱SOURSE 5 RPC ST进行反相高效液相色谱分离，收集生物活性多肽LPLP；反相高效液相色谱分离法中，收集分子量为439.29Da的多肽的洗脱峰，即为生物活性多肽LPLP；步骤3)a所述超滤法所采用的滤膜的截留分子量分别为10kDa和3kDa；所述超滤过程中，压力范围为0.1～0.3MPa，滤液流速为0.8～1.2mL/min。
2.一种氨基酸序列为Leu-Pro-Leu-Pro的生物活性多肽在制备抗氧化和/或增强机体免疫力的食品、保健品及药物中的用途，所述生物活性多肽在制备抗氧化的食品、保健品及药物中的用途具体是指所述生物活性多肽在制备还原氧化物质、清除体内自由基的食品、保健品及药物中的用途；所述生物活性多肽在制备增强机体免疫力的食品、保健品及药物中的用途具体是指所述生物活性多肽在制备促进巨噬细胞增殖、增强噬细胞吞噬功能、促巨噬细胞一氧化氮诱生量的食品、保健品及药物中的用途。
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