CN107987149A - 一种生物活性肽、寡聚核苷酸及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物活性肽技术领域，具体涉及生物活性肽、寡聚核苷酸及其制备方法和应用，具体的为源自酪蛋白的抗氧化肽MPFPK。经过广泛深入研究，发现本发明的生物活性肽MPFPK具有很好的抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化和泡沫细胞形成的能力；而血浆LDL的氧化修饰与动脉粥样硬化(AS)的发生发展有密切的关系。因此，本发明的酪蛋白抗氧化肽用于食品和保健品领域，具有很高的社会效益和经济效益。

Description

一种生物活性肽、寡聚核苷酸及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种来源于酪蛋白的生物活性肽，编码生物活性肽的寡聚合甘酸及其制备方法和应用。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病的主要病理基础，是指动脉及其分支动脉壁内膜下脂质沉积，内膜灶状纤维化，形成状如粥样物质的斑块，致使管壁变硬、管腔狭窄或破裂、血管阻塞，最后机体发生功能障碍，诱发一系列心脑血管疾病。AS及其并发症严重危害着人类的健康，拥有极高的发病率和死亡率，而我国居民动粥疾病已超过癌症，成为中国死亡率最高的疾病。
到目前为止，AS的发病机制仍未完全清楚，涉及多种危险因素，是一个多阶段慢性血管壁病变的过程，存在多种病理学说，其中“炎症学说”，“脂质氧化学说”被越来越多学者重视和认同，炎症介质参与动脉粥样硬化整个发生发展过程，而低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein，LDL)氧化修饰产生的氧化型低密度脂蛋白(oxidized low densitylipoprotein，Ox-LDL)是AS发病形成过程的中心环节。天然的LDL主要功能是负责胆固醇的运输，其核心组分是胆固醇酯和甘油三酯，表面还存在游离胆固醇、磷脂和载脂蛋白B-100(apoB-100)等。而Ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤并致使其功能性紊乱，经清道夫受体进入巨噬细胞并进行分化等一系列作用导致泡沫细胞的形成，促使血管平滑肌细胞的迁移和增殖，影响血小板粘附聚集等机制促进AS的发生和发展。Khan等研究发现Ox-LDL参与并促进了内皮细胞的激活，是AS形成早期的一个重要事件。经研究证实，Ox-LDL经巨噬细胞的清道夫受体、CD36等受体识别并被大量吞噬摄取，造成细胞内胆固醇大量积累，从而形成饱含脂质的泡沫细胞，并沉积在血管壁上，慢慢堆积、钙化，发展成为粥样硬化斑块，这是AS早期最明显的病理特征。因为LDL氧化成Ox-LDL促使动脉粥样硬化的发生、发展，这就给抗氧化剂抑制LDL氧化来防治动脉粥样硬化提供了理论依据。抗氧化剂可以分为合成抗氧化剂和天然抗氧化剂，而天然的抗氧化剂安全性更高，越来越受青睐。
从蛋白中提取的抗氧化活性肽，因其营养价值高、来源丰富及其自身的天然性和安全性而成为药物和食品领域研究的热点，在抑制LDL氧化方面具有很大的潜力。Ahn等从大马哈鱼蛋白酶解得到的肽组分具有抗氧化和抗炎的功能，抑制自由基和炎性因子的产生，保护Raw264.7巨噬细胞。王婵制备了不同电荷性质的酪蛋白抗氧化肽组分，各组分经Caco-2细胞转运前后均可使LDL氧化时间延长，尤其是碱性肽组分延滞时间最长，具有较强的抑制LDL氧化的能力。本发明从酪蛋白水解物中分离鉴定了1条抗氧化活性肽(KEMPFPK)对LDL氧化和泡沫细胞形成的显著的抑制作用，可用于预防动脉粥样硬化的功能食品或保健品。
发明内容
本发明的目的是提供一条具有高抗氧化活性的多肽序列，及其作为抗氧化剂的用途。
本发明所述的多肽序列为：KEMPFPK
其中，M表示英文名称Methionine，中文名称为蛋氨酸(甲硫氨酸)的氨基酸的相应残基；
P表示英文名称Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸的相应残基；
F表示英文名称Phenylalanine，中文名称为苯丙氨酸的氨基酸的相应的残基；
K表示英文名称Lysine,中文名称为赖氨酸的氨基酸的相应的残基；
E表示英文名称Glutamic acid，中文名称为谷氨酸的氨基酸的相应的残基。
为了实现上述目的及其他相关目的，本发明的技术方案如下：
一种生物活性肽，所述生物活性肽包括SEQ ID NO：1的序列或SEQ ID NO：1的衍生物。
进一步的改进，所述生物活性肽的序列为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的衍生物。
一种寡聚核苷酸，所述寡聚核苷酸可翻译为包括SEQ ID NO：1序列的生物活性肽。
进一步的改进，所述寡聚核苷酸可翻译为序列为SEQ ID NO：2的生物活性肽。
上述的生物活性肽用作抗氧化剂。
进一步的改进，生物活性肽用于抑制低密度脂蛋白氧化和/或抑制泡沫细胞形成。
进一步的改进，生物活性肽用于作为或添加到增强机体免疫力和/或抗衰老的食品、保健品或药物中。
一种生物活性肽的制备方法，包括如下步骤：
步骤一)酶解：用碱性蛋白酶对酪蛋白进行水解反应形成复溶液；
步骤二)离子交换法分离抗氧化肽：采用Sephadex C-25阳离子交换柱对步骤一)的复溶液进行分离，收集不同峰下组分的样品，各样品脱盐处理后，再次旋转蒸发浓缩并冷冻干燥存于-80℃备用；
步骤三)分别用TEAC法、ORAC法、测定各样品抑制低密度脂蛋白氧化的能力；
步骤五)筛选得到能够抑制低密度脂蛋白氧化和/或抑制泡沫细胞形成的样品。
进一步的改进，所述样品为生物活性肽，生物活性肽的序列为SEQ ID NO：1或SEQID NO：2。
进一步的改进，所述步骤五中的能够抑制低密度脂蛋白氧化和/或抑制泡沫细胞形成的样品通过HPLC法测定得到分子量，通过HPLC-异硫氰酸苯酯柱前衍生方法测定得到氨基酸组成，通过建立巨噬细胞诱导建立低密度脂蛋白氧化模型进一步确定抑制低密度脂蛋白氧化和/或抑制泡沫细胞形成的能力。
具体的上述的生物活性多肽制备方法，包括如下步骤：
1)酶法制备酪蛋白抗氧化肽：采用碱性蛋白酶酶解酪蛋白，底物浓度为5％(w/v)，酶与底物比2％(w/w)，反应在恒温水浴箱中进行，设定酶解温度为60℃，酶解时间为4h，控制酶解过程的pH为8.0。酶解结束后，立即高温煮沸灭酶，室温冷却后调节溶液pH至7.0。旋转蒸发浓缩，冷冻干燥存于-80℃备用，得到生物活性肽粗提取物；
2)离子交换法分离抗氧化肽：采用Sephadex C-25阳离子交换柱对步骤1)的复溶液进行分离，所用流动相为醋酸缓冲液(20mM，pH＝5.0)，流速为2.0mL/min，进样量为500mg，收集不同峰下不同组分的样品，脱盐处理后，再次旋转蒸发浓缩并冷冻干燥存于-80℃备用；
3)分子量分布测定：采用HPLC法测定不同酪蛋白抗氧化组分的分子量，其中采用的分析柱为TSK gel G2000 SWXL(7.8x300mm)，流动相为0.1％TFA+45％乙腈溶液，流速为0.5ml/min，检测波长214nm，时间30min，样品浓度为2mg/mL。标品aprotini(6512Da)、bactutracin(1423Da)、WPWW(四肽，674Da)、NCS(三肽，322Da)、Gly-Ser(二肽，146Da)的洗脱时间对log分子量作图得到标准曲线y＝-0.1881x+6.5867(R2＝0.9954，y：logMW，x：洗脱时间)；
4)氨基酸组成分析：采用HPLC-异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生方法测定不同酪蛋白抗氧化组分的氨基酸组成。柱前衍生法中，将100μL异硫氰酸苯酯(0.1M)和100μL三乙胺(1M)与200μL样品(2mg/mL)混合于包锡箔纸的离心观众，涡旋震荡充分混匀，放置于室温黑暗条件下反应1h。反应结束后，向其中加入400μL正己烷，涡旋混合震荡1min，静置10min。HPLC分析条件为：A为磷酸缓冲溶液(10mM，pH6.9)；B为色谱级乙腈。流速1mL/min，检测波长为254nm，进样量：10μL。
5)不同电荷性质肽组分抗氧化活性的测定：分别用TEAC法、ORAC法、测定抑制LDL氧化能力(丙二醛含量测定)等方法测定不同组分的抗氧化能力；
6)验证酪蛋白肽组分对LDL氧化及荷脂细胞胆固醇含量的影响：通过建立巨噬细胞诱导建立LDL氧化模型并对模型今昔染色和进一步分析。
本发明第二方面，提供了前述生物活性多肽MPFPK或其衍生物在制备抗氧化或/和抑制LDL氧化和泡沫细胞形成的食品、保健品及药物中的应用。
本发明的生物活性多肽MPFPK或其衍生物可以用于酸奶、成人配方奶粉等乳制品以及各种食品、减少自由基对皮肤伤害的化妆品。
本发明的第三方面，提供了一种抗氧化药物，包含前述生物活性多肽MPFPK或前述活性生物多肽的衍生物。
所述的多肽衍生物，是指在多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
本发明提供的以上多肽是通过酪蛋白水解、并从中分离纯化的，通过质谱鉴定。本发明的抗氧化肽具有较高的ABTS清除活性、ORAC活性以及抑制脂质过氧化、抑制巨噬细胞吞噬以及泡沫细胞形成的功能活性。本发明提供的具有高抗氧化活性的多肽可以作为抗氧化剂用于食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。
本发明的优点在于：(1)发明了未见报道的具有高抗氧化活性(ABTS清除活性、ORAC活性和抑制脂质过氧化活性)的肽序列；(2)发明的多肽是寡肽，分子量小，易吸收；(3)发明的抗氧化肽结构简单，人工合成方便，易于工业化生产，在食品、医药、饲料和化妆品领域中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为ABTS自由基清除力—Trolox标准曲线图；
图2酪蛋白肽的抗氧化活性图，其中图A表示TEAC活性，图B表示ORAC活性；
图3为油红O染色后巨噬细胞的形态。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施过程及方式之前，应理解本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案及手段；还应当理解，本发明案例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不限制本发明的保护范围。除非另外定义，本发明中所使用的所有技术和科学术语与本技术领域通常定义相同。根据本技术临沂的技术人员对现有技术的账务及本发明过程的记载，与本发明实施例中使用的具体方法、设备、参数、实验材料相似或等同的现有任何技术和方法可以用于实现本发明。
实施例1活性肽MPFPK的发现
一、酪蛋白的提取及水解物制备
将500g脱脂乳粉(新西兰恒天然Anchor)溶于500mL去离子水形成乳浊液，加入500mL浓度为0.2mol/L的醋酸＝醋酸钠缓冲溶液将其pH调至4.6，40℃水浴30min，冷却至室温，以离心力5000xg离心15min，弃去上清液，沉淀即为酪蛋白粗制品。取粗制品水洗三次，5000xg离心15min，弃去上清液，用1:1的乙醚-乙醇溶液洗涤一次，布氏漏斗抽滤，取沉淀，冷冻干燥后于-20℃保藏待用。
二、生物多肽混合物的制备和确认
采用酪蛋白提取物与pH8.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置5％(w/v)的水解液(5％(w/v)水解液的制备为将5g脱脂乳粉加入100mL水中，下同)。随后，将购买的碱性蛋白酶(丹麦Novozyme公司)活化以2％的量接种到5％(w/v)的水解液中，将反应装置置于60℃恒温震荡水浴箱中，反应时间4h，即完成酶解反应。取每10mL酶解液于50mL离心管进行离心，离心条件：4℃，10000xg，离心时间为15min。取上清液，冻干后隔氧保存于-20℃待用。
三、生物活性多肽的氨基酸组成分析
1、实验方法
(1)抗氧化肽组分的制备和分离纯化
采用Sephadex C-25分离抗氧化肽，并采用HPLC法测定不同酪蛋白抗氧化肽组分的分子量。
(2)不同抗氧化肽组分的氨基酸组成分析
对不同酪蛋白抗氧化肽组分的氨基酸组成分采用HPLC-异硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生法进行测定。抗氧化肽的电荷性质宏观上反映其内在氨基酸组成差异，带负电的肽组分含有相对较多的酸性氨基酸，而带正电荷的肽组分中碱性氨基酸含量相对较多。
2.实验结果
实施例2酪蛋白肽抗氧化活性的测定
1.TEAC法
TEAC法，即测定ABTS自由基的清除率，参照Re等[93]实验方法。将7.0mmol/L的ABTS·和2.45mmol/L过硫酸钾浓度混匀，用锡箔纸包裹避光，并置于黑暗环境下室温放置12-16h，即得到ABTS·储备液。在测量样品时，用0.20mol/L pH＝7.4磷酸缓冲液稀释，使其在734nm下吸光值为0.70±0.02，即为ABTS·工作液。
标准曲线的绘制：分别以0-2.50mmol/L Trolox作为标准品，测定其ABTS自由基清除率。即取40.0μL不同浓度下的Trolox标准品，加入4.0mL ABTS·工作液，充分摇匀30s，在避光条件下反应6min，于734nm处测定其吸光值。以40.0μL去离子水作为空白对照。
ABTS自由基清除率计算公式表示为：ABTS自由基清除率(％)＝(A0-A1)/A0×100
其中，A0为对照组在734nm波长处的吸光度值；A1为待测样品在734nm波长处的吸光度值。以Trolox标准品浓度(mmol/L)作为横坐标，ABTS·+清除率(％)作为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示。
样品的测定：取40.0μL样品(5.0mg/mL)，加入4.0mL ABTS·工作液，充分摇匀30s，避光反应6min，于734nm下测定其吸光度值，以去离子水代替样品作为空白对照，实验重复3次。计算样品的ABTS自由基清除率，并根据标准曲线如图1计算Trolox当量(单位：μmol/g)。
2.ORAC法
ORAC法根据抗氧化剂的保护面积Net AUC作为评价抗氧化剂的抗氧化能力的方法。抗氧化剂作用下荧光衰退曲线下的面积与无抗氧化剂存在时的荧光衰退曲线下的面积之差，即为荧光衰退曲线下净面积Net AUC。
ORAC测定方法采用Qu提出以荧光素钠盐作为荧光物质的方法，并经过Dávalos等改进，并做适当调整。所有反应试剂均用75mmol/L pH＝7.4的磷酸缓冲溶液配制。制备70nmol/L的荧光工作液，和12mmol/L AAPH溶液，均现用现配，避光保存。采用黑色96孔酶标板测量，先将20μL样品(浓度10-20μg/mL)和120μL荧光工作液加入每个小孔内，于37℃条件下孵育12min，之后采用排枪添加AAPH溶液60μL，迅速放入多功能酶标仪内进行。以磷酸缓冲液代替样品作为空白对照。
测定参数：激发光485nm，发射光520nm，温度37℃，每1min测定一次荧光值，并在每次读数前唯恐震荡2s，连续测定120min。
Net AUC的计算公式：Net AUC＝AUCsample-AUCblank
其中，AUCsample代表样品的荧光衰退面积，AUCblank代表空白对照的荧衰退面积。待测样品的Net AUC值均换算成Trolox的当量。
标准曲线的绘制：分别以10-80μmol/L Trolox作为标准品，以磷酸缓冲液为空白对照，按照上述方法进行测定。以Trolox浓度(μmol/L)为横坐标，NetAUC为纵坐标，绘制标准曲线。
3.抑制LDL氧化能力(丙二醛含量测定)
取0.2mL样品(2mg/ml)与0.2mL LDL溶液(400ug/ml)混合均匀，预先孵育1h，再加入4μL CuSO4溶液(1mM)引发氧化反应。在37℃下反应2h后，加入10μL EDTA(1mM)混合均匀而终止氧化。以蒸馏水代替样品作为LDL氧化对照组(Cu2+-LDL)，以蒸馏水代替样品和CuSO4作为正常对照组(LDL)。按照MDA试剂盒方法进行测定，MDA的含量以nmol/ml表示。
4.抑制LDL氧化能力(延迟时间的测定)
参照罗阳超[121]的研究方法，并做适当的调整。LDL和待测样品均用磷酸缓冲溶液(75mmol/L，pH＝7.4)配制。在UV-96孔板中，分别加入20μL待测样品(5mg/mL)，再取20μLLDL(250μg/mL)加入到每个孔内，立即采用多通道移液枪加入140μL磷酸缓冲溶液，充分混匀，随后在37℃环境下避光预热10min。最后在96孔板内加入20μL的CuSO4溶液(25μmol/mL)，引发氧化反应。以磷酸缓冲溶液替代样品和CuSO4溶液作为空白组，以磷酸缓冲溶液替代样品作为对照组。每组三个重复。设置测定参数：测定波长234nm，反应温度为37℃，每10min测定一次吸光值，连续测定600min。以时间为横坐标，以每10min测定的吸光值为纵坐标，绘制LDL氧化曲线，计算LDL氧化延迟时间。
5.巨噬细胞诱导LDL氧化模型的建立
5.1Raw264.7细胞的培养
用快速融化法复苏Raw264.7细胞，用含10％(v/v)胎牛血清、1％(v/v)双抗(0.1mg/mL链霉素和100U/mL的请青霉素组成)的DMEM培养液作为细胞培养基，并在37℃、相对湿度90％、5％的CO2气流的培养箱中进行培养，每天更换一次培养液。Raw264.7细胞生长较快，待培养瓶中细胞覆盖瓶底70％时，及时传代，否则细胞易发生分化，伸出伪足，形态发生改变。5.2模型的建立
将生长良好的Raw 264.7细胞以5×104个/mL浓度接种到96孔板(100μL)，培养12h后弃去培养基。设置正常细胞对照组、空白组(无细胞仅培养液)、Cu2+-LDL处理组(5μMCu2+，50、100、200μg/ml LDL)，加入新鲜培养基，每孔均100μL，每组4孔，孵育培养24、48、72h。根据细胞存活率(>80％)确定LDL的浓度和培养时间，建立模型，用于后续实验。
细胞存活率的检测—MTT法：培养结束后，弃去培养基，加入新鲜的培养基100μL，再加入20μL的5mg/mL MTT，孵育4h后，均弃去，最后加入100μL DMSO，摇床混匀10min，用酶标仪在500nm处测定OD值。
细胞存活率(％)＝(OD处理组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100
6.酪蛋白肽对巨噬细胞诱导LDL氧化的作用
6.1细胞存活率的检测(MTT法)
将生长良好的Raw 264.7细胞以5×104个/mL浓度接种到96孔板(100μL)，培养12h后弃去培养基。设置模型组、不同抗氧化肽组分处理组(终浓度1mg/ml)、正常细胞对照组、空白组(无细胞仅培养液)，加入新鲜培养基，每孔均100μL，每组4孔，孵育培养24h。按照上述MTT方法进行细胞存活率的测定。
6.2丙二醛含量的测定
将生长良好的Raw264.7细胞以5×104/mL的密度接种到24孔板(1mL)，采用无酚红DMEM细胞培养基培养12h后，去掉培养基。设置模型组、不同抗氧化肽处理组(终浓度1mg/ml)和正常细胞对照组，加入新鲜培养基，在37℃条件下进行孵育24h。在结束时，加入10μLEDTA(1mM)终止氧化，取细胞上清液进行MDA含量的测定。按照MDA试剂盒进行测定，MDA的含量以nmol/ml表示。
6.3油红O染色
将生长良好的Raw 264.7细胞以4×105个/mL浓度接种到6孔板(2mL)，培养12h后弃去培养基。设置模型组、不同抗氧化肽处理组(终浓度1mg/ml)和正常细胞对照组，加入新鲜培养基，在37℃条件下进行孵育24h。培养结束后，弃去培养基，用HBSS缓冲液清洗2次，然后进行油红O染色。
油红O染色的方法：(1)准备试剂：油红O原液与蒸馏水以3:2比例混匀，静置10min后过滤得油红O工作液(现用现配)；4％多聚甲醛溶化至澄清透明；蒸馏水配制60％异丙醇(2)染色步骤：4％多聚甲醛固定15-20min，用蒸馏水清洗；加入60％异丙醇进行分化，10-20s后弃去；油红O工作液染色10min，用60％异丙醇稍微漂洗一下，再用蒸馏水清洗2-3次；最后在倒置显微镜下观察，并进行拍照。
6.4荷脂细胞胆固醇含量的测定
将生长良好的Raw 264.7细胞以4×105个/mL浓度接种到6孔板(2mL)，培养12h后弃去培养基。设置模型组、抗氧化肽处理组(终浓度1mg/ml)和正常细胞对照组，加入新鲜培养基，在37℃条件下进行孵育24h。培养结束后，弃去培养基，用HBSS缓冲液清洗2次去除残存培养基，每孔加入0.1mL细胞裂解液，混匀静止10min。收集细胞裂解液，室温12000r/min离心10min，取上清液备用。
分别按照总胆固醇(TC)和游离胆固醇(FC)试剂盒进行测定，选取的波长为550nm。分别绘制总胆固醇标准品、游离胆固醇标准品浓度与吸光值OD的标准曲线，如图2所示。胆固醇酯含量等于总胆固醇与游离胆固醇的差值，因测定过程中反应时间和温度对细胞游离胆固醇的影响较大，一般采用胆固醇酯与总胆固醇的比值来衡量细胞胆固醇的多少。
用BCA法蛋白定量试剂盒对裂解上清液进行蛋白含量的测定。以蛋白浓度校正胆固醇的含量(mg/g prot)。
7.Ox-LDL诱导Raw264.7源荷脂细胞模型的建立
在Ox-LDL与Raw264.7细胞孵育24h前提下，以细胞存活率(>80％)和胞内胆固醇累积形态(油红O染色)为指标，确定Ox-LDL合适的浓度，诱导巨噬细胞转化荷脂细胞阶段。
7.1细胞存活率的检测(MTT法)
将生长良好的Raw 264.7细胞以5×104/mL浓度接种到96孔板(100μL)，培养12h后弃去培养基。将Ox-LDL用培养基配置成20、50、80、100ug/ml，加入96孔板内。正常细胞对照组不加Ox-LDL，空白组仅为细胞培养液。每个组4个重复，继续培养24h后，采用MTT法测定吸光值，方法同4.3.1.2，计算不同浓度Ox-LDL对细胞的存活率。
7.2油红O染色
同3.1细胞培养方法进行培养和接板，设置Ox-LDL处理组(20、50、80、100ug/ml)、不加Ox-LDL正常细胞对照组。然后按照4.3油红O染色的方法进行染色。
7.3酪蛋白肽对Ox-LDL诱导Raw264.7源荷脂细胞模型的作用
7.3.1细胞存活率的测定(MTT法)
将生长良好的Raw 264.7细胞以5×104个/mL浓度接种到96孔板(100μL)，培养12h后弃去培养基。设置Ox-LDL模型组、不同组分抗氧化肽处理组(终浓度1mg/mL)、不加Ox-LDL和样品的正常细胞对照组，Ox-LDL和样品均用培养基配置。每孔100μL，每个组4个重复，继续培养24h后，采用MTT法测定吸光值，方法同4.3.1.2，计算抗氧化肽组分对模型中巨噬细胞的存活率的影响。
7.3.2荷脂细胞胆固醇含量的测定
同3.1细胞培养方法进行培养和接板，设置Ox-LDL模型组、不同组分抗氧化肽处理组(终浓度1mg/mL)、不加Ox-LDL和样品的正常细胞对照组。测定方法同4.4。
8.数据处理与统计分析
所有实验数据重复测定三次，实验数据表示为平均值±标准差(SD)的形式。采用统计软件SPSS 17.0(SPSS Inc.,Chicago,IL)进行方差分析，利用Duncan多重检验分析各组数据间的显著差异性(P<0.05)。
实施例3生物活性肽抑制低密度脂蛋白过氧化反应及抑制泡沫细胞形成实验
1.TEAC和ORAC活性
由图2可知，与还原型谷胱甘肽的TEAC(Trolox，2.1mmol/g)和ORAC(Trolox，2.29mmol/g)活性相比，7个酪蛋白肽的抗氧化活性都很小，其中MPFPK的TEAC(Trolox，19.8μmol/g)和ORAC(Trolox，0.5mmol/g)活性最强。
2.抑制LDL氧化能力
通常，反映LDL氧化易感性的两个主要指标氧化延迟时间和达最大氧化速率时间(Tmax)，LDL氧化生成的脂质过氧化物代表其氧化的程度。本实验采取了LDL氧化延迟时间和LDL氧化脂质过氧化产物MDA的含量两个指标，来研究这些肽对LDL的氧化抑制作用。
2.1 LDL氧化延迟时间
表1所示的是7个不同电荷性质的多肽对LDL氧化延迟时间的影响结果。与对照组相比，这些肽均具有抑制LDL氧化的能力，使LDL氧化时间显著性延长(P<0.05)。PVEPF、EMPFPK对LDL氧化延迟时间随着净正电荷增多而增加，MPFPK与KEMPFPK净电荷相同，对LDL氧化延迟时间没有显著性差异(P>0.05)，表明多肽正电荷(Lys)能够提高对LDL氧化的抑制作用。QPH、HQPH对LDL氧化延迟时间随着净正电荷增多也增加，KEMPFPK和HQPH有相同的净电荷，但HKEMPFPK的延迟时间显著高于HQPH，这可能是因为它们所带正电荷的氨基酸种类不同，提示正电荷Lys比His在抑制LDL氧化方面有更强的作用。
表1 酪蛋白肽对Cu2+诱导LDL氧化延迟时间的影响
Table 5-3 Effects of casein peptides on Lag time of LDL oxidationinduced by Cu2+
2.2 MDA生成量的抑制作用
表2 酪蛋白肽对MDA生成的影响
Table 5-4 Inhibitory effects of casein peptides on oxidation of MDAcontent
在Cu2+诱导LDL氧化修饰模型中，加入不同酪蛋白肽，测定其脂质过氧化物产物MDA含量，结果如表2所示。与模型组相比，这2个肽都能显著性抑制MDA的生成量(P<0.05)。经计算得到它们对MDA生成量的抑制率。
3.酪蛋白肽对LDL氧化-巨噬细胞模型中MDA生成量的抑制作用
从表3中可以看出，与其他肽段相比，MPFPK、KEMPFPK对MDA生成量的抑制作用较强。
表3 酪蛋白肽对MDA生成的影响
Table 5-5Inhibitory effects of casein peptides on MDA content
4.酪蛋白肽对LDL氧化-巨噬细胞模型中胞内胆固醇含量的影响
表4 细胞内胆固醇和胆固醇酯的含量(mg/g细胞蛋白)
Table 5-6 Content of cholesterol and CE in macrophages(mg/g cellprotein)
注：*：vs对照组，P<0.01；#：vs模型组，P<0.05
在LDL氧化-巨噬细胞模型上，研究酪蛋白肽对巨噬细胞源荷脂细胞胆固醇含量的影响，测定结果如表4所示。与对照组相比，模型组细胞内TC、FC和CE含量增加，胆固醇酯所占比例显著性升高，达到50.8％(P<0.01)。第一组多肽PVEPF、EMPFPK和KEMPFPK处理组的细胞胆固醇酯的比重随着正电荷Lys增多而降低，PVEPF与模型组无显著性差异(P>0.05)，但EMPFPK和KEMPFPK均能降低细胞胆固醇的蓄积。
5.如图3所示，酪蛋白肽对Ox-LDL诱导的荷脂细胞内脂滴的影响
选用50μg/mL Ox-LDL诱导巨噬细胞24h成荷脂细胞模型，酪蛋白肽进行处理，经油红O染色，细胞内脂质堆积在形态学上的改变如图3所示。正常细胞形态多为圆形，偶见伸出伪足，胞内未见红色脂滴。模型组中，可见有些细胞内有红色脂滴，甚至有的细胞发生破裂，有大量的脂滴聚集，符合典型的泡沫细胞形态。与模型组相比，经多肽处理的细胞形态有些变化，尤其是MPFPK处理组，细胞内红色脂滴含量减少。
6.酪蛋白肽对Ox-LDL诱导的荷脂细胞胆固醇含量的影响
选用50μg/mL Ox-LDL诱导巨噬细胞24h成荷脂细胞，细胞内胆固醇的含量测定结果如表5-示。正常细胞CE/TC比重为35.6％，模型组内TC、FC和CE均有增加，其CE/TC比重达到56.2％，两者具有显著性差异(P<0.01)。与模型组相比，只有KEMPFPK这两个肽处理的巨噬细胞胆固醇含量显著性下降(P<0.05)，表明可以减少荷脂细胞内胆固醇的蓄积，表明对早期泡沫细胞具有一定的抑制作用。
表5 细胞内胆固醇和胆固醇酯的含量(mg/g细胞蛋白)
Table 5-7 Content of cholesterol and CE in macrophages(mg/g cellprotein)
注：*：vs对照组，P<0.01；#：vs模型组，P<0.05
上述各生物活性肽，均可人工合成对应编码的核苷酸序列，然后导入细胞或微生物进行表达合成。
序列表
<110> 澳优乳业（中国）有限公司
<120> 一种生物活性肽、寡聚核苷酸及其制备方法和应用
<141> 2017-12-29
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
Met Pro Pro Pro Leu
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
Leu Gly Met Pro Pro Pro Leu
1 5

Claims (10)

1.一种生物活性肽，其特征在于，所述生物活性肽包括SEQ ID NO：1的序列或SEQ IDNO：1的衍生物。
2.如权利要求1所述的生物活性肽，其特征在于，所述生物活性肽的序列为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的衍生物。
3.一种寡聚核苷酸，其特征在于，所述寡聚核苷酸可翻译为包括SEQ ID NO：1序列的生物活性肽。
4.如权利要去3所述的寡聚核苷酸，其特征在于，所述寡聚核苷酸可翻译为序列为SEQID NO：2的生物活性肽。
5.如权利要求1或2所述的生物活性肽用作抗氧化剂。
6.如权利要求5所述的生物活性肽用于抑制低密度脂蛋白氧化和/或抑制泡沫细胞形成。
7.如权利要求1或2所述的生物活性肽用于作为或添加到增强机体免疫力和/或抗衰老的食品、保健品或药物中。
8.一种生物活性肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一)酶解：用碱性蛋白酶对酪蛋白进行水解反应形成复溶液；
步骤二)离子交换法分离抗氧化肽：采用Sephadex C-25阳离子交换柱对步骤一)的复溶液进行分离，收集不同峰下组分的样品，各样品脱盐处理后，再次旋转蒸发浓缩并冷冻干燥存于-80℃备用；
步骤三)分别用TEAC法、ORAC法、测定各样品抑制低密度脂蛋白氧化的能力；
步骤五)筛选得到能够抑制低密度脂蛋白氧化和/或抑制泡沫细胞形成的样品。
9.如权利要求8所述的生物活性肽的制备方法，其特征在于，所述样品为生物活性肽，生物活性肽的序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。
10.如权利要求7所述的生物活性肽的制备方法，其特征在于，所述步骤五中的能够抑制低密度脂蛋白氧化和/或抑制泡沫细胞形成的样品通过HPLC法测定得到分子量，通过HPLC-异硫氰酸苯酯柱前衍生方法测定得到氨基酸组成，通过建立巨噬细胞诱导建立低密度脂蛋白氧化模型进一步确定抑制低密度脂蛋白氧化和/或抑制泡沫细胞形成的能力。
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