CN105777865A - 具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽、其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽，所述鱼肉耐消化肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1‑11所示。通过使用动物蛋白水解复合酶对鱼肉蛋白进行水解，离心，取上清液；利用截留分子量为3000Da的超滤膜对上清液进行超滤，收集滤液，然后浓缩、冷冻干燥得到。本发明的具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽具有较好的自由基清除能力，且所述鱼肉耐消化肽在经过胃肠道的消化和吸收后仍然能够保持很好的抗氧化能力；另外，本发明是以天然鱼类为原料，制得的鱼肉耐消化肽安全、无毒。本发明的制备方法简单，可以有效地解决鱼肉耐消化肽产业化生产问题，具有较高的社会效益和经济效益。

Description

具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽、其制备方法和用途
技术领域
本发明属于水产食品加工领域，具体地说，涉及一种具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽、其制备方法和用途。
背景技术
人体内活性氧自由基(ROS)的产生会对生物大分子，例如脂质、蛋白质、DNA以及核酸等造成氧化性损伤，而这些氧化性的损伤又会增加诸多疾病(癌症、心血管疾病等)的发生。通过额外补充抗氧化剂可以帮助人体维持体内的氧化应激水平，预防衰老和疾病的发生。其中天然抗氧化剂，例如鱼肉耐消化肽，由于其蛋白来源丰富及其自身的安全性而备受瞩目。蛋白质在发酵、酶解或消化过程中，鱼肉耐消化肽可以从这些蛋白质母体中释放出来。这些鱼肉耐消化肽具有清除自由基、供氢/供电子、螯合金属离子、淬灭单线态氧、分解过氧化物、抑制脂肪氧合酶活力和抑制脂质过氧化等功效。但是这些鱼肉耐消化肽经口服在体内发挥抗氧化功能前，会受到一系列的阻碍，如胃中的低酸环境和胃蛋白酶；肠道中碱性环境和胰蛋白酶、肽酶；以及小肠对鱼肉耐消化肽吸收的屏障作用等。这些因素都会影响鱼肉耐消化肽的吸收从而影响其在生物体内的生理活性。鱼肉耐消化肽进入血液循环到达靶点是其发挥功能的前提条件。
鱼肉中蕴含丰富的蛋白质、多肽和功能性氨基酸等生物活性物质，具有很高的营养价值。近年来国内外报道了许多以鱼肉为原料的活性肽方面的研究，然而尚未发现以鱼肉为原料制备鱼肉耐消化肽，利用体外消化吸收模型模拟其消化吸收，并利用LS-MS/MS鉴定能够完整吸收的多肽的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽。
本发明的另一目的是提供所述具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽的制备方法和用途。
为了实现本发明目的，本发明的具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽，所述鱼肉耐消化肽的氨基酸序列为GIITN、GFAGDDAPR、YETDAIQ R、DSYVGDEAQSK、VAEQELVDASER、LEQQVDDLEGSLEQEK、NLQQEISDLTEQLGETGK、AGFAGDDAPR、SYELPDGQVITIGNER、FAGDDAPR、QADSVAELGEQIDNLQR(SEQ ID NO:1-11)。
本发明还提供所述鱼肉耐消化肽的制备方法，包括以下步骤：
1)用水清洗鱼肉，将鱼肉绞碎得到鱼肉碎末，向鱼肉碎末中加入水中，得到鱼肉样品溶液，于37-50℃水浴中保持10-20min，然后用均质机在10000-15000rpm条件下匀浆1-5min，得到鱼肉匀浆液；
2)向步骤1)的鱼肉匀浆液中加入动物蛋白水解复合酶进行水解，得到鱼肉水解液；
3)对步骤2)的鱼肉水解液进行灭酶处理后离心，取上清液；
4)用截留分子量为3000Da的超滤膜对步骤3)的上清液进行超滤分离，收集的滤液经浓缩、冷冻干燥后，得到的冻干粉末中富含具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽。
前述的方法，步骤1)中向鱼肉碎末中加入1.0-4.0倍鱼肉碎末重量的水。本发明中使用的水为纯净水、去离子水或蒸馏水。
前述的方法，步骤2)中在进行水解之前，先用1mol/L的NaOH或HCl将鱼肉匀浆液的pH值调至7.0-8.0，温度调至37-50℃，然后加入动物蛋白水解复合酶进行水解。其中，动物蛋白水解复合酶与鱼肉的质量比为1:50-250，水解时间为0.5-3h。
本发明中述及的动物蛋白水解复合酶购自南宁庞博生物工程有限公司，主要由蛋白内切酶、外切酶和风味酶等组成。
前述的方法，步骤3)中灭酶方式为：将鱼肉水解液加热到85℃维持20min，或加热到100℃，维持10min；灭酶后在3000-8000g下离心10-20min，取上清液。
本发明述及的鱼肉可以是任何来源的鱼肉，例如，所述鱼肉来自罗非鱼、鲢鱼、草鱼或鳕鱼等。
本发明还提供所述具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽在制备功能保健食品或化妆品中的应用。
本发明进一步提供所述具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽制备的功能保健食品或化妆品。
本发明具有以下优点：
(一)本发明的具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽具有较好的抗氧化能力，能够很好地清除自由基。
(二)本发明的具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽在经过胃肠道的消化和吸收后仍然能够保持很好的抗氧化能力，可以作为功能性食物成分。
(三)本发明的具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽是以天然鱼类为原料，经过动物蛋白水解复合酶水解得到，可作为安全、无毒的食品添加剂使用。
(四)本发明的具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽制备方法简单，易实现产业化生产，具有较高的社会效益和经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例4中具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽吸收转运前后HPLC图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的动物蛋白水解复合酶购自南宁庞博生物工程有限公司，主要由蛋白内切酶、外切酶和风味酶等组成。
实施例1鳕鱼具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽及其制备
鳕鱼具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽的制备方法如下：
(1)将鳕鱼鱼肉500g用清水洗净，用绞碎机将鱼肉绞碎，然后向鱼肉碎末中加入3.0倍鱼肉重量的水1500g，在37℃水浴中放置15min，再用均质机在12000rpm条件下匀浆3min，得到鱼肉匀浆液2000g。
(2)用1mol/L的NaOH或HCl将步骤(1)中的鱼肉匀浆液pH调至7.0，温度调节为40℃，然后加入动物蛋白水解复合酶，酶与鱼肉的质量比为1:100，酶解3小时，然后将水解液在100℃条件下煮沸灭酶10min，5000g下离心15min，收集上清液。
(3)用截留分子量为3000Da的超滤膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液，然后将滤液进行浓缩、冷冻干燥，得到的冻干粉末中富含鳕鱼具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽。
实施例2草鱼具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽及其制备
草鱼具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽的制备方法如下：
(1)将300g草鱼鱼肉用清水洗净，用绞碎机将鱼肉绞碎，然后向鱼肉碎末中加入2.0倍鱼肉重量的水600g，在45℃水浴中放置10min，再用均质机在12000rpm条件下匀浆2min，得到鱼肉匀浆液900g。
(2)用1mol/L的NaOH或HCl将步骤(1)中的鱼肉匀浆液pH调至7.5，温度调节为40℃，然后加入动物蛋白水解复合酶，酶与鱼肉的质量比为1:200，酶解2小时，然后将水解液在100℃条件下煮沸灭酶10min，5000g下离心15min，收集上清液。
(3)用截留分子量为3000Da的超滤膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液，然后将滤液进行浓缩、冷冻干燥，得到的冻干粉末中富含草鱼具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽。
实施例3鲢鱼具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽及其制备
鲢鱼具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽的制备方法如下：
(1)将600g鲢鱼鱼肉用清水洗净，用绞碎机将鱼肉绞碎，然后向鱼肉碎末中加入3.0倍鱼肉重量的水1800g，在50℃水浴中放置10min，再用均质机在15000rpm条件下匀浆5min，得到鱼肉匀浆液2400g。
(2)用1mol/L的NaOH或HCl将步骤(1)中的鱼肉匀浆液pH调至8.0，温度调节为45℃，然后加入动物蛋白水解复合酶，酶与鱼肉的质量比为1:250，酶解3小时，然后将水解液在85℃条件下煮沸灭酶20min，7000g下离心15min，收集上清液。
(3)用截留分子量为3000Da的超滤膜对步骤(2)所得的上清液进行超滤，收集滤液，然后将滤液进行浓缩、冷冻干燥，得到的冻干粉末中富含鲢鱼具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽。
实施例1-3中述及的具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽序列如下：GIITN、GFAGDDAPR、YETDAIQR、DSYVGDEAQSK、VAEQELVDASER、LEQQVDDLEGSLEQEK、NLQQEISDLTEQLGETGK、AGFAGDDAPR、SYELPDGQVITIGNER、FAGDDAPR、QADSVAELGEQIDNLQR。
实施例4具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽的抗氧化活性测定、模拟胃肠消化吸收以及主要成分的鉴定
实验样品：实施例1-3中制得的具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽(待测样品)；人工合成肽YETDAIQR、DSYVGDEAQSK、VAEQELVDASER、LEQQVDDLEGSLEQEK、NLQQEISDLTEQLGETGK(对照样品)。
实验方法：
1、TEAC法测定抗氧化能力
以去离子水配制ABTS·+母液，其中ABTS·+的浓度为7mmol/L，过硫酸钾的浓度为2.45mmol/L，将其置于黑暗环境中室温下放置12-16h，即得到ABTS·+母液；ABTS·+母液用0.2mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，使其在734nm下的吸光值为0.70±0.02，得到ABTS·+工作液。测量过程中采用96孔酶标板，首先将10μL样品和50μL PBS加入每个小孔，之后用排枪添加100μL ABTS·+工作液，然后迅速将孔板放入多功能酶标仪内，读取6min后414nm处的吸光值，根据以下公式计算自由基清除能力，其中，以去离子水替代试样，所测的吸光度作为对照，
Trolox标准曲线制作:以0-300μM Trolox为标准品，其浓度为横坐标，自由基清除率为纵坐标绘制标准曲线。然后将样品的自由基清除率代入Trolox标准曲线，得到相应的Trolox当量。
2、ORAC法测定抗氧化能力
以荧光素钠盐作为荧光物质，所有反应试剂均用75mmol/L，pH7.4的磷酸缓冲液溶解并配置，20μL待测样品(浓度为10-20μg/mL)与120μL荧光工作液(70nmol/L)先后加入黑色96孔板内，混合液在37℃条件下孵育12min，然后用多通道加液器迅速加入60μL AAPH溶液(12mmol/L)于96孔板各个反应孔中。最后将黑色96孔板放入多功能酶标仪中进行测定。
测定参数：激发波长：485nm，发射波长：520nm，反应温度：37℃，每次读数之前微孔板振荡2s，每1min测定一次荧光值，连续测定120min。
Net AUC＝AUC样品-AUC空白，式中：AUC样品代表样品的荧光衰退面积，AUC空白代表空白对照的荧光衰退面积。
其中，AUC的计算公式为：
式中：f0代表反应0min时的初始荧光值，fi代表反应i min时的荧光值。
标准曲线制作：以Trolox作为标准品，浓度范围为10-80μmol/L，以GSH(还原型谷胱甘肽)作为阳性对照，以75mmol/L，pH 7.4的磷酸缓冲液作为空白对照，采用相同的测定方法，监测120min内，荧光值的变化。以Trolox浓度为横坐标，NetAUC为纵坐标，绘制标准曲线。
3、清除DPPH自由基能力测定
将鱼肉蛋白抗氧化溶于去离子水中配制成浓度为20μg/mL的溶液，取1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振荡混匀，室温下避光30min，然后在517nm下测定体系的吸光值。空白对照为将样品溶液用去离子水替换。
DPPH自由基清除能力％＝[(空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值]×100
4、对收集的鱼肉耐消化肽进行体外模拟胃肠消化
称取60.0mg鱼肉耐消化肽溶于5.5mL浓度为0.010mol/L的盐酸溶液中。按照酶/底物(E/S)＝1:50的比例用0.010mol/L盐酸溶液作为溶剂配制浓度为2.4mg/mL的胃蛋白酶溶液(pH＝2.0)，将待消化的底物溶液与胃蛋白酶溶液分别置于37℃预热15min，然后取0.5mL胃蛋白酶溶液加入待消化的底物溶液中，置于37℃恒温水浴振荡器中，计时模拟胃消化2h。
按照酶/底物(E/S)＝1:25配制浓度为8mg/m的胰酶溶液，待上述模拟胃消化结束后，用0.9mol/L的NaHCO3溶液将消化液pH值调节至5.3，再用2.0mol/L的NaOH溶液将其pH值继续调节至7.5，然后取0.1mL胰酶溶液加入上述消化液中，置于37℃恒温水浴振荡器中，计时模拟肠消化2h。
模拟胃肠消化结束后，消化液立即置于沸水浴中灭酶10min，待其冷却至室温，用0.01M的HCl溶液将其pH值调至7.0。
5、对收集的鱼肉耐消化肽进行体外模拟胃肠吸收
模拟肠吸收采用Caco-2细胞模型，以含20％(V/V)胎牛血清、1％(V/V)非必需氨基酸、1％(V/V)双抗(100U/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素组成的双抗)的培养液(Dulbecco's Modified Eagle Medium，简称DMEM)作为Caco-2细胞培养基，将Caco-2细胞置于细胞培养瓶中(25cm2)，于37℃、相对湿度为90％、5％的CO2培养箱中进行培养，每两天换一次细胞培养液，待细胞在培养瓶中培养融合至80％左右时，用含有0.05％EDTA的胰酶进行消化，将细胞消化悬液吹打均匀后以4-5×105/mL的密度接种于6孔Transwell板的上侧(AP侧)，同时下侧(BL侧)加入3mL细胞培养基，于细胞培养箱中进行培养，接种后每两天更换一次细胞培养基，并通过Millicell电阻仪测定细胞单层的跨膜电阻值，待细胞培养21天并且跨膜电阻达到400Ω.cm2以上时，可以用于鱼肉耐消化肽吸收转运实验；
在吸收实验前，用HBSS清洗Caco-2细胞模型两次，洗涤后置于细胞培养箱中平衡30min，然后弃去HBSS，在AP侧加入1.5mL溶于HBSS中的模拟胃肠消化后的鱼肉耐消化肽(10mg/mL)溶液，Transwell培养板放入细胞培养箱中，37℃孵育2h完成吸收实验，收集BL侧溶液，冷冻干燥，即为胃肠消化吸收的鱼肉耐消化肽。
6、鱼肉耐消化肽质谱鉴定
对于能够耐受胃肠消化和吸收而不被降解的肽，采用nanoACQUITY UPLC超高效液相色谱与电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF)联用的方法进行肽序列鉴定：
液相条件：富集柱为Symmetry C18(180μm×20mm，5um)，分析柱为nanoACQUITYUPLC超高效液相色谱键合乙烷杂颗粒柱BEH C18(75um×250mm,1.7um)，柱温35℃，流速为200nL/min，检测波长214nm；流动相A液为含0.1％甲酸水溶液，流动相B液为含0.1％甲酸乙睛溶液，流动相C液为含0.1％甲酸水溶液；进样后的前5min通过预柱脱盐(样品在预柱中用C液脱盐)，随后通过梯度洗脱经C18毛细管柱进行肽段分离；分析柱梯度洗脱条件：5～65min，10％～85％的流动相B液；65～85min，85％流动相B液，85～95min,A液平衡分析柱；
质谱条件：正离子模式，源温100℃，锥孔电压40V，毛细管电压3KV，一级质谱质量扫描范围350～1500Da，二级质谱扫描范围50～2000Da；采用DDA模式对肽段自动进行MS/MS测定；质谱仪的校正是用Glu-fib的串联碎片校正的，质量误差小于1pp，雾化气为氮气，碰撞气为氩气；
数据分析：质谱数据原始文件分析采用Waters公司的PLGS2.4软件进行，从原始MS/MS谱中产生PKL格式的数据文件，然后利用Matrixscience公司的Mascot软件进行MS/MSIon Search检索；肽段De novo测序采用Waters公司的Masslynx 4.1的peptide sequence软件。
以实施例1中制得的具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽为例进行如下分析：
实验例1、具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽抗氧化能力测定
对经超滤膜超滤得到的具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽及其胃肠消化吸收物的抗氧化能力进行测定，所得结果见表1。
表1本发明具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽在消化吸收前后抗氧化活性的实验结果
注：a、b表示在p<0.05水平下有显著差异。
可见，本发明的具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽经模拟胃肠消化吸收后TEAC值基本不变，清除DPPH自由基的能力有所下降。
实验例2、耐受胃肠消化的具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽质谱鉴定
将上述实验例中模拟胃肠消化吸收后的具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽进行LC-ESI-MS/MS检测，鉴定其中在吸收前后肽序列没有发生改变的肽段，通过比对，在胃肠消化和吸收阶段同时出现的肽段，即为耐受胃肠消化吸收的肽段，耐受胃肠消化吸收鱼肉耐消化肽的鉴定结果见表2。
表2经质谱鉴定具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽中耐消化肽序列
实验例3、耐消化肽的合成以及抗氧化活性和耐消化性的验证
从上述鉴定的耐消化肽中挑选其中的2条YETDAIQR、DSYVGDEAQSK进行固相合成(苏州强耀生物科技有限公司)，合成肽的纯度>90％，然后利用此合成的肽段验证其耐消化性和抗氧化能力，其中合成肽耐消化性的验证采用液相检测，条件如下：
色谱柱：ZORBAX SB-C18(250×4.6mm)
流动相：A相为含0.1％三氟乙酸的超纯水，B相为含0.1％三氟乙酸的80％的乙腈，洗脱条件0-35min，B 5％-30％；35-45min，B30％-100％；45-50min，B 100％。
流速：1.0mL/min，检测波长：220nm，进样量：10μL。
测定结果见表3和图1。
表3具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽的抗氧化能力测定结果
注：a、b表示在p<0.05水平下有显著差异。
可见，两条合成肽都具有很好的抗氧化能力，尤其是ORAC活性显著高于同浓度的谷胱甘肽(p＜0.05)。在模拟胃肠消化吸收前后的液相谱图基本一致，没有新的色谱峰生成，表明鉴定的耐消化肽确实能够耐受胃肠的消化和吸收而不被降解。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽，其特征在于，所述鱼肉耐消化肽的氨基酸序列为GIITN、GFAGDDAPR、YETDAIQR、DSYV GDEAQSK、VAEQELVDASER、LEQQVDDLEGSLEQEK、NLQQEISDLTEQLGETGK、AGFAGDDAPR、SYELPDGQVITIGNER、FAG DDAPR、QADSVAELGEQIDNLQR。
2.权利要求1所述鱼肉耐消化肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用水清洗鱼肉，将鱼肉绞碎得到鱼肉碎末，向鱼肉碎末中加入水中，得到鱼肉样品溶液，于37-50℃水浴中保持10-20min，然后用均质机在10000-15000rpm条件下匀浆1-5min，得到鱼肉匀浆液；
2)向步骤1)的鱼肉匀浆液中加入动物蛋白水解复合酶进行水解，得到鱼肉水解液；
3)对步骤2)的鱼肉水解液进行灭酶处理后离心，取上清液；
4)用截留分子量为3000Da的超滤膜对步骤3)的上清液进行超滤分离，收集的滤液经浓缩、冷冻干燥后，得到的冻干粉末中富含具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中向鱼肉碎末中加入1.0-4.0倍鱼肉碎末重量的水，所述水为纯净水、去离子水或蒸馏水。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中在进行水解之前，先用1mol/L的NaOH或HCl将鱼肉匀浆液的pH值调至7.0-8.0，温度调至37-50℃，然后加入动物蛋白水解复合酶进行水解。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中动物蛋白水解复合酶与鱼肉的质量比为1:50-250，水解时间为0.5-3h；所述动物蛋白水解复合酶主要由蛋白内切酶、外切酶和风味酶组成。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)中灭酶方式为：将鱼肉水解液加热到85℃维持20min，或加热到100℃，维持10min；灭酶后在3000-8000g下离心10-20min，取上清液。
7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于，所述鱼肉来自罗非鱼、鲢鱼、草鱼或鳕鱼。
8.权利要求1所述具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽在制备功能保健食品或化妆品中的应用。
9.由权利要求1所述具有抗氧化功能的鱼肉耐消化肽制备的功能保健食品或化妆品。
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