CN107880107B

CN107880107B - 一种生物活性多肽qvlsntvpa及其制备方法和应用

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Publication number: CN107880107B
Application number: CN201711311377.9A
Authority: CN
Inventors: 张少辉; 张伯宇; 李婉如; 李云飞; 汪超; 李阜烁; 林学海; 陈静
Original assignee: Shanghai Bohui Biological Technology Co ltd; Zhejiang Huitai Life Health Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Bohui Biological Technology Co ltd; Zhejiang Huitai Life Health Technology Co ltd
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2037-12-11
Also published as: CN107880107A

Abstract

本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种生物活性多肽QVLSNTVPA及其制备方法和应用，生物活性多肽QVLSNTVPA其氨基酸序列为Gln‑Val‑Leu‑Ser‑Asn‑Thr‑Val‑Pro‑Ala。经过体外抗炎活性实验、体内抗衰老实验，验证了多肽QVLSNTVPA具有较好的抗炎活性和抗衰老活性，一方面，本发明的生物活性多肽QVLSNTVPA能够促进巨噬细胞分泌细胞因子，促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率；另一方面，能够提高体内抗过氧化酶系的活力，增强机体抵抗外源性刺激的功能，从而降低机体老化、衰老和生病的机率，对开发具有抗炎功能、抗衰老功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

Description

一种生物活性多肽QVLSNTVPA及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及一种生物活性多肽QVLSNTVPA及其制备方法和应用。

背景技术

在牛乳经乳酸菌发酵的过程中，牛乳中的一部分蛋白质被乳酸菌代谢利用，并发生了一系列生理生化反应，使蛋白质变为多肽或者游离的氨基酸，被人体消化吸收或通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进入人体的血液循环。在这些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被称为“生物活性肽”。

在天然食物来源中寻找安全的生物活性肽尤为重要。近些年来，人们发现一些食物来源的多肽类物质具有良好的生物活性，如玉米短肽、大豆肽、牛乳多肽等。这些多肽可以通过微生物发酵、消化酶解等多种途径得到，并且大多具有生物活性的多肽是由2～20个氨基酸残基组成，分子量小于6000Da，含有一定量的疏水氨基酸、芳香族氨基酸。

免疫活性肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性多肽。1981年Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗，具有抗炎功能。李素萍等人用合成的乳源肽(PGPIPN)饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的抗炎功能有显著的增强。

研究表明，免疫活性肽不仅能够增强机体免疫力，刺激机体淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的吞噬功能，促进细胞因子的释放、促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加、提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且不会引起机体的免疫排斥反应。

衰老是一个自然现象，且过程常伴有抗氧化水平、器官组织、免疫因子的变化，其中细胞因子发生着复杂的变化，如促炎细胞因子IL-6、IL-4、TNF-α等呈现增长的趋势，IL-6与TNF-a均被认为在老年性疾病的发生过程中扮演重要角色。随着遗传学和分子生物学的发展，生物衰老机理的研究取得了可喜的进展。研究人员通过利用一些模式生物，如小鼠、果蝇和秀丽线虫等的单一基因突变实验，发现有些基因能够显著增加这些生物体的寿命达6倍之多。

抗衰老肽作为一种新兴的抗衰老剂，在生理功能方面具有氨基酸所不能比拟的优势，其能对生物体内的酶产生促进或抑制作用，改善对矿物质及其他营养元素的吸收和利用，清除体内自由基，增强机体自身的抗氧化力，以延缓衰老。因此，生物活性肽的营养保健作用已成为国内外学者课题研究的重点。邱隽等人经实验研究发现，乳源性生物活性小肽能有效延长果蝇寿命，延缓其衰老，并且还具有较好的抗氧化作用，推测可能是其中富含琉基肽类。周之辉等发现牛初乳提取物能显著性提高老年人体内血清中SOD活力，减少其脂质过氧化物和增强机体抗氧化力，具有一定的抗衰老功能。

目前关于生物活性多肽的研究有很多，比如中国专利CN105254738A公布了一种来源于β-酪蛋白的乳源性生物活性多肽DELQDKIH，中国专利CN105254739A公布了一种来源于αs1-酪蛋白的乳源性生物活性多肽GTQYTD，中国专利CN105254740A公布了一种来源于αs2-酪蛋白的乳源性生物活性多肽NQFYQKF。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物活性多肽QVLSNTVPA及其制备方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面，提供一种生物活性多肽QVLSNTVPA，其氨基酸序列为Gln-Val-Leu-Ser-Asn-Thr-Val-Pro-Ala，如SEQ ID NO：1所示。

较优的，所述生物活性多肽为乳源性。具体来源于κ-酪蛋白，并且为κ-酪蛋白变体A第98～106位的氨基酸残基。κ-酪蛋白变体A氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

κ-酪蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码κ-酪蛋白变体A第98～106位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽QVLSNTVPA。

较优的，所述生物活性多肽具有抗炎功能和抗衰老功能。

本发明第二方面，提供了编码所述生物活性多肽QVLSNTVPA的核苷酸片段，其序列为：5’-caa gtt ttg tca aat act gtg cct gcc-3’，如SEQ ID NO：2所示。

本发明第三方面，提供了所述生物活性多肽QVLSNTVPA的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从乳制品中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。

本发明第四方面，提供了所述生物活性多肽QVLSNTVPA在制备具有抗炎功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。

本发明第五方面，提供了所述生物活性多肽QVLSNTVPA在制备具有抗衰老功能的食品、保健品或药物中的应用。

本发明第六方面，提供了所述生物活性多肽QVLSNTVPA在制备同时具有抗炎功能和抗衰老功能的食品、保健品或药物中的应用。

具体而言，本发明的生物活性多肽QVLSNTVPA可以用于制备减少自由基对皮肤伤害的化妆品、制备具有抗炎和/或抗衰老的药物；并且由于本发明的生物活性多肽QVLSNTVPA通过胃肠道降解后的产物仍旧具有生物活性，因此还可以用于制备酸奶等食品、调节免疫力的保健品，以及口服的用于制备具有抗炎和/或抗衰老的药物。

本发明第七方面，提供了一种抗炎产品，包括所述生物活性多肽QVLSNTVPA或所述生物活性多肽QVLSNTVPA的衍生物；所述的抗炎产品包括抗炎食品、抗炎保健品、抗炎药物或抗炎化妆品；所述生物活性多肽QVLSNTVPA的衍生物，是指在生物活性多肽QVLSNTVPA的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。

本发明第八方面，提供了一种抗衰老产品，包括所述生物活性多肽QVLSNTVPA或所述生物活性多肽QVLSNTVPA的衍生物；所述的抗衰老产品包括抗衰老食品、抗衰老保健品或抗衰老药物；所述生物活性多肽QVLSNTVPA的衍生物，是指在生物活性多肽QVLSNTVPA的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。

本发明第九方面，提供了一种同时具有抗炎功能和抗衰老功能的产品，包括所述生物活性多肽QVLSNTVPA或所述生物活性多肽QVLSNTVPA的衍生物；具有抗炎功能和抗衰老功能的产品包括食品、保健品或药物；所述生物活性多肽QVLSNTVPA的衍生物，是指在生物活性多肽QVLSNTVPA的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。

本发明生物活性多肽QVLSNTVPA的有益效果为：本发明的乳源性生物活性多肽QVLSNTVPA具有较好的抗炎活性和抗衰老活性；一方面，本发明的生物活性多肽QVLSNTVPA能够促进巨噬细胞分泌细胞因子，促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率；另一方面，能够提高体内抗过氧化酶系的活力，增强机体抵抗外源性刺激的功能，从而降低机体老化、衰老和生病的机率，对开发具有抗炎功能、抗衰老功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

附图说明

图1：质量色谱提取图(m/z＝928.5105)；

图2：质荷比为928.5105的片段的二级质谱图；

图3：质荷比为928.5105的多肽az、by断裂情况；

图4：IL-4标准曲线；

图5：生物活性多肽QVLSNTVPA对细胞因子IL-4分泌量的影响；

图6：生物活性多肽QVLSNTVPA对果蝇存活率的影响情况。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1活性肽QVLSNTVPA的人工合成

一、生物活性肽的合成

1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。

2.2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。

3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。

4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。

5.称取氨基酸Gln适量和1-羟基-苯骈三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。

6.2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。

7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。

8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。

9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。

10.1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。

11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。

12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Val、Leu、Ser、Asn、Thr、Val、Pro和Ala。

13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。

至此，人工合成了生物活性肽QVLSNTVPA。

二、生物活性肽的确认

1)UPLC分析

UPLC条件如下：

仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱仪

色谱柱规格：BEH C18色谱柱

流速：0.4mL/min

温度：50℃

紫外检测波长：210nm

进样量：2μL

梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈

2)质谱分析

质谱条件如下：

离子方式：ES+

质量范围(m/z)：100-1000

毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0

采样锥(V)：35.0

离子源温度(℃)：115

去溶剂温度(℃)：350

去溶剂气流(L/hr)：700.0

碰撞能量(eV)：4.0

扫描时间(sec)：0.25

内扫描时间(sec)：0.02

根据以上分析方法，利用超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱，对生物活性肽QVLSNTVPA进行色谱分析和质谱分析，其质量色谱提取图如图1所示，提取此峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2和3所示，可得此峰的多肽质荷比为928.5105Da，保留时间是30.1min。

3)结果

由图3可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比928.5105Da的片段序列为Gln-Val-Leu-Ser-Asn-Thr-Val-Pro-Ala(QVLSNTVPA)，记为SEQID NO：1。该片段与κ-酪蛋白变体A第98～106位的残基序列相对应，κ-酪蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAA30433.1，序列见SEQ ID NO：3。

实施例2生物活性肽的抗炎活性实验

一、生物活性多肽QVLSNTVPA的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)

1.实验试剂及仪器：

试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的乳源性生物活性多肽QVLSNTVPA；ELISA细胞因子快速试剂盒(IL-4)，武汉博士德生物工程有限公司。

仪器设备：CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Heracell 150CO₂培养箱，Heraeus公司；Dragon Wellscan MK3酶标仪，Labsystems公司。

2.实验方法：

(1)标准曲线的制备

制作IL-4标准曲线：将浓度为500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.3pg/mL，15.6pg/mL，7.8pg/mL的IL-4标准品分别依次加入酶标板孔内，再加入生物素标记抗小鼠IL-4抗体(ELISA细胞因子快速试剂盒)，酶标板加上盖，37℃反应90min。甩去酶标板内液体，每孔依次加入亲和素-过氧化物酶复合物(ELISA细胞因子快速试剂盒)0.1mL。37℃反应60min。0.01M PBS洗涤3次，每孔加入0.1mL ABC工作液，37℃反应30min。0.01M PBS洗涤5次，每孔加入90ul TMB显色液，37℃避光反应25min。每孔加入0.1mL TMB终止液，用酶标仪在450nm测定吸光值。制作的IL-4检测用标准曲线如图4所示。IL-4标准曲线是以浓度为横坐标(单位pg/mL)，450nm下的吸光值为纵坐标，进行一次回归拟合，获得标准曲线Y＝0.0038X+0.1224，R²＝0.9979。其中X代表IL-4浓度，单位为pg/mL，Y代表OD450下的吸光值。

(2)多肽QVLSNTVPA的促巨噬细胞分泌细胞因子检测

在无菌条件下取小鼠脾脏淋巴细胞，调整细胞浓度至5×10⁵/mL接种于96孔板，实验组加入生物活性多肽QVLSNTVPA进行培养，调整生物活性多肽QVLSNTVPA的终浓度分别为100，50，10μg/mL，与淋巴细胞共同培养36小时后进行细胞因子IL-4的测定。空白组不加生物活性多肽QVLSNTVPA，培养36h作为对照。

3.实验结果及分析：

实验结果见图5，与空白对照组相比，随着多肽浓度的增加，IL-4的分泌量逐渐增加；当多肽添加浓度达到50和100μg/mL时，IL-4分泌量显著大于空白组；可见生物活性多肽QVLSNTVPA具有促进淋巴细胞增殖的功能，并且通过对IL-4细胞因子分泌的调节，起到对机体体液免疫的调节作用。

二、生物活性多肽QVLSNTVPA的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定(Griess法)

1.实验试剂及仪器：

试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的乳源性生物活性多肽QVLSNTVPA；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。

仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。

2.试验方法：

加入细胞个数为2×10⁶/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24h时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48h后，收集培养液上清50μl/孔，在培养液上清中依次添加Griess试剂1和Griess试剂2各50μl/孔，室温反应10分钟后，在540nm波长下测定吸光度值(OD540)。

3.实验结果及分析：

表1生物活性多肽QVLSNTVPA促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定

实验分组	正常组	炎症组
			细胞空白	0.0592±0.00525	0.3241±0.0381
QVLSNTVPA 1mg/ml	0.1412±0.0751**	0.4966±0.0457**
			QVLSNTVPA 0.5mg/ml	0.1346±0.0345**	0.3767±0.0654**
QVLSNTVPA 0.1mg/ml		0.2346±0.0753**

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)

实验结果见表1，由表1可知，在实验组中添加生物活性多肽QVLSNTVPA，浓度分别为1mg/mL和0.5mg/mL，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用。与细胞空白组相比，具有显著性差异(P<0.05)。当生物活性多肽QVLSNTVPA的添加浓度为0.1mg/mL，在LPS造炎症情况下相比，也能促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加，并具有显著性差异(P<0.05)。但是与正常情况下生长的细胞空白组相比，没有显著性差异。说明生物活性多肽QVLSNTVPA在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。

实施例3生物活性肽的抗衰老活性实验

一、生物活性多肽QVLSNTVPA提高果蝇生存能力的实验

1.实验试剂及仪器：

试剂：Oregon K野生型黑腹果蝇，上海交通大学农学院遗传学实验室；琼脂粉，国药集团化学试剂有限公司；实施例1获得的乳源性生物活性多肽QVLSNTVPA。

仪器设备：CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；G136T型Zealway智能高温灭菌锅，厦门致微仪器科技有限公司；BJ-CD SERIES生物培养箱，上海博讯实业公司；GRX-9073型热空气消毒箱，上海一恒科技有限公司。

2.实验方法：

以果蝇为实验模型：收集8小时内新羽化的果蝇成虫，麻醉后分雌雄随机转移到各实验组中，每组每个性别100只，每组设置3个平行，对照组给予普通玉米粉培养基，实验组分别为含有0.05mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml的QVLSNTVPA生物活性肽-玉米培养基。每2天更换新鲜培养基一次，每天观察并记录不同性别果蝇的死亡数，直到果蝇全部死亡为止。绘制果蝇生存曲线，并计算出不同性别果蝇的平均寿命和最高寿命(取最后死亡的5只果蝇进行统计)。

3.实验结果及分析：

本实验对喂食不同浓度生物活性肽的果蝇寿命的研究结果如下：从图6(A)中可以发现，相对于空白对照组雄性果蝇而言，喂食浓度为0.05mg/ml的QVLSNTVPA并没有显著改变雄性果蝇的存活率，而当肽浓度达到0.5mg/ml和1mg/ml时，相同时间点，雄性果蝇的存活率有了明显提高。从图6(B)看，相对于空白对照组雌性果蝇，喂食浓度为0.5mg/ml和1mg/ml时，在相同时间点，雌性果蝇的存活率有所提高，但结果差异不明显。

表2-1QVLSNTVPA对雄性果蝇寿命的影响情况

注：*标示与空白对照组比较，有显著性差异(P<0.05)；下同。

表2-2QVLSNTVPA对雌性果蝇寿命的影响情况

从表2-1中可知，相对于空白对照组，低剂量组雄性果蝇平均寿命没有明显变化，但中剂量组和高级量组雄性果蝇平均寿命均有提高，分别为15.87％和8.6％，但仅中剂量组产生了显著性差异(p<0.05)，说明中剂量组雄性果蝇的平均寿命显著性提高。同时，中剂量组和高剂量组果蝇的半数死亡时间得到了提高，但最长寿命方面均未有明显差异。由表2-2可知，雌性果蝇低剂量组、中剂量组和高剂量组在平均寿命方面均有所提高，但均未产生显著性差异。但中剂量组和高剂量组的最长寿命均有所提高，较空白对照组分别延长7天和6天，并产生了显著性差异(P<0.05)。

本实验结果说明，生物活性多肽QVLSNTVPA在一定浓度下可以提高果蝇的平均寿命和最长寿命，但与浓度和性别有关。这种与受试物浓度、品系相关的现象可能是因为QVLSNTVPA参与果蝇的部分生物代谢，或者是通过改善果蝇组织的抗氧化体系来达到延长果蝇寿命的效果。由于不同品系果蝇的代谢会有区别，从而造成结果的差异。而性别的差异，可能是由于雌性果蝇本身就具有一定的保守性和对外界环境的抵抗力，所以QVLSNTVPA对雌性果蝇寿命延长并不明显。

二、生物活性多肽QVLSNTVPA提高果蝇繁殖能力的实验

1.实验试剂及仪器：

2.实验方法：

收集8小时内新羽化的果蝇成虫，将其雌雄分开喂养，培养基中分别加入浓度为0mg/ml、0.05mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml的QVLSNTVPA溶液，连续培养12天。第13天收集相同浓度下培养的成年果蝇并转移到新的普通培养瓶中，每个培养瓶保证1只雌性和2只雄性(每组5瓶)，每瓶给予准确的24小时进行产卵。产卵后将亲本果蝇转移到新的普通培养瓶中，旧培养瓶继续繁殖培养，待幼虫羽化后统计后代数量，连续测定7天，并重复3次。

3.实验结果及分析：

表3繁殖力测定结果

从表3可以看出，低浓度实验组繁殖力与对照组相比未产生显著性变化，但中剂量实验组和高剂量实验组果蝇的繁殖力与空白对照组相比有显著提高(P<0.05)。说明一定浓度的QVLSNTVPA能够促进果蝇的繁殖力。本实验结果表明，果蝇寿命的延长是QVLSNTVPA直接作用的结果，而非QVLSNTVPA通过降低繁殖力所产生的二级生理效应。同时也说明QVLSNTVPA对果蝇是安全的，没有毒性危害。

三、生物活性多肽QVLSNTVPA对果蝇SOD和MAD含量影响的实验

1.实验试剂及仪器：

试剂：Oregon K野生型黑腹果蝇，上海交通大学农学院遗传学实验室；琼脂粉，国药集团化学试剂有限公司；MDA脂质过氧化物试剂盒，南京凯基生物科技有限公司；SOD超氧化物歧化酶试剂盒，南京建成生物科技有限公司；实施例1获得的乳源性生物活性多肽QVLSNTVPA。

仪器设备：CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；组织匀浆器，上海元象生物科技有限公司；G136T型Zealway智能高温灭菌锅，厦门致微仪器科技有限公司；BJ-CD SERIES生物培养箱，上海博讯实业公司；GRX-9073型热空气消毒箱，上海一恒科技有限公司；Infinite型酶标仪，奥地利帝肯有限公司。

2.实验方法：

收集8小时内新羽化的果蝇成虫，麻醉后分雌雄随机转移到各实验组中，每组每个性别100只，每组设置3个平行，对照组给予普通玉米粉培养基，实验组分别为含有0.05mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml的QVLSNTVPA生物活性肽-玉米培养基。每2天更换新鲜培养基一次，饲养30天后，每组称取果蝇40mg，加0.5ml生理盐水，在冰浴中研磨匀浆，间歇10s秒，反复进行3次，制成匀浆，按照试剂盒说明测定每组果蝇SOD活性及MDA浓度含量。利用MDA检测试剂盒检测果蝇体内的脂质过氧化产物MDA的浓度含量，分光光度计的波长为532nm。

3.实验结果及分析：

表4QVLSNTVPA对果蝇SOD、MDA的影响

从表4中可知，相对于空白对照组，多肽处理组雌雄果蝇体内的SOD含量均有提高，且对于雄性果蝇组而言，在肽浓度达到1mg/ml时，果蝇体内的SOD含量出现显著性差异，而雌性果蝇组则在肽浓度为0.5mg/ml和1mg/ml时出现显著差异。说明通过摄入一定的多肽，可以提高体内的SOD含量，并帮助机体保护自身防止氧化损伤。从表4中MDA含量可以看到，实验组雄性果蝇和雌性果蝇体内的MDA含量均有降低。相对于雄性空白对照组MDA含量1.37±0.21μmol/L，浓度为0.5mg/ml和1mg/ml果蝇组的MDA含量出现显著性的降低，而雌性果蝇组中，在1mg/ml肽处理时，果蝇体内的MDA含量出现显著性的降低。由于MDA是体内脂质过氧化而生成的，其含量的降低间接地说明果蝇的抗氧化酶系活力得到了提高，从而保护机体组织器官不会产生大量脂质过氧化物。

从实验结果可以看出，SOD和MDA的实验结果相互佐证，可以说明生物活性多肽QVLSNTVPA有助于提高机体体内的抗氧化酶系的活力，从而能有效提高机体的抗氧化能力，减少机体受不良因子的刺激，从而降低机体老化、衰老和生病机率，总体来看，对于雄性果蝇的作用要好于雌性果蝇。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江辉肽生命健康科技有限公司；上海铂辉生物科技有限公司

<120> 一种生物活性多肽QVLSNTVPA及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Leu Ser Asn Thr Val Pro Ala

1 5

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caagttttgt caaatactgt gcctgcc 27

<210> 3

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Met Lys Ser Phe Phe Leu Val Val Thr Ile Leu Ala Leu Thr Leu

1 5 10 15

Pro Phe Leu Gly Ala Gln Glu Gln Asn Gln Glu Gln Pro Ile Arg Cys

20 25 30

Glu Lys Asp Glu Arg Phe Phe Ser Asp Lys Ile Ala Lys Tyr Ile Pro

35 40 45

Ile Gln Tyr Val Leu Ser Arg Tyr Pro Ser Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr

50 55 60

Gln Gln Lys Pro Val Ala Leu Ile Asn Asn Gln Phe Leu Pro Tyr Pro

65 70 75 80

Tyr Tyr Ala Lys Pro Ala Ala Val Arg Ser Pro Ala Gln Ile Leu Gln

85 90 95

Trp Gln Val Leu Ser Asn Thr Val Pro Ala Lys Ser Cys Gln Ala Gln

100 105 110

Pro Thr Thr Met Ala Arg His Pro His Pro His Leu Ser Phe Met Ala

115 120 125

Ile Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn

130 135 140

Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu Ala Val

145 150 155 160

Glu Ser Thr Val Ala Thr Leu Glu Asp Ser Pro Glu Val Ile Glu Ser

165 170 175

Pro Pro Glu Ile Asn Thr Val Gln Val Thr Ser Thr Ala Val

180 185 190

Claims

1.一种生物活性多肽QVLSNTVPA，其特征在于，其氨基酸序列为Gln-Val-Leu-Ser-Asn-Thr-Val-Pro-Ala。

2.编码权利要求1所述生物活性多肽QVLSNTVPA的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段的序列如SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1所述生物活性多肽QVLSNTVPA的制备方法，其特征在于，通过基因工程的方法人工合成，或直接通过化学合成制备。

4.如权利要求1所述生物活性多肽QVLSNTVPA的应用，其特征在于，所述生物活性多肽QVLSNTVPA在制备具有抗炎功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。

5.如权利要求1所述生物活性多肽QVLSNTVPA的应用，其特征在于，所述生物活性多肽QVLSNTVPA在制备具有抗衰老功能的食品、保健品或药物中的应用。

6.如权利要求1所述生物活性多肽QVLSNTVPA的应用，其特征在于，所述生物活性多肽QVLSNTVPA在制备具有抗炎功能和抗衰老功能的食品、保健品或药物中的应用。

7.一种抗炎产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽QVLSNTVPA；所述的抗炎产品包括抗炎食品、抗炎保健品、抗炎药物或抗炎化妆品。

8.一种抗衰老产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽QVLSNTVPA；所述的抗衰老产品包括抗衰老食品、抗衰老保健品或抗衰老药物。

9.一种具有抗炎功能和抗衰老功能的产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽QVLSNTVPA；具有抗炎功能和抗衰老功能的产品包括食品、保健品或药物。