CN112724238B - 具有氨基酸结构fregttpkpk的生物活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白领域，具体涉及具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽及其制备方法和应用，具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽选自生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK中的一种或几种。经过体外免疫功能调节实验，验证了生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK具有较好的免疫调节功能。本发明生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK可促进巨噬细胞活化并释放细胞因子，提高机体免疫力，降低机体发病率，促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加，提高生命的质量，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
生物活性肽因其具有很多潜在的生物功能，所以引起人们越来越多的关注，成为科学研究的热点之一。目前很多生物活性肽的有益效果也已经得到了很好的证明，如抗癌、降血压、抗菌、降胆固醇、抗糖尿病等等特性。当前最权威的生物活性肽数据库BIOPEP-UMW中已报告了3000多个不同的生物活性肽，但是由于生活肽的数量实在是太多，所以，还有非常多的多肽有待研究其相关性能。
目前对于生物活性肽的研究多集中于食物衍生多肽，对非食物衍生多肽研究和报道较少。免疫调节肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性肽。1981年Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗，具有抗炎功能。李素萍等人用合成的小鼠骨髓巨噬细胞来与源肽(PGPIPN)饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的抗炎功能有显著的增强。Bowdis等人在研究来源于牛中性粒细胞的13氨基酸肽indolicidin的免疫功能时发现，多肽indolicidin在巨噬细胞样细胞系中抑制LPS诱导的TNF-α产量。
当小肽未从蛋白质中酶解分离时，这些蛋白质本身往往是不具备免疫调节活性的。如何从已知氨基酸序列的种类繁多的蛋白质中寻找具有特定功能的生物活性肽，并研究这些多肽的功能是蛋白领域研究的方向之一。
60S ribosomal protein L37蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。目前，现有技术中并没有关于60S ribosomal protein L37蛋白多肽片段相关功能的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽，选自生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK中的一种或几种；
生物活性肽FREGTTPKPK的氨基酸序列为Phe-Arg-Glu-Gly-Thr-Thr-Pro-Lys-Pro-Lys，如SEQ ID NO：1所示。
生物活性肽FREGTTPKPKRAA的氨基酸序列为Phe-Arg-Glu-Gly-Thr-Thr-Pro-Lys-Pro-Lys-Arg-Ala-Ala，如SEQ ID NO：2所示。
生物活性肽RHGFREGTTPKPK的氨基酸序列为Arg-His-Gly-Phe-Arg-Glu-Gly-Thr-Thr-Pro-Lys-Pro-Lys，如SEQ ID NO：3所示。
较优的，所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK为小鼠脾脏来源淋巴细胞肽。具体均来源于60S ribosomal protein L37蛋白，并且分别为60S ribosomal protein L37蛋白第78～87位、第78～90位和第75～87位的氨基酸残基。60S ribosomal protein L37蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
60S ribosomal protein L37蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码60S ribosomal protein L37蛋白第78～87位、第78～90位和第75～87位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性肽FREGTTPKPK、FREGTTPKPKRAA和RHGFREGTTPKPK。
较优的，所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK具有抗炎功能和免疫调节功能。
本发明还提供编码所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK的多核苷酸。
本发明第二方面，提供了所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。
通过基因工程的方法人工合成所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK是本领域技术人员能够实现的技术方案，例如可以是以DNA重组技术为基础，通过合适的DNA模板来控制多肽的序列合成。
关于从细胞中通过分离纯化的方法直接获得的方式可以为：基于给定的生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK的氨基酸序列，采用生物学技术上常规的酶解、纯化方法从小鼠脾脏来源淋巴细胞获得所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK。
本发明第三方面，提供具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽制备具有抗炎功能的药物或化妆品中的应用，具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽选自生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK中的一种或几种。
具体而言，本发明的生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK中的一种或几种的组合可以用于制备具有抗炎的药物。
具体而言，本发明的生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK中的一种或几种的组合在制备促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的药物中的应用。
本发明第四方面，提供具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用，具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽选自生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK中的一种或几种。
具体而言，本发明的生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK中的一种或几种的组合在制备促巨噬细胞分泌细胞因子的食物或药物中的应用。
本发明第五方面，提供了一种抗炎产品，包括所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK中一种或多种的组合或所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK的衍生物中的一种或几种的组合；所述的抗炎产品包括抗炎药物或抗炎化妆品。
本发明第六方面，提供了一种具有免疫调节功能的产品，包括所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK中一种或多种的组合或所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK的衍生物中的一种或几种的组合；所述具有免疫调节功能的产品包括具有免疫调节功能的食品或具有免疫调节功能的药物。
所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK的衍生物，是指与所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK具有相同的活性或更优的活性。
所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK的衍生物，是指在所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的生物活性肽衍生物。
本发明具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽的有益效果为：本发明所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK具有较好的抗炎活性；本发明所述生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK可促进巨噬细胞活化并释放细胞因子，提高机体免疫力，降低机体发病率，促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加，提高生命的质量，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。
附图说明
图1：质荷比为387.5527的片段的一级质谱图(m/z＝387.5527)；
图2：质荷比为387.5527的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
图3：质荷比为365.4602的片段的一级质谱图(m/z＝365.4602)；
图4：质荷比为365.4602的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
图5：质荷比为378.461的片段的一级质谱图(m/z＝378.461)；
图6：质荷比为378.461的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1活性肽FREGTTPKPK、FREGTTPKPKRAA和RHGFREGTTPKPK的人工合成
一、生物活性肽的合成
1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。
2.2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
5.称取氨基酸Phe适量和1-羟基-苯并三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6.2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10.1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Phe、Arg、Glu、Gly、Thr、Thr、Pro、Lys、Pro、Lys。
13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将生物活性肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。
至此，人工合成了生物活性肽FREGTTPKPK。
生物活性肽FREGTTPKPKRAA和RHGFREGTTPKPK的合成方法参考上面方法，只需在第5步选用特定生物活性肽对应的首个氨基酸，以及在第12步连接特定生物活性肽对应的氨基酸。
二、生物活性肽的确认
1)UPLC分析
UPLC条件如下：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪
色谱柱规格：BEH C18色谱柱
流速：0.4mL/min
温度：50℃
紫外检测波长：210nm
进样量：2μL
梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈
2)质谱分析
质谱条件如下：
离子方式：ES+
质量范围(m/z)：100、1000
毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0
采样锥(V)：35.0
离子源温度(℃)：115
去溶剂温度(℃)：350
去溶剂气流(L/hr)：700.0
碰撞能量(eV)：4.0
扫描时间(sec)：0.25
内扫描时间(sec)：0.02
根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对生物活性肽FREGTTPKPK、FREGTTPKPKRAA和RHGFREGTTPKPK进行色谱分析和质谱分析。生物活性肽FREGTTPKPK一级质谱图如图1所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为387.5527，保留时间是6.64min。生物活性肽FREGTTPKPKRAA的质量色谱提取图如图3所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图4所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为365.4602，保留时间是6.53min。生物活性肽RHGFREGTTPKPK的质量色谱提取图如图5所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图6所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为378.461，保留时间是6.35min。
3)结果
由图2可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比387.5527的片段序列为Arg、Val、Ala、Lys、Val、Thr、Gly、Gly、Ala、Ala、Ser、Lys、Leu(FREGTTPKPK)，记为SEQ ID NO：1。该片段与60S ribosomal protein L37蛋白第78～87位的残基序列相对应，60S ribosomal protein L37蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAB28307.1，序列见SEQ ID NO：4。
由图4可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比365.4602的片段序列为Arg、Val、Ala、Lys、Val、Thr、Gly、Gly、Ala、Ala、Ser、Lys、Leu、Ser(FREGTTPKPKRAA)，记为SEQ ID NO：2。该片段与60S ribosomal protein L37蛋白第78～90位的残基序列相对应，60S ribosomal protein L37蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAB28307.1，序列见SEQ ID NO：4。
由图6可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比378.461的片段序列为Val、Ala、Lys、Val、Thr、Gly、Gly、Ala、Ala、Ser、Lys、Leu、Ser(RHGFREGTTPKPK)，记为SEQ ID NO：3。该片段与60S ribosomal protein L37蛋白第75～87位的残基序列相对应，60S ribosomal protein L37蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAB28307.1，序列见SEQ ID NO：4。
实施例2生物活性肽的免疫调节活性实验
一、生物活性肽FREGTTPKPK的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6、8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源性生物活性肽FREGTTPKPK；ELISA细胞因子快速试剂盒(IL-1β和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：LRH、250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL、22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素、过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。
3.实验结果及分析：
表1生物活性肽FREGTTPKPK对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定
| 实验分组 | IL-1β | IL-6 |
| 细胞空白 | 0.451±0.047 | 1.213±0.031 |
| 生物活性肽(0.2mg/ml) | 0.739±0.035** | 1.301±0.025* |
| 生物活性肽(0.5mg/ml) | 0.632±0.029** | 1.289±0.012* |
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
从表1中可知，在IL-1β和IL-6这两种细胞因子的实验结果中，IL-1β在0.2mg/ml及以上出现了极显著性差异(P＜0.01)，IL-6在0.2mg/ml及以上出现了显著性差异(P＜0.05)，证明了一定浓度下的生物活性肽FREGTTPKPK可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放IL-1β和IL-6，其中对IL-1β因子的促进作用更为显著。
二、生物活性肽FREGTTPKPK的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定(Griess法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)脾脏淋巴细胞来源生物活性肽FREGTTPKPK；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.试验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24h时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48h后，收集培养液上清50μl/孔，在培养液上清中依次添加Griess试剂1和Griess试剂2各50μl/孔，室温反应10分钟后，在540nm波长下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表2生物活性肽FREGTTPKPK促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表2，由表2可知，在实验组中添加生物活性肽，浓度为0.5mg/mL时，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用，与细胞空白组相比，具有极显著性差异(P<0.01)。当生物活性肽的添加浓度为0.2mg/mL，与空白组并无明显差异，说明生物活性肽FREGTTPKPK在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。
三、生物活性肽FREGTTPKPKRAA的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6、8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源性生物活性肽FREGTTPKPKRAA；ELISA细胞因子快速试剂盒(IL-1β和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：LRH、250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL、22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素、过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。
3.实验结果及分析：
表3生物活性肽FREGTTPKPKRAA对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定
| 实验分组 | IL-1β | IL-6 |
| 细胞空白 | 0.463±0.042 | 1.221±0.034 |
| 生物活性肽(0.2mg/ml) | 0.548±0.042* | 1.298±0.031* |
| 生物活性肽(0.5mg/ml) | 0.743±0.033** | 1.388±0.030* |
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
从表3中可知，在IL-1β和IL-6这两种细胞因子的实验结果中，IL-1β和IL-6均在0.2mg/ml浓度时出现了显著性差异(P＜0.05)，在0.5mg/ml出现了极显著性差异(P＜0.01)，证明了一定浓度下的生物活性肽FREGTTPKPKRAA可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放IL-1β和IL-6，其中对IL-1β因子的促进作用更为显著。
四、生物活性肽FREGTTPKPKRAA的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定(Griess法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)脾脏淋巴细胞来源生物活性肽FREGTTPKPKRAA；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.试验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24h时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48h后，收集培养液上清50μl/孔，在培养液上清中依次添加Griess试剂1和Griess试剂2各50μl/孔，室温反应10分钟后，在540nm波长下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表4生物活性肽FREGTTPKPKRAA促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定
| 实验分组 | 正常组 | 炎症组 |
| 细胞空白 | 0.0587±0.0231 | 0.3783±0.0244 |
| 生物活性肽(0.2mg/ml) | 0.0873±0.0228* | 0.4382±0.0116* |
| 生物活性肽(0.5mg/ml) | 0.1852±0.0289** | 0.5473±0.0185** |
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表4，由表4可知，在实验组中添加生物活性肽，浓度为0.5mg/mL时，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用，与细胞空白组相比，具有极显著性差异(P<0.01)。当生物活性肽的添加浓度为0.2mg/mL，与空白组相比具有显著性差异(P<0.05)，说明生物活性肽FREGTTPKPKRAA在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。
五、生物活性肽RHGFREGTTPKPK的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6、8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源性生物活性肽RHGFREGTTPKPK；ELISA细胞因子快速试剂盒(IL-1β和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：LRH、250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL、22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素、过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。
3.实验结果及分析：
表5生物活性肽RHGFREGTTPKPK对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定
| 实验分组 | IL-1β | IL-6 |
| 细胞空白 | 0.446±0.034 | 1.228±0.027 |
| 生物活性肽(0.2mg/ml) | 0.863±0.014** | 1.483±0.012** |
| 生物活性肽(0.5mg/ml) | 0.793±0.021** | 1.515±0.024** |
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
从表5中可知，在IL-1β和IL-6这两种细胞因子的实验结果中，IL-1β在0.2mg/ml及以上均出现了极显著性差异(P＜0.01)，证明了一定浓度下的生物活性肽RHGFREGTTPKPK可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放IL-1β和IL-6。
六、生物活性肽RHGFREGTTPKPK的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定(Griess法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)脾脏淋巴细胞来源生物活性肽RHGFREGTTPKPK；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.试验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24h时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48h后，收集培养液上清50μl/孔，在培养液上清中依次添加Griess试剂1和Griess试剂2各50μl/孔，室温反应10分钟后，在540nm波长下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表6生物活性肽RHGFREGTTPKPK促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定
| 实验分组 | 正常组 | 炎症组 |
| 细胞空白 | 0.0630±0.0226 | 0.3745±0.0189 |
| 生物活性肽(0.2mg/ml) | 0.0683±0.0358 | 0.3759±0.0224 |
| 生物活性肽(0.5mg/ml) | 0.1648±0.0243** | 0.684±0.0478** |
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表6，由表6可知，在实验组中添加生物活性肽，浓度为0.5mg/mL时，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用，与细胞空白组相比，具有极显著性差异(P<0.01)。当生物活性肽的添加浓度为0.2mg/mL，与空白组并无明显差异，说明生物活性肽RHGFREGTTPKPK在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江辉肽生命健康科技有限公司
<120> 具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Phe Arg Glu Gly Thr Thr Pro Lys Pro Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Phe Arg Glu Gly Thr Thr Pro Lys Pro Lys Arg Ala Ala
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg His Gly Phe Arg Glu Gly Thr Thr Pro Lys Pro Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Thr Lys Gly Thr Ser Ser Phe Gly Lys Arg Arg Asn Lys Thr His
1 5 10 15
Thr Leu Cys Arg Arg Cys Gly Ser Lys Ala Tyr His Leu Gln Lys Ser
20 25 30
Thr Cys Gly Lys Cys Gly Tyr Pro Ala Lys Arg Lys Arg Lys Tyr Asn
35 40 45
Trp Ser Ala Lys Ala Lys Arg Arg Asn Thr Thr Gly Thr Gly Arg Met
50 55 60
Arg His Leu Lys Ile Val Tyr Arg Arg Phe Arg His Gly Phe Arg Glu
65 70 75 80
Gly Thr Thr Pro Lys Pro Lys Arg Ala Ala Val Ala Ala Ser Ser Ser
85 90 95
Ser
Claims (4)
1.具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽，其特征在于，选自生物活性肽FREGTTPKPK、生物活性肽FREGTTPKPKRAA或生物活性肽RHGFREGTTPKPK中的一种或几种；
生物活性肽FREGTTPKPK的氨基酸序列为Phe-Arg-Glu-Gly-Thr-Thr-Pro-Lys-Pro-Lys，
生物活性肽FREGTTPKPKRAA的氨基酸序列为Phe-Arg-Glu-Gly-Thr-Thr-Pro-Lys-Pro-Lys-Arg-Ala-Ala，
生物活性肽RHGFREGTTPKPK的氨基酸序列为Arg-His-Gly-Phe-Arg-Glu-Gly-Thr-Thr-Pro-Lys-Pro-Lys。
2.编码权利要求1所述具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽的多核苷酸。
3.权利要求1所述具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽的制备方法，其特征在于，直接通过化学合成制备。
4.权利要求1所述具有氨基酸结构FREGTTPKPK的生物活性肽在制备促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的药物中的应用。
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