CN112759636B - 具有氨基酸结构eslkgvdpkflr的生物活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白领域，具体涉及具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽及其制备方法和应用，具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽选自生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR中的一种或几种。经过体外免疫功能调节实验，验证了具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽具有较好的免疫调节功能。本发明具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽能显著促进体外巨噬细胞吞噬中性红能力，对炎症动物有很好的保护作用，并促进巨噬细胞活化并释放细胞因子，提高其在正常巨噬细胞静息状态下的作用，从而调节机体的免疫力，提高生命的质量，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
生物活性肽因其具有很多潜在的生物功能，所以引起人们越来越多的关注，成为科学研究的热点之一。目前很多生物活性肽的有益效果也已经得到了很好的证明，如抗癌、降血压、抗菌、降胆固醇、抗糖尿病等等特性。当前最权威的生物活性肽数据库BIOPEP-UMW中已报告了3000多个不同的生物活性肽，但是由于生活肽的数量实在是太多，所以，还有非常多的多肽有待研究其相关性能。
目前对于生物活性肽的研究多集中于食物衍生多肽，对非食物衍生多肽研究和报道较少。
免疫调节肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性肽。1981年Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗，具有抗炎功能。李素萍等人用合成的小鼠骨髓巨噬细胞来与源肽(PGPIPN)饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的抗炎功能有显著的增强。Bowdis等人在研究来源于牛中性粒细胞的13氨基酸肽indolicidin的免疫功能时发现，多肽indolicidin在巨噬细胞样细胞系中抑制LPS诱导的TNF-α产量。
当这些小肽未从蛋白质中酶解分离时，这些蛋白质本身往往是不具备免疫调节活性的。如何从已知氨基酸序列的种类繁多的蛋白质中寻找具有特定功能的生物活性肽，并研究这些多肽的功能是蛋白领域研究的方向之一。
60S ribosomal protein L29蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。目前，现有技术中并没有关于60S ribosomal protein L29蛋白多肽片段相关功能的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽及其制备方法和应用。具体而言，主要涉及四种具有相同氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR和生物活性肽YESLKGVDPKFLR及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽，选自生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR中的一种或几种；
生物活性肽ESLKGVDPKFLR的氨基酸序列为Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Val-Asp-Pro-Lys-Phe-Leu-Arg，如SEQ ID NO：1所示。
生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR的氨基酸序列为Gln-Arg-Tyr-Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Val-Asp-Pro-Lys-Phe-Leu-Arg，如SEQ ID NO：2所示。
生物活性肽RYESLKGVDPKFLR的氨基酸序列为Arg-Tyr-Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Val-Asp-Pro-Lys-Phe-Leu-Arg，如SEQ ID NO：3所示。
生物活性肽YESLKGVDPKFLR的氨基酸序列为Tyr-Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Val-Asp-Pro-Lys-Phe-Leu-Arg，如SEQ ID NO：4所示。
较优的，所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR为小鼠脾脏来源淋巴细胞肽。具体均来源于60S ribosomal protein L29蛋白，并且分别为60S ribosomal protein L29蛋白第30～41位、第27～41位、第28～41位和第29～41位的氨基酸残基。60S ribosomal protein L29蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
60S ribosomal protein L29蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码60S ribosomal protein L29蛋白第30～41位、第27～41位、第28～41位和第29～41位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性肽ESLKGVDPKFLR、QRYESLKGVDPKFLR、RYESLKGVDPKFLR和YESLKGVDPKFLR。
较优的，生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR具有抗炎功能和免疫调节功能。
本发明还提供编码所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR的多核苷酸。
本发明第二方面，提供了生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。
通过基因工程的方法人工合成所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR是本领域技术人员能够实现的技术方案，例如可以是以DNA重组技术为基础，通过合适的DNA模板来控制多肽的序列合成。
关于从细胞中通过分离纯化的方法直接获得的方式可以为：基于给定的生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR的氨基酸序列，采用生物学技术上常规的酶解、纯化方法从小鼠脾脏来源淋巴细胞获得所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR。
本发明第三方面，提供了具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽在制备具有抗炎功能的药物或化妆品中的应用，所述具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽选自生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR中的一种或几种。
具体而言，本发明的生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR可以用于制备具有抗炎的药物。
具体而言，本发明所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR中的一种或几种的组合在制备促巨噬细胞吞噬中性红能力的药物或化妆品中的应用。
本发明第四方面，提供了具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用，所述具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽选自生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR中的一种或几种。
具体而言，本发明所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR中的一种或几种的组合在制备促巨噬细胞分泌细胞因子的食物或药物中的应用。
本发明第五方面，提供了一种抗炎产品，包括所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR中一种或多种的组合或所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR的衍生物中的一种或几种的组合；所述的抗炎产品包括抗炎药物或抗炎化妆品。
本发明第六方面，提供了一种具有免疫调节功能的产品，包括所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR中一种或多种的组合或所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR的衍生物中的一种或几种的组合；所述具有免疫调节功能的产品包括具有免疫调节功能的食品或具有免疫调节功能的药物。
所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR的衍生物，是指与所述所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR相比具有相同的活性或更优的活性。
所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR的衍生物，是指在所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的生物活性肽衍生物。
本发明具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽的有益效果为：本发明所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR具有较好的抗炎活性；本发明所述生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR能显著促进体外巨噬细胞吞噬中性红能力，对炎症动物有很好的保护作用，并促进巨噬细胞活化并释放细胞因子，提高其在正常巨噬细胞静息状态下的作用，从而调节机体的免疫力，提高生命的质量，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。
附图说明
图1：质荷比为463.6013的片段的一级质谱图(m/z＝463.6013)；
图2：质荷比为463.6013的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
图3：质荷比为460.0048的片段的一级质谱图(m/z＝460.0048)；
图4：质荷比为460.0048的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
图5：质荷比为569.9901的片段的一级质谱图(m/z＝569.9901)；
图6：质荷比为569.9901的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
图7：质荷比为517.9561的片段的一级质谱图(m/z＝517.9561)；
图8：质荷比为517.9561的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1活性肽ESLKGVDPKFLR、QRYESLKGVDPKFLR、RYESLKGVDPKFLR和YESLKGVDPKFLR的人工合成
一、生物活性肽的合成
1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。
2.2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
5.称取氨基酸Glu适量和1-羟基-苯并三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6.2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10.1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Val-Asp-Pro-Lys-Phe-Leu-Arg。
13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将生物活性肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。
至此，人工合成了生物活性肽ESLKGVDPKFLR。
生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、RYESLKGVDPKFLR和YESLKGVDPKFLR的合成方法同上。
二、生物活性肽的确认
1)UPLC分析
UPLC条件如下：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪
色谱柱规格：BEH C18色谱柱
流速：0.4mL/min
温度：50℃
紫外检测波长：210nm
进样量：2μL
梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈
2)质谱分析
质谱条件如下：
离子方式：ES+
质量范围(m/z)：100、1000
毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0
采样锥(V)：35.0
离子源温度(℃)：115
去溶剂温度(℃)：350
去溶剂气流(L/hr)：700.0
碰撞能量(eV)：4.0
扫描时间(sec)：0.25
内扫描时间(sec)：0.02
根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对生物活性肽ESLKGVDPKFLR、QRYESLKGVDPKFLR、RYESLKGVDPKFLR和YESLKGVDPKFLR进行色谱分析和质谱分析。生物活性肽ESLKGVDPKFLR一级质谱图如图1所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为463.6013，保留时间是26.14min。生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR的质量色谱提取图如图3所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图4所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为460.0048，保留时间是26.14min。生物活性肽RYESLKGVDPKFLR的质量色谱提取图如图5所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图6所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为569.9901，保留时间是25.85min。生物活性肽YESLKGVDPKFLR的质量色谱提取图如图7所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图8所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为517.9561，保留时间是31.01min。
3)结果
由图2可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比463.6013的片段序列为Glu、Ser、Leu、Lys、Gly、Val、Asp、Pro、Lys、Phe、Leu、Arg(ESLKGVDPKFLR)，记为SEQ ID NO：1。该片段与60S ribosomal protein L29蛋白第30～41位的残基序列相对应，60S ribosomal protein L29蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAH82292.1，序列见SEQ ID NO：5。
由图4可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比460.0048的片段序列为Gln、Arg、Tyr、Glu、Ser、Leu、Lys、Gly、Val、Asp、Pro、Lys、Phe、Leu、Arg(QRYESLKGVDPKFLR)，记为SEQ ID NO：2。该片段与60S ribosomal protein L29蛋白第27～41位的残基序列相对应，60S ribosomal protein L29蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAH82292.1，序列见SEQ ID NO：5。
由图6可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比569.9901的片段序列为Arg、Tyr、Glu、Ser、Leu、Lys、Gly、Val、Asp、Pro、Lys、Phe、Leu、Arg(RYESLKGVDPKFLR)，记为SEQ ID NO：3。该片段与60S ribosomal protein L29蛋白第28～41位的残基序列相对应，60S ribosomal protein L29蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAH82292.1，序列见SEQ ID NO：5。
由图8可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比517.9561的片段序列为Tyr、Glu、Ser、Leu、Lys、Gly、Val、Asp、Pro、Lys、Phe、Leu、Arg(YESLKGVDPKFLR)，记为SEQ ID NO：4。该片段与60S ribosomal protein L29蛋白第29～41位的残基序列相对应，60S ribosomal protein L29蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAH82292.1，序列见SEQ ID NO：5。
实施例2生物活性肽的免疫调节活性实验
一、生物活性肽ESLKGVDPKFLR的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽ESLKGVDPKFLR；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性肽(0.5mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表1生物活性肽ESLKGVDPKFLR促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定
| 实验分组 | 吸光度值(OD540) |
| 空白组 | 0.1184±0.0291 |
| 实验组(0.5mg/ml) | 0.1748±0.0301* |
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表1，与细胞空白相比较，添加0.5mg/ml生物活性肽的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。说明生物活性肽ESLKGVDPKFLR在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。
二、生物活性肽ESLKGVDPKFLR的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6、8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源性生物活性肽ESLKGVDPKFLR；ELISA细胞因子快速试剂盒(TNF-α和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：LRH、250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL、22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素、过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。
3.实验结果及分析：
表2生物活性肽ESLKGVDPKFLR对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定
| 实验分组 | TNF-α | IL-6 |
| 细胞空白 | 0.113±0.023 | 1.218±0.041 |
| 生物活性肽(0.2mg/ml) | 0.385±0.022** | 2.184±0.052** |
| 生物活性肽(0.5mg/ml) | 0.683±0.472** | 2.572±0.201** |
| 生物活性肽(1mg/ml) | 0.138±0.181 | 1.214±0.052 |
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
从表2中可知，在TNF-α和IL-6这两种细胞因子的实验结果中，TNF-α和IL-6在0.2mg/ml和0.5mg/ml时均出现了极显著性差异(P＜0.01)，证明了一定浓度下的生物活性肽ESLKGVDPKFLR可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放TNF-α和IL-6，提高这些细胞因子在正常巨噬细胞静息状态下的作用。
三、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性肽(0.5mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表3生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定
| 实验分组 | 吸光度值(OD540) |
| 空白组 | 0.1204±0.0237 |
| 实验组(0.5mg/ml) | 0.2184±0.0264** |
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表3，与细胞空白相比较，添加0.5mg/ml生物活性肽的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有极显著性差异(P＜0.01)。说明生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。
四、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6、8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源性生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR；ELISA细胞因子快速试剂盒(TNF-α和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：LRH、250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL、22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素、过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。
3.实验结果及分析：
表4生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定
| 实验分组 | TNF-α | IL-6 |
| 细胞空白 | 0.128±0.025 | 1.232±0.037 |
| 生物活性肽(0.2mg/ml) | 0.473±0.032** | 2.385±0.015** |
| 生物活性肽(0.5mg/ml) | 0.634±0.087** | 2.478±0.051** |
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
从表4中可知，在TNF-α和IL-6这两种细胞因子的实验结果中，TNF-α和IL-6在0.2mg/ml和0.5mg/ml时均出现了极显著性差异(P＜0.01)，证明了一定浓度下的生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放TNF-α和IL-6，提高这些细胞因子在正常巨噬细胞静息状态下的作用。
五、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽RYESLKGVDPKFLR；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性肽(0.5mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表5生物活性肽RYESLKGVDPKFLR促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定
| 实验分组 | 吸光度值(OD540) |
| 空白组 | 0.1199±0.0263 |
| 实验组(0.5mg/ml) | 0.1896±0.0185** |
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表5，与细胞空白相比较，添加0.5mg/ml生物活性肽的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有极显著性差异(P＜0.01)。说明生物活性肽RYESLKGVDPKFLR在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。
六、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6、8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源性生物活性肽RYESLKGVDPKFLR；ELISA细胞因子快速试剂盒(TNF-α和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：LRH、250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL、22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素、过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。
3.实验结果及分析：
表6生物活性肽RYESLKGVDPKFLR对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定
| 实验分组 | TNF-α | IL-6 |
| 细胞空白 | 0.121±0.031 | 1.198±0.045 |
| 生物活性肽(0.2mg/ml) | 0.276±0.033* | 1.279±0.026* |
| 生物活性肽(0.5mg/ml) | 0.989±0.365** | 2.793±0.192** |
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
从表6中可知，在TNF-α和IL-6这两种细胞因子的实验结果中，TNF-α和IL-6在0.2mg/ml和0.5mg/ml时均出现了显著性差异，其中0.2mg/ml浓度时具有显著性差异(P＜0.05)，0.5mg/ml时浓度时具有极显著性差异(P＜0.01)，证明了一定浓度下的生物活性肽RYESLKGVDPKFLR可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放TNF-α和IL-6，提高这些细胞因子在正常巨噬细胞静息状态下的作用。
七、生物活性肽YESLKGVDPKFLR的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽YESLKGVDPKFLR；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性肽(0.5mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表7生物活性肽YESLKGVDPKFLR促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定
| 实验分组 | 吸光度值(OD540) |
| 空白组 | 0.1301±0.0383 |
| 实验组(0.5mg/ml) | 0.2265±0.0281** |
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表7，与细胞空白相比较，添加0.5mg/ml生物活性肽的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有极显著性差异(P＜0.01)。说明生物活性肽YESLKGVDPKFLR在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。
八、生物活性肽YESLKGVDPKFLR的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6、8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源性生物活性肽YESLKGVDPKFLR；ELISA细胞因子快速试剂盒(TNF-α和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：LRH、250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL、22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素、过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。
3.实验结果及分析：
表8生物活性肽YESLKGVDPKFLR对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定
| 实验分组 | TNF-α | IL-6 |
| 细胞空白 | 0.102±0.031 | 1.225±0.027 |
| 生物活性肽(0.2mg/ml) | 0.534±0.035** | 1.994±0.017** |
| 生物活性肽(0.5mg/ml) | 0.738±0.023** | 2.357±0.082** |
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
从表8中可知，在TNF-α和IL-6这两种细胞因子的实验结果中，TNF-α和IL-6在0.2mg/ml和0.5mg/ml时均出现了极显著性差异(P＜0.01)，证明了一定浓度下的生物活性肽YESLKGVDPKFLR可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放TNF-α和IL-6，提高这些细胞因子在正常巨噬细胞静息状态下的作用。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江辉肽生命健康科技有限公司
<120> 具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽及其制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ser Leu Lys Gly Val Asp Pro Lys Phe Leu Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Lys Gly Val Asp Pro Lys Phe Leu Arg
1 5 10 15
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Tyr Glu Ser Leu Lys Gly Val Asp Pro Lys Phe Leu Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Tyr Glu Ser Leu Lys Gly Val Asp Pro Lys Phe Leu Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Lys Ser Lys Asn His Thr Thr His Asn Gln Ser Arg Lys Trp
1 5 10 15
His Arg Asn Gly Ile Lys Lys Pro Arg Ser Gln Arg Tyr Glu Ser Leu
20 25 30
Lys Gly Val Asp Pro Lys Phe Leu Arg Asn Met Arg Phe Ala Lys Lys
35 40 45
His Asn Lys Lys Gly Leu Lys Lys Met Gln Ala Asn Asn Ala Lys Ala
50 55 60
Val Ser Ala Arg Ala Glu Ala Ile Lys Ala Leu Val Lys Pro Gln Ala
65 70 75 80
Ile Lys Pro Lys Met Pro Lys Gly Pro Lys Leu Lys Arg Leu Ala Phe
85 90 95
Ile Ala His Pro Lys Leu Gly Lys Arg Ile Arg Ser Tyr Met Ala Lys
100 105 110
Gly Gln Arg Leu Cys Gln Pro Lys Pro Lys Val Gln Thr Lys Ala Gly
115 120 125
Ala Lys Ala Pro Ala Lys Ala Gln Ala Ser Ala Pro Ala Gln Ala Pro
130 135 140
Lys Gly Ala Gln Ala Pro Lys Gly Ala Gln Ala Pro Val Lys Ala Pro
145 150 155 160
Claims (4)
1.具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽，其特征在于，选自生物活性肽ESLKGVDPKFLR、生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR、生物活性肽RYESLKGVDPKFLR或生物活性肽YESLKGVDPKFLR中的一种或几种；
生物活性肽ESLKGVDPKFLR的氨基酸序列为Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Val-Asp-Pro-Lys-Phe-Leu-Arg，
生物活性肽QRYESLKGVDPKFLR的氨基酸序列为Gln-Arg-Tyr-Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Val-Asp-Pro-Lys-Phe-Leu-Arg，
生物活性肽RYESLKGVDPKFLR的氨基酸序列为Arg-Tyr-Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Val-Asp-Pro-Lys-Phe-Leu-Arg，
生物活性肽YESLKGVDPKFLR的氨基酸序列为Tyr-Glu-Ser-Leu-Lys-Gly-Val-Asp-Pro-Lys-Phe-Leu-Arg。
2.编码权利要求1所述具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽的多核苷酸。
3.权利要求1所述具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽的制备方法，其特征在于，直接通过化学合成制备。
4.权利要求1所述具有氨基酸结构ESLKGVDPKFLR的生物活性肽在制备促巨噬细胞吞噬中性红能力的药物中的应用。
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