CN107188949B - 一种生物活性多肽eintvqvtst及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种生物活性多肽EINTVQVTST及其制备方法和应用，生物活性多肽EINTVQVTST其氨基酸序列为Glu‑Ile‑Asn‑Thr‑Val‑Gln‑Val‑Thr‑Ser‑Thr。经过体外抗氧化实验、体外免疫功能促进实验，验证了多肽EINTVQVTST具有较好的抗氧化生物学活性和免疫调节功能，一方面具有较好的抗氧化活性，能够清除机体内的自由基，提高生命的质量；另一方面，本发明的生物活性多肽EINTVQVTST能够增强淋巴细胞和巨噬细胞的体外增殖能力，促进巨噬细胞分泌细胞因子，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，对开发具有免疫调节功能、抗氧化功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

Description

一种生物活性多肽EINTVQVTST及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及一种生物活性多肽EINTVQVTST及其制备方法和应用。
背景技术
在牛乳经乳酸菌发酵的过程中，牛乳中的一部分蛋白质被乳酸菌代谢利用，并发生了一系列生理生化反应，使蛋白质变为多肽或者游离的氨基酸，被人体消化吸收或通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进入人体的血液循环。在这些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被称为“生物活性肽”。
氧化反应和氧化代谢对于食物和人体来说都是至关重要的，自由基和活性氧引起了一系列的氧化反应。当过量的自由基形成，它们会超过保护性酶如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的保护作用，从而导致脂质氧化、细胞凋亡等一系列的副作用产生。这一类的氧化反应，不仅影响含脂食物的保质期，也对人体的健康造成了一定的危害，如风湿性关节炎、糖尿病、动脉硬化等。此外，Collins等人2005年研究发现癌症的发生也与DNA的氧化损伤有关。
早期一些人工合成的抗氧化剂如丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)被运用到食品中，作为脂质的抗氧化剂，但这些人工合成的添加剂对于人体都有潜在的风险。因此，在天然食物来源中寻找安全的抗氧化剂尤为重要。近些年来，人们发现一些食物来源的多肽类物质具有良好的抗氧化作用，如玉米短肽、大豆肽、牛乳多肽等。这些多肽可以通过微生物发酵、消化酶解等多种途径得到，并且大多具有抗氧化活性的多肽是由2～20个氨基酸残基组成，分子量小于6000Da，含有一定量的疏水氨基酸、芳香族氨基酸。
免疫活性肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性多肽。1981年Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗。李素萍等人用合成的乳源免疫调节肽(PGPIPN)饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的免疫调节功能有显著的增强。
研究表明，免疫活性肽不仅能够增强机体免疫力，刺激机体淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的吞噬功能，促进细胞因子的释放、提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且不会引起机体的免疫排斥反应。
目前关于生物活性多肽的研究有很多，比如中国专利CN105254738A公布了一种来源于β-酪蛋白的乳源性生物活性多肽DELQDKIH，中国专利CN105254739A公布了一种来源于αs1-酪蛋白的乳源性生物活性多肽GTQYTD，中国专利CN105254740A公布了一种来源于αs2-酪蛋白的乳源性生物活性多肽NQFYQKF。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物活性多肽EINTVQVTST及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供一种生物活性多肽EINTVQVTST，其氨基酸序列为Glu-Ile-Asn-Thr-Val-Gln-Val-Thr-Ser-Thr，如SEQ ID NO：1所示。
较优的，所述生物活性多肽为乳源性。具体来源于κ-酪蛋白，并且为κ-酪蛋白变体A第179～188位的氨基酸残基。κ-酪蛋白变体A氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
κ-酪蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码κ-酪蛋白变体A第179～188位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽EINTVQVTST。
较优的，所述生物活性多肽具有抗氧化功能和免疫调节功能。
本发明第二方面，提供了编码所述生物活性多肽EINTVQVTST的核苷酸片段，其序列为：5’-gag atc aac aca gtc caa gtt act tca act-3’，如SEQ ID NO：2所示。
本发明第三方面，提供了所述生物活性多肽EINTVQVTST的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从乳制品中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。
本发明第四方面，提供了所述生物活性多肽EINTVQVTST在制备具有抗氧化功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。
本发明第五方面，提供了所述生物活性多肽EINTVQVTST在制备具有免疫调节功能的食品、保健品或药物中的应用。
本发明第六方面，提供了所述生物活性多肽EINTVQVTST在制备同时具有抗氧化功能和免疫调节功能的食品、保健品或药物中的应用。
具体而言，本发明的生物活性多肽EINTVQVTST可以用于制备减少自由基对皮肤伤害的化妆品、制备具有抗氧化和/或调节机体免疫力的药物；并且由于本发明的生物活性多肽EINTVQVTST通过胃肠道降解后的产物仍旧具有生物活性，因此还可以用于制备酸奶等食品、调节免疫力的保健品，以及口服的用于制备具有抗氧化和/或调节机体免疫力的药物。
本发明第七方面，提供了一种抗氧化产品，包括所述生物活性多肽EINTVQVTST或所述生物活性多肽EINTVQVTST的衍生物；所述的抗氧化产品包括抗氧化食品、抗氧化保健品、抗氧化药物或抗氧化化妆品；所述生物活性多肽EINTVQVTST的衍生物，是指在生物活性多肽EINTVQVTST的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
本发明第八方面，提供了一种免疫调节产品，包括所述生物活性多肽EINTVQVTST或所述生物活性多肽EINTVQVTST的衍生物；所述的免疫调节产品包括免疫调节食品、免疫调节保健品或免疫调节药物；所述生物活性多肽EINTVQVTST的衍生物，是指在生物活性多肽EINTVQVTST的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
本发明第九方面，提供了一种同时具有抗氧化功能和免疫调节功能的产品，包括所述生物活性多肽EINTVQVTST或所述生物活性多肽EINTVQVTST的衍生物；具有抗氧化功能和免疫调节功能的产品包括食品、保健品或药物；所述生物活性多肽EINTVQVTST的衍生物，是指在生物活性多肽EINTVQVTST的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
本发明生物活性多肽EINTVQVTST的有益效果为：本发明的乳源性生物活性多肽EINTVQVTST具有较好的抗氧化活性和调节机体免疫力活性；一方面能够清除机体内的自由基，减少自由基对人体的伤害；另一方面，本发明的生物活性多肽EINTVQVTST还能够调节机体免疫力，增强淋巴细胞的增殖能力，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且不会引起机体的免疫排斥反应，对开发具有抗氧化功能及调节免疫功能的乳制品和保健品具有十分重要的意义。
附图说明
图1：质量色谱提取图(m/z＝1091.55)；
图2：质荷比为1091.55的片段的一级质谱图；
图3：质荷比为1091.55的多肽az、by断裂情况；
图4：[DPPH·]甲醇标准曲线；
图5：FeSO4标准曲线；
图6：生物活性多肽EINTVQVTST的体外巨噬细胞增殖能力实验；
图7：IL-4标准曲线；
图8：生物活性多肽EINTVQVTST使用浓度细胞因子IL-4分泌量的影响。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1活性肽EINTVQVTST的人工合成
一、生物活性肽的合成
1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。
2.2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
5.称取氨基酸Glu适量和1-羟基-苯骈三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6.2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10.1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Ile、Asn、Thr、Val、Gln、Val、Thr、Ser和Thr。
13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。
至此，人工合成了生物活性肽EINTVQVTST。
以上步骤5、步骤9中所述的适量是指根据目标合成量和得率计算出一个理论用量，在理论用量基础上乘以一个系数(本实施例中为1.1)，最后得到的实际用量。
由于每次目标肽的合成量不同，而且得率也不同，所以每次称取的氨基酸的量也就不同。
例如目标肽的合成量是10克，合成肽的得率(回收率)为90％，那么氨基酸的理论称取量的计算公式为：
氨基酸的理论称取量＝10克*氨基酸分子量/目标肽分子量/90％.
这样计算出来的结果是氨基酸的理论称取量，在实际合成过程中为了保证得到10克的多肽，氨基酸要多称取一点，实际操作时氨基酸称取量一般都是理论称取量的1.1倍。
同理，1-羟基-苯骈三唑(HOBT)作为多肽合成过程中的一个中介物，也是理论称取量的1.1倍。
由于生物活性肽合成过程中所用氨基酸以及1-羟基-苯骈三唑(HOBT)的理论用量是本领域技术人员根据目标合成肽的需求量能够计算得到的，因此，实际操作时，在理论用量的基础上乘以一个系数就能够合成出目标肽，在参照本实施例的合成步骤以及合成工艺条件基础上，根据本领域技术人员的常规知识就能够合成得到本实施例中的生物活性肽。
二、生物活性肽的确认
1)UPLC分析
UPLC条件如下：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱仪
色谱柱规格：BEH C18色谱柱
流速：0.4mL/min
温度：50℃
紫外检测波长：210nm
进样量：2μL
梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈
2)质谱分析
质谱条件如下：
离子方式：ES+
质量范围(m/z)：100-1000
毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0
采样锥(V)：35.0
离子源温度(℃)：115
去溶剂温度(℃)：350
去溶剂气流(L/hr)：700.0
碰撞能量(eV)：4.0
扫描时间(sec)：0.25
内扫描时间(sec)：0.02
根据以上分析方法，利用超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱，对生物活性肽EINTVQVTST进行色谱分析和质谱分析，其质量色谱提取图如图1所示，提取此峰的一级和二级质谱图如图2和3所示，可得此峰的多肽质荷比为1091.55Da，保留时间是18.22min。
3)结果
由图3可知，根据az、by断裂的情况，经过Progenesis QI软件分析计算，得到质荷比1091.55Da的片段序列为Glu-Ile-Asn-Thr-Val-Gln-Val-Thr-Ser-Thr(EINTVQVTST)，记为SEQ ID NO：1。该片段与κ-酪蛋白变体A第179～188位的残基序列相对应，κ-酪蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAA30433.1，序列见SEQ ID NO：3。
实施例2生物活性肽的抗氧化活性实验
采用清除自由基法(DPPH·法)和总抗氧化能力法(Ferric Reducing AbilityPower FRAP法)，对实施例1得到的生物活性多肽EINTVQVTST的抗氧化活性进行测试。
1、[DPPH·]法测定生物活性肽EINTVQVTST的体外抗氧化活性
1)实验试剂及仪器
试剂：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl[DPPH·])，日本Wako公司生产；甲醇，上海国药公司提供；实施例1获得的乳源性生物活性多肽EINTVQVTST。
主要仪器：Sunrise酶标仪，奥地利Tecan公司产品；96孔细胞培养板，美国Millipore公司制造；分析天平，Meitelei-tolido公司产品。
2)实验方法
(1)1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液
用分析天平称取0.349mg[DPPH·]溶于1mL甲醇溶液中，配制得到的1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液，锡纸避光保存，即配即用。
(2)[DPPH·]甲醇标准曲线的测定
在96孔板中按表1分别加入100μL[DPPH·]甲醇标准曲线样品，室温静置90min，用酶标仪在517nm处检测吸光值。
表1[DPPH·]甲醇标准曲线溶液配制
根据实验结果，使用Excel拟合曲线并计算回归方程，结果见图4(回归方程：y＝-0.192x+0.2271，R2＝0.9991)。[DPPH·]甲醇标准曲线的线性关系良好，相关系数为0.999，表明[DPPH·]甲醇标准曲线精密度和准确度均符合检测要求。从结果看，吸光度值与[DPPH·]含量呈反比关系，[DPPH·]含量越少，吸光值越高，即样品清除自由基的能力越强。
(3)[DPPH·]法测定生物活性肽EINTVQVTST的抗氧化活性
1)样品组：在96孔板中加入80μL浓度为1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液、按表2分别加入20μL不同浓度的待测样品(EINTVQVTST)、阳性对照1(2.5mg/mL的Trolox)、阳性对照2(0.025mg/mL的Trolox)，和阴性对照(植酸)；
2)空白组：在同一96孔板上，以加入80μL浓度为1mmol/L[DPPH·]甲醇溶液和20μL去离子水的样品做空白对照。
待检测样品加样完毕后，室温静置90min，用酶标仪在517nm处检测吸光值。按照下式计算自由基清除率，实验结果见表2。
公式：
表2[DPPH·]法测定生物活性多肽的抗氧化活性结果
从表2可以看出，作为阳性对照的2.5mg/mL的Trolox在相同条件下具有最强的清除自由基的能力，几乎能清除溶液中所有的自由基，其次为0.025mg/mL的Trolox、植酸、活性多肽。多肽EINTVQVTST清除[DPPH·]自由基率随浓度变化呈现倒钟型，在浓度为2.5mg/mL处达到最高值，为22.21％。
2、FARP法测定生物活性肽EINTVQVTST体外抗氧化能力
1)实验试剂和仪器
总抗氧化能力检测试剂盒(Ferric Reducing Ability of Plasma FRAP法)，购自上海碧云天生物科技公司；FeSO4溶液(10mmol/L)，水溶性维生素E(Trolox溶液)(10mmol/L)，实施例1获得的乳源性生物活性多肽EINTVQVTST。
主要仪器：Sunrise酶标仪，奥地利Tecan公司产品；96孔细胞培养板，美国Millipore公司制造；分析天平，Meitelei-tolido公司产品；HWS26型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司制造。
2)实验方法
(1)FRAP工作液的配制
根据总抗氧化能力检测试剂盒，将TPTZ 7.5mL稀释液、TPTZ 750μL溶液、检测缓冲液750μL混合均匀，并在37℃水浴中孵育，2小时h内用完。
(2)FeSO4标准曲线曲线的制作测定
在96孔板中先加入180μLFRAP工作液，按表3加入5μL FeSO4标准曲线溶液，轻轻混匀，37℃孵育3-5min后，用酶标仪在593nm处测定吸光值。
表3FeSO4标准曲线测定的溶液配制
FeSO4浓度与吸光值呈良好的正比关系，FeSO4浓度越高，吸光值越高。本发明FeSO4标准曲线结果见图5，标准曲线的线性关系良好，相关系数为0.998，FeSO4标准曲线的精密度和准确度均符合检测要求，可用于后续计算。
(3)FRAP法测定生物活性多肽EINTVQVTST的抗氧化能力
在96孔板中先加入180μL FRAP工作液，空白对照孔中加入5μL ddH2O，样品检测孔内加入5μL待测样品、阳性对照内加入5μL植酸，轻轻混匀，37℃孵育3-5min后，用酶标仪在593nm处测定吸光值。总抗氧化能力表示方式以FeSO4标准溶液的浓度来表示。按照下式计算自由基清除率，实验结果见表4。
表4FARP法测定生物活性多肽EINTVQVTST的总抗氧化能力结果
通过总抗氧化能力法(Ferric Reducing Ability Power FRAP法)对多肽EINTVQVTST的体外总抗氧化活性进行了测定，发现生物活性多肽EINTVQVTST具有较好的还原氧化物质的能力；在浓度为4mg/mL情况下，多肽EINTVQVTST的总抗氧化水平达到0.0221mmol/g；说明生物活性多肽EINTVQVTST的总抗氧化能力，高于同等浓度下的具有弱抗氧化活性的植酸，具有显著性(p>0.05)差异。因此，可认定发明的生物活性多肽EINTVQVTST具有显著的抗氧化能力。
实施例3生物活性肽的促进机体免疫力活性实验
一、MTT法测定生物活性多肽EINTVQVTST的体外淋巴细胞增殖能力实验
1)实验材料与仪器：
试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的乳源性生物活性多肽EINTVQVTST；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(Corolase PP，购自AB公司)。
仪器：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱，Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。
2)实验方法：
无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行元代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO2 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：
式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3)实验结果及分析
实验结果见表5。由表5可知，在生物活性肽EINTVQVTST的质量浓度为100μg/mL的条件下，乳源性生物活性肽EINTVQVTST的刺激指数大于BSA，说明EINTVQVTST一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且EINTVQVTST的刺激指数达到了1.150，和阴性对照组具有显著差异(P<0.05)。因此，可以认定该活性多肽EINTVQVTST具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种保健品或者添加剂食用，能够提高动物和人体的免疫力。
表5生物活性多肽EINTVQVTST对体外淋巴细胞增殖的影响
实验分组 刺激指数SI
阴性对照组 1
EINTVQVTST 1.150±0.0493*
注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)。
二、MTT法测定生物活性多肽EINTVQVTST的体外巨噬细胞增殖能力实验
1)实验试剂及仪器
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的乳源性生物活性多肽EINTVQVTST；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)Amresco公司；LPS(脂多糖)Sigma公司；牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin，BSA)Genebase公司；三联溶解液，含10％SDS、5％异丁醇以及0.012mol/L HCl的水溶液。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2)试验方法：
balb/c小鼠腹腔注射2ml的2％(w/w)灭菌淀粉溶液，连续注射三天，最后一次注射24小时后断颈处死。剥去腹部皮肤，用注射器吸取4℃磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗腹腔，离心管收集冲洗液后，离心(1000rpm，4℃)10分钟后弃上清，用4℃RPMI1640完全培养液(含10％FBS)洗涤两次，0.2％台盼蓝溶液染色做细胞活力检测，确认采集到的有活力巨噬细胞占95％以上。细胞计数板读数后，调整细胞浓度至合适浓度。
将已吹打至完全悬浮的细胞悬液以合适体积加入96孔细胞培养板，37℃、5％CO2环境下培养4小时后，吸弃孔中液体，用37℃RPMI1640完全培养液小心清洗细胞培养板孔底，洗去未贴壁的细胞和细胞碎片，得到纯化后的贴壁腹腔巨噬细胞。每孔加入0.2mlRPMI1640完全培养基，实验用小肽样品及LPS事先溶解于培养基后加入，开始细胞培养。
加入细胞个数为2×105/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性多肽(100，500，1000μg/mL)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，连续培养48小时，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度100ng/ml。44小时时加入5％MTT 20μl/孔，达到48小时后加入100μl/孔的三联溶解液以终止培养，隔夜溶解后，在波长570nm下用酶标仪测各孔的吸光度值(OD570)，生长指数(Growth Indices)的计算公式如下：
其中，空白组为不施加小肽和BSA的细胞处理组，BSA组为阴性对照。
3)实验结果
实验结果见图6，在实验组中生物活性多肽(EINTVQVTST)的添加浓度分别为1000，500，100μg/mL，空白组加入相应量的PBS作为空白对照，表示在没有LPS刺激的情况下巨噬细胞的增殖情况。和空白对照组相比，添加不同浓度的多肽EINTVQVTST实验组随着实验浓度的增加，巨噬细胞的增殖能力逐渐上升，在浓度为1000，500μg/mL时，具有显著性差异(P<0.05)。说明生物活性多肽EINTVQVTST具有促进巨噬细胞增殖的能力。
三、生物活性多肽EINTVQVTST的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及设备
1)试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的乳源性生物活性多肽EINTVQVTST；ELISA细胞因子快速试剂盒(IL-4)，武汉博士德生物工程有限公司。
2)仪器设备
CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell150CO2培养箱，Heraeus公司；Dragon Wellscan MK3酶标仪，Labsystems公司。
2.试验方法
1)标准曲线的制备
制作IL-4标准曲线：将浓度为500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.3pg/mL，15.6pg/mL，7.8pg/mL的IL-4标准品分别依次加入酶标板孔内，再加入生物素标记抗小鼠IL-4抗体(ELISA细胞因子快速试剂盒)，酶标板加上盖，37℃反应90min。甩去酶标板内液体，每孔依次加入亲和素-过氧化物酶复合物(ELISA细胞因子快速试剂盒)0.1mL。37℃反应60min。0.01M PBS洗涤3次，每孔加入0.1mL ABC工作液，37℃反应30min。0.01M PBS洗涤5次，每孔加入90ul TMB显色液，37℃避光反应25min。每孔加入0.1mL TMB终止液，用酶标仪在450nm测定吸光值。制作的IL-4检测用标准曲线如图7所示。IL-4标准曲线是以浓度为横坐标(单位pg/mL)，450nm下的吸光值为纵坐标，进行一次回归拟合，获得标准曲线Y＝0.0038X+0.1224，R2＝0.9979。其中X代表IL-4浓度，单位为pg/mL，Y代表OD450下的吸光值。
2)多肽EINTVQVTST的促巨噬细胞分泌细胞因子检测
在无菌条件下取小鼠脾脏淋巴细胞，调整细胞浓度至5×105/mL接种于96孔板，实验组加入生物活性多肽EINTVQVTST进行培养，调整生物活性多肽EINTVQVTST的终浓度分别为100，50，10μg/mL，与淋巴细胞共同培养36小时后进行细胞因子IL-4的测定。空白组不加生物活性多肽EINTVQVTST，培养36h作为对照。
3.实验结果
实验结果见图8，与空白对照组相比，随着多肽浓度的增加，IL-4的分泌量逐渐增加；当多肽添加浓度达到50和100μg/mL时，IL-4分泌量显著大于空白组；可见生物活性多肽EINTVQVTST具有促进淋巴细胞增殖的功能，并且通过对IL-4细胞因子分泌的调节，起到对机体体液免疫的调节作用。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
<110>浙江辉肽生命健康科技有限公司
<120>一种生物活性多肽EINTVQVTST及其制备方法和应用
<160>3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223> 生物活性多肽
<400> 1
Glu Ile Asn Thr Val Gln Val Thr Ser Thr
5 10
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 生物活性多肽编码序列
<400> 2
gagatcaaca cagtccaagt tacttcaact 30
<210> 3
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> κ-酪蛋白变体A氨基酸序列
<400> 3
<400> 3
Met Met Lys Ser Phe Phe Leu Val Val Thr Ile Leu Ala Leu Thr
5 10 15
Leu Pro Phe Leu Gly Ala Gln Glu Gln Asn Gln Glu Gln Pro Ile
20 25 30
Arg Cys Glu Lys Asp Glu Arg Phe Phe Ser Asp Lys Ile Ala Lys
35 40 45
Tyr Ile Pro Ile Gln Tyr Val Leu Ser Arg Tyr Pro Ser Tyr Gly
50 55 60
Leu Asn Tyr Tyr Gln Gln Lys Pro Val Ala Leu Ile Asn Asn Gln
65 70 75
Phe Leu Pro Tyr Pro Tyr Tyr Ala Lys Pro Ala Ala Val Arg Ser
80 85 90
Pro Ala Gln Ile Leu Gln Trp Gln Val Leu Ser Asn Thr Val Pro
95 100 105
Ala Lys Ser Cys Gln Ala Gln Pro Thr Thr Met Ala Arg His Pro
110 115 120
His Pro His Leu Ser Phe Met Ala Ile Pro Pro Lys Lys Asn Gln
125 130 135
Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu
140 145 150
Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu Ala Val Glu Ser Thr Val Ala
155 160 165
Thr Leu Glu Asp Ser Pro Glu Val Ile Glu Ser Pro Pro Glu Ile
170 175 180
Asn Thr Val Gln Val Thr Ser Thr Ala Val
185 190

Claims (9)

1.一种生物活性多肽EINTVQVTST，其特征在于，其氨基酸序列为Glu-Ile-Asn-Thr-Val-Gln-Val-Thr-Ser-Thr。
2.编码权利要求1所述生物活性多肽EINTVQVTST的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段的序列如SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1所述生物活性多肽EINTVQVTST的制备方法，其特征在于，通过基因工程的方法人工合成，或直接通过化学合成制备。
4.如权利要求1所述生物活性多肽EINTVQVTST的应用，其特征在于，所述生物活性多肽EINTVQVTST在制备具有抗氧化功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。
5.如权利要求1所述生物活性多肽EINTVQVTST的应用，其特征在于，所述生物活性多肽EINTVQVTST在制备具有免疫调节功能的食品、保健品或药物中的应用。
6.如权利要求1所述生物活性多肽EINTVQVTST的应用，其特征在于，所述生物活性多肽EINTVQVTST在制备具有抗氧化功能和免疫调节功能的食品、保健品或药物中的应用。
7.一种抗氧化产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽EINTVQVTST；所述的抗氧化产品包括抗氧化食品、抗氧化保健品、抗氧化药物或抗氧化化妆品。
8.一种免疫调节产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽EINTVQVTST；所述的免疫调节产品包括免疫调节食品、免疫调节保健品或免疫调节药物。
9.一种具有抗氧化功能和免疫调节功能的产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽EINTVQVTST；具有抗氧化功能和免疫调节功能的产品包括食品、保健品或药物。
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Denomination of invention: A bioactive peptide eintvqvtst and its preparation method and Application

Effective date of registration: 20210630

Granted publication date: 20191224

Pledgee: Zhejiang Cangnan rural commercial bank Limited by Share Ltd.

Pledgor: ZHEJIANG HUITAI LIFE HEALTH TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2021330000661

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