CN105254714A

CN105254714A - 一种源自酪蛋白的抗氧化肽及其制备方法

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Publication number: CN105254714A
Application number: CN201510672835.6A
Authority: CN
Inventors: 李博; 王婵; 王波; 霍艳姣
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: Beijing Sipin International Trade Co ltd
Priority date: 2015-10-16
Filing date: 2015-10-16
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2035-10-16
Also published as: CN105254714B

Abstract

本发明涉及生物活性肽技术领域，尤其涉及一种源自酪蛋白的抗氧化肽混合物，其通过使用蛋白酶对酪蛋白进行水解，得到多种酪蛋白抗氧化肽的前制品，然后经过离子交换柱层析进行分离、脱盐和浓缩得到富含碱性氨基酸的酪蛋白抗氧化肽。本发明的酪蛋白抗氧化肽具有很好的细胞抗氧化能力和抑制低密度脂蛋白氧化的能力，并且在经过胃肠道的消化和吸收后仍然能够保持很好的抗氧化能力，因此，本发明的富含碱性氨基酸的酪蛋白抗氧化肽可用于食品和保健品领域，具有很高的社会效益和经济效益。

Description

一种源自酪蛋白的抗氧化肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物活性肽技术领域，尤其涉及一种源自酪蛋白的富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物及其制备方法。

背景技术

低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，简称LDL)是一种运载胆固醇进入外周组织细胞的脂蛋白颗粒，可被氧化成氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)，当低密度脂蛋白，尤其是经氧化修饰的低密度脂蛋白过量时，它携带的胆固醇便会积存在动脉壁上，从而引起动脉粥样硬化。因此，通过补充额外的抗氧化剂来抑制LDL的氧化是一种非常可行的预防动脉粥样硬化的方法。人工合成的抗氧化剂虽然高效、廉价，但由于有副作用，人们更青睐于选择天然的抗氧化剂。例如抗氧化肽，由于其以预防疾病、保护健康的良好功效以及蛋白来源丰富和其自身的安全性而备受瞩目。

抗氧化肽，是来源于蛋白质的一类具有清除自由基、供氢/供电子、螯合金属离子、淬灭单线态氧、分解过氧化物、抑制脂肪氧合酶活力和抑制脂质过氧化等功效的活性肽。酪蛋白是牛乳中的主要蛋白质，约占80％。酪蛋白不仅是优质的乳源蛋白，更是多种重要生物活性肽的良好来源。但是这些生物活性肽经口服到达血液循环前，会受到一系列的阻碍，如胃中的低酸环境和胃蛋白酶，以及肠道中碱性环境和胰蛋白酶、肽酶等，这些因素都会影响抗氧化肽的吸收从而影响其在生物体内的生理活性。抗氧化肽进入血液循环到达靶点是其发挥功能的前提条件。因此，要想利用来自牛奶酪蛋白的抗氧化肽来预防动脉粥样硬化的发生，不仅需要这些肽具有较好的抑制LDL氧化的能力，还需要其能够耐受胃肠道的消化和吸收。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术之不足，提供一种源自酪蛋白富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物，该抗氧化肽混合物不仅具有抑制低密度脂蛋白氧化功能，而且能够耐受胃肠道的吸收和消化而不被降解，因此，其适于应用于保健食品和预防动脉粥样硬化的药物领域中。

本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术之不足，提供一种源自酪蛋白富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物的制备方法。

本发明提供的一种源自酪蛋白富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物的技术方案为：该抗氧化肽混合物为KEMPFPK、RGPFPIIV、VYPFPGPIHN、TEDELQDKIHP、KAVPYPQRDMPIQ、VYPFPGPIHNSLPQ、QPHQPLPPTVMFPPQ、HQPHQPLPPTVMFPPQ、MHQPHQPLPPTVMFPPQ、KNQDKTEIPT、HQPHQPLPPT、MHQPHQPLPPT、HQPHQPLPPTVM、NLHLPLPL、LHLPLPL和MPFPK氨基酸序列中的至少一种。

本发明提供一种源自酪蛋白富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物的制备方法采用的主要技术方案为，其包括以下步骤：

a、将酪蛋白浸泡于水中，制得酪蛋白样品溶液，以便加酶进行水解；

b、向步骤a中所制得的酪蛋白样品液中加入蛋白酶进行水解，水解结束后进行酶的钝化，制得富含抗氧化肽的水解液；

c、将步骤b中制得的水解液的pH采用0.5-1M盐酸溶液将其调节至6.5～7.0，然后对其进行真空浓缩，得到浓缩液；

d、将步骤c中得到的酪蛋白水解物浓缩液采用离子交换柱层析设备进行分离纯化，得到富含碱性氨基酸的肽组分，即为具有显著抑制低密度脂蛋白氧化的高活性抗氧化性的抗氧化肽；

e、将步骤d中得到的抗氧化肽进行冷冻干燥或喷雾干燥，得到富含碱性氨基酸的酪蛋白抗氧化肽干粉。

本发明提供的一种源自酪蛋白富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物的制备方法还采用如下附属技术方案：

步骤a中酪蛋白样品液的制备方法为将酪蛋白浸泡于pH为2.0～8.0的水中，然后在30～60℃的水浴中预热10～15min，目的是使酪蛋白样品液达到蛋白酶的最佳酶解条件；其中，所述酪蛋白与水的比例为1g∶10～20mL。

步骤a中，所述水优选为纯净水、去离子水或蒸馏水；所述酪蛋白优先选用牛奶、羊奶的酪蛋白提取物。

步骤b中，所述蛋白酶与所述酪蛋白的质量比为1∶20～100。

步骤b中所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰液素、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶或地衣芽孢杆菌蛋白酶。

步骤b中酶的钝化方法为将所述富含抗氧化肽的水解液加热至85～100℃，并维持10～20min，即完成酶的钝化过程，同时也起到杀灭微生物的作用。

步骤b中，使用蛋白酶对酪蛋白进行水解的条件视酶的活力和种类而定，以便在最佳条件下水解生成更多的抗氧化肽；例如使用碱性蛋白酶进行水解，在酶解过程中，酶与酪蛋白的比例为1～2％(w/w)，水解液pH值为8.0，温度控制在60℃，水解时间为4h，水解过程中每30min调节水解液的pH至8.0(因为在酪蛋白水解过程中，由于水解产生的肽和游离氨基酸，使水解液的pH会降低到5～6左右，为了维持碱性蛋白酶水解的最佳pH，需要用1MNaOH将水解液的pH调回至8.0)；

步骤(c)所述酪蛋白水解液真空浓缩的温度为40～60℃。

步骤d中酪蛋白抗氧化肽的分离纯化方法，采用离子交换色谱柱法。包括以下步骤：

(I)采用缓冲液平衡柱子2～3体积，其中，柱层析填料为SPSephadexC-25或DEAE-SephadexA-25离子交换树脂填料；

(II)将酪蛋白水解物溶于所述缓冲液，使其浓度为100～500mg/mL，然后用0.45μm的水系滤膜过滤；

(III)取一定量滤液加到离子交换柱填料上方，在0.5～5mL/min的流速下进行分离，收集富含碱性氨基酸的抗氧化肽组分。

步骤(III)中，离子交换柱洗脱程序前半部分的洗脱液为缓冲液；后半部分洗脱液为缓冲液+0.5～1M的氯化钠。

步骤(III)中将收集的富含碱性氨基酸的抗氧化肽组分，继续进行处理的制备方法为：采用0.5～1.5M的氢氧化钠溶液将收集组分的pH调节为6.5～7.0，将调节pH后的收集组分真空浓缩至干物质含量为15～40％，接着用填料为SephadexG15柱层析或D-SaltExcellulosePlasticDesalting柱进行脱盐处理，然后对脱盐后的抗氧化肽溶液进行真空浓缩，将所述浓缩液进行喷雾或冷冻干燥，得到富含碱性氨基酸的酪蛋白抗氧化肽。

所述的富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物在保健食品和预防动脉粥样硬化的药物领域中的应用。

对制得抗氧化肽进行体外模拟胃肠消化的方法

称取60.0mg抗氧化肽溶于5.5mL浓度为0.010mol/L的盐酸溶液中。按照酶/底物(E/S)＝1∶50的比例用0.010mol/L盐酸溶液作为溶剂配制浓度为2.4mg/mL的胃蛋白酶溶液(pH＝2.0)，将待消化的底物溶液与胃蛋白酶溶液分别置于37℃预热15min，然后取0.5mL胃蛋白酶溶液加入待消化的底物溶液中，置于37℃恒温水浴振荡器中，计时模拟胃消化2h；

按照酶/底物(E/S)＝1∶25配制浓度为8mg/m的胰酶溶液，待上述模拟胃消化结束后，用0.9mol/L的NaHCO₃溶液将消化液pH值调节至5.3，再用2.0mol/L的NaOH溶液将其pH值继续调节至7.5，然后取0.1mL胰酶溶液加入上述消化液中，置于37℃恒温水浴振荡器中，计时模拟肠消化2h；

模拟胃肠消化结束后，消化液立即置于沸水浴中灭酶10min，待其冷却至室温，用0.01M的HCl溶液将其pH值调至7.0，8000g离心15min后，取上层清液冷冻干燥。

对制得抗氧化肽进行体外模拟肠吸收的方法

模拟肠吸收采用Caco-2细胞模型，以含20％(V/V)胎牛血清、1％(V/V)非必需氨基酸、1％(V/V)双抗(100U/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素组成的双抗)的培养液(Dulbecco′sModifiedEagleMedium，简称DMEM)作为Caco-2细胞培养基，将Caco-2细胞置于细胞培养瓶中(细胞培养面积为25cm²)，于37℃、相对湿度为90％、5％的CO₂培养箱中进行培养，每两天换一次细胞培养液，待细胞在培养瓶中培养融合至80％左右时，用含有0.05％EDTA的胰酶进行消化，将细胞消化悬液吹打均匀后以4-5×10⁵个/mL的密度接种于6孔Transwell板的上侧(AP侧)，同时下侧(BL侧)加入3mL细胞培养基，于细胞培养箱中进行培养，接种后每两天更换一次细胞培养基，并通过Millicell电阻仪测定细胞单层的跨膜电阻值，待细胞培养21天并且跨膜电阻达到400Ω.cm²以上时，可以用于抗氧化肽吸收转运实验；

在吸收实验前，用HBSS清洗Caco-2细胞模型两次，洗涤后置于细胞培养箱中平衡30min，然后弃去HBSS，在AP侧加入1.5mL溶于HBSS中的模拟胃肠消化后的抗氧化肽(10mg/mL)溶液，Transwell培养板放入细胞培养箱中，37℃孵育2h完成吸收实验，收集BL侧溶液，冷冻干燥，即为胃肠消化吸收的抗氧化肽。

TEAC法测定抗氧化肽的抗氧化能力

以去离子水配制ABTS·⁺母液，其中ABTS·⁺的浓度为7mmol/L，过硫酸钾的浓度为2.45mmol/L，在室温下将其置于黑暗环境中放置12～16h，即得到ABTS·⁺母液；ABTS·⁺母液用浓度为0.2mol/L、pH为7.4磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，使其在734nm下的吸光值为0.70±0.02，得到ABTS·⁺工作液。测量过程中采用96孔酶标板，首先将10μL样品和50μL的PBS加入每个小孔，之后用排枪添加100μL的ABTS·⁺工作液，然后迅速将孔板放入多功能酶标仪内，读取6min后414nm下的吸光值，根据以下公式计算自由基清除能力，其中，以去离子水替代试样，所测的吸光度作为对照，

Trolox标准曲线制作：以0-300μM的Trolox为标准品，其浓度为横坐标，自由基清除率为纵坐标绘制标准曲线。然后将样品的自由基清除率代入Trolox标准曲线，得到相应的Trolox当量。

ORAC法测定抗氧化肽的抗氧化能力

以荧光素钠盐作为荧光物质，所有反应试剂均用75mmol/L，pH为7.4的磷酸缓冲液溶解并配制，20μL待测样品(浓度为10μg/mL～20μg/mL)与120μL荧光工作液(70nmol/L)先后加入黑色96孔板内，混合液在37℃条件下孵育12min，然后用多通道加液器迅速加入60μL的AAPH溶液(12mmol/L)于96孔板各个反应孔中。最后将黑色96孔板放入多功能酶标仪中进行测定。

测定参数：激发波长485nm，发射波长520nm，反应温度37℃，每次读数之前微孔板振荡2s，每1min测定一次荧光值，连续测定120min。

NetAUC＝AUC_sample-AUC_blank，式中：AUC_sample代表样品的荧光衰退面积，AUC_blank代表空白对照的荧光衰退面积。

其中AUC的计算公式为：f_o代表反应0min时的初始荧光值，f_i代表反应imin时的荧光值。

标准曲线制作：以Trolox作为标准品，浓度范围为10～80μmol/L，以GSH(还原型谷胱甘肽)作为阳性对照，以75mmol/L、pH为7.4的磷酸缓冲液作为空白对照，采用相同的测定方法，监测120min内，荧光值的变化。以Trolox浓度为横坐标，NetAUC为纵坐标，绘制标准曲线。

细胞抗氧化(CAA)能力的测定方法

抗氧化肽及其胃肠消化吸收物的细胞抗氧化活性以HepG2细胞为模型，将HepG用含10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基培养在细胞培养瓶中，并置于温度37℃，CO₂浓度5％，相对湿度90％的细胞培养箱中进行培养；待HepG2细胞培养至70-80％融合度时，将其用含有0.05％EDTA的胰酶进行消化，细胞消化悬液吹打均匀后以1×10⁵个/mL的密度接种在96孔细胞培养板内，每孔内添加100μL细胞悬液，之后将96孔细胞培养板放入细胞培养箱中培养24h(培养条件：温度37℃，CO₂浓度5％，相对湿度90％)，24h后，移除96孔细胞培养板中旧的培养基，并用HBSS清洗细胞两次，之后，在96孔细胞培养板的每个孔内添加20μL(浓度为5mg/mL)样品和180μL浓度为25μmol/L的DCFH-DADMEM培养基，并置于细胞培养箱中孵育1h，随后移除96孔细胞培养板中的旧培养基，并用150μLHBSS清洗两次。然后将该96孔细胞培养板置于37℃的环境中继续孵育10min；在进行下一步检测之前，称取25mgAAPH并溶解在5mL的HBSS中，配成AAPH反应液。采用多通道加液器迅速加入20μLAAPH反应液于96孔细胞培养板的每个孔内，立即移入多功能酶标仪中进行测定，空白组使用DCHF-DA和HBSS处理细胞，不添加AAPH和样品；对照组使用DCFH-DA、HBSS和AAPH处理细胞，不添加样品；

测定参数：激发波长485nm，发射波长538nm，反应温度：37℃，每2min测定一次荧光值，连续测定60min；

Areaundercurve(AUC)面积计算公式为：AUC＝[R₁/2+sum(R₂：R_n-1)+R_n/2]×CT。式中R₁代表起始点的荧光值，R_n代表终点的荧光值，CT代表每分钟荧光扫描次数，扣去空白后每个样品“时间-荧光值”曲线下的面积即为CAA值，计算公式为CAA(unit)＝1-NetAUC_样品/NetAUC_对照，其中NetAUC＝AUC_样品-AUC_空白。

抑制LDL氧化的化学方法

抗氧化肽及其胃肠消化吸收物抑制LDL氧化的方法如下：将LDL用75mmol/L、pH为7.4的磷酸缓冲液稀释至250μg/mL。取20μL稀释后的LDL(250μg/mL)加入UV-96孔板中，再分别加入20μL待测样品(浓度为5mg/mL)于UV-96孔板对应的孔内，随后采用多通道加液器分别加入140μL磷酸缓冲液，之后将UV-96孔板置于37℃的环境中预热10min，随后利用多通道加液器迅速向96孔板内加入20μL浓度为25μmol/mL的CuSO₄溶液，引发氧化反应，以磷酸缓冲液代替样品和CuSO₄溶液作为空白组，以磷酸缓冲液代替样品作为对照组。

测定参数：测定波长234nm，反应温度37℃，每10min测定一次吸光值，连续测定600min。

抑制LDL氧化的细胞方法

生长良好的RAW264.7细胞以4×10⁵个/mL的密度接种到24孔板，采用DMEM高糖培养基，不加酚红。样品组、对照组(不加样品)、空白组(不加细胞)加入N-LDL(天然的LDL，200ug/mL)，在37℃条件下进行孵育24h，在结束时，加入200uM的EDTA和40uM的BHT，取上清液100ul测定MDA和共轭烯烃的含量。

生长良好的RAW264.7细胞以1×10⁶个/mL的密度接种到6孔板，采用DMEM高糖培养基，不加酚红。样品组、对照组(不加样品)加入N-LDL(天然的LDL，200ug/mL)，在37℃条件下进行孵育24h。去掉培养基，用HBSS清洗，进行油红O染色。具体步骤如下：

油红O工作液：油红原液∶蒸馏水＝3∶2，混匀、室温放置5-10min，过滤。4％多聚甲醛放在-20℃条件下，实验前放室温融化，配制60％异丙醇。加4％多聚甲醛溶液固定30min，HBSS清洗3次。用60％异丙醇润洗，加油红O染液，染色30min。HBSS冲洗，显微镜观察。

抗氧化肽的质谱鉴定

对于能够耐受胃肠消化和吸收而不被降解的肽，采用nanoACQUITYUPLC超高效液相色谱与电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF)联用的方法进行肽序列鉴定：

液相条件：富集柱为SymmetryC₁₈(180μm×20mm，5um)，分析柱为nanoACQUITYUPLC超高效液相色谱键合乙烷杂颗粒柱BEHC₁₈(75um×250mm，1.7um)，柱温35℃，流速为200nL/min，检测波长214nm；流动相A液为含0.1％甲酸水溶液，流动相B液为含0.1％甲酸乙睛溶液，流动相C液为含0.1％甲酸水溶液；进样后的前5min通过预柱脱盐(样品在预柱中用C液脱盐)，随后通过梯度洗脱经C18毛细管柱进行肽段分离；分析柱梯度洗脱条件：5～65min，10％～85％的流动相B液；65～85min，85％流动相B液，85～95min，A液平衡分析柱；

质谱条件：正离子模式，源温100℃，锥孔电压40V，毛细管电压3KV，一级质谱质量扫描范围350～1500Da，二级质谱扫描范围50～2000Da；采用DDA模式对肽段自动进行MS/MS测定；质谱仪的校正是用Glu-fib的串联碎片校正的，质量误差小于1pp，雾化气为氮气，碰撞气为氩气；

数据分析：质谱数据原始文件分析采用Waters公司的PLGS2.4软件进行，从原始MS/MS谱中产生PKL格式的数据文件，然后利用Matrixscience公司的Mascot软件进行MS/MSIonSearch检索；肽段Denovo测序采用Waters公司的Masslynx4.1的peptidesequence软件。

本发明的有益效果在于：本发明的抗氧化肽不仅具有抑制低密度脂蛋白氧化功能，而且能够耐受胃肠道的吸收和消化而不被降解。

附图说明

图1为实例1酪蛋白水解物经SPSephadexC-25阳离子交换柱层析的分离图谱。

图2为抗氧化肽模拟胃肠消化吸收前后液相色谱比较图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

以碱性蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白抗氧化肽。

(1)称取30g酪蛋白，浸没于600mL、pH为8.0的去离子水中，在60℃水浴中预热10min，制得酪蛋白样品溶液；

(2)接着加入酶活力为2.4U/g的碱性蛋白酶0.6g，并放入60℃水浴中水解4h；在水解0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h时用1M的NaOH水溶液将水解液的pH调节至8.0；制得富含抗氧化肽的水解液。

(3)水解结束后，将步骤(2)中制得的水解液在100℃沸水浴中加热15min进行酶的钝化，冷却至室温后采用1M盐酸溶液将其pH调节至7.0；对调节PH后的酪蛋白水解液真空浓缩至干物质含量为40％。

(4)将步骤(3)中浓缩液溶于溶于浓度为20mM，pH为4.0的1mL醋酸缓冲溶液中，充分溶解后，用0.45μm的水系滤膜过滤，取1mL滤液上SPSephadexC-25阳离子交换柱进行分离；其中，柱子填料填装高度为20cm，洗脱流速为2mL/min，检测波长为220nm。0～120min之间，以浓度为20mM、pH为4.0的醋酸缓冲溶液进行洗脱，得到酸性酪抗氧化肽，带负电荷；120-300min之间，以浓度为20mM、pH为4.0的醋酸缓冲溶液+0.5M的NaCl进行洗脱，得到碱性酪抗氧化肽，带正电荷。采用1.0M的氢氧化钠溶液将阳离子交换柱分离得到的带正电荷组分的pH调节至7.0，将调节pH后的带正电荷组分真空浓缩至干物质含量为40％，然后用SephadexG15填料填装的柱层析脱盐处理，脱盐后的浓缩液冷冻干燥得到碱性酪蛋白抗氧化肽干粉。酪蛋白水解物经阳离子交换柱分离的结果见图1。

实施例2

以木瓜蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白抗氧化肽。

(1)称取30g酪蛋白，浸没于450mL、pH为7.0的蒸馏水中，在50℃水浴中预热10min，制得酪蛋白样品溶液；

(2)接着加入木瓜蛋白酶0.6g，并放入50℃水浴中水解3h；制得富含抗氧化肽的水解液。

(3)水解结束后，将步骤(2)中制得的水解液在100℃沸水浴中加热15min进行酶的钝化，冷却至室温后采用1M盐酸溶液将其pH调节至7.0；对调节PH后的酪蛋白水解液真空浓缩至干物质含量为30％。

(4)将步骤(3)中浓缩液溶于，pH为8.3的Tris-HCl缓冲溶液中，用0.45μm的水系滤膜过滤，取2mL滤液上DEAE-SephadexA-25离子交换柱进行分离；其中，柱子填料填装高度为30cm，洗脱流速为4mL/min，检测波长为220nm。0～150min之间，以pH为8.3的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱；150-300min之间，以pH为8.3的Tris-HCl缓冲溶液+0.5M的NaCl进行洗脱，得到碱性酪抗氧化肽，带正电荷。采用1.0M的氢氧化钠溶液将碱性组分的pH调节至7.0，将调节pH后的组分真空浓缩至干物质含量为30％，然后用5mLD-SaltExcellulosePlasticDesalting柱柱层析脱盐处理，脱盐后的浓缩液冷冻干燥得到碱性酪蛋白抗氧化肽干粉。

实施例3

以胰蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白抗氧化肽。

(1)称取60g酪蛋白，浸没于600mL、pH为7.5的纯净水中，在37℃水浴中预热10min，制得酪蛋白样品溶液；

(2)接着加入胰蛋白酶1.2g，并放入37℃水浴中水解3h；制得富含抗氧化肽的水解液。

(3)水解结束后，将步骤(2)中制得的水解液在85℃沸水浴中加热25min进行，冷却至酶的钝化室温后采用1M盐酸溶液将其pH调节至7.0；对调节PH后的酪蛋白水解液真空浓缩至干物质含量为30％。

(4)将步骤(3)中浓缩液溶于浓度为20mM，pH为4.0的2mL醋酸缓冲溶液中，充分溶解后，用0.45μm的水系滤膜过滤，取1mL滤液上SPSephadexC-25阳离子交换柱进行分离；其中，柱子填料填装高度为30cm，洗脱流速为3mL/min，检测波长为220nm。0～150min之间，以浓度为20mM、pH为4.0的醋酸缓冲溶液进行洗脱，得到酸性酪抗氧化肽，带负电荷；150-300min之间，以浓度为20mM、pH为4.0的醋酸缓冲溶液+0.5M的NaCl水溶液进行洗脱，得到碱性酪抗氧化肽，带正电荷。采用1.0M的氢氧化钠溶液将碱性组分的pH调节至7.0，将调节pH后的组分真空浓缩至干物质含量为40％，然后用5mLD-SaltExcellulosePlasticDesalting柱进行脱盐处理，脱盐后的浓缩液冷冻干燥得到带有正电荷的酪蛋白抗氧化肽干粉。

以实施例1中碱性蛋白酶水解酪蛋白制得的抗氧化肽为例进行抗氧化活性分析：

实验例1

对经阳离子交换组分离得到的抗氧化肽的TEAC活性进行测定，同时对分离组分进行体外模拟胃肠消化和吸收，吸收物也进行TEAC测定，所得结果见表1。

表1.不同抗氧化肽组分及其胃肠吸收物的TEAC活性

GSH：阳性对照；H：未经分离的酪蛋白水解物；CN：酪蛋白；F-GI-B：酪抗氧化肽模拟胃肠消化和吸收后的吸收物

可以看出，水解物H的TEAC活性显著高于各个分离组分对应的活性(p＜0.05)，与同浓度谷胱甘肽的TEAC活性相当(p＞0.05)，F1-F4四个组分中，酸性氨基酸含量较多的组分(F1和F2)其TEAC活性显著低于碱性氨基酸含量较多的组分(F3和F4)(p＜0.05)。

经Caco-2细胞吸收后，F4-GI-B的TEAC活性最高，F2-GI-B和F3-GI-B的TEAC活性相当，而CN和H组分吸收物的TEAC活性最低。

抗氧化肽以及其吸收物的ORAC活性

实验例2

对经阳离子交换组分离得到的抗氧化肽的TEAC活性进行测定，同时对分离组分进行体外模拟胃肠消化和吸收，吸收物也进行TEAC测定，所得结果见表2。

表2.不同抗氧化肽及其胃肠吸收物的ORAC活性

GSH：阳性对照；H：未经分离的酪蛋白水解物；CN：酪蛋白；F-GI-B：抗氧化肽模拟胃肠消化和吸收后的吸收物

可以看出，水解物H的ORAC活性显著高于各个分离组分对应的活性(p＜0.05)，F1-F4四个组分中，酸性氨基酸含量较多的组分(F1和F2)其ORAC活性低于碱性氨基酸含量较多的组分(F3和F4)。

经Caco-2细胞吸收后，四组分吸收物的ORAC活性相当，而CN和H组分吸收物的TEAC活性最低。

抗氧化肽以及其吸收物的细胞抗氧化活性(CAA)

实验例3

对经阳离子交换组分离得到的抗氧化肽的CAA进行测定，同时对分离组分进行体外模拟胃肠消化和吸收，吸收物也进行CAA测定，所得结果见表3。

表3.不同抗氧化肽及其胃肠吸收物的细胞抗氧化的效果

可以看出，在模拟吸收转运前，四组分之间的CAA活性之间无显著性差异(p＞0.05)，在经过Caco-2细胞吸收转运后，碱性组分(F3和F4)的转运吸收肽CAA活性较高，与同浓度的GSH转运吸收肽的CAA活性相当(p＞0.05)。酸性组分(F1和F2)、酪蛋白及酪蛋白碱性蛋白酶酶解物对应的转运吸收肽的CAA活性之间没有显著性差异。

抗氧化肽及其吸收物抑制LDL氧化的活性

实验例4

对经阳离子交换组分离得到的抗氧化肽抑制LDL氧化的活性进行测定，同时对分离组分进行体外模拟胃肠消化和吸收，吸收物也进行抑制LDL氧化的活性测定测定，所得抑制LDL氧化的结果表4。

表4.不同酪抗氧化肽组分及其胃肠吸收物抑制LDL氧化的效果

通过分析，相对于对照组，GSH、H、F1、F2、F3和F4均可以有效的延缓共轭双键的产生。其中GSH的延滞时间最短，相比之下，H、F1-F4表现出较好的抑制LDL氧化能力。其中F3和F4组分抑制LDL氧化能力最强，在检测600min时，仍然没有出现共轭双键含量上升的现象。而H、F1和F2组分也具有一定的抑制低密度脂蛋白氧化的能力，可以使低密度脂蛋白氧化时间延长400min以上。

经模拟胃肠消化及Caco-2细胞吸收后，相对于对照组，阳性对照GSH的吸收物(GSH-B)在Cu2+诱导的LDL氧化体系中，对LDL的氧化没有表现出延缓或者抑制作用，反而表现出了强烈的促进作用。未经分离的水解物(H-GI-B)和酪蛋白(CN-GI-B)经胃肠消化和Caco-2细胞转运吸收后的产物抑制LDL氧化的能力较弱。F1和F2组分经胃肠消化和Caco-2细胞转运吸收后的产物具有一定的抑制LDL氧化的能力，但其抑制能力较低，延滞时间为110-140min，而F3和F4组分经胃肠消化和Caco-2细胞转运吸收后的产物。可使LDL的氧化时间延长250min以上。说明偏碱性的组分具有较强的抑制LDL氧化的能力。

抗氧化肽碱性组分抑制LDL氧化(细胞方法)

实验例5

采用巨噬细胞RAW264.7模型研究抗氧化肽碱性组分F3和F4混合物在细胞水平上抑制LDL氧化的效果，计算其中丙二醛(MDA)的含量，

结果见表5。

表5酪蛋白抗氧化肽抑制LDL氧化-丙二醛含量的测定

经计算：不加酪蛋白的空白组中MDA含量为：90.67nmol/mgpro，加酪蛋白抗氧化肽样品的实验组中MDA的含量为：0.518nmol/mgpro，说明抗氧化肽碱性组分能够抑制LDL氧化，减少丙二醛生成。

抗氧化肽的质谱鉴定

实验例6

将上述实例中具有较好的细胞抗氧化活性和抑制LDL氧化的偏碱性组分的胃肠消化物和Caco-2细胞吸收物分别进行质谱鉴定，鉴定其中在吸收前后肽序列不改变的肽段，通过比对，在消化物和吸收物中同时出现肽的序列，即为耐消化肽，F3和F4中鉴定出的耐消化肽结果见表6。

表6.经质谱鉴定酪蛋白碱性组分中耐消化肽序列

耐消化肽的合成以及耐消化性和抑制LDL氧化活性的验证

实验例7从上述鉴定出的耐消化肽中挑选出其中三条(MPFPK、KEMPFPK、KNQDKTEIPT)进行固相合成(多肽合成单位为任一家具有相应能力公司)，合成肽的纯度为＞90％，然后利用此合成的三条肽验证其耐消化性和抑制LDL氧化能力，合成肽耐消化性的验证采用液相检测，条件如下：

色谱柱：ZORBAXSB-C18(250×4.6mm)

流动相：A相为含0.1％三氟乙酸的超纯水，B相为含0.1％三氟乙酸的80％的乙腈，洗脱条件0-35min，B5％-30％；35-45min，B30％-100％；45-50min，B100％

流速：1.0mL/min，检测波长：220nm，进样量：10μL。

测定结果见图2和表7

表7.合成肽抑制LDL氧化的结果

三条合成肽吸收前后的液相谱图基本一致，没有新的色谱峰生成，表明鉴定的耐消化肽确实能够耐受胃肠的消化和吸收而不被降解。合成肽抑制LDL氧化的结果表明，与空白组比较，合成肽的延滞时间都有显著性差异(P＜0.01)，能够显著抑制LDL的氧化。因此，可以判定供试样品具有较好的胃肠耐受性，同时具有较强的抑制LDL氧化的能力。

本说明书中未做详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

以上所述实施方式，只是本发明的较佳实施方式，并非来限制本发明实施范围，故凡依本发明申请专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括本发明专利申请范围内。

Claims

1.一种源自酪蛋白的富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物，其特征在于：该抗氧化肽混合物为KEMPFPK、RGPFPIIV、VYPFPGPIHN、TEDELQDKIHP、KAVPYPQRDMPIQ、VYPFPGPIHNSLPQ、QPHQPLPPTVMFPPQ、HQPHQPLPPTVMFPPQ、MHQPHQPLPPTVMFPPQ、KNQDKTEIPT、HQPHQPLPPT、MHQPHQPLPPT、HQPHQPLPPTVM、NLHLPLPL、LHLPLPL和MPFPK氨基酸序列中的至少一种。

2.如权利要求1所述的富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、将酪蛋白浸泡于水中，制得酪蛋白样品溶液；

b、向步骤a中所制得的酪蛋白样品液中加入蛋白酶进行水解，水解结束后进行酶的钝化处理，制得富含抗氧化肽的水解液；

3.如权利要求2所述的富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于：步骤a中酪蛋白样品液的制备方法为将酪蛋白浸泡于pH为2.0～8.0的水中，然后在30～60℃的水浴中预热10～15min；其中，所述酪蛋白与水的比例为1g∶10～20mL。

4.如权利要求2所述的富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于：步骤b中，所述蛋白酶与所述酪蛋白的质量比为1∶20～100。

5.如权利要求2所述的富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于：步骤b中所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰液素、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶或地衣芽孢杆菌蛋白酶。

6.如权利要求2所述的富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于：步骤b中酶的钝化方法为将所述富含抗氧化肽的水解液加热至85～100℃，并维持10～20min，即完成酶的钝化过程，同时也起到杀灭微生物的作用。

7.如权利要求2所述的富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于，步骤(c)所述酪蛋白水解液真空浓缩的温度为40～60℃。

8.如权利要求2所述的富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于，步骤d中酪蛋白抗氧化肽的分离纯化方法，采用离子交换色谱柱法。包括以下步骤：

9.如权利要求8所述的富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于：步骤(III)中，离子交换柱洗脱程序前半部分的洗脱液为缓冲液；后半部分洗脱液为缓冲液+0.5～1M的氯化钠。

10.如权利要求8所述的富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物的制备方法，其特征在于，将步骤(III)中收集的富含碱性氨基酸的抗氧化肽组分，进行如下后处理：采用0.5～1.5M的氢氧化钠溶液将收集组分的pH调节为6.5～7.0，将调节pH后的收集组分真空浓缩至干物质含量为15～40％，接着用填料为SephadexG15柱层析或D-SaltExcellulosePlasticDesalting柱进行脱盐处理，然后对脱盐后的抗氧化肽溶液进行真空浓缩，将所述浓缩液进行喷雾或冷冻干燥，得到富含碱性氨基酸的酪蛋白抗氧化肽。

11.如权利要求1所述的富含碱性氨基酸的抗氧化肽混合物在保健食品和预防动脉粥样硬化的药物领域中的应用。