CN110938130A

CN110938130A - 一种生物活性多肽rvfqplphenkpltl及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110938130A
Application number: CN201911086877.6A
Authority: CN
Inventors: 张少辉; 占文静; 李明逸; 范梦珠; 张伯宇; 栾媛媛; 郭婷婷; 李阜烁
Original assignee: Zhejiang Peptide Life Health Science And Technology Co Ltd; Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Zhejiang Peptide Life Health Science And Technology Co Ltd; Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2039-11-08
Also published as: CN110938130B

Abstract

本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL及其制备方法和应用，生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL其氨基酸序列为Arg‑Val‑Phe‑Gln‑Pro‑Leu‑Pro‑His‑Glu‑Asn‑Lys‑Pro‑Leu‑Thr‑Leu。经过体外抗炎活性实验、免疫调节实验，验证了多肽RVFQPLPHENKPLTL具有较好的抗炎功能和免疫调节活性，一方面，本发明的生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL能够促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率；另一方面，有较好的免疫调节活性，能够提高巨噬细胞吞噬中性红能力，提高生命的质量，对开发具有抗炎功能、免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

Description

一种生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及一种生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL及其制备方法和应用。

背景技术

随着生活水平的提高，人们对饮食的要求从“追求量”转变为对“质”的追求。因此对具有特殊功能的生物活性肽的研究成为热点。近些年来，人们发现一些食物来源的多肽类物质具有良好的生物活性，如玉米短肽、大豆肽、牛乳多肽等。而且实验验证可能具有免疫调节、抗菌、抗癌、抗炎、降血压等功能。

这些多肽可以通过微生物发酵、消化酶解等多种途径得到，并且大多具有生物活性的多肽是由2～20个氨基酸残基组成，分子量小于6000Da，含有一定量的疏水氨基酸、芳香族氨基酸。

巨噬细胞是机体抵御外界有害物质入侵的第二道防线，广泛存在于机体各种组织中，是主要免疫应答细胞，通过吞噬及分泌细胞因子参与免疫应答、抗炎等生物学功能，在免疫系统中发挥着重要的作用。对于巨噬细胞中存在的多肽具有的功能进行研究。

目前，现有技术中有一些关于抗衰老生物活性肽的研究，但是具有抗氧化或抗衰老功能的不同于现有多肽的新的生物活性多肽仍然是目前需要进一步研究的方向，以进一步扩大生物活性多肽的多样性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL及其制备方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面，提供一种生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL，其氨基酸序列为Arg-Val-Phe-Gln-Pro-Leu-Pro-His-Glu-Asn-Lys-Pro-Leu-Thr-Leu，如SEQ ID NO：1所示。

较优的，所述生物活性多肽为小鼠骨髓来源巨噬细胞肽。具体来源于Cystatin-B蛋白，并且为Cystatin-B蛋白第68～82位的氨基酸残基。Cystatin-B蛋白氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

Cystatin-B蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码Cystatin-B蛋白第68～82位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL。

较优的，所述生物活性多肽具有抗炎和免疫调节功能。

本发明第二方面，提供了所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。

本发明第三方面，提供了所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL在制备具有抗炎功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。

本发明第四方面，提供了所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL在制备具有免疫调节功能的食品、保健品或药物中的应用。

本发明第五方面，提供了所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL在制备同时具有抗炎和免疫调节功能的食品、保健品或药物中的应用。

具体而言，本发明的生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL可以用于制备减少自由基对皮肤伤害的化妆品、制备具有抗炎和/或免疫调节的药物。

本发明第六方面，提供了一种抗炎产品，包括所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL或所述生物活性多肽VASNLNLKPGECLKVRGEV A的衍生物；所述的抗炎产品包括抗炎食品、抗炎保健品、抗炎药物或抗炎化妆品；所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的衍生物，是指在生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。

本发明第七方面，提供了一种免疫调节产品，包括所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL或所述生物活性多肽VASNLNLKPGECLKVRGEV A的衍生物；所述的免疫调节产品包括免疫调节食品、免疫调节保健品或免疫调节药物；所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的衍生物，是指在生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。

本发明第八方面，提供了一种同时具有抗炎功能和免疫调节功能的产品，包括所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL或所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的衍生物；具有抗炎功能和免疫调节功能的产品包括食品、保健品或药物；所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的衍生物，是指在生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。

本发明生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的有益效果为：本发明的小鼠骨髓来源巨噬细胞生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL具有较好的抗炎活性和免疫调节活性；一方面，本发明的生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL能够促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率；另一方面，有较好的免疫调节活性，能够提高巨噬细胞吞噬中性红能力，提高生命的质量，对开发具有抗炎功能、免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

附图说明

图1：质量色谱提取图(m/z＝597.0109)；

图2：质荷比为597.0109的片段的二级质谱图；

图3：质荷比为597.0109的多肽az、by断裂情况。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1活性肽RVFQPLPHENKPLTL的人工合成

一、生物活性肽的合成

1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。

2. 2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。

3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。

4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。

5.称取氨基酸Arg适量和1-羟基-苯骈三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。

6. 2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。

7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。

8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。

9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。

10. 1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。

11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。

12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Val、Phe、Gln、Pro、Leu、Pro、His、Glu、Asn、Lys、Pro、Leu、Thr、Leu。

13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。

至此，人工合成了生物活性肽RVFQPLPHENKPLTL。

二、生物活性肽的确认

1)UPLC分析

UPLC条件如下：

仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱仪

色谱柱规格：BEH C18色谱柱

流速：0.4mL/min

温度：50℃

紫外检测波长：210nm

进样量：2μL

梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈

2)质谱分析

质谱条件如下：

离子方式：ES+

质量范围(m/z)：100-1000

毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0

采样锥(V)：35.0

离子源温度(℃)：115

去溶剂温度(℃)：350

去溶剂气流(L/hr)：700.0

碰撞能量(eV)：4.0

扫描时间(sec)：0.25

内扫描时间(sec)：0.02

根据以上分析方法，利用超高效液相-电喷雾-四级杆-飞行时间质谱，对生物活性肽RVFQPLPHENKPLTL进行色谱分析和质谱分析，其质量色谱提取图如图1所示，提取此峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2和3所示，可得此峰的多肽质荷比为597.0109Da，保留时间是40.9min。

3)结果

由图3可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比597.0109Da的片段序列为Arg-Val-Phe-Gln-Pro-Leu-Pro-His-Glu-Asn-Lys-Pro-Leu-Thr-Leu(RVFQPLPHENKPLTL)，记为SEQ ID NO：1。该片段与Cystatin-B蛋白第68～82位的残基序列相对应，Cystatin-B蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAH56170.1，序列见SEQ IDNO：2。

实施例2生物活性肽的抗炎活性实验

一、生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定(Griess法)

1.实验试剂及仪器：

试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠骨髓巨噬细胞来源生物活性肽RVFQPLPHENKPLTL；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。

仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。

2.试验方法：

加入细胞个数为2×10⁶/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24h时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48h后，收集培养液上清50μl/孔，在培养液上清中依次添加Griess试剂1和Griess试剂2各50μl/孔，室温反应10分钟后，在540nm波长下测定吸光度值(OD540)。

3.实验结果及分析：

表1生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)

实验结果见表1，由表1可知，在实验组中添加生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL，浓度分别为1mg/mL和0.5mg/mL，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用。与细胞空白组相比，具有显著性差异(P<0.01)。当生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的添加浓度为0.1mg/mL，在LPS造炎症情况下相比，也能促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加，并具有显著性差异(P<0.01)。但是与正常情况下生长的细胞空白组相比，没有显著性差异。说明生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。

实施例3生物活性肽的免疫调节活性实验

一、生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验

1.实验试剂及仪器：

试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的乳源性生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。

2.实验方法：

加入细胞个数为2×10⁶/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含活性肽RVFQPLPHENKPLTL(1mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(OD540)。

3.实验结果及分析：

表2生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定

实验分组	炎症组吸光度值(OD540)
		空白组	0.1079±0.0314
实验组	0.1351±0.0114**

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)

**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)

实验结果见表2，与细胞空白相比较，添加1mg/ml生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有显著性差异(P＜0.01)。说明生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海交通大学；浙江辉肽生命健康科技有限公司

<120> 一种生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Val Phe Gln Pro Leu Pro His Glu Asn Lys Pro Leu Thr Leu

1 5 10 15

<210> 2

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Met Cys Gly Ala Pro Ser Ala Thr Met Pro Ala Thr Ala Glu Thr

1 5 10 15

Gln Glu Val Ala Asp Gln Val Lys Ser Gln Leu Glu Ser Lys Glu Asn

20 25 30

Gln Lys Phe Asp Val Phe Lys Ala Ile Ser Phe Lys Arg Gln Ile Val

35 40 45

Ala Gly Thr Asn Leu Phe Ile Lys Val Asp Val Gly Gly Asp Lys Cys

50 55 60

Val His Leu Arg Val Phe Gln Pro Leu Pro His Glu Asn Lys Pro Leu

65 70 75 80

Thr Leu Ser Ser Tyr Gln Thr Asn Lys Glu Arg His Asp Glu Leu Ser

85 90 95

Tyr Phe

Claims

1.一种生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL，其特征在于其氨基酸序列为Arg-Val-Phe-Gln-Pro-Leu-Pro-His-Glu-Asn-Lys-Pro-Leu-Thr-Leu。

2.根据权利要求1所述的一种生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL，其特征在于，所述生物活性多肽为小鼠骨髓来源巨噬细胞肽。

3.编码权利要求1所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的核苷酸片段。

4.如权利要求1所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的制备方法，其特征在于，通过基因工程的方法人工合成，或从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，或直接通过化学合成制备。

5.如权利要求1所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的应用，其特征在于，所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL在制备具有抗炎功能的食品、保健品、药物或化妆品中的应用。

6.如权利要求1所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的应用，其特征在于，所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL在制备具有免疫调节功能的食品、保健品或药物中的应用。

7.如权利要求1所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL的应用，其特征在于，所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL在制备具有抗炎和免疫调节功能的食品、保健品或药物中的应用。

8.一种抗炎产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL；所述的抗炎产品包括抗炎食品、抗炎保健品、抗炎药物或抗炎化妆品。

9.一种免疫调节产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL；所述的免疫调节产品包括免疫调节食品、免疫调节保健品、免疫调节药物或免疫调节化妆品。

10.一种具有抗炎和免疫调节功能的产品，其特征在于，包括如权利要求1所述生物活性多肽RVFQPLPHENKPLTL；具有抗炎和免疫调节功能的产品包括食品、保健品或药物。