CN110655553B

CN110655553B - 一种芝麻来源的ace抑制肽、制备方法及其在制备降血压药物方面的应用

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Publication number: CN110655553B
Application number: CN201910958371.3A
Authority: CN
Inventors: 王瑞丹; 芦鑫; 高锦鸿; 贾聪; 孙强; 黄纪念
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-10-10
Filing date: 2019-10-10
Publication date: 2023-02-21
Anticipated expiration: 2039-10-10
Also published as: CN110655553A

Abstract

本发明提供了一种芝麻ACE抑制肽，属于生物小分子活性肽领域，具体涉及一种芝麻二肽，该二肽由半胱氨酸和酪氨酸组成，其序列为：Cys‑Tyr。本发明芝麻二肽不仅可以通过蛋白酶解、分离纯化获得，而且可以通过化学固相合成的方法进行人工合成。本发明通过测定ACE抑制活性发现：该活性肽具有很强的ACE抑制活性，属于食源性降压肽，分子量小，具有易吸收、溶解度好、低致敏性等特点，可以用于制备降血压药物，作为添加剂或者活性药物添加至食品、医药、保健品、化妆品、日化用品等多种行业和领域，具有广阔的应用开发前景。

Description

一种芝麻来源的ACE抑制肽、制备方法及其在制备降血压药物方面的应用

技术领域

本发明属于生物小分子活性肽领域，具体涉及一种来源于芝麻蛋白的ACE抑制肽CY、制备方法及其在制备降血压药物、保健品、食品、化妆品、日化用品等中的应用。

背景技术

高血压是世界上死亡率最高的疾病之一，是冠心病、中风、心力衰竭的主要发病因素。近年来高血压的发病率不断提高，且趋于年轻化。因此，高血压的防治已成为全球医学界的一项艰巨任务。血管紧张素转化酶（ACE）对血压起着重要的调节作用。目前，许多合成的ACE 抑制剂如卡托普利、依那普利可能诱发皮肤疹、、腹泻、咳嗽和头晕等不良症状，因此从天然来源的食物中提取具有降血压功能的ACE 抑制剂具有重要的社会意义和应用价值。

生物活性肽是蛋白质水解释放或由生物工程等方法制得的2-20个氨基酸组成的多肽类物质。在加工、酶解、发酵或胃肠消化过程中，食物可以释放生物活性肽。大量研究证实，食源性活性肽具有抗疲劳、降血压、提高免疫力、降血脂、抗菌、抗病毒、激素调节等多种生理功能，且易被人体消化吸收，溶解性好，食用安全性高，是目前热门的研究课题和极具发展前景的活性因子。目前已从牛奶蛋白、大豆蛋白、海洋蛋白、蛋清蛋白等多种食源性蛋白中分离出大量的ACE抑制肽。

芝麻（SesamumindicumL.），又称胡麻、脂麻、油麻，是我国重要油料作物之一。目前我国芝麻主要用于生产芝麻油，制油后产生大量的芝麻饼粕，其主要成分为蛋白质。芝麻饼粕中的蛋白大部分直接作为饲料、肥料使用，其蛋白资源没有得到充分利用。因此，芝麻蛋白可以作为活性肽的重要来源，有效利用蛋白资源，为芝麻蛋白深加工提供新途径，实现芝麻加工副产物的高效增值。

发明内容

针对人工合成的ACE抑制剂有严重毒副作用，人们对降血压药物的安全性产生忧虑，本发明目的在于提供一种芝麻来源的ACE抑制肽，以消除人们对人工合成ACE抑制剂安全性的担忧。该芝麻来源的ACE抑制肽抑制活性高、副作用小、易于分离纯化，且制备工艺简单，在食品、医药、保健品等领域有广阔的市场前景，可应用于制备具有调节血压作用的保健食品或药物。

本发明还提供了上述芝麻来源的ACE抑制肽的制备方法以及其在制备降血压药物、保健品、食品、化妆品、日化用品等中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种芝麻来源的ACE抑制肽，该ACE抑制肽由半胱氨酸和酪氨酸两个氨基酸组成，其序列为Cys-Tyr（CY），具有较好的降血压活性功效。

上述的芝麻二肽来源于芝麻11S球蛋白储藏前体蛋白2（11S2_SESIN）。本发明提供了一种从芝麻蛋白中制备上述ACE抑制肽的方法，其通过蛋白酶解、分离纯化等步骤获取，具体包括以下步骤：

1）提取芝麻蛋白：将芝麻饼粕粉碎、溶剂萃取法脱脂，加蒸馏水混匀（将脱脂后的芝麻粕原料与蒸馏水以1 g/10 mL-25mL的料液比进行混匀）后采用碱溶酸沉法提取蛋白，离心，收集所得沉淀物并冷冻干燥，即为蛋白原料；

2）蛋白酶解：将步骤1）所得蛋白原料加蒸馏水混匀获得5-8%的蛋白溶液，中和至中性，然后于90-95℃条件下加热20-30min使其完全变性；用酸将pH值调至1.5-2.2，加入胃蛋白酶酶解3.5-4.5h，再用碱将pH值调至7.6-8.5，加入胰酶酶解5.5-6.5h，酶解结束后中和酶解液，离心、取上清液，4-10℃低温备用；

3）分离纯化：将步骤2）所得上清液用100 kDa, 50 kDa, 30 kDa, 10 kDa, 5 kDa以及 3 kDa不同截留分子量的超滤膜进行超滤，测定不同分子量多肽组分的ACE抑制活性，收集高活性组分（经试验验证，透过3 kDa超滤膜对应的活性组分，其ACE抑制活性最高）；然后采用NGC色谱系统对上述高活性组分进一步分离，收集并筛选出高活性的洗脱峰对应的组分，即收集保留时间在7.6-8.2min的组分，浓缩后于-60℃冷冻干燥即得芝麻多肽样品。将该芝麻多肽样品使用Nano-LC-ESI-MS/MS进行质谱鉴定，鉴定到该活性肽的氨基酸序列为：Cys-Tyr。

具体的，步骤2）中，胃蛋白酶与蛋白溶液添加量比例为0.40-0.42g：100g，胰酶与蛋白溶液添加量比例为0.40-0.42g：100g，酶解温度为36-38℃。pH值调节时，酸优选用盐酸溶液，碱优选用氢氧化钠溶液。

进一步的，步骤2）中，所述胰酶优选由质量比为10:2-4的胰蛋白酶和α-糜蛋白酶混合组成，酶解温度优选控制在37℃。

具体的，步骤3）中，NGC色谱系统的条件为：流动相A为含0.1%三氟乙酸的甲醇，流动相B为含0.1%三氟乙酸的超纯水；流速7.5 mL/min，流动相A由55%变化至60%，线性梯度洗脱60min；检测波长为220nm，色谱柱为Shim-pack GIS C₁₈制备柱。

本发明还提供了上述芝麻来源的ACE抑制肽的制备方法，可以通过人工化学合成制备，如其采用化学固相合成法按照本领域常规技术人工合成ACE抑制肽。

本发明还提供了上述芝麻来源的ACE抑制肽在制备降血压药物、保健品、食品、化妆品、日化用品中的应用，如其可以作为添加剂或者活性药物添加至食品、医药、保健品、化妆品、营养强化剂、日化用品等多种行业和领域，具有广阔的应用开发前景。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

1）本发明所用的原料为芝麻，来源广泛，有效利用芝麻蛋白资源，对保护环境、促进社会经济的可持续发展有重要意义；

2）本发明提供的芝麻活性肽分子量小，易吸收，易于分离纯化，且具有强ACE抑制活性；

3）本发明提供的芝麻小分子肽活性显著，安全性高，可用于开发治疗高血压的相关保健品或者药物，在食品、保健品、医药等许多领域有广阔的市场前景。

附图说明

图1为实施例1中NGC色谱系统分离色谱图；

图2 为实施例1提取所得芝麻多肽样品在Nano-LC-ESI-MS/MS中的二级质谱图；

图3为实施例2中人工合成活性二肽CY的HPLC图；

图4为实施例2中人工合成活性二肽CY的质谱图；

表1为实施例1和2制备所得芝麻二肽CY的ACE抑制活性的IC₅₀值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明不局限于具体实施例。

实施例1

一种从芝麻蛋白中制备ACE抑制肽的方法，其具体包括如下步骤：

1）芝麻蛋白提取：

将芝麻饼粕粉碎，采用索氏抽提器进行脱脂，选用溶剂为石油醚，萃取温度为80℃，脱脂6h。将脱脂后的芝麻粕原料与蒸馏水以1 g/20mL的料液比进行混合，室温搅拌60min以混匀。碱溶酸沉法提取蛋白，具体为：用5 mol/L NaOH调节pH为11.0，室温搅拌60min，在4℃条件下以5000 r/min离心20 min，收集上清液后用5 mol/L HCl将pH调至4.3，离心，收集蛋白沉淀物，冷冻干燥并在4-10℃储存备用，即为蛋白原料；

2）蛋白酶解：

将步骤1）所得蛋白原料加蒸馏水搅拌均匀，混合成8%的蛋白溶液，用5 mol/LNaOH中和至中性（即pH为7.0），然后于95℃条件下加热30min使其完全变性。用5 mol/L HCl将pH值调至2.0，加入蛋白溶液质量0.40%的胃蛋白酶，于37℃酶解4h。用5 mol/L NaOH将pH值调至7.6，加入蛋白溶液质量0.40%的胰酶（所述胰酶由质量比为10:3的胰蛋白酶和α-糜蛋白酶混合组成），于37℃酶解6h。酶解结束后中和酶解液，离心、取上清液，4-10℃低温备用；

3）分离纯化：

将步骤2）所得上清液用3 kDa截留分子量的超滤膜进行超滤，然后采用NGC色谱系统进一步分离，色谱条件如下：流动相A为含0.1%三氟乙酸的甲醇，流动相B为含0.1%三氟乙酸的超纯水。流速7.5 mL/min，流动相A由55%升至60%，线性梯度洗脱60min。检测波长为220nm，色谱柱为Shim-pack GIS C₁₈制备柱，内径250mm，柱长20cm，粒度10μm。使用收集器收集并筛选高ACE抑制活性洗脱峰对应的组分，即收集保留时间在7.6-8.2min的组分（见图1，图中主要有5个洗脱峰，其中峰4的保留时间在7.6-8.2min），浓缩后于-60℃冷冻干燥。将收集到的多肽样品使用Nano-LC-ESI-MS/MS进行质谱鉴定（见图2），鉴定到活性肽的序列为：Cys-Tyr（CY）。

实施例2

一种人工合成芝麻多肽的方法，其采用固相合成法人工合成。基本流程如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接到固相载体上了；其次将氨基被Fmoc基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的多肽。该方法合成的芝麻二肽Cys-Tyr（CY），其液相与质谱分析图见图3和图4。此高纯度合成肽的主要离子峰质荷比为284.4，符合需要合成序列的分子量，说明固相合成成功。

上述采用固相合成法合成芝麻多肽的具体过程参见：①黄惟德、陈常庆著，多肽合成，科学出版社，1985年。②.N.休厄德、H.D.贾库布克著，刘克良等译，肽：化学与生物学，科学出版社，2005年。），该芝麻多肽也可以委托相应的多肽生物公司进行合成，因其化学合成过程不是本申请的重点所在，故本申请此处不再对化学合成过程进行详细赘述。

抑制活性应用试验

ACE抑制活性的测定试验按照以下方法进行：

将多肽样品用蒸馏水溶解至适当浓度获得样液，用96孔板作为反应容器。将15μL样液（无抑制的反应液中以蒸馏水代替）与30μL底物溶液（底物为4.66mmol/L马尿酰-组氨酰-亮氨酸HHL的氯化钠磷酸缓冲液）混合，然后加入30μL浓度 12.5mU/mL ACE酶液（对照液中以蒸馏水代替）混匀，于37℃水浴反应30min。然后加入125μL 1.2 mol/L NaOH终止酶反应。接着在反应液中加入30μL含2%邻苯二甲醛（OPA）的甲醇溶液，混合均匀，室温下静置20min后加入40μL 6 mol/L HCl溶液终止衍生反应。将反应溶液稀释10倍后使用荧光光谱仪测定荧光吸收强度，测定条件为：激发波长340nm，发射波长455nm，狭缝宽度5nm。使用SPSS 13.0软件计算半数抑制浓度(IC₅₀)。样液的ACE抑制活性的计算公式如下：

ACE抑制率(%) = [1- (a-c)/(b-d)] × 100

式中：a为抑制剂与ACE都存在时的荧光吸收强度；

b为抑制剂不存在而ACE存在时的荧光吸收强度；

c为抑制剂存在而ACE不存在时的荧光吸收强度；

d为抑制剂与ACE都不存在时的荧光吸收强度。

以ACE抑制活性的IC₅₀值为指标进行芝麻多肽的ACE抑制活性应用试验，测试分析实施例1从芝麻蛋白中提取的芝麻活性肽CY和实施例2采用人工合成的芝麻活性肽CY的ACE抑制活性，具体结果见下表1。

表1、实施例1和2所得芝麻二肽CY的ACE抑制活性结果

由表1可知：本发明芝麻活性肽CY具有强ACE抑制活性，长期食用可预防、缓解、控制、辅助治疗高血压的目的，可用于开发治疗高血压的保健品或药物。

综上可以看出：本发明芝麻二肽ACE抑制肽不仅可以通过蛋白酶解、分离纯化获得，还可以通过化学固相合成的方法进行人工合成。本发明通过测定ACE抑制活性发现：该活性肽具有很强的ACE抑制活性，属于食源性降压肽，分子量小，具有易吸收、溶解度好、低致敏性等特点，可以用于制备降血压药物，作为添加剂或者活性药物添加至食品、医药、保健品、化妆品、日化用品等多种行业和领域，具有广阔的应用开发前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此。凡依本发明申请专利范围所做的均等改变与修饰，都应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种从芝麻蛋白中制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取芝麻蛋白：将芝麻饼粕粉碎、脱脂，加蒸馏水混匀后采用碱溶酸沉法提取蛋白，离心，收集所得蛋白沉淀物并冷冻干燥，即为蛋白原料；

2）蛋白酶解：将步骤1）所得蛋白原料加蒸馏水混匀获得5-8%的蛋白溶液，中和至中性，然后于90-95℃条件下加热20-30min；用酸将pH值调至1.5-2.2，加入胃蛋白酶酶解3.5-4.5h，再用碱将pH值调至7.6-8.5，加入胰酶酶解5.5-6.5h，酶解结束后中和酶解液，离心、取上清液；

3）分离纯化：将步骤2）所得上清液用3kDa的超滤膜进行超滤，然后采用NGC色谱系统进一步分离，收集保留时间在7.6-8.2min的组分，浓缩后冷冻干燥即得。

2.如权利要求1所述从芝麻蛋白中制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，步骤2）中，胃蛋白酶与蛋白溶液添加量比例为0.40-0.42g：100g，胰酶与蛋白溶液添加量比例为0.40-0.42g：100g，酶解温度为36-38℃。

3.如权利要求2所述从芝麻蛋白中制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，所述胰酶由质量比为10:2-4的胰蛋白酶和α-糜蛋白酶混合组成，酶解温度控制在37℃。

4.如权利要求2至3任一所述从芝麻蛋白中制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，步骤3）中，NGC色谱系统的条件为：流动相A为含0.1%三氟乙酸的甲醇，流动相B为含0.1%三氟乙酸的超纯水；流速7.5 mL/min，流动相A由55%变化至60%，线性梯度洗脱60min；检测波长为220nm，色谱柱为Shim-pack GIS C₁₈制备柱。

5.芝麻来源的ACE抑制肽在制备降血压药物中的应用，其特征在于，该ACE抑制肽由两个氨基酸组成，其序列为Cys-Tyr。