CN105131085A - 一种五肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种五肽及其应用，所述合成五肽的氨基酸序列如下所示：Phe-Phe-Glu-Phe-Phe，缩写为FFEFF，分子量735.32。本发明的合成五肽使用多肽合成仪，采用固相合成法合成，高相液相色谱纯化，冷冻干燥而得。本发明提供了一种具有保护红细胞溶血以及促进人皮肤成纤维细胞增殖和胶原蛋白产生的合成五肽，可应用于生物制药与化妆品等领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药与化妆品等领域，具体涉及一种五肽及其应用。
背景技术
构建细胞氧化损伤模型是评价样品是否具有抗氧化能力的常用方法，而红细胞来源丰富、取材方便，是体外生物实验中的常用材料。自由基首先攻击红细胞膜上的脂质和蛋白质，使细胞膜破损，释放出红细胞中的血红蛋白，称为红细胞溶血。AAPH、H2O2和Hemin为常用的诱导红细胞溶血的物质。活性样品的预处理，可以起到抑制红细胞溶血的作用，从而该模型通过测定红细胞溶血抑制率和细胞内抗氧化酶SOD的活性来评价样品的细胞内抗氧化效果。原子力显微镜(AFM)是一种高分辨率的新型成像工具，在生物医学界已被广泛用于细胞形貌及其超微结构的表征，其原理是通过检测探针扫描样品时所产生的原子间相互作用力来获得样品形貌结构信息，经计算机软件处理成像。自由基攻击细胞膜使之结构和功能丧失，发生细胞溶血。这一结论通过用原子力显微镜（AFM）观察对照组、损伤组和保护组红细胞形貌得到进一步验证。
光老化是外界环境对皮肤的生物学应答的效果。皮肤对光老化的应答通常与正常的水合作用的缺乏、皮肤下垂以及线条和皱纹外观有关。UVB照射可使成纤维细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)堆积，超过了其清除能力，打破氧化与抗氧化平衡，发生氧化应激反应，调节一系列程序化的细胞反应，甚至调控衰老相关的信号通路，促进细胞衰老的发生。大量研究表明ROS在细胞内的堆积是皮肤光老化发生发展过程中的重要环节。人皮肤成纤维细胞是人皮肤产胶原蛋白的主要场所，其数量的多少和细胞胶原蛋白的产率与皮肤衰老状态息息相关。因此，人皮肤成纤维细胞的存活率和胶原蛋白的产率是被广泛应用认可的一种评价皮肤衰老状态的模型。
生物活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫调节、抗菌、降血压、抗癌、抗氧化等功效，是由25个天然氨基酸通过肽键以不同组成和排列方式构成的二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称。活性肽安全性极高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。现代营养学表明，蛋白质经消化道酶作用后并不完全以游离氨基酸的形式吸收，大多以低肽的形式吸收，并且低肽比游离氨基酸具有更高的营养价值和生物效价。虽然，活性肽被广泛应用在化妆品中，但是，本发明中的序列是首次发现，并具备该功效的多肽。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有保护红细胞溶血以及促进人皮肤成纤维细胞的增殖和胶原蛋白产生的合成五肽，可应用于生物制药与化妆品等领域。本发明以APPH诱导的红细胞溶血实验以及紫外损伤人皮肤成纤维细胞来评价多肽的抗氧化及抗皮肤衰老活性。
本发明所述的合成五肽缩写为FFEFF，分子量735.32。序列为：Phe-Phe-Glu-Phe-Phe。其中，
Phe表示英文名称为phenylalanine，中文名称为苯丙氨酸的氨基酸的相应残基；
Glu表示英文名称为Glutamicacid，中文名称为谷氨酸的氨基酸的相应残基。
本发明所述的氨基酸序列采用标准Fmoc方案，通过树脂的筛选，合理的多肽合成方法。将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，固相合成顺序从C端向N端合成。采用高效液相色谱进行纯化，液氮速冻，冷冻干燥，得到成品合成五肽。
本发明将终浓度为1-100μg/mL的合成五肽与正常人血红细胞混匀，孵育，经AAPH损伤2h后，使得细胞溶血抑制率最高可达到82.0±1.03%。用100μg/mL的合成五肽处理组与仅用AAPH损伤的红细胞组相比，其形貌比单纯AAPH处理组光滑，有序。用5μg/mL合成五肽处理，红细胞SOD活力由2.5976mgprot/mL上升到5.6877mgprot/mL，结果表明，合成五肽处理后红细胞的SOD活性有较大提高，可在生物医药与化妆品等领域应用。
本发明将浓度为1-10μg/mL的合成五肽加入人皮肤成纤维细胞培养液中孵育，经中波紫外（UVB）80mJ/cm2损伤后，与模型组相比，样品组细胞存活率提高了0-18.62%。同时，胶原蛋白得率提高了4.69-9.8%。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
本发明首次合成了该肽，并且应用于AAPH损伤的正常人红细胞进行保护，使得红细胞溶血率显著降低，SOD活性有较大的提高，同时，合成五肽对紫外损伤的人皮肤成纤维细胞的生长具有促进作用，同时能促进其胶原蛋白的产生。
附图说明
图1为合成五肽Phe-Phe-Glu-Phe-Phe的TOF图谱。
图2为添加合成五肽进行预保护后进行AAPH损伤的正常人红细胞溶血抑制率变化曲线，其中横坐标为Concentration(浓度)、纵坐标为Hemolysisinhibition(溶血抑制率)。。
图3为不同处理组红细胞的原子力显微镜（AFM）成像图。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
合成五肽固相合成
选用高分子树脂（中肽生化有限公司），按照氨基酸序列Phe-Phe-Glu-Phe-Phe的特征，先将Phe的羧基以共价键的形式与一个树脂相连，然后Phe的氨基和Phe的羧基缩水反应，处理后，再添加Glu，Phe的氨基和Glu的羧基反应，依次从右到左添加氨基酸，加好最后一个Phe氨基酸后，再切除树脂即得到目标合成五肽。高效液相色谱纯化得到最后的产品，纯化过程使用PhenomenexC18（4.6*250mm）色谱柱，流速为1.0mL/min。采用两个通道进行洗脱，溶剂A:含有0.1%三氟乙酸的水；溶剂B:含有0.09%三氟乙酸的溶液（80%乙腈+20%水）；洗脱梯度过程中B初始比例为39%，在20min内，B的比例上升到49%，检测波长220nm。收集合成五肽溶液，液氮速冷，然后冻干。得到纯度为95%以上的产品，并经ESI-MS鉴定结构（如图1所示）。
合成五肽对人皮肤成纤维细胞UVB损伤的保护应用
人皮肤成纤维细胞培养在完全培养基中，完全培养基主要由基础培养基高糖DMEM，10％胎牛血清（v/v），以及1%双抗(由青霉素和链霉素组成，v/v)组成。置于37℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度培养箱中。每隔2d换液1次。待细胞长满培养平的90%左右，取其接种于96孔培养板中,每孔100μL,浓度为5×104cells/mL。细胞生长24h后,吸弃培养液，用200μLPBS洗1次，加入200μLPBS，用80mJ/cm2UVB照射，吸弃PBS，每孔加入200μL10μg/mL样品（零浓度用完全培养基取代，即为正常对照），继续培养72h，吸弃培养液，采用MTT法检测细胞存活率，结果见表1。
表1
| UVB | 合成五肽+ UVB | |
| 人皮肤成纤维细胞存活率 | 1 | 1.1862 |
合成五肽促进UVB损伤人皮肤成纤维细胞胶原蛋白产生的应用
取上述处理组的细胞，吸弃培养液，用无菌水洗细胞表面两次，加入冰冷70%乙醇200μL进行固定，在-80oC冰箱放置至少10min，取出后，用无菌水洗细胞表面两次，风干水分后，每孔加入200μL1%饱和苦味酸-猩红染液（m/v），于4oC条件下轻晃24h，吸弃染液，用无菌水洗3次，直至没有染色液洗出为止，加入150μL1MNaOH溶液，150r/min，震荡15min，每孔取出100μL置于96孔板中，测定492nm处的吸光度值，结果见表2。
表2
| UVB | 合成五肽+ UVB | |
| 人皮肤成纤维细胞胶原蛋白产率（μg/mL） | 11.9512±1.2067 | 13.122±1.2002 |
合成五肽对正常人红细胞AAPH损伤的保护应用
用含有柠檬酸钠的抗凝管(抗凝剂柠檬酸钠：血液=1：9，v/v)抽取健康成人（30岁以下）血液放于4℃冰箱保存，一周内使用。临用时，将血液放在离心管中于1000~1500g离心8-15min，移去上层的血浆，红细胞用PBS（pH=7.4）洗2-3次，直至上清液为无色。最后于离心机中1000~1500g离心8-15min，去除上清液，得到紧密的红细胞压积，用PBS稀释成浓度为20%（体积，v/v）的红细胞悬液。单独用100μg/mL的合成五肽处理红细胞，以0.1mL20%红细胞悬液和0.3mLPBS共同孵育2h作为空白对照组，确定样品不具有溶血性。
应用实施例1
0.1mL20%红细胞悬液经0.1mL浓度为0μg/mL的合成五肽（用PBS取代，即为模型组）预处理20min后，加入0.2mL终浓度为100mM的AAPH溶液，微震、避光孵育2h，取各处理组的反应物溶液50μL用PBS缓冲液稀释至1mL，1500g离心12min，取上清液于96孔板中，用酶标仪在540nm处测其吸光度，同样地，用蒸馏水稀释反应混合物作为全溶血对照，计算溶血率，结果见图2。同时，将各处理组细胞用离心机于1500g离心12min，收集细胞沉淀，用PBS洗3次离心，弃去上清液，再次重悬。制片时，取10μL红细胞重悬液均匀涂于洁净的云母片上（要求细胞无重叠、不团聚），然后用2.5%（体积，v/v）的戊二醛固定细胞，5min后，用超纯水冲洗硅片3次，自然风干硅片，最后置于原子力显微镜上，在轻敲模式下扫描观察细胞形貌，用NanoScope软件分析实验数据，结果见图3。
应用实施例2
0.1mL20%红细胞悬液经0.1mL浓度为5μg/mL的合成五肽预处理20min后，加入0.2mL终浓度为100mM的AAPH溶液，微震、避光孵育2h，取各处理组的反应物溶液50μL用PBS缓冲液稀释至1mL，1500g离心12min，取上清液于96孔板中，用酶标仪在540nm处测其吸光度，同样地，用蒸馏水稀释反应混合物作为全溶血对照，计算溶血率，结果见图2。
应用实施例3
0.1mL20%红细胞悬液经0.1mL浓度为25μg/mL的合成五肽预处理20min后，加入0.2mL终浓度为100mM的AAPH溶液，微震、避光孵育2h，取各处理组的反应物溶液50μL用PBS缓冲液稀释至1mL，1500g离心12min，取上清液于96孔板中，用酶标仪在540nm处测其吸光度，同样地，用蒸馏水稀释反应混合物作为全溶血对照，计算溶血率，结果见图2。
应用实施例4
0.1mL20%红细胞悬液经0.1mL浓度为100μg/mL的合成五肽预处理20min后，加入0.2mL终浓度为100mM的AAPH溶液，微震、避光孵育2h，取各处理组的反应物溶液50μL用PBS缓冲液稀释至1mL，1500g离心12min，取上清液于96孔板中，用酶标仪在540nm处测其吸光度，同样地，用蒸馏水稀释反应混合物作为全溶血对照，计算溶血率，结果见图2。同时，将各处理组细胞用离心机于1500g离心12min，收集细胞沉淀，用PBS洗3次离心，弃去上清液，再次重悬。制片时，取10μL红细胞重悬液均匀涂于洁净的云母片上（要求细胞无重叠、不团聚），然后用2.5%的戊二醛固定细胞，5min后，用超纯水冲洗硅片3次，自然风干硅片，最后置于原子力显微镜上，在轻敲模式下扫描观察细胞形貌，用NanoScope软件分析实验数据，结果见图3。
应用实施例5
0.1mL20%红细胞悬液经0.1mL浓度为0μg/mL（用PBS取代，即为正常对照组）的合成五肽预处理20min后，加入0.2mL终浓度为0mM的AAPH溶液（用PBS取代，即为正常对照），微震、避光孵育2h，取各处理组的反应物溶液50μL用PBS缓冲液稀释至1mL，1500g离心12min，取上清液于96孔板中，用酶标仪在540nm处测其吸光度，同样地，用蒸馏水稀释反应混合物作为全溶血对照，计算溶血率，结果见图2。同时，将各处理组细胞用离心机于1500g离心12min，收集细胞沉淀，用PBS洗3次离心，弃去上清液，再次重悬。制片时，取10μL红细胞重悬液均匀涂于洁净的云母片上（要求细胞无重叠、不团聚），然后用2.5%的戊二醛固定细胞，5min后，用超纯水冲洗硅片3次，自然风干硅片，最后置于原子力显微镜上，在轻敲模式下扫描观察细胞形貌，用NanoScope软件分析实验数据，结果见图3。
应用实施例6
0.1mL20%红细胞悬液经0.1mL浓度为5μg/mL（用PBS取代，即为正常对照组）的合成五肽预处理20min后，加入0.2mL终浓度为0mM的AAPH溶液（用PBS取代，即为正常对照），微震、避光孵育2h，将各处理组细胞用离心机于1500g离心12min，收集细胞沉淀，用PBS洗3次离心，加入4oC预冷的超纯水，150r/min震荡10min，10000g离心30min，收集上清液备用，按照试剂盒（南京建成）的说明书进行测定其中的SOD活性，结果见表3。
表3
| AAPH | 合成五肽+AAPH | |
| T-SOD活性 (mgprot/mL) | 2.5976 | 5.6877 |
图2为添加合成五肽进行预保护后进行AAPH损伤的正常人红细胞溶血抑制率变化曲线，结果表明，加入体系中合成五肽浓度为5μg/mL时，红细胞溶血抑制率显著高于模型组，浓度达到25μg/mL后，溶血抑制率不再升高。
图3为不同处理组红细胞的原子力显微镜（AFM）成像图。其中a为正常红细胞，b为100mM的AAPH处理2h的红细胞，c为用100μg/mL的合成肽Phe-Phe-Glu-Phe-Phe预处理20min之后再加100mMAAPH培养2h的红细胞。结果表明，正常红细胞具有典型的双凹面结构，细胞表面光滑，四周高度基本一致。AAPH处理组细胞表面变得粗糙，细胞严重塌陷，高度降低，形状不规则。合成五肽预处理的保护组，细胞损伤程度明显减弱，四周与中间的高度差明显，呈现饼状结构。
Claims (5)
1.一种五肽，其特征是该合成五肽的氨基酸序列为Phe-Phe-Glu-Phe-Phe。
2.权利要求1所述的一种五肽的应用，其特征在于将所述五肽与红细胞预先混合，在AAPH的作用下，孵育2h后，使得细胞溶血抑制率达到82.0±1.03%，所述五肽的浓度为1-100μg/mL。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述五肽能使细胞SOD活性由2.5976mgprot/mL上升到5.6877mgprot/mL，所述五肽浓度为5μg/mL。
4.权利要求1所述的一种五肽的应用，其特征在于，在UVB的作用下，将所述五肽与人皮肤成纤维细胞混合，孵育72h后，使得细胞存活率提高0-18.62%，此外，胶原蛋白得率提高4.69-9.8%，所述五肽的浓度为1-10μg/mL。
5.权利要求1所述的一种五肽在制备生物医药或化妆品中的应用。
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