WO2022186290A1 - ジペプチジルペプチダーゼ－ｉｖ阻害剤 - Google Patents

ジペプチジルペプチダーゼ－ｉｖ阻害剤 Download PDF

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WO2022186290A1
WO2022186290A1 PCT/JP2022/008940 JP2022008940W WO2022186290A1 WO 2022186290 A1 WO2022186290 A1 WO 2022186290A1 JP 2022008940 W JP2022008940 W JP 2022008940W WO 2022186290 A1 WO2022186290 A1 WO 2022186290A1
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pro
dpp
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oligopeptide
present
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昌樹 栗本
小百合 新井
美奈 大河内
祐圭 田中
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森永乳業株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to novel peptides having dipeptidyl peptidase-IV inhibitory activity.
  • Dipeptidyl peptidase-IV (hereinafter also referred to as “DPP-IV”) is a multifunctional transmembrane glycoprotein having N-terminal dipeptidase activity. DPP-IV is present on cells of various tissues such as liver, kidney, small intestine, salivary glands, blood cells and plasma of most mammals. DPP-IV is assumed to play various roles in vivo, one of which is the incretin glucagon-like peptide-1 (Glucagon-like peptide-1: hereinafter referred to as "GLP-1”) and It is known to be a degrading enzyme of glucose-dependent insulinotropic polypeptide (hereinafter referred to as "GIP").
  • GLP-1 glucose-dependent insulinotropic polypeptide
  • GLP-1 is released postprandially and is responsible for glucose-induced stimulation of insulin biosynthesis and secretion, suppression of glucagon secretion, modulation of gene expression, nutritional effects on beta cells, suppression of food intake, and It has multiple effects, including slowing gastric emptying.
  • GIP is also released after meals, and has the effect of promoting insulin secretion from the pancreas in a blood sugar level-dependent manner. Inhibition of DPP-IV suppresses the degradation of GLP-1 and GIP and increases the levels of these incretins in the blood. As a result, it is known that insulin secretion is promoted and the blood sugar level is lowered.
  • DPP-IV inhibitors which have the effect of inhibiting DPP-IV activity, are expected as active ingredients of new types of antidiabetic drugs, and multiple drugs have already been marketed.
  • further searches for possible DPP-IV inhibitors are also ongoing (Patent Document 1, etc.).
  • An object of the present invention is to provide peptides with excellent DPP-IV inhibitory activity.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and found that an oligopeptide containing a specific amino acid sequence derived from milk protein has a high DPP-IV inhibitory activity. Completed.
  • a first aspect of the present invention is an oligopeptide comprising any one of the sequences (a) to (g) below.
  • (a) Leu-Pro-Val (b) Ile-Pro-Thr (c) Pro-Pro-Gln (d) Ala-Pro-Phe (e) Pro-Pro-Leu (f) Pro-Pro-Phe (g) Ala-Pro-Ser
  • the oligopeptide preferably comprises (h) Leu-Pro-Val-Pro.
  • a second aspect of the present invention is a DPP-IV containing, as an active ingredient, one or more oligopeptides selected from oligopeptides containing any of the sequences (a) to (h) above.
  • the oligopeptide may be contained in the agent in the form of a milk protein hydrolyzate. That is, in other words, this aspect contains a milk protein hydrolyzate containing one or more oligopeptides selected from oligopeptides containing any of the sequences described in (a) to (h), It is a DPP-IV inhibitor.
  • the DPP-IV inhibitor is preferably included in a pharmaceutical composition.
  • a third aspect of the present invention is a postprandial blood glucose level containing, as an active ingredient, one or more oligopeptides selected from oligopeptides containing any of the sequences (a) to (h) above. It is a rise suppression composition.
  • the oligopeptide may be included in the composition in the form of a milk protein hydrolyzate. That is, in other words, this aspect contains a milk protein hydrolyzate containing one or more oligopeptides selected from oligopeptides containing any of the sequences described in (a) to (h), It is a composition for suppressing postprandial blood glucose level elevation.
  • the composition for suppressing an increase in postprandial blood glucose level is preferably a food or drink.
  • the oligopeptide of the present invention has an excellent DPP-IV inhibitory activity, it is preferably contained in a pharmaceutical composition as a DPP-IV inhibitor, or used as a composition for suppressing postprandial blood glucose level elevation in the form of food or drink. be able to.
  • a first aspect of the present invention is an oligopeptide comprising any one of the sequences (a) to (g) below (hereinafter also referred to as "the oligopeptide of the present invention”).
  • the oligopeptide of the present invention (a) Leu-Pro-Val (b) Ile-Pro-Thr (c) Pro-Pro-Gln (d) Ala-Pro-Phe (e) Pro-Pro-Leu (f) Pro-Pro-Phe (g) Ala-Pro-Ser
  • Leu (L) is a leucine residue
  • Pro (P) is a proline residue
  • Val (V) is a valine residue
  • Ile (I) isoleucine residue
  • Thr (T) is a threonine residue.
  • Gln (Q) is a glutamine residue
  • Ala (A) is an alanine residue
  • Phe (F) is a phenylalanine residue
  • Ser (S) is a serine residue.
  • Any amino acid is preferably an L-form amino acid.
  • the oligopeptide of the present invention is not particularly limited as long as it contains any of the sequences described in (a) to (g), and any amino acid residue is added to the N-terminus and/or C-terminus of the above sequence. It's okay.
  • an oligopeptide containing the sequence (a) Leu-Pro-Val preferably includes an oligopeptide containing the sequence (h) Leu-Pro-Val-Pro.
  • the oligopeptide preferably has 3 to 10 amino acid residues, more preferably 3 to 7 residues, even more preferably 3 to 4 residues.
  • the oligopeptide of the present invention includes a tripeptide consisting of any one of the sequences (a) to (g) below (hereinafter also referred to as “tripeptide of the present invention"), and (h) below.
  • a tetrapeptide consisting of the sequence of (hereinafter also referred to as “the tetrapeptide of the present invention”) is particularly preferred.
  • An oligopeptide containing any of the sequences described in (a) to (h) may be in the form of its salt.
  • salts include alkali metals such as potassium and sodium; alkaline earth metals such as calcium and magnesium;
  • the oligopeptide of the present invention can be obtained, for example, by (1) decomposing a desired protein or peptide containing any of the amino acid sequences described in (a) to (h) with a hydrolase or the like, and from the resulting decomposition product (2) a method of synthesizing the oligopeptide of the present invention by a peptide synthesis method and then separating and purifying the desired oligopeptide of the present invention from the resulting crude synthesis; (3) It can be obtained by a method of extracting from plants, animals or microorganisms producing the oligopeptide of the present invention, and separating and purifying the resulting extract.
  • the methods (1) and (2) will be specifically described below.
  • the oligopeptide of the present invention is obtained by hydrolyzing a desired protein or peptide containing any of the amino acid sequences described in (a) to (h) with a protein hydrolase, an acid, an alkali, or the like.
  • the oligopeptide of the present invention can be obtained by separating and purifying the resulting hydrolyzate.
  • raw materials containing proteins and peptides include proteins derived from milk, soybeans, eggs, wheat, barley, rice, potatoes, sweet potatoes, peas, corn, livestock meat, fish meat, seafood, and the like.
  • the milk protein casein is particularly preferred.
  • a method for obtaining the oligopeptide of the present invention by treatment with a hydrolase will be described below using casein as a starting material.
  • a casein protein is a protein containing the oligopeptide of the invention in its primary structure, and capable of producing the oligopeptide of the invention when digested with an appropriate hydrolase.
  • the starting protein is dispersed in water or warm water and dissolved to prepare an aqueous protein solution.
  • concentration of the aqueous protein solution is not particularly limited, it is usually preferable to set the protein concentration to a concentration range of 2% by mass or more, more preferably 5 to 15% by mass.
  • the aqueous protein solution is subjected to an ion exchange method using a sodium-type or potassium-type cation exchange resin (preferably a strongly acidic cation exchange resin), an electrodialysis method, an ultrafiltration membrane method, a loose reverse osmosis membrane method, or the like. It is preferable to desalt and appropriately adjust the pH and calcium concentration. For desalting, either a column system or a batch system may be employed. Moreover, you may heat-sterilize protein aqueous solution suitably before desalting.
  • a sodium-type or potassium-type cation exchange resin preferably a strongly acidic cation exchange resin
  • the aqueous protein solution is hydrolyzed.
  • the hydrolysis treatment include enzymatic treatment, acid treatment, alkali treatment, heat treatment, and the like, and two or more of these treatments may be combined as appropriate.
  • plant-derived, animal-derived, or microbial-derived proteolytic enzymes can be used, and one or two or more of these can be used in combination.
  • An endoprotease is suitable as the proteolytic enzyme.
  • the endoprotease include serine protease, metalloprotease, cysteine protease, and aspartic protease, and one or more of these can be selected and used. Among these, it is preferable to use serine protease and/or metalloprotease.
  • Proteases are also classified into alkaline proteases, neutral proteases and acid proteases. Of these, it is preferable to use neutral protease.
  • a commercially available product can be used as the proteolytic enzyme.
  • the protease include Bioprase (manufactured by Nagase Chemtex), Proleather (manufactured by Amano Enzymes), Protease S (manufactured by Amano Enzymes), PTN6.0S (manufactured by Novozymes), Savinase (manufactured by Novozymes). , GODO B. A. P (manufactured by Godo Shusei), Protease N (manufactured by Amano Enzyme), GODO B. N.
  • P (manufactured by Godo Shusei), Neutrase (manufactured by Novozymes), Alcalase (manufactured by Novozymes), Trypsin (manufactured by Novozymes), Chymotrypsin (manufactured by Novozymes), Subtilisin (manufactured by Novozymes), Papain (manufactured by Amano Enzymes) ), bromelain (manufactured by Amano Enzyme), etc., and one or more of these enzymes may be selected and used.
  • subtilisin e.g., bioprase
  • trypsin e.g., PTN6.0S
  • bacillolysin e.g., protease N
  • the amount of endoprotease used for the protein is not particularly limited, and may be appropriately adjusted depending on the substrate concentration, enzyme titer, reaction temperature, reaction time, etc., but generally, 2 per 1 g of protein in the protein. ,000 to 11,000 activity units.
  • a desired peptide can be obtained by appropriately adjusting the hydrolysis conditions of the protease.
  • the pH of the raw protein solution can be adjusted to the optimum pH for the enzyme used by using salts such as potassium carbonate and sodium hydroxide that can be used in foods.
  • the pH of the raw protein solution is preferably adjusted to 5-10, more preferably 7-10.
  • the reaction temperature of the protease is desirably within the optimum temperature range for the enzyme used, preferably 30 to 60°C, more preferably 40 to 60°C.
  • the reaction retention time of the proteolytic enzyme is, while monitoring the decomposition rate of the enzymatic reaction, the reaction may be continued until the desired decomposition rate is reached, for example, 0.5 to 24 hours. 15 hours, more preferably 3 to 10 hours.
  • the decomposition rate is preferably 20 to 30%.
  • the method for calculating the decomposition rate of the raw material protein is to measure the total nitrogen content of the sample by the Kjeldahl method (edited by the Japan Food Industry Society, “Food Analysis Method", p. 102, Korin Co., Ltd., 1984).
  • the hydrolysis by the protease may be terminated by heating the enzyme to deactivate it.
  • the heating temperature and holding time of the heat-inactivation treatment can be appropriately set in consideration of the thermal stability of the enzyme used so as to sufficiently inactivate the enzyme. For example, when inactivating at 100° C. or higher (preferably 110 to 130° C.), it is preferably performed for 1 to 3 seconds. .
  • As a method of heat treatment either a batch method or a continuous method can be used.
  • a continuous method a plate heat exchange method, an infusion method, an injection method, or the like can be used.
  • the heat deactivation treatment can be used in combination with the sterilization treatment of the hydrolyzate, and a conventional heat treatment method or the like can be used.
  • the pH of the decomposed solution is adjusted to preferably 6 to 8, more preferably 7.0 ⁇ 0.5, still more preferably 7.0 ⁇ 0.3, if necessary.
  • the resulting hydrolyzate when a solution with unadjusted calcium concentration is hydrolyzed, the resulting hydrolyzate may be desalted as described above to adjust the calcium concentration. good.
  • the enzyme is then deactivated by heating in a conventional manner.
  • the reaction heating temperature and the reaction retention time can be appropriately set so as to sufficiently inactivate the enzyme by considering the thermal stability of the enzyme used. After heat deactivation, it can be cooled by a conventional method and used as it is, or if necessary, it can be concentrated to obtain a concentrate, and the concentrate can be dried to obtain a powder product.
  • the pH of the aqueous protein solution may be adjusted.
  • the pH of the aqueous protein solution is preferably pH 5 or less or pH 9 or more, more preferably pH 4 or less or pH 10 or more.
  • the pH-treated aqueous solution is allowed to stand or stirred at room temperature for several minutes or more, preferably 5 minutes to 1 hour, to obtain an acid- or alkali-treated hydrolyzate.
  • room temperature is about 4 to 40°C, preferably 10 to 30°C.
  • the aqueous protein solution may be pH-unadjusted, or may be pH-adjusted (specifically, acidic (pH 5 or less), neutral (pH 6-8), alkaline (pH 8 or higher)).
  • the heat treatment may be performed at a temperature of about 4 to 100° C. under the same conditions as the above acid-alkali treatment.
  • the content of the oligopeptide of the present invention in the protein hydrolyzate is not particularly limited, but the lower limit is preferably 0.001% by mass or more from the viewpoint of better exhibiting the efficacy of the present invention. .005% by mass or more, more preferably 0.01% by mass or more, and the upper limit thereof is preferably 1% by mass or less, more preferably 0, from the viewpoint of the production efficiency of the decomposed product of the present invention. 0.5% by mass or less, more preferably 0.4% by mass or less, and even more preferably 0.3% by mass or less.
  • the target peptide content can be measured by the following method.
  • several solution solutions of a chemically synthesized standard peptide (manufactured by Peptide Institute) of the peptide to be measured are prepared for each concentration, and LC/MS analysis is performed under the following measurement conditions to create a calibration curve.
  • the peaks in the analysis of the powder solution those having the same molecular weight and retention time as the standard peptide are identified as having the same sequence as the standard peptide.
  • the peak area of the standard peptide and the peak area of the sample powder the content of the target peptide in the powder solution is determined.
  • Target peptide content (mg/1 g of casein hydrolyzate) [measured value of target peptide in obtained casein hydrolyzate (mg)]/[mass of obtained casein hydrolyzate (g)] [Measured value of target peptide in obtained casein hydrolyzate (mg)] is the measured value of the target peptide in the sample by the following “LC/MS”.
  • the resulting protein hydrolyzate can exhibit efficacy even when used in an unpurified state. That is, a protein hydrolyzate, preferably a milk protein hydrolyzate, may be ingested or administered in the form of a food, drink or pharmaceutical composition described below. Further, the obtained protein hydrolyzate may be appropriately subjected to known separation and purification. For example, the obtained protein hydrolyzate is subjected to molecular weight fractionation to obtain a protein hydrolyzate containing a fraction corresponding to the molecular weight of the oligopeptide of the present invention. The fraction containing the target substance can be determined using the DPP-IV inhibitory activity described below as an index.
  • the separated and purified peptide fractions can be subjected to peptide identification by mass spectrometry for the purpose of confirming whether the oligopeptide of the present invention is contained.
  • the oligopeptide of the present invention thus obtained can be used as a peptide solution, or if necessary, the solution can be used as a concentrated solution by a known method. Alternatively, the concentrate can be dried by a known method and used as a powder.
  • the oligopeptide of the present invention can be produced by chemical synthesis or biosynthesis.
  • Peptide chemical synthesis can be carried out by a liquid-phase method or a solid-phase method commonly used for oligopeptide synthesis.
  • the synthesized peptide is deprotected, if necessary, and unreacted reagents, by-products, etc. are removed to isolate the oligopeptide of the present invention.
  • Synthesis of such peptides can be performed using a commercially available peptide synthesizer.
  • Peptide biosynthesis can be carried out by conventional methods such as introducing a peptide expression vector into a host organism to produce and secrete the peptide. The fact that the desired peptide was obtained can be confirmed by using the DPP-IV inhibitory activity described below as an index.
  • the oligopeptide of the present invention has an inhibitory effect on DPP-IV activity.
  • DPP-IV inhibitory activity means that the DPP-IV activity in the presence of the oligopeptide of the present invention is smaller than the activity in the absence thereof, and the inhibition rate under the same conditions is preferably 10%. Above, more preferably 30% or more, still more preferably 50% or more. It also means that the 50% inhibitory concentration (IC 50 ) of the enzyme is preferably 1000 ⁇ M or less, more preferably 500 ⁇ M or less, and still more preferably 100 ⁇ M or less.
  • IC 50 50% inhibitory concentration
  • the oligopeptide of the present invention can be preferably contained as an active ingredient of a DPP-IV inhibitor.
  • the oligopeptide of the present invention may be contained in the agent in the form of a milk protein hydrolyzate, in other words, the milk protein hydrolyzate containing one or more oligopeptides of the present invention is DPP- It can be preferably contained as an active ingredient of an IV inhibitor.
  • DPP-IV may cause various diseases and symptoms by degrading substances involved in in vivo physiological functions. For this reason, when DPP-IV is inhibited, the decomposition of substances involved in physiological functions in the body, which are normally decomposed by DPP-IV, is suppressed and the life span is extended. Diseases and symptoms can be prevented, improved or treated. Substances involved in the physiological functions include, for example, incretins such as GLP-1 and GIP. By inhibiting the degradation of GLP-1, glucose-induced stimulation of insulin biosynthesis and secretion, inhibition of glucagon secretion, modulation of gene expression, trophic effects on beta cells, inhibition of food intake, and gastric emptying. slowing down Inhibition of GIP degradation also acts as a glucose-induced stimulation of insulin secretion from the pancreas. These can contribute to the normalization of elevated blood sugar levels and the improvement and regulation of hunger and body weight.
  • DPP-IV reduces the function of vascular endothelial cells or damages vascular endothelial cells. Due to the functional deterioration and disorder of the endothelial cells of the blood vessels, vascular disorders such as vasoconstriction, arteriosclerosis, and thrombus formation occur due to increased vascular tone. complications will be induced. In recent years, there have been many reports that the administration of DPP-IV inhibitors improves the function of endothelial cells (for example, Endocrine Journal 2011, 58 (1), 69-73, J Am Coll Cardiol. 2012, 59 (3), 265-76, Diabetes Care. 2011, 34(9), 2072-7, Cardiovascular Diabetology 2011, 10(85), etc.).
  • Such an endothelial cell function-improving effect is thought to be mediated by the vascular protective action of incretins, in addition to improvement simply by lowering blood sugar levels.
  • hyperglycemia reduces the function of endothelial cells and the flexibility of blood vessels is lost, blood pressure rises, and the increased blood pressure further damages blood vessels, creating a vicious cycle that adversely affects organs such as the heart, kidneys, and brain. appear. Therefore, DPP-IV inhibitors are considered to play an important role also in the treatment of the cardiovascular system.
  • the oligopeptide of the present invention and the milk protein hydrolyzate containing one or more oligopeptides of the present invention, and the DPP-IV inhibitor of the present invention containing these have DPP-IV inhibitory activity
  • a blood sugar level elevation suppressing action hyperglycemia improving action, vascular endothelial dysfunction suppressing action, vascular endothelial disorder suppressing action, vascular disorder suppressing action, vascular endothelial cell protecting action, appetite suppressing action, etc.
  • blood sugar level elevation suppression includes the meaning of lowering the blood sugar level, but particularly means “being able to lower the blood sugar level that has risen above the normal level or above the necessary level”. .
  • the diagnostic criteria of the Japan Diabetes Society should be referred to for determining the normal blood sugar level.
  • An increase in blood sugar level may refer to an increase that occurs after a meal.
  • the oligopeptide of the present invention and the DPP-IV inhibitor of the present invention containing it have DPP-IV inhibitory activity, so that it is possible to prevent, improve or treat diseases and symptoms caused by DPP-IV. Conceivable. Therefore, the oligopeptide of the present invention and the DPP-IV inhibitor of the present invention containing it are ingested or administered to animals including humans to prevent, improve and/or improve diseases and symptoms caused by DPP-IV. It can be used in methods for therapeutic purposes.
  • the prevention of a disease, symptom, etc. means to prevent the occurrence of a disease or symptom, etc., to delay the occurrence, and to prevent the occurrence of the disease or symptom, etc. Including risk reduction.
  • the subject (administrator) to whom the oligopeptide of the present invention is administered (administered person) and the subject to be ingested (consumer) are not particularly limited as long as they are animals, but are usually humans. Also, it may be an adult, a child, an infant, a newborn, or the like. Moreover, sex is not specifically limited.
  • Another aspect of the present invention is the use of the oligopeptides of the present invention in the manufacture of DPP-IV inhibitors or compositions for the prevention, amelioration and/or treatment of diseases or conditions caused by DPP-IV. .
  • Another aspect of the invention is the use of the oligopeptides of the invention in DPP-IV inhibition or prevention, amelioration and/or treatment of diseases or conditions caused by DPP-IV.
  • Another aspect of the invention is the oligopeptides of the invention for use in DPP-IV inhibition or prevention, amelioration and/or treatment of diseases or conditions caused by DPP-IV.
  • Another aspect of the present invention is a method of inhibiting DPP-IV or preventing, ameliorating and/or treating a disease or condition caused by DPP-IV comprising administering an oligopeptide of the present invention to an animal. be.
  • administering the oligopeptide of the present invention to an animal may be synonymous with “giving the animal ingestion of the oligopeptide of the present invention.”
  • the intake may be voluntary (free intake) or forced (forced intake).
  • the administration step may be, for example, a step of mixing the oligopeptide of the present invention with food, drink or feed and supplying it to a subject, thereby allowing the subject to freely ingest the oligopeptide of the present invention. good.
  • the timing of ingestion (administration) of the oligopeptide of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the condition of the subject to be administered.
  • the intake (administration) amount of the oligopeptide of the present invention is appropriately selected depending on the age, sex, condition, other conditions, etc. of the intake (administration) target.
  • the intake (administration) amount of the oligopeptide of the present invention is preferably in the range of 1 ⁇ g/day to 10 mg/day for adults, and 5 ⁇ g/day to 5 ⁇ g/day, as the intake amount of each oligopeptide of the present invention. A range of 5 mg/day is more preferred.
  • the oligopeptide of the present invention can be administered once a day or in multiple doses, regardless of the amount and duration of intake (administration).
  • the period of ingestion (administration) of the oligopeptide of the present invention is not particularly limited, but the effect is likely to be obtained when it is preferably 12 weeks or longer, more preferably 24 weeks or longer.
  • the route of intake (administration) of the oligopeptide of the present invention may be either oral or parenteral, but oral is preferred.
  • parenteral intake (administration) includes percutaneous, intravenous, rectal administration, inhalation, and the like.
  • the DPP-IV inhibitor of the present invention can be suitably used for the prevention, amelioration, or treatment of diseases or symptoms caused by DPP-IV as described above, it is preferably contained in a pharmaceutical composition. That is, a pharmaceutical composition for prevention, amelioration or treatment of diseases or symptoms caused by DPP-IV is also an aspect of the present invention.
  • Diseases and symptoms caused by DPP-IV include, but are not limited to, hyperglycemia, diabetes, diabetic complications, vascular endothelial disorders, and vascular disorders. Diabetes preferably includes type 2 diabetes, and more preferably includes type 2 diabetes due to hyposecretion of insulin. Diseases and symptoms caused by DPP-IV may be directly related to DPP-IV or indirectly related to DPP-IV.
  • hyperglycemia diabetes and various diseases and conditions caused by hyperglycemia can also be targeted by the pharmaceutical composition of the present invention.
  • diseases and symptoms include, for example, diabetic microangiopathy (e.g., retinopathy, nephropathy, neuropathy, etc.) and macrovascular complications (e.g., ischemic heart disease such as angina pectoris and myocardial infarction, cerebral infarction, arteriosclerosis obliterans, gangrene, etc.).
  • diabetic microangiopathy e.g., retinopathy, nephropathy, neuropathy, etc.
  • macrovascular complications e.g., ischemic heart disease such as angina pectoris and myocardial infarction, cerebral infarction, arteriosclerosis obliterans, gangrene, etc.
  • the administration route of the pharmaceutical composition may be oral or parenteral, but oral is preferred.
  • parenteral intake includes percutaneous, intravenous, rectal administration, inhalation, and the like.
  • the form of the pharmaceutical composition it can be appropriately formulated into a desired dosage form depending on the administration method.
  • solid preparations such as powders, granules, tablets and capsules; and liquid preparations such as solutions, syrups, suspensions and emulsions can be formulated.
  • parenteral administration it can be formulated into suppositories, ointments, injections, and the like.
  • ingredients such as excipients, pH adjusters, colorants, and corrigents that are commonly used for formulation can be used.
  • other pharmaceutical ingredients such as other medicinal ingredients and ingredients capable of preventing, ameliorating and/or treating diseases or symptoms caused by DPP-IV that are known or discovered in the future.
  • other peptides may coexist as long as they do not interfere with the effects of the present invention.
  • formulation can be appropriately carried out by a known method depending on the dosage form.
  • a carrier that is usually used for formulation may be blended as appropriate to form the formulation.
  • Such carriers include excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents and the like.
  • Excipients include, for example, sugar derivatives such as lactose, sucrose, glucose, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as corn starch, potato starch, ⁇ -starch, dextrin, carboxymethyl starch; crystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, carboxymethylcellulose, cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose calcium; gum arabic; dextran; pullulan; silicate derivatives such as light silicic anhydride, synthetic aluminum silicate, and magnesium aluminometasilicate; phosphate derivatives such as calcium phosphate; carbonate derivatives such as calcium; sulfate derivatives such as calcium sulfate;
  • binders examples include gelatin; polyvinylpyrrolidone; macrogol, etc., in addition to the above excipients.
  • disintegrants include, in addition to the above excipients, chemically modified starch or cellulose derivatives such as croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium, and crosslinked polyvinylpyrrolidone.
  • Lubricants include, for example, talc; stearic acid; metal stearates such as calcium stearate and magnesium stearate; colloidal silica; waxes such as pea gum and gairou; ; carboxylic acid sodium salts such as sodium benzoate; sulfates such as sodium sulfate; leucine; lauryl sulfates such as sodium lauryl sulfate and magnesium lauryl sulfate; silicic acid anhydride and silicic acid hydrate; be done.
  • stabilizers include paraoxybenzoic acid esters such as methylparaben and propylparaben; alcohols such as chlorobutanol, benzyl alcohol and phenylethyl alcohol; benzalkonium chloride; acetic anhydride; and sorbic acid.
  • Flavoring agents include, for example, sweeteners, acidulants, flavoring agents, and the like.
  • solvents such as water and the like can be used as carriers for liquid formulations for oral administration.
  • the timing of ingesting the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, such as before meals, after meals, between meals, and before bedtime, but preferably before meals.
  • the oligopeptide of the present invention is used as a composition to be orally ingested, it is preferably in the form of a food or drink.
  • the oligopeptide of the present invention having DPP-IV inhibitory activity as described above, has a blood glucose level elevation suppressing action, a hyperglycemia improving action, a vascular endothelial dysfunction suppressing action, a vascular endothelial disorder suppressing action, an angiopathy suppressing action, Since it exhibits a protective effect on vascular endothelial cells, an appetite-suppressing effect, and the like, it can be used in the form of a composition intended for these effects.
  • a particularly preferred embodiment is a composition for suppressing an increase in postprandial blood glucose level.
  • the oligopeptide of the present invention can be embodied as a food or drink without any particular limitation on its use. In addition, it can be food and drink for use in the various actions described above, and particularly preferably food and drink for suppressing postprandial blood glucose level elevation.
  • the form and properties are not particularly limited as long as they can be taken orally without impairing the effects of the present invention. can be manufactured by a normal method.
  • feed can also be set as feed as one aspect
  • the feed include pet food, livestock feed, fish feed, and the like.
  • the form of the feed is not particularly limited, and in addition to the oligopeptide of the present invention, for example, grains such as corn, wheat, barley, rye, and milo; vegetable oil cakes such as soybean meal, rapeseed meal, coconut oil meal, and linseed meal.
  • Bran such as wheat bran, wheat bran, rice bran, and defatted rice bran; Manufacturing lees such as corn gluten meal and corn jam meal; Animal feeds such as fish meal, skim milk powder, whey, yellow grease, and tallow; Torula yeast, beer Yeast such as yeast; mineral feed such as tribasic calcium phosphate and calcium carbonate; oils and fats; simple amino acids;
  • the oligopeptide of the present invention is in the form of a food or drink (including feed), food and drink labeled with uses such as improvement of diseases and symptoms caused by DPP-IV, prevention of brain function deterioration, prevention of memory deterioration, etc. It can be offered and sold as a product. Moreover, the oligopeptide of the present invention according to the present specification can be used for producing these foods and drinks.
  • Such "display” acts include all acts for informing consumers of the above-mentioned use. Regardless of the object, medium, etc. to be displayed, all of them fall under the act of "display” in the present invention.
  • the "display” be performed in an expression that allows the consumer to directly recognize the use. Specifically, the act of transferring, handing over, displaying for the purpose of transfer or delivery, importing products related to food and beverages or product packaging that describes the above-mentioned use, advertisements related to products, price lists or transaction documents Examples include the act of displaying or distributing information with the above-mentioned use described, or providing information containing such information with the above-mentioned use by electromagnetic means (Internet, etc.).
  • the content of the display is a display approved by the government (for example, a display that is approved based on various systems established by the government and performed in a manner based on such approval).
  • a display that is approved based on various systems established by the government and performed in a manner based on such approval it is preferable to attach such display contents to packaging, containers, catalogs, pamphlets, POP and other advertising materials at sales sites, other documents, and the like.
  • labeling includes health food, functional food, enteral nutrition food, food for special dietary use, food with health claims, food for specified health use, food with nutrient function claims, food with function claims, quasi-drugs, etc. Display is also included.
  • the labeling approved by the Consumer Affairs Agency for example, the labeling approved by the system related to food for specified health use, food with nutrient function claims, or food with function claims, or similar system.
  • labeling as a food for specified health use labeling as a food for specified health use with certain conditions, labeling to the effect that it affects the structure and function of the body, labeling to reduce the risk of disease, labeling for functionality based on scientific evidence.
  • Such indications include, for example, “slowing rise in postprandial blood sugar level”, “suppressing postprandial rise in blood sugar level”, “for those concerned about postprandial blood sugar level”, and “lowering high blood sugar level”.
  • Example 1 Evaluation of DPP-IV inhibitory activity of each peptide 904 kinds of tripeptides derived from milk protein amino acid sequences were organically synthesized, and the DPP-IV inhibitory activity of each peptide was evaluated.
  • DPP-IV inhibitory activity was measured according to the method of Uchida et al. (Uchida, M. et al., J. Pharmacol. Sci. 117, 63-66, 2011). Specifically, liquid control serum I Wako C&C (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as the enzyme (DPP-IV), and Gly-Pro-AMC (manufactured by Enzo Life Sciences) was used as the substrate.
  • Figure 1 shows the ratio of numbers divided by the inhibition rate against DPP-IV for 904 tripeptides. 89% of the peptides had an inhibition rate of less than 20%, 8% had an inhibition rate of 20% or more and less than 50%, and 3% had an inhibition rate of 50% or more. That is, tripeptides with a high DPP-IV inhibition rate were only those with a very small specific amino acid sequence.
  • Example 2 Evaluation of IC 50 of tripeptide having DPP-IV inhibitory activity
  • DPP-IV inhibitory activity was evaluated according to the method of Kato et al. (Kato, T. et al., Biochem. Med. 19, p351, 1978). Specifically, Recombinant human DPPIV (manufactured by Enzo Life Sciences) was used as the enzyme (DPP-IV), and Gly-Pro-AMC (manufactured by Enzo Life Sciences) was used as the substrate.
  • Inhibition rate (%) [1-(Y/X)] x 100%
  • X Fluorescence intensity value of "water + enzyme + substrate”
  • Y Fluorescence intensity value of "test substance (peptide) + enzyme + substrate”
  • Table 1 shows the IC 50 values of tripeptides composed of novel sequences that are not known to have DPP-IV inhibitory activity among the tripeptides evaluated.
  • LPV peptide, IPT peptide, PPQ peptide, APF peptide, PPL peptide, PPF peptide and APS peptide were obtained as novel DPP-IV inhibitory peptides.
  • four types of tripeptides Ile-Pro-Pro, Val-Pro-Pro, Val-Glu-Pro, Val-Ala -Pro), all had IC 50 greater than 1000 ⁇ M and low DPP-IV inhibitory activity.
  • Example 3 IC 50 evaluation of tetrapeptide containing LPV sequence
  • Table 2 shows the IC50 values for the LPVP peptides evaluated.
  • the LPVP peptide is a novel peptide with high DPP-IV inhibitory activity, since it has a lower IC50 value than the LPV peptide.
  • solutions of chemically synthesized standard peptides (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) of various oligopeptides were prepared at concentrations of 0.01, 0.1 and 1.0 ⁇ g/mL to prepare standard solutions for the calibration curve.
  • the above peptide preparation solution and standard solution were quantified by LC/MS analysis under the following measurement conditions.
  • MS2 peaks of the peptide preparation solution those having the same molecular weight and retention time as the standard peptide were identified as having the same sequence as the standard peptide.
  • a quantitative value was calculated by comparing the area value of the MS2 peak with the standard curve.
  • Table 3 shows the measurement results of the amount of the oligopeptide of the present invention contained in each casein hydrolyzate.

Abstract

優れたジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）阻害活性を有するペプチドを提供することを課題とする。以下の（ａ）～（ｈ）に記載のいずれかの配列を含むオリゴペプチド。これらのオリゴペプチドはＤＰＰ－ＩＶ阻害剤の有効成分となり得る。 （ａ）Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ、（ｂ）Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ、（ｃ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ、（ｄ）Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ、（ｅ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ、（ｆ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ、（ｇ）Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ、（ｈ）Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ

Description

ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害剤
　本発明は、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ阻害活性を有する新規ペプチドに関する。
　ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（di-peptidyl peptidase-IV：以下、「ＤＰＰ－ＩＶ」ともいう）は、Ｎ末端ジペプチダーゼ活性を有する多機能性の貫通膜型糖タンパク質である。ＤＰＰ－ＩＶは、大部分の哺乳類の、肝臓、腎臓、小腸、唾液腺、血液細胞及び血漿等の種々の組織の細胞上に存在する。
　ＤＰＰ－ＩＶは生体内での様々な役割が果たすことが想定されており、その１つとしてインクレチンであるグルカゴン様ペプチド１（Glucagon-like peptide-1：以下、「ＧＬＰ－１」という）及びグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（Glucose-dependent insulinotropic polypeptide：以下、「ＧＩＰ」という）の分解酵素であることが知られている。
　ＧＬＰ－１は、食後に放出されるものであり、インスリンの生合成及び分泌に対するグルコース誘導性の刺激、グルカゴン分泌抑制、遺伝子発現の調整、β細胞に対する栄養性の効果、食物摂取の抑制、及び胃内容排出の緩徐化をはじめとする、多面的な作用を有する。ＧＩＰもまた、食後に放出され、血糖濃度依存的に膵臓からのインスリン分泌を促進する作用を有する。
　ＤＰＰ－ＩＶを阻害すると、ＧＬＰ－１及びＧＩＰの分解が抑制され、血中のこれらインクレチン濃度が上昇する。その結果、インスリン分泌が促進され、血糖値を低下させることが知られている。このインクレチンによるインスリン分泌促進の作動条件は血糖値が高いことであるため、２型糖尿病の中でもインスリン分泌低下による糖尿病において、ＤＰＰ－ＩＶを阻害することは、従前のインスリン分泌促進剤で生じる低血糖の副作用が生じにくいと考えられる。
　このように、ＤＰＰ－ＩＶ活性を阻害する作用を有するＤＰＰ－ＩＶ阻害剤は、新しいタイプの糖尿病治療薬の有効成分として期待されており、すでに複数の医薬が上市されている。また、さらなるＤＰＰ－ＩＶ阻害剤となり得る成分の探索も、引き続き行われている（特許文献１等）。
　また、糖尿病治療においては食餌療法と運動療法が第一選択であり、それでも血糖値コントロールが不十分な場合に糖尿病治療薬を用いるのが通常である。かかる状況においては、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性剤をサプリメントや食品添加物等の形態で食餌により摂取することの需要がある。
　そこで、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有し、さらに飲食品として適用し得る成分の探索も種々行われている。例えば、乳タンパク質由来のオリゴペプチドのいくつかについてＤＰＰ－ＩＶ阻害活性が見出されている（特許文献２～５）。特に、カゼイン由来のトリペプチドについてもＤＰＰ－ＩＶ阻害活性が確認されている（特許文献６～７）。
特表２００８－５２７０１１号公報 米国特許出願公開第２００９／００７５９０４号明細書 特許６０２６７２０号 特許４９１５８３３号 国際公開２００６／０６８４８０号 特許１４５３２７０号 特許５８３２０４９号
　本発明は、優れたＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有するペプチドを提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、乳タンパク質に由来する特定のアミノ酸配列を含むオリゴペプチドが、高いＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明の第一の態様は、以下の（ａ）～（ｇ）に記載のいずれかの配列を含むオリゴペプチドである。
　（ａ）Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ
　（ｂ）Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ
　（ｃ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ
　（ｄ）Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ
　（ｅ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ
　（ｆ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ
　（ｇ）Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
　本態様において、オリゴペプチドは好ましくは（ｈ）Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｐｒｏを含む。
　本発明の第二の態様は、前記（ａ）～（ｈ）に記載のいずれかの配列を含むオリゴペプチドから選択される一種又は二種以上のオリゴペプチドを有効成分として含有する、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤である。
　本態様において、前記オリゴペプチドは乳タンパク質加水分解物の態様で剤に含まれていてもよい。すなわち、本態様を言い換えると、前記（ａ）～（ｈ）に記載のいずれかの配列を含むオリゴペプチドから選択される一種又は二種以上のオリゴペプチドを含む乳タンパク質加水分解物を含有する、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤である。
　本態様において、前記ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤は好ましくは医薬組成物に含有させる。
　本発明の第三の態様は、前記（ａ）～（ｈ）に記載のいずれかの配列を含むオリゴペプチドから選択される一種又は二種以上のオリゴペプチドを有効成分として含有する、食後血糖値上昇抑制用組成物である。
　本態様において、前記オリゴペプチドは乳タンパク質加水分解物の態様で組成物に含まれていてもよい。すなわち、本態様を言い換えると、前記（ａ）～（ｈ）に記載のいずれかの配列を含むオリゴペプチドから選択される一種又は二種以上のオリゴペプチドを含む乳タンパク質加水分解物を含有する、食後血糖値上昇抑制用組成物である。
　本態様において、前記食後血糖値上昇抑制用組成物は好ましくは飲食品である。
　本発明のオリゴペプチドは優れたＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有することから、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤として医薬組成物に好適に含有させたり、飲食品などの形態で食後血糖値上昇抑制用組成物とすることができる。
ＤＰＰ－ＩＶに対する阻害率ごとのトリペプチド数の割合を示すグラフ。 カゼイン加水分解物を摂取した被験者の血糖値変化量を示すグラフ（各群ｎ＝２の平均）。
　次に、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。
　本発明の第一の態様は、以下の（ａ）～（ｇ）に記載のいずれかの配列を含むオリゴペプチドである（以下、「本発明のオリゴペプチド」ともいう）。
　（ａ）Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ
　（ｂ）Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ
　（ｃ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ
　（ｄ）Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ
　（ｅ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ
　（ｆ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ
　（ｇ）Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
　ここで、Ｌｅｕ（Ｌ）はロイシン残基を、Ｐｒｏ（Ｐ）はプロリン残基を、Ｖａｌ（Ｖ）はバリン残基を、Ｉｌｅ（Ｉ）イソロイシン残基を、Ｔｈｒ（Ｔ）はスレオニン残基を、Ｇｌｎ（Ｑ）はグルタミン残基を、Ａｌａ（Ａ）はアラニン残基を、Ｐｈｅ（Ｆ）はフェニルアラニン残基を、Ｓｅｒ（Ｓ）はセリン残基を、それぞれ示す。いずれのアミノ酸も、Ｌ－型アミノ酸であることが好ましい。
　本発明のオリゴペプチドは、（ａ）～（ｇ）に記載のいずれかの配列を含む限りにおいて特に限定されず、前記配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸残基が付加したものでもよい。
　例えば、配列（ａ）Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｖａｌを含むオリゴペプチドとしては、配列（ｈ）Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｐｒｏを含むオリゴペプチドを好ましく挙げられる。
　本発明においてオリゴペプチドは、アミノ酸長が３～１０残基のものが好ましく、３～７残基のものがより好ましく、３～４残基のものがさらに好ましい。
　本発明のオリゴペプチドとしては、以下の（ａ）～（ｇ）に記載のいずれかの配列からなるトリペプチド（以下、「本発明のトリペプチド」ともいう）、及び以下の（ｈ）に記載の配列からなるテトラペプチド（以下、「本発明のテトラペプチド」ともいう）が特に好ましい。
　（ａ）Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｖａｌからなるペプチド（「ＬＰＶペプチド」ともいう）
　（ｂ）Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒからなるペプチド（「ＩＰＴペプチド」ともいう）
　（ｃ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎからなるペプチド（「ＰＰＱペプチド」ともいう）
　（ｄ）Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅからなるペプチド（「ＡＰＦペプチド」ともいう）
　（ｅ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕからなるペプチド（「ＰＰＬペプチド」ともいう）
　（ｆ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅからなるペプチド（「ＰＰＦペプチド」ともいう）
　（ｇ）Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒからなるペプチド（「ＡＰＳペプチド」ともいう）
　（ｈ）Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｐｒｏからなるペプチド（「ＬＰＶＰペプチド」ともいう）
　（ａ）～（ｈ）に記載のいずれかの配列を含むオリゴペプチドは、その塩の形態であってもよい。塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム等のアルカリ金属類；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属類等が挙げられる。
　本発明のオリゴペプチドは、例えば、（１）所望の（ａ）～（ｈ）に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質やペプチドを加水分解酵素等にて分解し、得られた分解物から分離精製して得る方法、（２）ペプチドの合成法によって本発明のオリゴペプチドを合成した後、得られた粗合成物から所望の本発明のオリゴペプチドを分離精製して得る方法、（３）本発明に係る本発明のオリゴペプチドを生産する植物、動物又は微生物から抽出し、得られた抽出物から分離精製する方法等により得ることができる。
　以下に（１）及び（２）の方法について具体的に説明する。
（１）加水分解により得る方法
　本発明のオリゴペプチドは、所望の（ａ）～（ｈ）に記載のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質やペプチドをタンパク質加水分解酵素や、酸・アルカリ等により加水分解し、得られた加水分解物から本発明のオリゴペプチドを分離精製して得ることができる。原料となるタンパク質やペプチドを含むものとしては、例えば、乳、大豆、卵、小麦、大麦、米、じゃが芋、さつま芋、えんどう豆、トウモロコシ、畜肉、魚肉、魚介などに由来するタンパク質などが挙げられ、これらのうち乳タンパク質であるカゼインが特に好ましい。
　以下にカゼインを原料として用いる場合を例に挙げて、加水分解酵素による処理によって本発明のオリゴペプチドを得る方法を説明する。
　カゼインタンパク質は、本発明のオリゴペプチドを一次構造中に含むタンパク質であって、適宜加水分解酵素で消化したときに本発明のオリゴペプチドが生成可能なものである。
　まず、酵素で加水分解する前に、原料タンパク質を水又は温湯に分散し、溶解してタンパク質水溶液を調製する。当該タンパク質水溶液の濃度は、特に限定されないが、通常、タンパク質濃度として２質量％以上、さらに好ましくは５～１５質量％程度の濃度範囲に設定するのが好適である。
　さらに、前記タンパク質水溶液を、ナトリウム型又はカリウム型陽イオン交換樹脂（好適には強酸性陽イオン交換樹脂）を用いたイオン交換法、電気透析法、限界ろ過膜法、ルーズ逆浸透膜法等で脱塩し、適宜ｐＨ調整やカルシウム濃度調整を行うのが好適である。脱塩の際には、カラム式やバッチ式の何れを採用してもよい。また、タンパク質水溶液を、脱塩前等に適宜、加熱殺菌をおこなってもよい。
　次いで、前記タンパク質水溶液を、加水分解処理する。当該加水分解処理として、例えば酵素処理、酸処理、アルカリ処理、熱処理等が挙げられ、これらの２種以上の処理を適宜組み合わせてもよい。
　酵素処理には、植物由来、動物由来、微生物由来等のタンパク質分解酵素を使用でき、これらから１種又は２種以上組み合わせて使用できる。当該タンパク質分解酵素としては、エンドプロテアーゼが好適である。
　前記エンドプロテア－ゼとしては、例えば、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼが挙げられ、これらを１種又は２種以上選択して用いることができる。このうち、セリンプロテアーゼ及び/又はメタロプロテアーゼを用いるのが好適である。
　また、プロテアーゼは、アルカリ性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ及び酸性プロテアーゼに分類される。このうち中性プロテアーゼを用いるのが好適である。
　前記タンパク質分解酵素は、市販品を用いることができる。前記タンパク質分解酵素として、例えば、ビオプラーゼ（ナガセケムテックス社製）、プロレザー（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＳ（天野エンザイム社製）、ＰＴＮ６．０Ｓ（ノボザイムズ社製）、サビナーゼ（ノボザイムズ社製）、ＧＯＤＯ Ｂ．Ａ．Ｐ（合同酒精社製）、プロテアーゼＮ（天野エンザイム社製）、ＧＯＤＯ Ｂ．Ｎ．Ｐ（合同酒精社製）、ニュートラーゼ（ノボザイムズ社製）、アルカラーゼ（ノボザイムズ社製）、トリプシン（ノボザイムズ社製）、キモトリプシン（ノボザイムズ社製）、スブチリシン（ノボザイムズ社製）、パパイン（天野エンザイム社製）、ブロメライン（天野エンザイム社製）等が挙げられ、これらから１種又は２種以上の酵素を選択して用いてもよい。
　これらのうち、スブチリシン（subtilisin：例えば、ビオプラーゼ）、トリプシン（trypsin：例えばＰＴＮ６．０Ｓ）、及びバシロリシン（bachillolysin：例えばプロテアーゼＮ）から選ばれる１種又は２種以上の中性プロテアーゼが好ましく、より好ましくはこれら３種を組み合わせて用いる。
　前記タンパク質に対するエンドプロテア－ゼの使用量は、特に限定されず、基質濃度、酵素力価、反応温度及び反応時間等により適宜調整すればよいが、一般的には、タンパク質中のタンパク質１ｇ当り２，０００～１１，０００活性単位の割合で添加することが好ましい。
　前記タンパク質分解酵素による加水分解条件を適宜調整することにより、所望のペプチドを得ることができる。
　前記タンパク質分解酵素による加水分解前に、前記原料タンパク質溶液のｐＨを、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム等の食品上使用可能な塩類を用いて、使用酵素の至適ｐＨに調整することもできる。前記原料タンパク質溶液のｐＨは、好ましくは５～１０、より好ましくは７～１０に調整する。
　前記タンパク質分解酵素の反応温度は、使用酵素の最適温度の範囲で行うことが望ましく、好ましくは３０～６０℃、より好ましくは４０～６０℃で行う。
　前記タンパク質分解酵素の反応保持時間は、酵素反応の分解率をモニターしながら、好ましい分解率に達するまで反応を続ければよく例えば０．５～２４時間で行うことが可能であり、好ましくは１～１５時間、より好ましくは３～１０時間である。特に、原料に前記カゼインタンパク質を用いた場合の分解率は２０～３０％であることが好ましい。
　なお、原料タンパク質の分解率の算出方法は、ケルダール法（日本食品工業学会編、「食品分析法」、第１０２頁、株式会社光琳、昭和５９年）により試料の全窒素量を測定し、ホルモール滴定法（満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第５４７ページ、養賢堂、１９７０年）により試料のホルモール態窒素量を測定し、これらの測定値から分解率を次式により算出する。
　分解率（％）＝（ホルモール態窒素量／全窒素量）×１００
　前記タンパク質分解酵素による加水分解は、当該酵素を加熱して失活させて終了させればよい。加熱失活処理の加熱温度と保持時間は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができる。例えば、１００℃以上（好適には１１０～１３０℃）で失活させる場合には１～３秒間、１００℃未満６０℃以上で失活させる場合には３～４０分間で行うことが好適である。
　加熱処理の方式としては、バッチ方式、連続方式のいずれの方式も可能であり、連続方式として、プレート熱交換方式、インフュージョン方式、インジェクション方式等の方式を用いることができる。
　なお、前記の加熱失活処理は、加水分解物の殺菌処理として併用することも可能であり、常法による加熱処理方法等を用いることができる。
　加水分解終了後、必要に応じて分解液のｐＨを、好ましくは６～８、より好ましくは７．０±０．５、さらに好ましくは７．０±０．３とするのが好適である。
　なお、本発明に係るタンパク質分解物の製造において、カルシウム濃度未調整の溶液を加水分解した場合には、得られた分解液を、前記のような脱塩処理し、カルシウム濃度を調整してもよい。次いで、常法により加熱して酵素を失活させる。反応加熱温度と反応保持時間は使用した酵素の熱安定性を配慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができる。加熱失活後、常法により冷却し、そのまま利用することもでき、必要に応じて濃縮して濃縮液を得ることもでき、更に濃縮液を乾燥し、粉末製品を得ることも可能である。
　また、前記タンパク質水溶液を酸処理又はアルカリ処理にて加水分解する際には、タンパク質水溶液のｐＨを調整して処理すればよい。当該ｐＨ調整による処理の場合には、タンパク質水溶液のｐＨが、好ましくはｐＨ５以下又はｐＨ９以上であり、より好ましくはｐＨ４以下又はｐＨ１０以上である。このようにｐＨ処理された水溶液は、室温にて数分以上、好ましくは５分～１時間、放置又は撹拌することによって、酸処理又はアルカリ処理の加水分解物を得ることができる。ここで、「室温」とは、４～４０℃程度であるが、１０～３０℃が好適である。
　また、前記タンパク質水溶液を、熱処理にて加水分解してもよい。このタンパク質水溶液は、ｐＨ未調整でもよく、またｐＨ調整（具体的には、酸性（ｐＨ５以下）、中性（ｐＨ６～８）、アルカリ性（ｐＨ８以上））してもよい。熱処理は、４～１００℃程度で、上記酸アルカリ処理のような条件にて行えばよい。
　タンパク質加水分解物中の本発明のオリゴペプチドの含有率は特に限定されないが、その下限値は、本発明の効能をより良好に発揮させる観点から、好ましくは０．００１質量％以上であり、０．００５質量％以上であり、より好ましくは０．０１質量％以上であり、その上限値は、本発明の分解物の製造効率の観点から、好ましくは１質量％以下であり、より好ましくは０．５質量％以下であり、さらに好ましくは０．４質量％以下であり、よりさらに好ましくは０．３質量％以下である。
　なお、本発明において、対象のペプチド含有量は、下記の方法にて測定できる。
（ａ）試料粉末を、１．０ｍｇ／ｍＬとなるように、０．２％ギ酸水溶液に希釈溶解し、１０分間超音波破砕したのち、０．２２μｍ口径のＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）でろ過して粉末溶液を調製し、下記測定条件によるＬＣ／ＭＳ分析を実施する。一方、測定対象のペプチドの化学合成標準ペプチド（ペプチド研究所社製）の溶解液を濃度別に数点調製し、下記測定条件によるＬＣ／ＭＳ分析を実施し、検量線を作成する。
　前記粉末溶液の分析におけるピークのうち、標準ペプチドと分子量及びリテンションタイムが一致するものを、標準ペプチドと同一の配列として同定する。標準ペプチドのピーク面積と資料粉末のピーク面積を対比することにより、前記粉末溶液中に対象ペプチドの含有量を求める。
　（ｂ）対象ペプチド含有量（ｍｇ／カゼイン加水分解物１ｇ）
　対象ペプチド含有量（ｍｇ／カゼイン加水分解物１ｇ）＝〔得られたカゼイン加水分解物中の対象ペプチド測定値（ｍｇ）〕／〔得られたカゼイン加水分解物の質量（ｇ）〕
　〔得られたカゼイン加水分解物中の対象ペプチド測定値（ｍｇ）〕は、下記「ＬＣ／ＭＳ」による、試料中の対象ペプチドの測定値である。
　（ｃ）ＬＣ／ＭＳ使用機器
　質量分析計：ＴＳＱ　Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）。
　高速液体クロマトグラフ：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ　（島津製作所社製）、カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ３００ Ｃ１８ φ２．１ ｍｍ×２５０ ｍｍ，３．５ μｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）。
　（ｄ）ＬＣ／ＭＳ測定条件
　移動相Ａ：０．２重量％　ギ酸－水溶液
　移動相Ｂ：０．２重量％　ギ酸－アセトニトリル溶液
　タイムプログラム：２％Ｂ（０．０分）－２５％Ｂ（５．０分）－６５％Ｂ（５．１分）－６５％Ｂ（１０分）－８５％Ｂ（１０．１分）－８５％Ｂ（１３．０％）－２％Ｂ（１３．１分）－ＳＴＯＰ（３０．０分）。
　試料注入量：１０μＬ、カラム温度：４０℃、液体流量：２００μＬ／ｍｉｎ
　分析モード：ＳＲＭ測定。
　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｍａｓｓ：ｍ／ｚ＝２６０．１０（Ｐａｒｅｎｔ　ｍ／ｚ　＝　３７５．２１）
　得られたタンパク質加水分解物は、未精製のままの状態で使用しても効能を発揮することが可能である。すなわち、タンパク質加水分解物を、好ましくは乳タンパク質加水分解物を後述の飲食品や医薬組成物の態様として、摂取や投与に供してもよい。
　また、さらに、得られたタンパク質加水分解物に対して、適宜公知の分離精製を行ってもよい。例えば、得られたタンパク質加水分解物に対して分子量分画を行い、本発明に係る本発明のオリゴペプチドの分子量に該当する分画を含むタンパク質分解物を得ることができる。目的物質を含む画分は、後述するＤＰＰ-ＩＶ阻害作用を指標として決定することができる。
　分子量分画として、例えば、限外ろ過、ゲルろ過等の方法が採用でき、これにより不要な分子量のペプチドや遊離アミノ酸の除去率を高めることができる。
　限外ろ過の場合には、所望の限外ろ過膜を使用すればよく、ゲルろ過の場合には、所望のサイズ排除クロマトグラフィーに用いるゲルろ過剤を使用すればよい。
　さらに、脱塩や不純物を除去したり、純度を高めたりするために、公知の分離精製方法例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、溶媒沈殿、塩析、２種の液相間での分配等の方法を用いてもよい。
　分離精製したペプチドの分画物は、本発明のオリゴペプチドが含まれているかどうかを確認することを目的として、質量分析法によりペプチドの同定を行うことができる。
　このようにして得られた本発明のオリゴペプチドは、ペプチド溶液のまま使用することもでき、また、必要に応じて、該溶液を公知の方法により、濃縮した濃縮液として使用することもできる。また、該濃縮液を公知の方法により乾燥し、粉末にして使用することもできる。
（２）合成により得る方法
　本発明のオリゴペプチドは、化学合成又は生合成によっても製造することができる。
　ペプチドの化学合成は、オリゴペプチドの合成に通常用いられている液相法または固相法によって行うことができる。合成されたペプチドは必要に応じて脱保護され、未反応試薬や副生物等を除去して、本発明のオリゴペプチドを単離することが可能である。このようなペプチドの合成は、市販のペプチド合成装置を用いて行うことができる。
　ペプチドの生合成は、宿主生物にペプチド発現ベクターを導入して生成・分泌させるといった常法により行うことができる。
　目的とするペプチドが得られたことは、後述するＤＰＰ-ＩＶ阻害作用を指標として確認することができる。
　本発明のオリゴペプチドは、ＤＰＰ－ＩＶ活性を阻害する作用を有する。
　ここで、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有するとは、本発明のオリゴペプチド存在下におけるＤＰＰ-ＩＶ活性が、非存在下における活性に比べて小さいことをいい、同条件における阻害率が好ましくは１０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは５０％以上であることをいう。また、酵素の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が、好ましくは１０００μＭ以下、より好ましくは５００μＭ以下、さらに好ましくは１００μＭ以下であることをいう。
　なお、ＤＰＰ-ＩＶ阻害活性、阻害率、ＩＣ５０は、定法により確認することができる。
　したがって、本発明のオリゴペプチドは、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤の有効成分として好ましく含有させることができる。ここで、本発明のオリゴペプチドは乳タンパク質加水分解物の態様で剤に含まれていてもよく、言い換えると本発明のオリゴペプチドを一種又は二種以上を含む乳タンパク質加水分解物は、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤の有効成分として好ましく含有させることができる。
　ＤＰＰ－ＩＶが、生体内の生理機能に関与している物質を分解することで、種々の疾患や症状が生じる場合がある。このため、ＤＰＰ－ＩＶを阻害すると、通常ＤＰＰ－ＩＶによって分解される生体内の生理機能に関与している物質の分解が抑制されその寿命が延びることを利用して、ＤＰＰ－ＩＶに起因する疾患や症状の予防、改善又は治療が可能となる。
　前記生理機能に関与する物質として、例えば、ＧＬＰ－１やＧＩＰといったインクレチンが挙げられる。ＧＬＰ－１の分解を抑制することによって、インスリンの生合成及び分泌に対するグルコース誘導性の刺激、グルカゴン分泌抑制、遺伝子発現の調整、β細胞に対する栄養性の効果、食物摂取の抑制、及び胃内容排出の緩徐化などが作用する。また、ＧＩＰの分解を抑制することによって、膵臓からのインスリン分泌に対するグルコース誘導性の刺激が作用する。これらによって、上昇した血糖値の正常化、並びに空腹感及び体重の改善・調整に寄与することが可能である。
　また、ＤＰＰ－ＩＶの作用によって、血管の内皮細胞の機能が低下したり、血管の内皮細胞が障害されることが知られている。この血管の内皮細胞の機能低下や障害によって、血管の緊張増加による血管収縮、動脈硬化、血栓形成等の血管障害が生じ、これらの原因によって臓器の血流障害が生じ、臓器機能不全となり、糖尿病の合併症が誘発されることとなる。
　近年、ＤＰＰ－ＩＶ阻害薬を投与することで内皮細胞の機能が改善することが多数報告されている（例えば、Endocrine Journal 2011, 58 (1), 69-73、J Am Coll Cardiol. 2012, 59(3), 265-76、Diabetes Care. 2011, 34(9), 2072-7、Cardiovascular Diabetology 2011, 10(85)等）。かかる内皮細胞機能改善効果は、単に血糖値を下げることによる改善の他に、インクレチンによる血管の保護作用を介していると考えられている。高血糖により内皮細胞の機能が低下し、血管のしなやかさが失われると、血圧が上昇し、上昇した血圧がさらに血管を傷めるという悪循環が、心臓・腎臓・脳といった臓器への悪影響となって現れる。そのため、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤は循環器系の治療においても、重要な役割を果たすものと考えられている。
　以上のことから、本発明のオリゴペプチド及び本発明のオリゴペプチドを一種又は二種以上を含む乳タンパク質加水分解物、並びにこれらを含有する本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤は、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有することにより、血糖値上昇抑制作用、高血糖改善作用、血管内皮機能低下抑制作用、血管内皮障害抑制作用、血管障害抑制作用、血管内皮細胞の保護作用、食欲抑制作用等を示す。
　なお、本明細書における「血糖値上昇抑制」とは、血糖値低下を含む意味であるが、特に「正常値以上又は必要以上に上昇した血糖値を下げることができること」を意味するものである。血糖値の正常値の判断は、日本糖尿病学会の診断基準（2012年改訂）を参考にすればよい。なお、血糖値上昇は、食後に生じる上昇を指すものであってよい。
　さらに、本発明のオリゴペプチド及びそれを含有する本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤は、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有することにより、ＤＰＰ-ＩＶに起因する疾患や症状の予防、改善又は治療が可能と考えられる。よって、本発明のオリゴペプチド及びそれを含有する本発明のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤は、ヒトを含む動物に摂取又は投与して、ＤＰＰ－ＩＶに起因する疾患や症状等の予防、改善及び／又は治療を図るための方法に使用することができる。
　ここで、疾患や症状等の予防とは、疾患や症状等を罹患（発症）していない適用対象において、疾患又は症状等の発生を防止すること、該発生を遅延させること、及び該発生の危険性を低下させることを含む。
　本発明のオリゴペプチドを投与する対象（被投与者）及び摂取させる対象（摂取者）は、動物であれば特に限定されないが、通常はヒトである。また、成人、小児、乳児、新生児等のいずれであってもよい。また、性別は特に限定されない。
　本発明の別の側面は、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤、又はＤＰＰ-ＩＶに起因する疾患や症状の予防、改善及び／若しくは治療のための組成物の製造における、本発明のオリゴペプチドの使用である。
　本発明の別の側面は、ＤＰＰ－ＩＶ阻害、又はＤＰＰ-ＩＶに起因する疾患や症状の予防、改善及び／若しくは治療における、本発明のオリゴペプチドの使用である。
　本発明の別の側面は、ＤＰＰ－ＩＶ阻害、又はＤＰＰ-ＩＶに起因する疾患や症状の予防、改善及び／若しくは治療のために用いられる、本発明のオリゴペプチドである。
　本発明の別の側面は、本発明のオリゴペプチドを動物に投与することを含む、ＤＰＰ－ＩＶを阻害する、又はＤＰＰ-ＩＶに起因する疾患や症状を予防、改善及び／若しくは治療する方法である。
　なお、本明細書において「本発明のオリゴペプチドを動物に投与すること」は、「本発明のオリゴペプチドを動物に摂取させること」と同義であってよい。摂取は、自発的なもの（自由摂取）であってもよく、強制的なもの（強制摂取）であってもよい。すなわち、投与工程は、具体的には、例えば、本発明のオリゴペプチドを飲食品や飼料に配合して対象に供給し、以て対象に本発明のオリゴペプチドを自由摂取させる工程であってもよい。
　本発明のオリゴペプチドの摂取（投与）時期は、特に限定されず、投与対象の状態に応じて適宜選択することが可能である。
　本発明のオリゴペプチドの摂取（投与）量は、摂取（投与）対象の年齢、性別、状態、その他の条件等により適宜選択される。
　本発明のオリゴペプチドの摂取（投与）量は、本発明に係る本発明のオリゴペプチド１種類ずつの摂取量として、例えば、成人において１μｇ／日～１０ｍｇ／日の範囲が好ましく、５μｇ／日～５ｍｇ／日の範囲がさらに好ましい。
　なお、摂取（投与）の量や期間にかかわらず、本発明のオリゴペプチドは１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
　本発明のオリゴペプチドの摂取（投与）期間は、特に限定されないが、好ましくは１２週間以上、より好ましくは２４週間以上とすると、効果が得られやすい。また、摂取（投与）期間の上限は特に設けられず、継続的な、長期の摂取（投与）が可能である。
　本発明のオリゴペプチドの摂取（投与）経路は、経口又は非経口のいずれでもよいが経口が好ましい。また、非経口摂取（投与）としては、経皮、静注、直腸投与、吸入等が挙げられる。
　本発明のＤＰＰ-ＩＶ阻害剤は、前述の通りＤＰＰ-ＩＶに起因する疾患や症状の予防、改善又は治療に好適に用いることができるため、医薬組成物に含有させる態様が好ましい。すなわち、ＤＰＰ-ＩＶに起因する疾患や症状の予防、改善又は治療のための医薬組成物も本発明の一態様である。
　ＤＰＰ-ＩＶに起因する疾患や症状として、例えば、高血糖症、糖尿病、糖尿病合併症、血管内皮障害、血管障害等が挙げられるがこれらに限定されない。糖尿病としては、好ましくは２型糖尿病が挙げられ、より好ましくはインスリン分泌低下による２型糖尿病が挙げられる。なお、ＤＰＰ-ＩＶに起因する疾患や症状には、ＤＰＰ-ＩＶが直接的に関与するものの他、ＤＰＰ-ＩＶが間接的に関与するものであってよい。
　さらに、高血糖症、糖尿病及び高血糖状態によって引き起こされる種々の疾患や症状も、本発明の医薬組成物の対象となり得る。かかる疾患や症状としては、例えば、糖尿病性の細小血管症（例えば、網膜症、腎症、神経障害等）及び大血管合併症（例えば、狭心症・心筋梗塞等の虚血性心疾患、脳梗塞、閉塞性動脈硬化、壊疽等）等が挙げられる。
　医薬組成物の投与経路は、経口又は非経口のいずれでもよいが経口が好ましい。また、非経口摂取（投与）としては、経皮、静注、直腸投与、吸入等が挙げられる。
　医薬組成物の形態としては、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、座剤、軟膏剤、注射剤等に製剤化することができる。
　製剤化に際しては、本発明のオリゴペプチドの他に、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。また、他の薬効成分や、公知の又は将来的に見出されるＤＰＰ-ＩＶに起因する疾患や症状を予防、改善及び／又は治療し得る成分等の他の医薬を併用することも可能である。
　また、本発明の効果を妨げない限りにおいて、他のペプチドが併存してもかまわない。
　加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、適宜、通常製剤化に用いる担体を配合して製剤化してもよい。かかる担体としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α－デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
　結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
　崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
　滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
　安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
　矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
　なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物を摂取するタイミングは、例えば食前、食後、食間、就寝前など特に限定されないが食前が好ましい。
　本発明のオリゴペプチドを経口摂取される組成物とする場合は、飲食品の態様とすることが好ましい。
　本発明のオリゴペプチドは、前述のようにＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有することにより、血糖値上昇抑制作用、高血糖改善作用、血管内皮機能低下抑制作用、血管内皮障害抑制作用、血管障害抑制作用、血管内皮細胞の保護作用、食欲抑制作用等を示すため、これらの作用を企図して用いられる組成物の態様とすることができる。特に好ましい態様としては、食後血糖値上昇抑制用の組成物が挙げられる。
　本発明のオリゴペプチドは、特に用途を限定せずに飲食品の態様とすることができる。また、前述した種々の作用に係る用途に供される飲食品とすることもでき、特に好ましくは食後血糖値上昇抑制用の飲食品とすることができる。
　飲食品としては、本発明の効果を損なわず、経口摂取できるものであれば形態や性状は特に制限されず、本発明のオリゴペプチドを含有させること以外は、通常飲食品に用いられる原料を用いて通常の方法によって製造することができる。
　飲食品としては、液状、ペースト状、ゲル状固体、粉末等の形態を問わず、例えば、錠菓；流動食（経管摂取用栄養食）；パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等の小麦粉製品；即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等の即席食品類；農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等の農産加工品；水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等の水産加工品；畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品；加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等の乳・乳製品；バター、マーガリン類、植物油等の油脂類；しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等の基礎調味料；調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等の複合調味料・食品類；素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等の冷凍食品；キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、ゼリー、その他の菓子などの菓子類；炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等の嗜好飲料類、ベビーフード、ふりかけ、お茶漬けのり等のその他の市販食品等；育児用調製粉乳；経腸栄養食；機能性食品（特定保健用食品、栄養機能食品）等が挙げられる。
　また、飲食品の一態様として飼料とすることもできる。飼料としては、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
　飼料の形態としては特に制限されず、本発明のオリゴペプチドの他に例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等の穀類；大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類；フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；魚粉、脱脂粉乳、ホエイ、イエローグリース、タロー等の動物性飼料類；トルラ酵母、ビール酵母等の酵母類；第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；単体アミノ酸；糖類等を含有するものであってよい。
　本発明のオリゴペプチドが飲食品（飼料を含む）の態様である場合、ＤＰＰ-ＩＶに起因する疾患や症状の改善に関する用途や、脳機能低下予防、記憶力低下予防等の用途が表示された飲食品として提供・販売されることが可能である。また、本明細書に係る本発明のオリゴペプチドは、これら飲食品等の製造のために使用可能である。
　かかる「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起・類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本発明における「表示」行為に該当する。
　また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
　一方、表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
　また、「表示」には、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、医薬用部外品等としての表示も挙げられる。この中でも特に、消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、若しくは機能性表示食品に係る制度、又はこれらに類似する制度にて認可される表示等が挙げられる。具体的には、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク減少表示、科学的根拠に基づいた機能性の表示等を挙げることができ、より具体的には、健康増進法に規定する特別用途表示の許可等に関する内閣府令（平成二十一年八月三十一年内閣府令第五十七号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が典型的な例である。
　かかる表示としては、例えば、「食後の血糖値上昇を緩やかにする」、「食後の血糖値上昇を抑える」、「食後の血糖値が気になる方へ」、「高めの血糖値を下げる」、「高血糖の改善のために」、「血管内皮細胞をまもる」、「食欲を抑えたいときに」等と表示することが挙げられる。
　以下に実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞各ペプチドのＤＰＰ－ＩＶ阻害活性の評価
　乳タンパク質のアミノ酸配列に由来する９０４種のトリペプチドを有機合成し、各ペプチドのＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を評価した。
　ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性の測定は、ウチダらの方法（Uchida, M. et al., J. Pharmacol. Sci. 117, 63-66, 2011）に準じて行った。すなわち、酵素（ＤＰＰ－ＩＶ）として液体コントロール血清ＩワコーＣ＆Ｃ（富士フィルム和光純薬株式会社製）、基質としてＧｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣ（Enzo Life Sciences社製）を用いた。３８４ウェルブラックプレート（ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに、液体コントロール血清ＩワコーＣ＆Ｃを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで２５倍希釈したものを５μＬ、１００μＭペプチド溶液を５μＬ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。各ウェルに１０μＭ Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣを１０μＬずつ添加して混合後、３７℃で３０分間インキュベートした。蛍光強度値の測定にはマイクロプレートリーダー（SH-9000, コロナ電気株式会社製）を用いた（Ｅｘ.３８０ｎｍ／Ｅｍ.４６０ｎｍ）。
　下記の式により各ペプチドのＤＰＰ-ＩＶ阻害率を算出した。
　　阻害率（％）＝［１－（Ｙ／Ｘ）］×１００％
　　Ｘ：「水＋酵素＋基質」の蛍光強度値
　　Ｙ：「試験物質（ペプチド）＋酵素＋基質」の蛍光強度値
　各ペプチドのＤＰＰ-ＩＶ阻害活性評価を同条件で３回行い、阻害率の平均値を算出した。
　９０４種のトリペプチドについてＤＰＰ－ＩＶに対する阻害率ごとに分けた数の割合を図１に示す。阻害率２０％未満のペプチドが８９％、阻害率２０％以上５０％未満のペプチドが８％、阻害率５０％以上のペプチドが３％であった。すなわち、ＤＰＰ-ＩＶ阻害率の高いトリペプチドは、ごく一部の特定のアミノ酸配列を持つものだけであった。
＜実施例２＞ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有するトリペプチドのＩＣ５０の評価
　実施例１においてＤＰＰ－ＩＶ阻害率が５０％以上であったトリペプチドのＤＰＰ－ＩＶ阻害活性をＩＣ５０値で評価した。
　ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性評価はカトウらの方法（Kato , T. et al., Biochem. Med. 19, p351, 1978）に準じて行った。すなわち、酵素（ＤＰＰ－ＩＶ）としてRecombinant human DPPIV（Enzo Life Sciences社製）、基質としてＧｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣ（Enzo Life Sciences社製）を用いた。３８４ウェルブラックプレート（nunc社製）の各ウェルにＤＰＰ－ＩＶ溶液（１０．４ μＵ／μＬ）を５μＬ、各濃度のペプチド溶液を５μＬ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。各ウェルに１０μＭ Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－ＡＭＣを１０μＬずつ添加して混合後、３７℃で１５分間インキュベートした。蛍光強度値の測定にはマイクロプレートリーダー（SH-9000, コロナ電気株式会社製）を用いた（Ｅｘ.３８０ｎｍ／Ｅｍ.４６０ｎｍ）。
　阻害率は下記の式で算出した。
　　阻害率（％）＝［１－（Ｙ／Ｘ）］×１００％
　　Ｘ：「水＋酵素＋基質」の蛍光強度値
　　Ｙ：「試験物質（ペプチド）＋酵素＋基質」の蛍光強度値
　ＩＣ５０算出のため、ペプチド濃度を段階的に希釈し、それぞれの阻害率を求め、その結果を基にペプチド濃度と阻害率の関係式を求めた。この関係式を用いて５０％阻害率となるペプチド濃度を算出し、ＩＣ５０とした。
　結果を表１に、評価したトリペプチドのうち、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性を有することが知られていない新規配列からなるトリペプチドのＩＣ５０を示す。ＬＰＶペプチド、ＩＰＴペプチド、ＰＰＱペプチド、ＡＰＦペプチド、ＰＰＬペプチド、ＰＰＦペプチド、ＡＰＳペプチドが新規のＤＰＰ－ＩＶ阻害ペプチドとして得られた。また、実施例１においてＤＰＰ－ＩＶ阻害率が２０％未満であったトリペプチドから選出した４種類のトリペプチド（Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｐｒｏ）については、いずれもＩＣ５０が１０００μＭより大きく、ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性が低かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜実施例３＞ＬＰＶ配列を含むテトラペプチドのＩＣ５０評価
　実施例２においてＩＣ５０値が最も低かったＬＰＶペプチドの配列を含むテトラペプチド（ＬＰＶＰペプチド）のＤＰＰ－ＩＶ阻害活性をＩＣ５０値で評価した。
　ＤＰＰ－ＩＶ阻害活性評価は実施例２と同様の方法で行った。
　表２に評価したＬＰＶＰペプチドのＩＣ５０値を示す。ＬＰＶＰペプチドはＬＰＶペプチドに比べてＩＣ５０値が低いことから、高いＤＰＰ－ＩＶ阻害活性をもつ新規のペプチドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜実施例４＞カゼイン加水分解物のＤＰＰ－ＩＶ阻害活性及び食後血糖値上昇抑制作用の評価
（１）本発明のオリゴペプチドを含むカゼイン加水分解物の取得
　市販のカゼインナトリウム１２５ ｇを８７５ ｇの精製水に溶解した。該カゼインナトリウム水溶液を８５℃で１０分間加熱殺菌し、５０℃に温度調整し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨを７．０に調整した。タンパク質分解酵素１．０、２．５、又は４．０重量％を添加して加水分解をし、本発明のオリゴペプチドを含む溶液３種類を得た。その後、酵素を失活させ、常法により濃縮し、乾燥し、カゼイン加水分解物Ａ、Ｂ、Ｃを得た。
（２）カゼイン加水分解物中の本発明のオリゴペプチド含量の測定
　以下の手順で、カゼイン加水分解物における本発明のトリペプチド５種（ＬＰＶペプチド、ＩＰＴペプチド、ＰＰＱペプチド、ＡＰＦペプチド、ＰＰＬペプチド）及びテトラペプチド（ＬＰＶＰペプチド）の各含量を測定した。
　（１）で取得したカゼイン加水分解物Ａ、Ｂ及びＣをそれぞれ、１．０ｍｇ／ｍＬとなるように、超純水で溶解し、１０分間超音波破砕したのち、０．２２μｍ口径のＰＶＤＦフィルター(Millipore社製)でろ過して溶液を調製した。また、各種オリゴペプチドの化学合成標準ペプチド(フナコシ社製)の溶解液を０．０１、０．１、及び１．０ μｇ／ｍＬの濃度で調製し、検量線用の標準溶液を作成した。以上のペプチド調製液と標準溶液を、下記測定条件でＬＣ／ＭＳ分析し定量した。なお、前記ペプチド調製液のＭＳ２ピークのうち、標準ペプチドと分子量及びリテンションタイムが一致するものを、標準ペプチドと同一の配列として同定した。定量値は、MS2ピークの面積値を検量線と対比することで算出した。
　使用機器
　・質量分析計：TSQ Quantum Discovery MAX(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)。
　・HPLC構成：システムコントローラーCBM-20A、オートインジェクターSIL-20AC、送液ポンプLC-20AD×2、カラムオーブンCTO-20AC、UV/VIS検出器SPD-20A、オンラインデガッサDGU-20A5 (以上、島津製作所社製)
　・カラム：XBridge Peptide BEH C18 Column, 300Å(2.1mm×250mm)(Waters社製)。
測定条件（HPLC）
　・移動相A：0.2重量％ 蟻酸-水溶液、移動相B：0.2重量％ 蟻酸-アセトニトリル溶液。
　・タイムプログラム：2%B (0分) - 40%B (12分) - 80%B (15分) - 80%B (17%) - 2%B (17分) - STOP (30分)。
　・試料注入量：10 μL、液体流量：200 μL / min、カラム温度：40℃
測定条件（質量分析計）
　・イオン化モード： ESI(＋)、スプレー電圧：＋4.0kV、キャピラリー温度：300℃、シースガス圧：30Arb、補助ガス圧：10Arb
　・分析モード：SRM
　各カゼイン加水分解物中に含まれる本発明のオリゴペプチド量の測定結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（３）カゼイン加水分解物のＤＰＰ－ＩＶ阻害に対するＩＣ５０の評価
　前述の実施例２と同様の方法で、カゼイン加水分解物Ａ、Ｂ及びＣ並びにカゼインそれぞれのＩＣ５０を評価した。
　結果を表４に示す。カゼインと比較し、ＤＰＰ－ＩＶ阻害効果が高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（４）カゼイン加水分解物による食後血糖値上昇抑制試験
　被験者に、水１００ｍＬにカゼイン加水分解物Ｂ １ｇとデキストリン ５ｇを溶解した試験溶液、又は水１００ｍＬにデキストリン ５ｇを溶解した対照溶液を摂取させ、摂取５分後に米飯２００ｇを摂取させた。米飯摂取から０、１５、３０、４５、６０、９０、及び１２０分経過後にメディセーフファインタッチディスポ（テルモ(株)）を用いて指先から採血し、ワンタッチベリオビュー（ジョンソン・エンド・ジョンソン(株)）を用いて血糖値を測定した。
　米飯摂取前（０分）に対する血糖値変化量について、被験者２名のデータを平均した結果を図２に示す。カゼイン加水分解物を含む試験溶液を摂取した場合には、対照溶液を摂取した場合と比較して、血糖値変化量が低く推移した。

Claims (9)

  1. 　以下の（ａ）～（ｇ）に記載のいずれかの配列を含むオリゴペプチド。
    　（ａ）Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ
    　（ｂ）Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ
    　（ｃ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ
    　（ｄ）Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ
    　（ｅ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ
    　（ｆ）Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ
    　（ｇ）Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ
  2. 　（ｈ）Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｐｒｏを含む、請求項１に記載のオリゴペプチド。
  3. 　請求項１又は２に記載のオリゴペプチドから選択される一種又は二種以上のオリゴペプチド含む、乳タンパク質加水分解物。
  4. 　請求項１又は２に記載のオリゴペプチドから選択される一種又は二種以上のオリゴペプチドを有効成分として含有する、ジペプチジルペプチダーゼ－ＩＶ（ＤＰＰ－ＩＶ）阻害剤。
  5. 　請求項１又は２に記載のオリゴペプチドから選択される一種又は二種以上のオリゴペプチドを含む乳タンパク質加水分解物を含有する、ＤＰＰ－ＩＶ阻害剤。
  6. 　請求項４又は５に記載のＤＰＰ－ＩＶ阻害剤を含有する医薬組成物。
  7. 　請求項１又は２に記載のオリゴペプチドから選択される一種又は二種以上のオリゴペプチドを有効成分として含有する、食後血糖値上昇抑制用組成物。
  8. 　請求項１又は２に記載のオリゴペプチドから選択される一種又は二種以上のオリゴペプチドを含む乳タンパク質加水分解物を含有する、食後血糖値上昇抑制用組成物。
  9. 　飲食品である、請求項７又は８に記載の組成物。
     
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